一種與馬氏珠母貝軟體部重和閉殼肌重顯著關(guān)聯(lián)的snp298299標(biāo)記及引物和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)動物遺傳及分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與馬氏珠 母貝軟體部重和閉殼肌重顯著關(guān)聯(lián)的SNP298299標(biāo)記及引物和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 馬氏珠母貝是我國及世界上海水珍珠養(yǎng)殖的主要物種。我國自1965年成功地開 展了馬氏珠母貝人工育苗以來，海水珍珠產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，已成為廣東、廣西及海南部分沿海 地區(qū)海水養(yǎng)殖支柱產(chǎn)業(yè)之一。近10多年，我國海水珍珠的質(zhì)量和產(chǎn)量明顯下降，國際競爭 力減弱，養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益下滑。就其原因，除了養(yǎng)殖環(huán)境惡化、養(yǎng)殖技術(shù)落后外，還有一個重要 原因是：多年來不注重種貝的選育和保留，缺乏優(yōu)良品種；種苗質(zhì)量參差不齊，育珠母貝性 狀退化，如生長慢、個體小型、育珠能力減弱等。為了我國海水珍珠養(yǎng)殖業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展， 培育適合我國海區(qū)養(yǎng)殖的馬氏珠母貝優(yōu)良品種已迫在眉睫。
[0003] 育種技術(shù)有雜交、選擇育種，生物技術(shù)育種及分子育種等多種方法。分子育種是 目前國內(nèi)外研宄的熱點(diǎn)，是育種技術(shù)發(fā)展的主要方向，它具有高效、快捷的特點(diǎn)。分子育 種離不開分子標(biāo)記的開發(fā)，用在海洋貝類遺傳育種研宄的分子標(biāo)記主要有限制片段長度 多態(tài)性（RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP)、錨定簡單重復(fù) 序列（ISSR)、簡單重復(fù)序列（SSR)、單核苷酸多態(tài)性（SNP)、表達(dá)序列標(biāo)簽（EST)、線粒體 DNA(mtDNA)、核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)標(biāo)記（ITS)分子標(biāo)記等。Qiu等對合浦珠母貝不 同群體進(jìn)行EST-SSR標(biāo)記與生長及珍珠層性狀的關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明在野生群體中基因 PmartE05、PmartE35與殼高、總重顯著相關(guān)，基因 PmartE64與珍珠層厚度顯著相關(guān)，在養(yǎng)殖 群體中發(fā)現(xiàn)基因 PmartE05與殼高顯著的相關(guān)。Cong等利用SNP標(biāo)記研宄太平洋牡蠣的胰 島素相關(guān)多肽基因（oIRP)的多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)在oIRP基因1.5kb處發(fā) 現(xiàn)31個SNPs，其中6個與生長性狀顯著相關(guān)，特別是標(biāo)記T1358G和標(biāo)記G1437A與殼高、殼 長、殼寬、總重、軟體部重5個生長性狀顯著相關(guān)。軟體部重和閉殼肌重是在活體狀態(tài)下無 法測定的指標(biāo)，它們對珍珠貝培育珍珠有很大的影響，要想實(shí)現(xiàn)對這兩個性狀的選擇，只有 依靠與它們間接相關(guān)的易于測定的指標(biāo)，或者依靠關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記來選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種與馬氏珠母貝軟體部重和閉殼肌重顯著關(guān)聯(lián)的 SNP298299標(biāo)記的檢測引物。
[0005] 本發(fā)明的與馬氏珠母貝軟體部重和閉殼肌重顯著關(guān)聯(lián)的SNP298299標(biāo)記的檢測 引物，其特征在于，其核苷酸序列如下：
[0006] 298299FI:GGAATTCGTATCACTGTTTGAAGCAAGG ;
[0007] 298299RI:GGGAACACATCCCACATTTAACAATGTTA ;
[0008] 298299F0:TTGATAGCGGAATAGGCACATTCAATTT ；
[0009] 298299RO:TTAAAAGGCAAAGAAAACTTTGGCATCAG。
[0010] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種與馬氏珠母貝軟體部重和閉殼肌重顯著關(guān)聯(lián)的 SNP298299標(biāo)記，其特征在于，其特異性檢測引物為：
[0011] 298299FI:GGAATTCGTATCACTGTTTGAAGCAAGG ;
[0012] 298299RI:GGGAACACATCCCACATTTAACAATGTTA ;
[0013] 298299FO:TTGATAGCGGAATAGGCACATTCAATTT ；
[0014] 298299RO:TTAAAAGGCAAAGAAAACTTTGGCATCAG。
[0015] 本發(fā)明的第三個目的是提供與馬氏珠母貝軟體部重和閉殼肌重顯著關(guān)聯(lián)的 SNP298299標(biāo)記在鑒定馬氏珠母貝軟體部重和閉殼肌重大小中的應(yīng)用，其特征在于，包括以 下步驟：
[0016] a、提取馬氏珠母貝樣品基因組DNA ;
[0017] b、采用上述引物298299FI、298299RI、298299FO、298299RO對馬氏珠母貝樣品基 因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0018] c、根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對馬氏珠母貝樣品進(jìn)行鑒定，當(dāng)出現(xiàn)具有202bp和236bp大 小2條帶的為GT型；當(dāng)只出現(xiàn)202bp大小1條帶的為GG型。GG型個體的軟體部重和閉殼 肌重顯著大于GT型個體的樣品。
[0019] 優(yōu)選，所述的PCR擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)體系為：25 μ I^PCR反應(yīng)體系如下：包含馬氏珠 母貝樣品基因組 DNA 50ng，2XPCRMixture 12.5yL，檢測引物 298299FI 2yL、298299RI 2yL、298299FO 0.5yL、298299R0 0.5yL(各引物濃度均為 10pmol/yL)，0.0625U Taq DNA酶，余量為水；反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min ;94°C 40s，56°C 40s ;72°C 40s，35個循環(huán)； 72°C 延伸 5min。
[0020] 本發(fā)明的第四個目的是提供與馬氏珠母貝軟體部重和閉殼肌重顯著關(guān)聯(lián)的 SNP298299標(biāo)記在馬氏珠母貝分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0021] 利用本發(fā)明的與馬氏珠母貝軟體部重和閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP298299標(biāo)記的檢 測引物，能夠擴(kuò)增出兩種SNP基因型位點(diǎn)，再根據(jù)PCR擴(kuò)增電泳圖可直觀地比較個體間軟體 部重和閉殼肌重的大小，可直接用于后續(xù)的分子標(biāo)記輔助育種，如可在生長早期篩選目標(biāo) 性狀，進(jìn)而篩選特定的個體進(jìn)行品種培育。
【附圖說明】：
[0022] 圖1是與馬氏珠母貝軟體部重和閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP298299標(biāo)記的擴(kuò)增電泳 圖，其中泳道1 _12為馬氏珠母貝樣品，M為marker。
【具體實(shí)施方式】：
[0023] 以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0024] 實(shí)施例1 :
[0025] 隨機(jī)取來自于同一群體的96個馬氏珠母貝個體，清洗干凈后，取其軟體部重稱 重，然后取其閉殼肌組織稱重并一一對應(yīng)記錄，取一小塊閉殼肌組織置于95%乙醇中， 于-20°C保存。使用HiPure Universal DNA Kit (廣州美基生物公司）對來自96個馬氏珠母 貝個體的閉殼肌的基因組DNA進(jìn)行提取，相關(guān)操作參見試劑盒說明書進(jìn)行。DNA提取后，于 I. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，紫外分光光度計(jì)測量DNA的濃度和純度，于-20°C 保存。
[0026] 與馬氏珠母貝軟體部重和閉殼肌重相關(guān)聯(lián)的SNP298299標(biāo)記的檢測引物為：
[0027] 298299FI:GGAATTCGTATCACTGTTTGAAGCAAGG ;
[0028] 298299RI:GGGAACACATCCCACATTTAACAATGTTA ;
[0029] 298299FO:TTGATAGCGGAATAGGCACATTCAATTT ；
[0030] 298299RO:TTAAAAGGCAAAGAAAACTTTGGCATCAG。
[0031] 用上述引物298299FI、298299RI、298299FO、298299RO對馬氏珠母貝樣品基因組 DNA在PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其PCR反應(yīng)體系為：25 μ L。PCR反應(yīng)體系如下：包含馬氏珠 母貝樣品基因組 DNA 50ng，2XPCRMixture 12.5yL，檢測引物 298299FI 2yL、298299RI 2yL、298299FO 0.5yL、298299R0 0.5yL(各引物濃度均為 10pmol/yL)，0.0625U Taq DNA酶（廣州東盛生物科技有限公司），余量為水；反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min ;94°C 40s， 56°C 40s ;72°C 40s，35 個循環(huán)；72°C延伸 5min。
[0032] PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖（廣州康龍科技生物公司）凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀 察電泳圖譜。分型電泳圖如圖1所示，當(dāng)出現(xiàn)具有202bp和236bp大小2條帶的為GT型 (泳道11);當(dāng)只出現(xiàn)202bp大小1條帶的為GG型（泳道2-10、12)。在這96個個體中，GG 型個體84個，軟體部重5. 37±2. 04g，肌肉重0. 87±0. 41g，GT型個體有12個，軟體部重 4. 0±1.69g，閉殼肌重0. 56±0. 32g。采用SPSS 17. 0軟件中的t-test檢驗(yàn)，GG型個體的 軟體部重和閉殼肌重顯著大于GT型個體（p〈0. 05)，即認(rèn)為它們之間具有極其顯著的統(tǒng)計(jì) 學(xué)差異。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種與馬氏珠母貝軟體部重和閉殼肌重顯著關(guān)聯(lián)的SNP298299標(biāo)記的檢測引物，其 特征在于，其核苷酸序列如下： 298299 FI:GGAATTCGTATCACTGTTTGAAGCAAGG ; 298299 RI:GGGAACACATCCCACATTTAACAATGTTA ; 298299 FO:TTGATAGCGGAATAGGCACATTCAATTT ； 298299 RO:TTAAAAGGCAAAGAAAACTTTGGCATCAG〇
2. -種與馬氏珠母貝軟體部重和閉殼肌重顯著關(guān)聯(lián)的SNP298299標(biāo)記，其特征在于， 其特異性檢測引物為： 298299 FI:GGAATTCGTATCACTGTTTGAAGCAAGG ; 298299 RI:GGGAACACATCCCACATTTAACAATGTTA ; 298299 FO:TTGATAGCGGAATAGGCACATTCAATTT ； 298299 RO:TTAAAAGGCAAAGAAAACTTTGGCATCAG〇
3. 權(quán)利要求2所述的與馬氏珠母貝軟體部重和閉殼肌重顯著關(guān)聯(lián)的SNP298299標(biāo)記在 鑒定馬氏珠母貝軟體部重和閉殼肌重大小中的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟： a、 提取馬氏珠母貝樣品基因組DNA ; b、 采用權(quán)利要求1所述的檢測引物298299?1、2982991?1、298299?0、2982991?0對馬氏珠 母貝樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； c、 根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對馬氏珠母貝樣品進(jìn)行鑒定，當(dāng)出現(xiàn)具有202bp和236bp大小2 條帶的為GT型；當(dāng)只出現(xiàn)202bp大小1條帶的為GG型；GG型個體的軟體部重和閉殼肌重 顯著大于GT型個體的樣品。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)體系 為：25yL。PCR反應(yīng)體系如下：包含馬氏珠母貝樣品基因組DNA 50ng，2XPCR Mixture 12. 5yL，濃度為10pmol/yL的權(quán)利要求1所述的檢測引物298299FI 2yL、298299RI 2yL、298299F0 0.5yL、298299R0 0.5yL，0.0625U Taq DNA 酶，余量為水；反應(yīng)條件為： 94°〇預(yù)變性51^11;94°0 4〇8,56°0 4〇8;72°0 4〇8,35個循環(huán)；72°0延伸51^11。
5. 權(quán)利要求2所述的與馬氏珠母貝軟體部重和閉殼肌重顯著關(guān)聯(lián)的SNP298299標(biāo)記在 馬氏珠母貝分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種與馬氏珠母貝軟體部重和閉殼肌重顯著關(guān)聯(lián)的SNP298299標(biāo)記及引物和應(yīng)用。引物包括:298299FI:GGAATTCGTATCACTGTTTGAAGCAAGG；298299RI:GGGAACACATCCCACATTTAACAATGTTA；298299FO:TTGATAGCGGAATAGGCACATTCAATTT；298299RO:TTAAAAGGCAAAGAAAACTTTGGCATCAG。利用本發(fā)明的引物能擴(kuò)增出兩種SNP基因型位點(diǎn)，再根據(jù)PCR電泳圖可直觀地比較個體間軟體部重和閉殼肌重的大小，可直接用于后續(xù)的分子標(biāo)記輔助育種。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104561305
【申請?zhí)枴緾N201410856451
【發(fā)明人】何毛賢, 李耀國
【申請人】中國科學(xué)院南海海洋研究所
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月31日