幽門螺旋桿菌絲氨酸蛋白酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體設(shè)及幽口螺桿菌絲氨酸蛋白酶的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 幽口螺旋桿菌是一種單極、多鞭毛、末端純圓、螺旋形彎曲的細(xì)菌。在胃粘膜上皮 細(xì)胞表面常呈典型的螺旋狀或弧形。幽口螺桿菌是微需氧菌，環(huán)境氧要求5~8%，在大氣 或絕對(duì)厭氧環(huán)境下不能生長(zhǎng)。大量研究表明，超過90%的十二指腸潰瘍和80%左右的胃潰 瘍，都是由幽口螺桿菌感染所導(dǎo)致的。長(zhǎng)期的潰瘍，會(huì)導(dǎo)致癌癥，因此WK)宣布胃幽口桿菌 為微生物型的致癌物質(zhì)，也是第一個(gè)可致癌的原核生物。
[0003] 最近研究發(fā)現(xiàn)幽口螺旋桿菌的絲氨酸蛋白酶（S巧是一種新型的分泌性細(xì)菌毒力 因子，它的同源蛋白也廣泛表達(dá)于原核生物和真核生物細(xì)胞，在蛋白質(zhì)量控制中發(fā)揮重要 作用。SP蛋白除了包含一個(gè)絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，還包括了PDZ結(jié)構(gòu)域，而PDZ與細(xì)胞內(nèi) 的信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)，已有研究發(fā)現(xiàn)它與關(guān)節(jié)炎、癌癥都有密切的關(guān)系。幽口螺旋桿菌感染后， SP蛋白被細(xì)菌分泌到黏膜表面，作用于細(xì)胞間粘連蛋白E-ca化erin的胞外段，從而破壞細(xì) 胞之間的連接，達(dá)到損傷胃黏膜的目的。而E-ca化erin作為細(xì)胞連接和癌癥抑制的重要蛋 白，它的破壞對(duì)胃潰瘍和胃癌的發(fā)生和發(fā)展起到重要作用。因此，SP蛋白的成功表達(dá)純化 對(duì)于研究其結(jié)構(gòu)功能W及與胃癌相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供幽口螺桿菌絲氨酸蛋白酶的制備方法，制備方 法簡(jiǎn)單，采用細(xì)菌體內(nèi)TEV酶切技術(shù)，純化過程中對(duì)酶量和酶活性損失小，能夠獲得有活性 的幽口螺桿菌絲氨酸蛋白酶。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] 幽口螺旋桿菌絲氨酸蛋白酶的制備方法，包括如下步驟；WSEQIDNo. 3和SEQID No. 4為引物，SEQIDNo. 2所示的核巧酸序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切 后連入經(jīng)同樣酶切的pMkC質(zhì)粒中，獲得重組表達(dá)載體pMAkC-SP，然后將重組表達(dá)載體 pMAkC-SP于大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，接著收集菌體，破碎，離屯、取上清，用Ni"親和層析柱和 強(qiáng)陰離子交換柱純化，最后過G200分子篩，即得幽口螺旋桿菌絲氨酸蛋白酶。
[0007] 優(yōu)選的，所述大腸桿菌為大腸桿菌JM109或含有TEV蛋白酶編碼基因的大腸桿菌 JM109。
[000引優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)表達(dá)是在溫度為16~37°C條件下用0. 1~Immol/L的IPTG誘 導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)；然后用0. 5M脫水四環(huán)素誘導(dǎo)2小時(shí)。
[0009] 優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)表達(dá)是在溫度為37°C條件下用Immol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3小 時(shí)。
[0010] 優(yōu)選的，所述收集菌體是將菌液在100(K)巧m條件下離屯、10分鐘，棄上清，收集沉 淀。
[0011] 優(yōu)選的，所述破碎為向收集的菌體中加入細(xì)菌裂解液和苯甲基橫酷氣至苯甲基橫 酷氣的終濃度為Immol/l，超聲至溶液變清澈即可；所述細(xì)菌裂解液為P服.0、Tris-HCl濃 度為25mM，化C1濃度為300mM的溶液。
[001引優(yōu)選的，所述離屯、為在180(K)巧m條件下離屯、15分鐘。
[0013] 優(yōu)選的，所述Ni2+親和層析柱純化為取上清過Ni"親和層析柱，先用平衡緩沖液 洗柱3次，再用上樣緩沖液洗脫，收集洗脫液；所述平衡緩沖液為P服.0、Tris-HCl濃度為 25mM，化C1濃度為300mM，咪挫濃度為20mM的溶液；所述上樣緩沖液為抑8. 0、Tris-肥1濃 度為25mM，化C1濃度為300mM，咪挫濃度為200mM的溶液。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于；本發(fā)明采用細(xì)菌體內(nèi)TEV酶切技術(shù)，通過在細(xì)菌內(nèi)酶切 目標(biāo)蛋白標(biāo)簽，并采用Ni2+柱、離子交換和分子篩純化SP蛋白，相對(duì)于傳統(tǒng)標(biāo)簽酶切方式 (MBP柱一酶切一化2+柱一離子交換一分子篩），采用本發(fā)明的方法能夠減少目的蛋白純化 過程的損失，同時(shí)減少純化的技術(shù)流程；同時(shí)優(yōu)化緩沖液，結(jié)果顯示采用25mMTris-HCl， 300mM化Cl，p服.0的體系，當(dāng)化Cl濃度低于300mM時(shí)，SP出現(xiàn)大量沉淀，無法順利純化出 目的蛋白；此外，利用本發(fā)明的方法制備的絲氨酸蛋白酶具有較強(qiáng)的絲氨酸蛋白酶活性，能 促使膚鏈分裂，有效降解細(xì)胞間粘附分子，與傳統(tǒng)上消化細(xì)胞的膜酶相比，SP蛋白酶具有更 強(qiáng)的活性，可用于替代商業(yè)化的膜酶。
【附圖說明】
[0015] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0016] 圖1為幽口螺旋桿菌絲氨酸蛋白酶編碼基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖 (其中泳道1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2和3為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物）。
[0017] 圖2為重組質(zhì)粒pMAkC-SP酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖（其中泳道1為DNA分 子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2和3為化〇1和甜al雙酶切產(chǎn)物）。
[001引圖3為pMAkc-SP轉(zhuǎn)化菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖（其中泳道1為蛋白質(zhì)分 子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物，泳道3為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物，泳道4 為沉淀，泳道5為Ni"親和層析結(jié)果）。
[0019] 圖4為Se地adex-G75分子篩后的蛋白電泳圖（其中泳道1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)， 泳道2和3為幽口螺旋桿菌絲氨酸蛋白酶）。
[0020] 圖5不同純化方式獲得的SP蛋白電泳圖（其中泳道1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道 2為未用含TEV蛋白酶菌株純化的SP蛋白，泳道3為用含TEV蛋白酶菌株純化的SP蛋白）。
[0021] 圖6為不同緩沖液純化的SP蛋白（其中泳道1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為緩 沖液化C1高于300mM純化結(jié)果，泳道3緩沖液化C1低于300mM純化結(jié)果）。
[002引圖7為SP酶活性鑒定（a為對(duì)照；b，為12小時(shí)；C為24小時(shí)）。
[002引圖8為SP酶與膜酶在相同濃度相同時(shí)間內(nèi)的活性對(duì)比（a為對(duì)照；b為10yg/ml膜酶24小時(shí)內(nèi)消化結(jié)果；c為10yg/mlSP酶24小時(shí)內(nèi)消化結(jié)果）。
【具體實(shí)施方式】
[0024] W下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明 具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第=版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0025] 實(shí)施例1、幽口螺旋桿菌絲氨酸蛋白酶表達(dá)質(zhì)粒pMAkc-SP的構(gòu)建
[0026] 根據(jù)化iProt數(shù)據(jù)庫(kù)中公開的幽口螺旋桿菌絲氨酸蛋白酶（S巧氨基酸序列 化niProt:025663,SEQIDNo. 1)和大腸桿菌的密碼子偏好優(yōu)化編碼SP的核巧酸序列，優(yōu) 化后的核巧酸序列如SEQIDNo. 2,然后人工合成SEQIDNo. 2所示核巧酸序列。根據(jù)人工 合成的SEQIDNo. 2所示的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增SP的引物，具體序列如下：
[0027]上游引物SP-F;5，-tcccatgggaaaatcttgttttccaaggaatgtcccctc-3' (沈QID No. 3)，下劃線為TEV酶切序列；
[0028]下游引物SP-R;5, -gttctagatcacatcatcatcatcatcattttcaccaaaatg-3,(SEQID No.4)，下劃線為化is序列。
[0029] 設(shè)計(jì)的引物及人工序列委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行合成。
[0030] W人工合成的SP序列為模板，采用引物SP-F和SP-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為； 先94°C預(yù)變性2分鐘，再94°C變性30秒、65 °C退火30秒、72 °C延伸Imin，共33個(gè)循環(huán)，最 后72°C延伸10分鐘；擴(kuò)增后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯 示，擴(kuò)增獲得約1329bp的條帶，與預(yù)期片段大小一致。然后切膠回收目的DNA片段，將回收 所得的目的DNA片段用化〇1和甜al雙酶切，再與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒pMkc2x在T4DNA 連接酶的作用下連接，獲得重組質(zhì)粒pMAkc-SP。將重組質(zhì)粒pMAkc-SP經(jīng)化〇1和甜al雙 酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，所得的重組質(zhì)粒pMAkc-SP中含有目的DNA片段。
[0031] 實(shí)施例2、幽口螺旋桿菌絲氨酸蛋白酶的制備
[0032] 將重組質(zhì)粒pMAkc-SP轉(zhuǎn)化含有TEV蛋白酶編碼