一種奶牛早期妊娠階段血清中的差異蛋白及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及奶牛飼養(yǎng)領域，具體設及一種奶牛早期妊娠階段血清中的差異蛋白及 其用途。
【背景技術】
[0002] 奶牛繁殖性能的好壞，不僅影響奶牛數(shù)量的增加和質量的提高，還影響奶牛的生 產性能和經濟效益，因此，奶牛的妊娠率受到各國奶牛業(yè)的廣泛重視。
[0003] 目前的統(tǒng)計結果顯示，盡管奶牛的受精率達90%，但是平均產轄率只有40%~ 55%，約70%~80%的胚胎/胎兒損失發(fā)生在妊娠前3周，其中14~18天母體妊娠識別 時期的早期胚胎丟失為主。
[0004] 因此，盡早對人工授精后的奶牛進行妊娠診斷，及時分辨妊娠奶牛和空懷奶牛，對 妊娠奶牛進行有效監(jiān)控，防止胚胎損失；對空懷奶牛實施同期發(fā)情和再次人工授精，可提高 牛群的妊娠率和繁殖效率。
[0005] 目前，通常采用直腸檢查和化ISA試劑盒診斷奶牛是否妊娠，直腸觸診法是通過 實踐經驗豐富的工作人員觸摸奶牛直腸，勞動強度較大、工作效率較低，難W在奶牛妊娠早 期進行診斷，容易造成奶牛的產轄間隔延長、繁殖率降低、產奶量減少，增加了飼養(yǎng)管理的 成本，降低了奶牛養(yǎng)殖的經濟效益。采用直腸觸診法進行診斷時，最早可于奶牛人工授精后 35天進行診斷，而且容易觸及子宮和胎膜，對早期胚胎造成傷害，甚至導致母牛直腸組織破 壞。
[0006]ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實驗）試劑盒是通過判斷奶牛血清中的PAG(妊娠相關糖蛋 白）含量，進而判斷受精28天W上的奶牛是否妊娠，不能準確判斷奶牛受精后一個情期內 (21天）是否妊娠，進而難W排查受精后14~18天的奶牛是否為空懷奶牛。
[0007] 專利號為201410294733. 0的發(fā)明專利申請?zhí)峁┝艘环N基于BRCA2蛋白、mRNA診斷 奶牛是否妊娠的方法及用途，該方法根據(jù)BRCA2蛋白在妊娠奶牛和空懷奶牛體內的差異， 判斷奶牛是否妊娠，該方法只能在奶牛人工授精后18天進行早期妊娠診斷，而且由于該蛋 白在妊娠早期階段的表達趨勢并不一致，能否用于奶牛早期胚胎丟失的預警也尚無界定。

【發(fā)明內容】

[0008] 針對現(xiàn)有技術中存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種奶牛早期妊娠階段血清 中的差異蛋白，所述差異蛋白為妊娠差異蛋白、空懷差異蛋白和反向差異蛋白，妊娠差異蛋 白包括ARHGAP42、E陽MP1、GT巧F1、L0XL2、CPB2、LYST、畑H11、TRA抓、TRIM67 和TRMT112，空 懷差異蛋白包括IGL反向差異蛋白包括皿B和HP;所述差異蛋白用于判斷奶牛是否妊娠。
[0009] -種使用權利要求1所述的奶牛早期妊娠階段血清中的差異蛋白判斷奶牛妊娠 的方法，檢測受精時間大于等于14天的奶牛血清中差異蛋白含量是否符合下列條件之一， 若符合，則該奶牛為妊娠奶牛，所述條件為：
[0010] (1)血清中ARHGAP42蛋白含量大于等于未受精奶牛血清中ARHGAP42蛋白含量的 2. 80 倍；
[0011] (2)血清中EFEMPl蛋白含量大于等于未受精奶牛血清中EFEMPl蛋白含量的2. 03 倍；
[0012] (3)血清中GW2F1蛋白含量大于等于未受精奶牛血清中GW2F1蛋白含量的2. 83 倍；
[0013] (4)血清中L0XL2蛋白含量大于等于未受精奶牛血清中L0XL2蛋白含量的2. 04 倍；
[0014] (5)血清中CPB2蛋白含量小于等于未受精奶牛血清中CPB2的0. 76倍；
[0015] (6)血清中LYST蛋白含量小于等于未受精奶牛血清中LYST的0.65倍；
[0016] (7)血清中畑化1蛋白含量小于等于未受精奶牛血清中畑化1的0. 23倍；
[0017] (8)血清中TRABD蛋白含量小于等于未受精奶牛血清中RDH11的0. 62倍；
[0018] (9)血清中TRIM67蛋白含量小于等于未受精奶牛血清中TRIM67的0. 18倍；
[0019] (10)血清中TRMT112蛋白含量小于等于未受精奶牛血清中TRMT112的0. 60倍；
[0020] (11)血清中皿B蛋白含量Xi為未受精奶牛血清中皿B蛋白含量y1的0至0. 73 倍；
[002。 （12)血清中的HP蛋白含量X2為未受精奶牛血清中HP蛋白含量Y2的0至0. 67 倍；
[002引（蝴同時符合條件似至中兩個或兩個W上。
[0023] 在上述技術方案的基礎上，該方法之后還包括W下步驟：
[0024] 判斷妊娠奶牛血清中的ARHGAP42、EFEMP1、GW2F1和/或L0XL2蛋白在受精后14 天至28天是否一直上調表達，若是，該奶牛的胚胎穩(wěn)定，若否，該妊娠奶牛存在胚胎丟失的 風險；
[00巧]或者判斷妊娠奶牛血清中的CPB2、LYST、畑H11、TRABD、TRIM67和/或TRMT112蛋 白在受精后14天至28天是否一直下調表達，若是，該奶牛的胚胎穩(wěn)定，若否，該妊娠奶牛存 在胚胎丟失的風險。
[0026] 在上述技術方案的基礎上，判斷奶牛為妊娠奶牛之后還包括W下步驟：判定所述 妊娠奶牛中Xi> 0. 82y1時，該奶牛存在流產風險。
[0027] 在上述技術方案的基礎上，判斷奶牛為妊娠奶牛之后還包括W下步驟：判定所述 妊娠奶牛中X2> 0. 69Y2時，該奶牛存在流產風險。
[0028] -種使用權利要求1所述的奶牛早期妊娠階段血清中的差異蛋白判斷奶?？諔?的方法，該方法包括W下步驟：
[0029] 判定受精時間大于等于14天的奶牛血清中I化蛋白含量為未受精奶牛血清中蛋 白含量的1. 43倍W上，奶牛受精失敗，該奶牛為空懷奶牛；或/和判定受精時間大于等于 14天的奶牛血清中皿B蛋白含量Xi為未受精奶牛血清中皿B蛋白含量y1的2. 01倍W上； 或/和判定受精時間大于等于14天的奶牛血清中的HP蛋白含量X2為未受精奶牛血清中 HP蛋白含量Y2的3.53倍W上。
[0030] 在上述技術方案的基礎上，判定奶牛為空懷奶牛之后，還包括W下步驟：對空懷奶 牛實施同期發(fā)情和再次人工授精。
[0031]一種基于早期妊娠階段差異蛋白的奶牛妊娠診斷試紙，所述試紙用于檢測妊娠差 異蛋白和/或空懷差異蛋白，所述試紙上設置有ARHGAP42、EFEMPl、GTF2F1、L0XL2、CPB2、LYST、畑化1、TRABD、TRIM67、TRMT112或/和I化對應的免疫吸附劑、標記物和顯色劑。
[0032] -種基于早期妊娠階段差異蛋白的奶牛妊娠診斷試劑盒，所述試劑盒用于檢測妊 娠差異蛋白和/或空懷差異蛋白，所述試劑盒包括妊娠差異蛋白和/或空懷差異蛋白、妊娠 差異蛋白抗體和/或空懷差異蛋白抗體、妊娠差異蛋白抗體標記物和/或空懷差異蛋白抗 體標記物。
[0033] 一種基于早期妊娠階段差異蛋白的奶牛早期妊娠保胎素，所述保胎素包括 ARHGAP42、E陽MP1、GT巧F1 和 / 或L0XL2 蛋白。
[0034] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0035] (1)本發(fā)明中的判斷奶牛是否妊娠的差異蛋白，包括妊娠差異蛋白、空懷差異蛋白 和反向差異蛋白，通過檢測受精14天的奶牛血清中上述蛋白，能夠準確判斷對應奶牛是否 妊娠，而且診斷的時間提前。
[0036] (2)本發(fā)明能夠準確判斷奶牛是否為空懷奶牛，便于工作人員及時對空懷奶牛實 施同期發(fā)情和再次人工授精，能夠提高牛群的妊娠率和繁殖效率。
[0037] (3)本發(fā)明能夠通過檢測奶牛體內妊娠差異蛋白或/和反向差異蛋白的含量，判 斷妊娠奶牛是否存在胚胎丟失的風險，方法比較簡單，結果比較準確。
[0038] (4)本發(fā)明將妊娠奶牛血清中持續(xù)上調的蛋白作為保胎素原料，為奶牛妊娠早期 保胎素生物制品的研發(fā)提供了蛋白資源，能夠有效促進妊娠的維持，減低妊娠識別時期胚 胎丟失的風險。
【附圖說明】
[0039] 圖1為本發(fā)明實施例中NFE化2蛋白的電泳圖；
[0040] 圖2為本發(fā)明實施例中EFEMP1蛋白的電泳圖；
[0041] 圖3為本發(fā)明實施例中CD44蛋白的電泳圖；
[0042] 圖4為本發(fā)明實施例中KRT18蛋白的電泳圖。
[004引 圖中；PH表示妊娠牛，NPH表示空懷牛。
【具體實施方式】
[0044]W下結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0045] 參見圖1所示，本發(fā)明實施例提供一種奶牛早期妊娠階段血清中的差異蛋白及其 用途，受精奶牛血清蛋白的分離和鑒別方法包括W下步驟：
[0046]S1;制備蛋白樣品
[0047]S101;對若干頭奶牛進行人工授精，采集每頭奶牛人工授精0天、14天、18天、21 天、28天后的血樣，每次義集血樣后，均將血樣在轉速為5000r/min的條件下離屯、15min，吸 取上清液，得到血清。
[0048]S102;采用直腸檢測法判斷人工授精60天的奶牛是否已經妊娠，根據(jù)直腸檢查的 結果，任意選取9頭妊娠奶牛人工受精14天、18天、21天、28天后的血樣分別等量混合，得 至IJ4個不同時間點的妊娠樣本;A1，A2,A3,A4;任意選取12頭空懷奶牛，將12頭空懷奶牛 人工受精14天、18天、21天、28天后的血樣分別等量混合，得到4個不同時間點的空懷樣 本；Bl，B2,B3,B4 ;所有妊娠奶牛和空懷奶牛受精后0天的樣本混合成對照樣品，即ABl。
[0049]S103 ;將所有妊娠樣本、空懷樣本和對照樣本進行如下處理；去除樣本中的高豐 度蛋白質后，取20y1樣本并加入450y1的BindingBuffer(結合緩沖）溶液稀釋，得到 對應的樣本稀釋液。
[0050] 將850 Binding Buffer溶液加入去血清高豐度蛋白柱后，將所有的樣本稀釋 液依次加入去血清高豐度蛋白柱，并收集對應的穿流液，得到對應的樣本穿流液。分別將所 有的樣本穿流液放入超濾離屯、管中離屯、至100 y 1，得到對應的樣本濃縮液，測定每個樣本 濃縮液的濃度。
[0051]S104 ;分別取20yg所有樣本的樣本濃縮液，向每份樣本濃縮液中加入4yg上 樣緩沖液，置于沸水中保溫5min后，在離屯、力為14000g(g為離屯、力單位）的條件下離屯、 20min，取上清液，用12. 5%的SDS-PAGE中電泳分離后，使用考馬斯亮藍進行染色，得到所 有樣本的樣本濃縮液的電泳圖譜。
[0052]S2 ;酶解、膚段定量和膚段標記
[0053] 分別取200yg所有樣本的樣本濃縮液，向每份樣本濃縮液中加入30y1SDT 溶液，SDT溶液由4%SDS(十二烷基硫酸鋼）、100mMTris-HCl(S哲甲基氨基甲燒）、 lOOmMDTT(二硫蘇糖醇）混合后調節(jié)抑至7.6而制成，并混合均勻，置于沸水中保溫 5min后，冷卻至室溫并加入200y1UAbuffer(尿素緩沖溶液）混合均勻，放入超濾離屯、 管中，在離屯、力為14000g的條件下離屯、30min，去除濾液后，加入lOOy1濃度為50mM的 IAA(Indo^^-3-AceticAcid,嘲噪己酸）溶液，在轉速為60化pm的條件下震蕩Imin， 并于室溫下避光放置30min后，在離屯、力為14000g的條件下離屯、20min，加入lOOy1UA buffer(sodiumhypochloritebuffer,次氯酸鋼緩沖溶液），在離屯、力為14000g的條件下 離屯、20min后，再次加入lOOylUAbuffer,在離屯、力為14000g的條件下離屯、20min后， 加入40y1Trypsinbuffer(膜酶緩沖溶液，由2yg的膜酶溶解于40y1的分散液中制 成），在震蕩速度為60化pm的條件下振蕩Imin后，在溫度為37°C的條件下靜置16~1她， 在離屯、力為14000g的條件下離屯、lOmin后，得到濾液，濾液為0D280膚段溶液，定量分析所 有0D280膚段溶液，并測定其濃度。
[0054] 分別取100 y g所有的0D280膚段溶液，分別加入由ABI公司生產的型號為iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit的試劑盒（一種用于對膚段進行同位素相對標記與絕對定 量的試劑盒）進行標記，形成8種相對分子質量為145的等量異位標簽。
[00巧]參見表1、表2所示，第一空白樣本AB1對應的0D280膚段溶液被試劑盒Kit中相 對分子量為113的報告基團標記。
[0056] 第一待測樣本A1對應的0D280膚段溶液被試劑盒Kit中相對分子量分別為114、 118的報告基團標記；第二待測樣本A2被相對分子量分別為115、119的報告基團標記；第 S待測樣本A3被相對分子量分別為116、118的報告基團標記；第四待測樣本A4被相對分 子量分別為117、119的報告基團標記。
[0057] 第一對比樣本B1對應的0D280膚段溶液被試劑盒Kit中相對分子量為114的報 告基團標記；第二對比樣本B2被相對分子量為115的報告基團標記；第=對比樣本B3被相 對分子量為116的報告基團標記；第四對比樣本B4被相對分子量為117的報告基團標記。 [005引表1樣品標記
[0059]
[0062]S3;對