一種基于羅非魚育種抗病性能的評(píng)價(jià)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬水產(chǎn)育種技術(shù)領(lǐng)域。具體是一種基于羅非魚育種抗病性能的評(píng)價(jià)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 本發(fā)明的目的是在開展羅非魚抗病選育過程中，找到一套相對(duì)科學(xué)的方法評(píng)估每 個(gè)選育羅非魚的世代抗病性能。本發(fā)明的技術(shù)方案包括實(shí)驗(yàn)魚規(guī)格選擇、菌株選擇、菌株培 養(yǎng)、感染方式、抗病性能檢測(cè)及感染過后實(shí)驗(yàn)魚的處理等步驟。本發(fā)明適用于羅非魚抗病育 種。（請(qǐng)改寫）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種基于羅非魚育種抗病性能的評(píng)價(jià)方法。
[0004] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：
[0005] -種基于羅非魚育種抗病性能的評(píng)價(jià)方法，評(píng)價(jià)步驟如下：
[0006] 1. 一種基于羅非魚育種抗病性能的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，步驟如下：
[0007] 步驟1感染菌株的選擇：
[0008] 利用特異PCR分子血清型鑒定和基因型分析的方法對(duì)前期分離到的169株羅非魚 無乳鏈球菌菌株進(jìn)行分析，共得到Ia、Ib、III型三種血清型以及A~M13種帶型。結(jié)合毒 力測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HN016菌株為優(yōu)勢(shì)菌株，具有較強(qiáng)的毒力，且在羅非魚養(yǎng)殖的幾個(gè)主產(chǎn)區(qū) 中均分離到此菌株，因此，在進(jìn)行羅非魚抗病性能評(píng)估時(shí)，感染的菌株選擇HN016菌株。
[0009] 步驟2HN016菌株毒力穩(wěn)定性檢測(cè)：
[0010]隨機(jī)挑選10管從養(yǎng)殖場(chǎng)分離得到的原代HN016菌株，進(jìn)行革蘭氏染色鑒定，確定 為無乳鏈球菌后進(jìn)行-80 °C冷凍保存。將HN016原代菌株與-80 °C冷凍保存1個(gè)月、6個(gè)月、 12個(gè)月、2年、3年后的菌株進(jìn)行人工感染檢測(cè)其毒力的變化。結(jié)果表明冷凍保存后1個(gè)月、 6個(gè)月12個(gè)月、2年、3年的HN016菌株經(jīng)過復(fù)壯后進(jìn)行感染與HN016原代菌株相比并沒有 發(fā)生顯著變化，其毒力接近HN016原代菌株。說明HN016菌株毒力穩(wěn)定性可靠，可以用于評(píng) 估多個(gè)羅非魚選育世代的抗病性能。
[0011] 步驟3HN016菌株的復(fù)壯：
[0012] 復(fù)壯方式是將HN016菌株從-80°C冰柜取出接種于TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后大劑量 注射一尾羅非魚，待其發(fā)病后，再?gòu)哪X組織中接種分離出病原菌，并加入500mlTSB培養(yǎng)基。 在28°C條件下振蕩培養(yǎng)24h后，即得到用于大規(guī)模感染試驗(yàn)的菌液。
[0013] 步驟4HN016菌株半數(shù)致死濃度的測(cè)定：
[0014] 將步驟3培養(yǎng)好的HN016菌液用PBS溶液分別稀釋至1. 0X108、1. 0X107、 1.0X106、1.0X105、1.0X104、1.0X103和 1.0X10 2CFU/尾六個(gè)不同濃度對(duì)同一個(gè)家 系相同規(guī)格的羅非魚進(jìn)行等量注射感染。結(jié)果顯示1.0X105、1.0X104、1.0X103和 1. 0X102CFU/尾這四個(gè)感染劑量的累計(jì)死亡率均在75%以上，且死亡的試驗(yàn)魚多數(shù)出現(xiàn)無 乳鏈球菌病的發(fā)病癥狀。死亡時(shí)間主要集中在12~72h，7d后基本停止死亡。通過計(jì)算， HN016菌株對(duì)試驗(yàn)魚的半數(shù)致死濃度為7. 48X106CFU。篩選得到的HN016菌株的半數(shù)致死 濃度將用于各個(gè)羅非魚選育世代的感染評(píng)估。
[0015] 步驟5人工注射感染HN016菌株：
[0016] 將待感染的羅非魚置于預(yù)先清潔過的水池中，飼養(yǎng)一周左右。羅非魚在感染前24h 禁食。根據(jù)HN016菌株的半數(shù)致死量和菌液濃度計(jì)算好每尾魚注射菌液的體積，用連續(xù)注 射器將菌液注入羅非魚的腹部。
[0017] 步驟6感染HN016菌株之后試驗(yàn)魚的飼養(yǎng)管理：
[0018] 感染后水池須保持潔凈，每隔1日更換半池水。水溫用家熱管控制在31°C左右，每 天按早中晚飼喂3次，每次按魚體重的3%飼喂，并保證供氧充足。每隔3h統(tǒng)計(jì)一次死魚的 數(shù)量，記錄死亡個(gè)體的體重、體長(zhǎng)、體高、體寬及死亡時(shí)間。
[0019] 步驟7感染HN016菌株后存活試驗(yàn)魚的消毒處理：
[0020] 待試驗(yàn)魚停止死亡后，再對(duì)其暫養(yǎng)20d，之后轉(zhuǎn)入親魚培育池進(jìn)行培育。入池之前 先用清水對(duì)實(shí)驗(yàn)魚進(jìn)行清洗，之后放入5毫克/升高錳酸鉀溶液浸泡消毒lOmin。
[0021] 本發(fā)明的有益效果
[0022] 1.本發(fā)明一種基于羅非魚育種抗病性能的評(píng)價(jià)方法，設(shè)計(jì)合理，操作簡(jiǎn)單，能快速 有效地篩選出抗病力強(qiáng)的羅非魚個(gè)體和家系。
[0023] 2.感染選用的菌株在羅非魚養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)具有廣泛的代表性且毒力穩(wěn)定性強(qiáng)，適合 用于多個(gè)選育世代羅非魚的抗病性能評(píng)價(jià)。
【附圖說明】
[0024] 圖1是本發(fā)明HN016菌株冷凍保存的毒力檢測(cè)圖。
[0025] 圖2是本發(fā)明臨床菌株HN016腹腔注射感染羅非魚試驗(yàn)結(jié)果圖。
[0026] 圖中，a、b、c、d、e、f和g感染課題分別為 1. 0X108、1. 0X107、1. 0X106、1. 0X105、 1. 0X104、1. 0X103和 1. 0X102CFU/尾。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0028] 本發(fā)明羅非魚育種抗病性能的評(píng)價(jià)方法方法，采用以下步驟進(jìn)行：
[0029] 步驟1感染菌株的選擇：
[0030] 利用特異PCR分子血清型鑒定和基因型分析的方法對(duì)前期分離到的169株羅非魚 無乳鏈球菌菌株進(jìn)行分析，共得到Ia、Ib、III型三種血清型以及A~M13種帶型。結(jié)合毒 力測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HN016菌株為優(yōu)勢(shì)菌株，具有較強(qiáng)的毒力，且在羅非魚養(yǎng)殖的幾個(gè)主產(chǎn)區(qū) 中均分離到此菌株，因此，在進(jìn)行羅非魚抗病性能評(píng)估時(shí)，感染的菌株選擇HN016菌株，不 同基因型代表菌株的毒力測(cè)定的結(jié)果見附表1。
[0031] 步驟2HN016菌株毒力穩(wěn)定性檢測(cè)：
[0032] 隨機(jī)挑選10管從養(yǎng)殖場(chǎng)分離得到的原代HN016菌株，進(jìn)行革蘭氏染色鑒定，確定 為無乳鏈球菌后進(jìn)行-80 °C冷凍保存。將HN016原代菌株與-80 °C冷凍保存1個(gè)月、6個(gè)月、 12個(gè)月、2年、3年后的菌株進(jìn)行人工感染檢測(cè)其毒力的變化。結(jié)果表明冷凍保存后1個(gè)月、 6個(gè)月12個(gè)月、2年、3年的HN016菌株經(jīng)過復(fù)壯后進(jìn)行感染與HN016原代菌株相比并沒有 發(fā)生顯著變化，其毒力接近HN016原代菌株。說明HN016菌株毒力穩(wěn)定性可靠，可以用于評(píng) 估多個(gè)羅非魚選育世代的抗病性能。HN016菌株冷凍保存后毒力變化的測(cè)定結(jié)果見附圖1。<