一種補(bǔ)料發(fā)酵提高β-聚蘋果酸產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用補(bǔ)料工藝提高出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)β-聚蘋果酸產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
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[0002]高分子材料至今已有四十年的研宄歷史，上世紀(jì)七十年代開始蓬勃發(fā)展，高分子材料的研宄無論是在科學(xué)上還是在實(shí)用價(jià)值上都有著非常重要的意義。隨著高分子材料的飛速發(fā)展，其重要性日益顯著的同時(shí)，它的不足之處也出現(xiàn)在人們的面前，大部分人工合成高分子材料在自然界中難以降解。在環(huán)境日益惡化的今天，人們開始關(guān)注高分子材料因不能分解而造成的環(huán)境污染問題。隨著環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，人們把材料的可降解性能的要求逐漸增加，現(xiàn)在對(duì)于我們正在使用或處于研發(fā)階段的產(chǎn)品把是否具備可生物降解性作為重要的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。為了解決上述難題，人們開始研宄并制造了各種可降解材料。
[0003]聚蘋果酸(PMLA)是一種水溶性脂肪族聚酯類化合物，主鏈上帶有酯基，可以在水環(huán)境下自發(fā)或發(fā)生酶促反應(yīng)而降解。因?yàn)榫哂羞@特殊的立體結(jié)構(gòu)，聚蘋果酸具備了一些優(yōu)良的性質(zhì)，其中包括:生物相容性、高度的水溶性、生物可吸收性、生物可降解性、可化學(xué)衍生性和無免疫原性等，聚蘋果酸及其衍生物作為一類新型的生物高分子材料而受到人們的高度重視。
[0004]生物法合成聚蘋果酸可以利用可再生的生物資源發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉，合成條件溫和，產(chǎn)物的分子量相對(duì)較高，從發(fā)酵液中提取純化步驟簡(jiǎn)單，通過甲醇或乙醇反復(fù)沉淀就可以得到聚蘋果酸鈣鹽。因此生物法合成具有很大優(yōu)勢(shì)，但其開發(fā)和應(yīng)用受到了高成本，低效率的制約，目前還沒有一個(gè)優(yōu)化的可以工業(yè)化生產(chǎn)的路線，只有少量的天然聚蘋果酸和人工合成聚蘋果酸可以提供。如果能夠提高天然聚蘋果酸的產(chǎn)量，降低其生產(chǎn)成本，其應(yīng)用領(lǐng)域?qū)?huì)得到進(jìn)一步開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0005]本發(fā)明的主要目的是提供一種補(bǔ)料工藝生產(chǎn)β -聚蘋果酸的新方法，該方法通過流加濃度為500g/L的葡萄糖控制發(fā)酵液殘?zhí)窃?g/L-7g/L，同時(shí)流加濃度為lg/L_5g/L的氨基酸溶液，所述氨基酸溶液包括天冬氨酸、組氨酸、亮氨酸、蘇氨酸中的至少一種，解決分批發(fā)酵中聚蘋果酸產(chǎn)率較低的問題，顯著提高β-聚蘋果酸的產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。
[0006]本發(fā)明提供的技術(shù)方案具體如下:
[0007]1.培養(yǎng)基的制備
[0008](I)活化培養(yǎng)基為土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):土豆200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L, pH自然，121 °C高壓蒸汽滅菌20min ；
[0009]種子培養(yǎng)基組成為:蔗糖140g/L、酵母膏3g/L、硫酸銨lg/L 丁二酸2g/L、玉米漿lg/L,K2CO30.4g/L,MgSO4.7Η20 0.1g/L、KH2PO41g/L、ZnSO4.7Η20 0.05g/L，其余為水 pH7.0。
[0010]發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:蔗糖100_200g/L、硝酸鈉6g/L、磷酸二氫鉀0.1-0.3g/L、氯化鉀0.5、硫酸錳0.05-0.lg/L、蛋白胨35g/L、七水合硫酸鎂0.3g/L、碳酸鈣20g/L。
[0011]2.CGMCC3336菌種活化:菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上，25°C活化培養(yǎng)3?5d ;
[0012]3.種子液制備:選取生長(zhǎng)良好的斜面種子用無菌生理鹽水洗下孢子，制備孢子濃度約16個(gè)/ml的孢子懸浮液，按10% (v/v)接種量接種至裝有10ml液體種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，25°C，200rpm條件下培養(yǎng)2?3d，制得種子液。
[0013]4.發(fā)酵罐發(fā)酵:將所得種子液以10% (v/v)的量接于1L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在控制PH6.0-7.0及溶解氧濃度60% -70%條件下，在含碳源、氮源、無機(jī)鹽及微量元素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)出芽短梗霉CGMCC N0.3336 ;初糖采用蔗糖，發(fā)酵36_48h開始流加補(bǔ)料溶液，通過流加500g/L的葡萄糖溶液使發(fā)酵液殘?zhí)蔷S持在4-7g/L，同時(shí)每隔兩小時(shí)補(bǔ)加濃度為l_5g/L的氨基酸溶液10mL，所述的氨基酸溶液包括天冬氨酸、亮氨酸、組氨酸、蘇氨酸中的至少一種，繼續(xù)發(fā)酵96-120h。
[0014]有益效果:
[0015]通過流加補(bǔ)料溶液提高了聚蘋果酸的發(fā)酵產(chǎn)率，發(fā)酵周期內(nèi)產(chǎn)物得率，降低了成本，將聚蘋果酸產(chǎn)量提高11-20%。
【具體實(shí)施方式】
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[0016]下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明中聚蘋果酸的生產(chǎn)方法。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0017]實(shí)施例1:連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸
[0018]按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸:
[0019]1.培養(yǎng)基的制備
[0020](I)活化培養(yǎng)基為:土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):土豆200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L, pH自然，121 °C高壓蒸汽滅菌20min ；
[0021]種子培養(yǎng)基組成為:蔗糖140g/L、酵母膏3g/L、硫酸銨lg/L 丁二酸2g/L、玉米漿 lg/L, K2CO30.4g/L、MgSO4.7H20 0.lg/L, KH2PO41 g/L, ZnSO4.7H20 0.05g/L，其余為水，pH7.0o
[0022]發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:蔗糖150g/L、硝酸鈉6g/L、磷酸二氫鉀0.2g/L、氯化鉀0.5、硫酸錳0.75g/L、蛋白胨35g/L、七水合硫酸鎂0.3g/L、碳酸鈣20g/L。
[0023]2.CGMCC3336菌種活化:菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上，25°C活化培養(yǎng)4d ；
[0024]3.種子液制備:選取生長(zhǎng)良好的斜面種子用無菌生理鹽水洗下孢子，制備孢子濃度約16個(gè)/ml的孢子懸浮液，按10(% v/v)接種量接種裝有10ml液體種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，25°C，200rpm條件下培養(yǎng)2d，制得種子液。
[0025]4.發(fā)酵罐發(fā)酵:將所得種子液以10% (v/v)的量接于裝有5L發(fā)酵液的1L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)初始轉(zhuǎn)速400r/min，通氣量1.0vvm，罐壓在0.01-0.1Mpa，容氧串聯(lián)攪拌控制DO在65%。初始蔗糖濃度150g/L，發(fā)酵周期為120h。發(fā)酵液中β _聚蘋果酸含量為40.81g/Lo
[0026]實(shí)施例2:補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸
[0027]1.培養(yǎng)基的制備:同實(shí)施例1
[0028]2.菌種活化:同實(shí)施例1
[0029]3.種子液制備:同實(shí)施例1
[0030]4.發(fā)酵罐發(fā)酵:將所得種子液以10% (v/v)的量接于裝有5L發(fā)酵液的1L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)初始轉(zhuǎn)速400r/min，通氣量1.0vvm，罐壓在0.01-0.1Mpa，容氧串聯(lián)攪拌控制DO在65%。
[0031]初始蔗糖濃度150g/L，發(fā)酵36h開始流加的補(bǔ)料溶液中葡萄糖濃度為500g/L，維持發(fā)酵液殘?zhí)窃?g/L-7g/L，每隔2小時(shí)流加一次濃度為1.7g/L的天冬氨酸溶液，每次流加10ml，繼續(xù)發(fā)酵112h。發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中聚蘋果酸含量為45.33g/L?
[0032]實(shí)施例3:補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸
[0033]1.培養(yǎng)基的制備:同實(shí)施例1
[0034]2.菌種活化:同實(shí)施例1
[0035]3.種子液制備:同實(shí)施例1
[0036]4.發(fā)酵罐發(fā)酵:將所得種子液以10% (v/v)的量接于裝有5L發(fā)酵液的1L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)初始轉(zhuǎn)速400r/min，通氣量1.0vvm，罐壓在0.01-0.1Mpa，容氧串聯(lián)攪拌控制DO在62%。
[0037]初始蔗糖濃度150g/L，發(fā)酵40h開始流加的補(bǔ)料溶液，其中流加的葡萄糖溶液濃度為500g/L，維持發(fā)酵液殘?zhí)窃?g/L-7g/L，每隔2小時(shí)流加一次濃度為lg/L的組氨酸溶液，每次流加10ml，繼續(xù)發(fā)酵112h。發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中聚蘋果酸含量為45.26g/L?
[0038]實(shí)施例4:補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸
[0039]1.培養(yǎng)基的制備:同實(shí)施例1
[0040]2.菌種活化:同實(shí)施例1
[0041]3.種子液制備:同實(shí)施例1
[0042]4.發(fā)酵罐發(fā)酵:將所得種子液以10% (v/v)的量接于裝有5L發(fā)酵液的1L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)初始轉(zhuǎn)速400r/min，通氣量1.0vvm，罐壓在0.01-0.1Mpa，容氧串聯(lián)攪拌控制DO在62%。
[0043]初始蔗糖濃度150g/L，發(fā)酵48h開始流加的補(bǔ)料溶液，其中流加的葡萄糖溶液濃度為500g/L，維持發(fā)酵液殘?zhí)窃?g/L-7g/L，每隔2小時(shí)流加一次蘇氨酸溶液濃度為2.5g/L，每次流加10ml，繼續(xù)發(fā)酵96h。發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中聚蘋果酸含量為46.03g/L?
[0044]實(shí)施例5:補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸
[0045]1.培養(yǎng)基的制備:同實(shí)施例1
[0046]2.菌種活化:同實(shí)施例1
[0047]3.種子液制備:同實(shí)施例1
[0048]4.發(fā)酵罐發(fā)酵:將所得種子液以10% (v/v)的量接于裝有5L發(fā)酵液的1L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)初始轉(zhuǎn)速400r/min，通氣量1.0vvm，罐壓在0.01-0.1Mpa，容氧串聯(lián)攪拌控制DO在62%。
[0049]初始蔗糖濃度150g/L，發(fā)酵48h開始流加的補(bǔ)料溶液，其中流加的葡萄糖溶液濃度為500g/L，維持發(fā)酵液殘?zhí)窃?g/L-7g/L，每隔2小時(shí)流加一次濃度為4.35g/L的亮氨酸溶液，每次流加10ml，繼續(xù)發(fā)酵112h。發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中聚蘋果酸含量為46.03g/L?
[0050]實(shí)施例6:補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸
[0051]1.培養(yǎng)基的制備:同實(shí)施例1
[0052]2.菌種活化:同實(shí)施例1
[0053]3.種子液制備:同實(shí)施例1
[0054]4.發(fā)酵罐發(fā)酵:將所得種子液以10% (v/v)的量接于裝有5L發(fā)酵液的1L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)初始轉(zhuǎn)速400r/min，通氣量1.0vvm，罐壓在0.01-0.1Mpa，容氧串聯(lián)攪拌控制DO在62%。
[0055]初始蔗糖濃度150g/L，發(fā)酵36h開始流加的補(bǔ)料溶液，其中流加的葡萄糖溶液濃度為500g/L，維持發(fā)酵液殘?zhí)窃?g/L-7g/L，每隔兩小時(shí)流加一次氨基酸溶液，每次10ml，所述氨基酸溶液含有濃度為4.35g/L的亮氨酸，2.5g/L的蘇氨酸，lg/L的組氨酸，1.7g/L的天冬氨酸，繼續(xù)發(fā)酵104h。發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中聚蘋果酸含量為49.78g/Lo
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸的方法，其特征在于，將生產(chǎn)菌種進(jìn)行種子培養(yǎng)后進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)階段，發(fā)酵培養(yǎng)36-48小時(shí)后開始流加補(bǔ)料溶液繼續(xù)發(fā)酵96-120h，通過流加濃度為500g/L的葡萄糖溶液使發(fā)酵液殘?zhí)蔷S持在4-7g/L，同時(shí)每隔兩小時(shí)補(bǔ)加濃度為l-5g/L的氨基酸溶液10mL。
2.如權(quán)利要求所述的一種補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)β-聚蘋果酸的方法，其特征在于，所述的氨基酸溶液包括天冬氨酸、亮氨酸、組氨酸、蘇氨酸中的至少一種。
3.如權(quán)利要求所述的一種補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)β-聚蘋果酸的方法，其特征在于，所述生產(chǎn)菌株為出芽短梗霉，編號(hào)CGMCC N0.3376。
4.如權(quán)利要求所述的一種補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)β-聚蘋果酸的方法，其特征在于，發(fā)酵階段具體如下: 將出芽短梗霉CGMCC N0.3336種子液以體積比10%的量接于1L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在控制ρΗ6.0-7.0及溶解氧濃度60% -70%條件下，發(fā)酵36_48h開始流加補(bǔ)料溶液，通過流加500g/L的葡萄糖溶液使發(fā)酵液殘?zhí)蔷S持在4-7g/L，同時(shí)每隔兩小時(shí)補(bǔ)加濃度為l-5g/L的氨基酸溶液10mL，所述的氨基酸溶液包括天冬氨酸、亮氨酸、組氨酸、蘇氨酸中的至少一種，繼續(xù)發(fā)酵96-120h。
【專利摘要】本發(fā)明公布了一種補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)β-聚蘋果酸的方法，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。所述的補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)方法將生產(chǎn)菌種進(jìn)行種子培養(yǎng)后進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)階段，發(fā)酵培養(yǎng)36-48小時(shí)后開始流加補(bǔ)料溶液繼續(xù)發(fā)酵96-120h，通過流加濃度為500g/L的葡萄糖溶液使發(fā)酵液殘?zhí)蔷S持在4-7g/L，同時(shí)每隔兩小時(shí)補(bǔ)加濃度為1-5g/L的氨基酸溶液10mL。上述方法能夠提高天然聚蘋果酸的產(chǎn)量，降低其生產(chǎn)成本，使β-聚蘋果酸產(chǎn)量提高11-20％。
【IPC分類】C12P7-62, C12R1-645
【公開號(hào)】CN104561143
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410833031
【發(fā)明人】喬長(zhǎng)晟, 范栩嘉, 郝華璇, 于世云
【申請(qǐng)人】天津北洋百川生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月29日