用于識別相對于其野生型具有提高的特定代謝物細胞內(nèi)濃度的細胞的方法,其中通過重...的制作方法【專利說明】用于識別相對于其野生型具有提高的特定代謝物細胞內(nèi)濃度的細胞的方法，其中通過重組工程實現(xiàn)細胞的改變，以及用于制備相對于其野生型具有優(yōu)化的特定代謝物產(chǎn)量的經(jīng)基因修飾的生產(chǎn)細胞的方法，用于制備這種代謝物的方法，以及適合于此的核酸[0001]本發(fā)明涉及用于識別相對于其野生型具有提高的特定代謝物細胞內(nèi)濃度的細胞的方法，其中通過重組工程實現(xiàn)細胞的改變，以及用于制備相對于其野生型具有優(yōu)化的特定代謝物產(chǎn)量的經(jīng)基因修飾的生產(chǎn)細胞的方法，用于制備這種代謝物的方法，以及適合于此的核酸。[0002]幾十年來，微生物在工業(yè)上被用于生產(chǎn)低分子量分子。低分子量分子是例如天然細菌代謝物如氨基酸（EP1070132Bl，WO2008/006680A8)、核苷和核苷酸（EP2097512Cl，CA2297613Cl)、脂肪酸（TO2009/071878Cl，TO2011/064393Cl)、維生素（EP0668359Cl)、有機酸（EP0450491Bl，EP0366922BI)或糖（EP0861902C1，US3642575A)。通過細菌生產(chǎn)的低分子量分子也是通過例如源自植物的異源基因的表達形成的那些分子。它們是植物活性物質(zhì)。實例包括紫杉醇（W01996/032490Cl，WO1993/021338Cl)、青蒿素（W02009/088404Cl)和屬于類異戊二烯、苯丙素類或生物堿類類別的另外的分子（MarienhagenJ，BottM，2012，JBiotechnol.，doi.org/10.1016/j.jbiotec.2012.06.001)。通常，除植物來源的分子或分子的前體而外也可用微生物制得這些具有經(jīng)濟利益的分子。這些包括例如用于制備甲基丙烯酸酯的羥基異丁酸(PCT/EP2007/055394)、用于制備塑料的二胺（JP2009-284905A)或用作燃料的醇（W02011/069105C2,WO2008/137406Cl)。[0003]適合用作生產(chǎn)低分子量分子的微生物是革蘭氏陰性的細菌、革蘭氏陽性的細菌和酵母菌。合適的細菌例如是屬于腸桿菌屬（GenusEnterobacteria)的埃希氏桿菌各種（Escherichiaspecies)如大腸桿菌，或?qū)儆诤癖诰鷮伲℅enusFirmicutes)的芽抱桿菌各種（Bacillusspecies)如枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis)，或?qū)儆诤癖诰鷮俚娜榍蚓鞣N（Lactococcusspecies)如乳酸乳球菌（LactococcusIactis)或乳桿菌各種（Lactobacillusspecies)如干酷乳桿菌（Lactobacilluscasei)，或?qū)儆谧幽揖鷮伲℅enusAscomycetes)的酵母屬各種（Saccharomycesspecies)如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，或耶氏酵母屬各種（Yarrowiaspecies)如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)，或?qū)儆诎魻顥U菌屬（GenusCorynebacterium)的棒狀桿菌屬各種(Corynebacteriumspecies)。[0004]棒狀桿菌中優(yōu)選的是有效棒狀桿菌（Corynebacteriumefficiens)(DSM44549)、熱產(chǎn)氨棒狀桿菌（Corynebacteriumthermoaminogenes)(FERMBP-1539)和產(chǎn)氨棒狀桿菌（Corynebacteriumammoniagenes)(ATCC6871)，但特別是谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)(ATCC13032)。谷氨酸棒狀桿菌的一些種是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)下的其它名稱已知的。例如嗜乙酰乙酸棒狀桿菌（Corynebacteriumacetoacidophilum)ATCC13870、百合棒狀桿菌（Corynebacteriumlilium)DSM20137、棲糖蜜棒狀桿菌(Corynebacteriummelassecola)ATCC17965、黃色短桿菌（BrevibacteriumfIavum)ATCC14067、乳酸發(fā)酵短桿菌（Brevibacteriumlactofermentum)ATCC13869、散枝短桿菌(擴展短桿菌）ATCC14020和嗜氨微桿菌（Microbacteriumammoniaphilum)ATCC15354〇[0005]為了形成和生產(chǎn)低分子量分子，表達或增強表達該低分子量分子的合成途徑的微生物本身的基因、或同源基因或異源基因，或提高其mRNA的穩(wěn)定性。為此，這些基因可以在質(zhì)?；蜉d體上引入到細胞中，或它們可以存在于附加體上，或整合到染色體中。細胞自身的染色體編碼的基因也可以在它們的表達中得以增加。這例如通過染色體中適當?shù)耐蛔冊趩幼訁^(qū)域中實現(xiàn)。也可以將導致產(chǎn)量增加的其它突變引入到染色體中，所述其它突變例如影響mRNA的穩(wěn)定性，或滲透穩(wěn)定性，對pH值變化的耐受性，或者也可將其功能未知、但對產(chǎn)物的形成有有利影響的基因引入到染色體中。同源基因或異源基因也被嵌入到染色體中，或者它們被如此嵌入，以至于它們在染色體中以多次復制存在。[0006]有針對性地將突變或基因嵌入到基因組中需要構(gòu)建質(zhì)粒，該質(zhì)粒通過利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶在體外重組DNA序列來制備。為有針對性地引入染色體突變，整個過程還包括以下步驟：為實現(xiàn)體內(nèi)置換，對成功置換的測試，和最后對增加的產(chǎn)物形成的測試。這需要在圖1(左）中示意性列出的多個步驟，Al-A8。這種方法適用于許多用于生產(chǎn)小分子的細菌。實例是谷氨酸棒狀桿菌（Smallmobilizablemulti-purposecloningvectorsderivedfromtheEscherichiacoliplasmidspK18andpK19:selectionofdefineddeletionsinthechromosomeofCorynebacteriumglutamicum.SchaferA，TauchA，JagerW?KalinowskiJ?ThierbachG?PlihlerA.Gene.1994Jul22;145(1):69-73)，或綠胺桿菌（Pseudomonasaeruginosa)(AllelicexchangeinPseudomonasaeruginosausingnovelColEl-typevectorsandafamilyofcassettescontainingaportableoriTandthecounter-selectableBacillussubtilissacBmarker.SchweizerHP.MolMicrobiol.1992May;6(9):1195_204)，或枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)(ConstructionofamodularplasmidfamilyforchromosomalintegrationinBacillussubtilis.GimpelM，BrantlS.JMicrobiol.Methods.201211月；91(2):312-7)，或肉毒梭菌屬（Clostridien)(Novelsystemforefficientisolationofclostridiumdouble-crossoverallelicexchangemutantsenablingmarkerIesschromosomalgenedeletionsandDNAintegration.Al-HinaiMA，F(xiàn)astAG，PapoutsakisET.Appl.EnvironMicrobiol.201211月；78(22):8112-21)〇[0007]有針對性地將突變或基因引入到染色體中需要體外重組DNA序列，利用限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶以制備質(zhì)粒（圖1，A1)。為此所需的質(zhì)粒是在合適的條件下在所希望的生產(chǎn)者中不復制的質(zhì)粒。在通過電穿孔將質(zhì)粒引入到微生物中，化學轉(zhuǎn)化或彈道轉(zhuǎn)化（ballistischeTransformation)(圖1，A2)之后，整合到染色體中。在整合中通過載體介導的抗性來選擇（圖1，A3)。合適的質(zhì)粒例如是pBRHl(W02003076452C2)或pWVOl(US6025190)，其在醋桿菌屬（Azetobacter)或芽抱桿菌屬（Bacillus)中在轉(zhuǎn)化（圖1，A2)后不再能夠通過升高細胞內(nèi)的溫度復制，由此在抗性細胞中實現(xiàn)將載體嵌入到染色體中。質(zhì)粒pK19mobsacB從一開始就不能在棒狀桿菌如谷氨酸棒桿菌中復制，因此，在卡那霉素存在下僅選擇克隆，其中，通過同源重組將載體整合到染色體中（Schafer等人，Gene145,69-73(1994)(圖1，A3)。這些非復制質(zhì)粒充當載體，以使所針對的染色體中的基因突變、使啟動子序列突變、刪除序列、或置換序列、或者將新的基因引入到染色體中。該方法是復雜的，因為必須單獨在體外構(gòu)建質(zhì)粒。該方法此外是復雜的，因為通過合適的選擇方法，如選擇抗生素抗性或所提出的溫度升高，首先使質(zhì)粒與要置換的序列一起引入到染色體中，并在隨后的步驟中再從染色體中失去該質(zhì)粒（圖，A4)。通過隨后的測試，通常為PCR擴增，然后可以首先檢驗要置換的序列是否如希望般確實保留在染色體中（圖1，A5)。由此構(gòu)建了單個克隆，隨后培養(yǎng)它（圖1，A6)，定量其產(chǎn)物（圖1，A7)，并且由此可能得到改進的生產(chǎn)者（圖1，A8)。這種質(zhì)粒構(gòu)建和同源重組以獲得微生物生產(chǎn)者的技術(shù)被廣泛應(yīng)用，例如以在谷氨酸棒桿菌或大腸桿菌中實現(xiàn)等位基因置換或缺失（US8,293,514;US8,257,943;US8,216,820;WO2008/006680A8;EP2386650Cl)〇[0008]近來，引入所謂的"重組工程"作為有針對性的基因組突變的另一方法。引入突變需要遠比借助質(zhì)粒嵌入突變更少的步驟（圖1，右，BI-B2)。重組工程利用噬菌體-或原噬菌體基因，它們導致染色體DNA和外部供入的DNA之間的同源重組。在最簡單的情況中，這種DNA作為商業(yè)合成的單鏈-DNA來使用。也可以使用借助PCR擴增的雙鏈DNA。如果存在合適的噬菌體-或原噬菌體基因，這種方法僅需要很少步驟。但是，缺點是，這種方法基本上被限于引入允許在選擇性培養(yǎng)基上生長的突變，例如引入抗生素抗性，因為其它突變不能被識別。因此，形成產(chǎn)物的微生物的快速生成的直接使用是非常有限的，并且迄今僅被描述用于大腸桿菌和產(chǎn)物番前紅素（Programmingcellsbymultiplexgenomeengineeringandacceleratedevolution.WangHH，IsaacsFJ,CarrPA,SunTL,XuG,ForestCR，ChurchGM.Nature.2009;460(7257):894-8)。在這種特殊情況下，由于著色的番茄紅素，可借助菌落顏色推斷出產(chǎn)物的形成。對于其它生物體和其它產(chǎn)物，例如氨基酸或其它有機酸，迄今不能直接識別產(chǎn)品形成的增加。另一個缺點是，重組工程限于大腸桿菌和非常有限數(shù)量的另外的微生物，如腸道沙門氏菌（Salmonellaenterica)，假結(jié)核耶爾森菌（Yersiniapseudotuberculosis)，乳芽抱桿菌屬（Lactobacillus)，枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)和分枝桿菌（Mycobacterium)。[0009]另一問題在于，迄今沒有任何通用系統(tǒng)，用以在重組工程后立即在大的細胞群中識別并從這樣的細胞群中分離出形成產(chǎn)物的微生物。迄今在重組工程中使用的在培養(yǎng)皿上選擇的方法，如已述及的，限于非常特殊的應(yīng)用和此外在培養(yǎng)皿上得到的重組體的數(shù)目有限，這使得該方法不適用于大的重組體庫（Rekombinantenbibliotheken)的篩選。[0010]重組工程基于由源自噬菌體或原噬菌體的蛋白介導的同源重組。對于大腸桿菌而言，已知兩個同源系統(tǒng)。Rac-原菌體的RecE/RecT和由菌體A的Red-y、Red-0和Red-a構(gòu)成的red-操縱子。這兩個系統(tǒng)都允許在兩個不同的DNA分子之間的可自由選擇的DNA片段的置換。DNA的置換通過在目標片段側(cè)翼的兩個具有30-100個堿基對長度的同源(相似或相同的）區(qū)域進行。為引入染色體突變，將攜帶突變的DNA分子商業(yè)合成為單鏈（圖1，B1)，并引入到表達蛋白質(zhì)Red-0的大腸桿菌中。由于所引入的DNA分子和該染色體之間的同源性，通過Red-0蛋白介導重組和序列的置換。以此方式修正在大腸桿菌的染色體的galK基因中的突變。因為只有完好的galK基因能夠利用半乳糖，所以選擇在培養(yǎng)皿上通過生長成為菌落的重組體克?。▓D1，B2)(Rekombineering:invivogeneticengineeringinE.coli,S.enterica，和beyond.SawitzkeJA，ThomasonLC,CostantinoN，BubunenkoM，DattaS，CourtDL.MethodsEnzymol當前第1頁1 2 3 4 5