修剪式多位點(diǎn)組合裝配的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 本申請(qǐng)是發(fā)明名稱為"修剪式多位點(diǎn)組合裝配"、申請(qǐng)?zhí)枮?200880101253. 0"、申 請(qǐng)日為2008年7月31日的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003] 本申請(qǐng)要求2007年7月31日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/953, 171的優(yōu)先權(quán)， 其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明總體上涉及修剪式多位點(diǎn)組合裝配（tailored multi-site combinatorial assembly，"TMCA"）的方法，其作為產(chǎn)生多個(gè)子代多核苷酸和對(duì)基因進(jìn)行 特異變化以及在多個(gè)位點(diǎn)重裝配突變或變化的方法。在短寡核苷酸上設(shè)計(jì)并合成突變或變 化。寡核苷酸與包括野生型基因的模板DNA退火。DNA聚合酶用于擴(kuò)增全DNA。從宿主回 收所產(chǎn)生的擴(kuò)增的DNA。該方法的優(yōu)勢(shì)在于速度、技術(shù)簡(jiǎn)單以及控制裝配的能力。
【背景技術(shù)】
[0005] 已公布的進(jìn)行基因變化的方法采用，例如，易錯(cuò)PCR、Invitrogen的Gene Tailor site-directed Mutagenesis Kit?、Stratagene 的 QuickChange Mutagenesis Kit?、重疊 PCR和基于PCR的連接/重組。對(duì)已知方法的研宄表明這些方法往往面對(duì)一個(gè)主要困難：在 單個(gè)位點(diǎn)/臨近區(qū)域產(chǎn)生突變和/或修飾和/或這些方法在多個(gè)區(qū)域進(jìn)行修飾是費(fèi)力的。
[0006] 美國(guó)專利7, 202, 086 (~086專利"）要求保護(hù)誘變方法，其使用至少5個(gè)重疊或 不重疊的寡核苷酸以及dsDNA(質(zhì)粒）以產(chǎn)生突變基因的文庫(kù)，其中每個(gè)突變平均存在于文 庫(kù)中1/5以下的基因中。'086專利描述了所公開(kāi)的發(fā)明不同于現(xiàn)有技術(shù)，因?yàn)?086專 利要求控制突變的頻率以避免在一個(gè)DNA分子中的"過(guò)量突變"（第5欄，28-45行）。所期 望的是獲得各含有一個(gè)突變的突變體。為了達(dá)到該目的，每個(gè)突變體寡核苷酸的量與模板 量之間的比例必須在0.01-100之間（第5欄，28-45行）。該特征區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)，其中同 時(shí)使用幾個(gè)寡核苷酸使得每條引物并入的水平大于75% (第5欄，28-45行）。'086專利 要求控制突變的頻率以避免在一個(gè)DNA分子中的"過(guò)量突變"并產(chǎn)生各含有一個(gè)突變的突 變體。
[0007] 美國(guó)專利7, 132, 265("' 265專利"）和美國(guó)專利公開(kāi)2003/0064516要求保護(hù)將 突變引入單鏈DNA( "ssDNA"）分子的方法，其包括退火引物、合成DNA鏈和消化DNA分子。 TCMA方法使用雙鏈DNA( "dsDNA"）作為模板。'265專利在使用ssDNA和dsDNA作為起始 底物用于誘變方法之間進(jìn)行了明確區(qū)分（參見(jiàn)，例如，第6欄，45-55行）。
[0008] 美國(guó)已公布的申請(qǐng)2003/0194807涉及文庫(kù)，其中蛋白質(zhì)的突變體包括在確定的 區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)位置上的單個(gè)預(yù)定氨基酸，其中所述確定的區(qū)域是至少三個(gè)氨基酸。只 允許在位置上的單個(gè)變化，即，排除具體氨基酸位置的簡(jiǎn)并變化。
[0009] 美國(guó)已公布的申請(qǐng) 2006/0051748、2006/0134624、2004/0248131 和 2002/0083488 以及美國(guó)專利6, 673, 610、6, 335, 160和5, 354, 670中的每一個(gè)都要求連接合成的DNA以產(chǎn) 生具有突變的子代環(huán)狀DNA。
[0010] 另外，美國(guó)已公布的申請(qǐng)2006/0051748要求使用瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶并將所有引物 與同一 DNA鏈退火。美國(guó)已公布的申請(qǐng)2006/0134624要求依次（即，不在一個(gè)反應(yīng)中） 使用兩種引物。在美國(guó)已公布的申請(qǐng)2004/0248131中，引物與兩條鏈退火，其中所述引物 必須包括2-4個(gè)互補(bǔ)堿基對(duì)。美國(guó)專利6, 673, 610和美國(guó)已公布的申請(qǐng)2002/0083488要 求使用通過(guò)親代DNA鏈消化產(chǎn)生的片段作為大引物（megaprimer)以獲得用于轉(zhuǎn)化的環(huán)狀 DNA。美國(guó)專利6, 335, 160涉及來(lái)自重疊片段和產(chǎn)生重組文庫(kù)的基因裝配。最后，美國(guó)專利 5, 354, 670要求兩個(gè)轉(zhuǎn)化步驟和采用限制性（restriction)進(jìn)行的中間處理。
[0011] 美國(guó)專利7, 176, 004、6, 713, 285、6, 391，548和5, 932, 419以及美國(guó)已公布的申請(qǐng) 20040253729和20030032037中的每一個(gè)都要求兩種引物以與兩條不同的鏈退火，用于在 相反的方向起始擴(kuò)增（即，正向和反向引物）并要求具有互補(bǔ)區(qū)。美國(guó)專利7, 078, 389和 5, 935, 830要求引物以包括誘變劑（例如，補(bǔ)骨脂素），其與模板相互作用以便形成三鏈分 子。
[0012] 美國(guó)已公布的申請(qǐng)2006/0228786要求在兩個(gè)不同的反應(yīng)中使用兩個(gè)不同的引物 進(jìn)行兩條鏈的聚合，然后將合成的ssDNA分子退火。美國(guó)已公布的申請(qǐng)2003/0077613涉及 基因裝配和產(chǎn)生文庫(kù)的方法，其中裝配的基因（ssDNA)與支架DNA退火以填充間隙并產(chǎn)生 dsDNA，其被亞克隆至載體。
[0013] 美國(guó)已公布的申請(qǐng)2004/0002057描述了在樣品中檢測(cè)不包括誘變的配體的方 法。美國(guó)已公布的申請(qǐng)2004/0002057描述了通過(guò)使用誘變劑在培養(yǎng)的細(xì)胞中建立突變體 大腸桿菌（E.coli)菌株的方法。美國(guó)已公布的申請(qǐng)2006/0199222描述了定向進(jìn)化的一般 方法，其中將突變的DNA轉(zhuǎn)化至具體的桿菌（Bacillus)菌株。
[0014] 仍然存在對(duì)更好的且更有效的方法的需要，所述方法有效且快速地產(chǎn)生特異的基 因變體和組合基因文庫(kù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 除非特別定義，所有用于本文的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員例如化 學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)或醫(yī)學(xué)領(lǐng)域結(jié)合上下文來(lái)看所通常理解的含義。
[0016] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供通過(guò)修剪式多位點(diǎn)組合裝配產(chǎn)生多個(gè)修飾的多核 苷酸的方法，所述修飾的多核苷酸在多個(gè)位點(diǎn)具有各種突變的不同組合。本發(fā)明允許對(duì) 基因進(jìn)行特異變化并在所述基因的多個(gè)位點(diǎn)重裝配突變或變化。本發(fā)明的這些和其他目 的一一其與下列優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述（單獨(dú)或其組合）結(jié)合而變得更加明顯一一通過(guò) 發(fā)現(xiàn)如下方法而得以滿足，所述方法包括：
[0017] (a)在單一反應(yīng)混合物中將至少三種引物添加至雙鏈模板多核苷酸，其中所述至 少三種引物不重疊，并且其中所述至少三種引物的每一種包括至少一個(gè)不同于其他引物的 突變，其中至少一種引物是可與所述模板的負(fù)鏈退火的正向引物以及至少一種引物是可與 所述模板的正鏈退火的反向引物，和
[0018] (b)使所述反應(yīng)混合物進(jìn)行聚合酶延伸反應(yīng)以從所述至少三種引物產(chǎn)生多個(gè)延伸 的修飾的多核苷酸。
[0019] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)生多個(gè)包括感興趣突變的修飾的多核苷酸的方法包括：
[0020] (a)在單一反應(yīng)混合物中將至少兩種引物添加至雙鏈模板多核苷酸，其中所述至 少兩種引物不重疊，并且其中所述至少兩種引物的每一種包括至少一個(gè)不同于其他引物的 突變，其中至少一種引物是可與所述模板的負(fù)鏈退火的正向引物以及至少一種引物是可與 所述模板的正鏈退火的反向引物，
[0021] (b)使所述反應(yīng)混合物進(jìn)行聚合酶延伸反應(yīng)以從所述至少兩種引物產(chǎn)生多個(gè)延伸 的修飾的多核苷酸，
[0022] (c)用酶處理所述多個(gè)延伸的修飾的多核苷酸，從而破壞所述模板多核苷酸，
[0023] (d)將所述處理的延伸的修飾的多核苷酸轉(zhuǎn)化入細(xì)胞，所述多核苷酸未用連接酶 處理，
[0024] (e)從所述細(xì)胞回收所述多個(gè)延伸的修飾的多核苷酸，和
[0025] (f)選擇包括感興趣的突變的所述多個(gè)延伸的修飾的多核苷酸。
[0026] 本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式的細(xì)節(jié)在如下所附描述中闡述。雖然類似或等同于 本文所述的任何方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試，但是現(xiàn)描述優(yōu)選的方法和材料。 本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)勢(shì)通過(guò)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求將變得明顯。在說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利 要求中，單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文明確另外指出。除非上下文明確地另外說(shuō)明， 本文使用或考慮的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。實(shí)施方式的實(shí)例僅用于說(shuō) 明目的。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 本發(fā)明的更完整的理解和其許多附隨優(yōu)勢(shì)將易于獲得，因?yàn)楫?dāng)與附圖結(jié)合考慮 時(shí)，參考下列詳述，它們得到更好的理解，其中：
[0028] 圖 LGSSMs19 圖示。
[0029] 圖2?進(jìn)化_GSSMsm方法流程的圖示。
[0030] 圖3.修剪式多位點(diǎn)組合裝配的圖示。
[0031] 圖4A-D. TMCA反應(yīng)中的引物組合。
[0032] 圖5.六個(gè)突變裝配中引物退火的圖譜。
[0033] 圖6.具有六個(gè)突變位點(diǎn)的可能組合的分布。標(biāo)準(zhǔn)：在理想狀態(tài)下計(jì)算的變體分 布；1A :采用大腸桿菌菌株XLl-Blue的反應(yīng)條件1 ;7A :采用大腸桿菌菌株XLl-Blue的反應(yīng) 條件2 ;13A :采用大腸桿菌菌株XLl-Blue的反應(yīng)條件3 ;總計(jì)：來(lái)自1A、7A和13A組合的數(shù) 據(jù)；Ox :無(wú)突變；lx :單個(gè)突變；2x :兩個(gè)突變；3x :三個(gè)突變；4x :四個(gè)突變；5x :五個(gè)突變； 6x :六個(gè)突變。
[0034] 圖7.六突變裝配中統(tǒng)計(jì)計(jì)算與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
[0035] 圖8.四突變裝配中引物退火的圖譜。
[0036] 圖9.具有四個(gè)突變位點(diǎn)的可能組合的分布。標(biāo)準(zhǔn)：在理想狀態(tài)下計(jì)算的變體分 布；2A :采用大腸桿菌菌株XLl-Blue的反應(yīng)條件1 ;8A :采用大腸桿菌菌株XLl-Blue的反應(yīng) 條件2 ;14A :采用大腸桿菌菌株XLl-Blue的反應(yīng)條件3 ;總計(jì)：來(lái)自2A、8A和14A組合的數(shù) 據(jù)；Ox :無(wú)突變；lx :單個(gè)突變；2x :兩個(gè)突變；3x :三個(gè)突變；4x :四個(gè)突變。
[0037] 圖10.具有四個(gè)位點(diǎn)的可能組合的分布。標(biāo)準(zhǔn)：在理想狀態(tài)下計(jì)算的變體分布； 2B :采用大腸桿菌菌株Stbl2的反應(yīng)條件1 ;8B :采用大腸桿菌菌株Stbl2的反應(yīng)條件2 ; 14B :采用大腸桿菌菌株Stbl2的反應(yīng)條件3 ;總計(jì)：來(lái)自2B、8B和14B組合的數(shù)據(jù)；Ox :無(wú) 突變；lx :單個(gè)突變；2x :兩個(gè)突變；3x :三個(gè)突變；4x :四個(gè)突變。
[0038] 圖11.三突變裝配中引物退火的圖譜。
[0039] 圖12.具有三個(gè)突變位點(diǎn)的可能組合的分布。標(biāo)準(zhǔn)：在理想狀態(tài)下計(jì)算的變體分 布；15A :采用大腸桿菌菌株XLl-Blue的反應(yīng)條件3 ;9B :采用大腸桿菌菌株Stbl2的反應(yīng)條 件2 ;15B :采用大腸桿菌菌株Stbl2的反應(yīng)條件3 ;總計(jì)：來(lái)自15A、9B和15B組合的數(shù)據(jù)； Ox :無(wú)突變；lx :單個(gè)突變；2x :兩個(gè)突變；3x :三個(gè)突變。
[0040] 圖13.具有5個(gè)突變位點(diǎn)和13個(gè)突變體的引物退火圖譜。
[0041] 圖14A、B、C.五個(gè)突變位點(diǎn)和13個(gè)引物裝配的獨(dú)特變體組合。在TMCA第I輪中 的變體破壞（A)、第II輪后的變體破壞（B)，引物退火圖譜（C)。
[0042] 優(yōu)選實(shí)施方式詳述
[0043] TMCA方法可高效快速地產(chǎn)生包括多個(gè)變化的特異基因變體或產(chǎn)生組合基因文庫(kù)； 要求最低的財(cái)力和人力；并可以被修改來(lái)根據(jù)"需要"產(chǎn)生偏好的組合文庫(kù)。TMCA方法可 不使用連接步驟而進(jìn)行，因此簡(jiǎn)化產(chǎn)生多個(gè)突變的方法。對(duì)具體文庫(kù)的"需要"隨實(shí)驗(yàn)而變