一種鎖核酸增敏的檢測mthfr基因c677t突變的探針及引物、試劑盒和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種鎖核酸增敏的檢測MTHFR基因C677T 突變的探針及引物、試劑盒和檢測方法，適用于人體MTHFR基因C67H多態(tài)性位點(diǎn)的定性檢 測。
【背景技術(shù)】：
[0002] 亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)是葉 酸代謝中的關(guān)鍵酶之一，可將還原型輔酶I(NADPH)相關(guān)的5, 10-亞甲基四氫葉酸還原為 5-甲基四氫葉酸。而5-甲基四氫葉酸是體內(nèi)轉(zhuǎn)移"碳基團(tuán)"，包括甲基（-CH3)，甲?；?(-CH0)、次甲基（-CH)等過程中起輔酶作用。MTHFR基因中C677T(SNPID:rsl801133)為該 基因影響功能的重要突變位點(diǎn)。研宄表明，C677T位點(diǎn)C變?yōu)門后，其編碼的丙氨酸被纈氨酸 替代，純合突變TT型MTHFR酶活性只有正常的30%，雜合突變CT型有正常酶活性的60%。 由于MTHFR酶活性的降低，導(dǎo)致了血液中5-甲基四氫葉酸的降低和同型半胱氨酸的堆積， 使得作為甲基供體的蛋氨酸合成障礙，最終引起DNA的甲基化水平異常，并會造成DNA鏈斷 裂、染色體重組改變和染色體分離異常。因此MTHFR基因C677T位點(diǎn)的突變與一些妊娠并 發(fā)癥有關(guān)，如胎兒神經(jīng)管缺陷（NTD)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，先兆子癇，胎盤剝離等有關(guān)。通過分析個 體MTHFR基因C67H位點(diǎn)的多態(tài)性，對提前采取預(yù)防措施，防止妊娠并發(fā)癥具有指導(dǎo)意義。
[0003] 國家衛(wèi)生計生委在2013年8月印發(fā)的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目目錄（2013年版）》 中就明確了MTHFR(C677T)基因檢測的醫(yī)學(xué)意義。
[0004] 目前檢測MTHFR基因C67H位點(diǎn)多態(tài)性的方法分為三類：傳統(tǒng)Sanger測序法，聚 合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（PCR-RFLP)、熒光定量PCR法（qPCR)，這三種方 法都是基于PCR技術(shù)。
[0005] 測序法：先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物設(shè)計時使得待檢的基因位點(diǎn)位于PCR產(chǎn)物 內(nèi)，然后純化PCR產(chǎn)物，再對其進(jìn)行測序，根據(jù)測序峰圖判讀基因型。優(yōu)點(diǎn)：結(jié)果準(zhǔn)確，測序 法是基因多態(tài)性位點(diǎn)檢測的金標(biāo)準(zhǔn)；缺點(diǎn)：成本較高，操作繁瑣，需要湊齊一批樣本才適合 開機(jī)檢測。
[0006] PCR-RFLP技術(shù)：先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有目的SNP位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物，然后對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切，電泳檢測酶切條帶，根據(jù)酶切條帶進(jìn)行判讀。優(yōu)點(diǎn)：成本低，結(jié)果比較直觀； 缺點(diǎn)：電泳檢測操作繁瑣，污染的風(fēng)險大。
[0007] qPCR法：qPCR的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，試驗(yàn)周期短，PCR產(chǎn)物無需進(jìn)行后續(xù)分析即可判 斷結(jié)果，因全過程在封閉的管內(nèi)進(jìn)行，減少了交叉污染。但是為了在一管qPCR中能同時區(qū) 分野生型、突變型和雜合型的基因多態(tài)性，在qPCR方法的引物和探針設(shè)計上衍生出不同的 策略；例如ARMS-PCR法：ARMS_PCR(amplificationrefractorymutationsystem)又叫等 位基因特異PCR，TaqDNA聚合酶缺少3' 一 5'外切酶活性，在一定條件下PCR引物3'末端 的錯配導(dǎo)致產(chǎn)物的急劇減少，針對不同的已知突變，分別設(shè)計突變引物、野生引物，2個引物 主要是3'末端堿基不同，通過qPCR方法直接達(dá)到區(qū)分突變型和野生型基因的目的。缺點(diǎn)： 區(qū)分基因不同等位位點(diǎn)只能通過引物序列3'末端的錯配設(shè)計，特異性并不能保證，容易出 現(xiàn)假陽性。
[0008] TaqMan-MGB雙探針法：常規(guī)的TaqMan探針一般長度在25個堿基，對于錯配的區(qū) 分能力不強(qiáng)。MGB(Minorgroovebinder)分子能結(jié)合到雜交雙鏈DNA的小溝中，在降低探 針長度的同時，仍然保證了DNA雜交雙鏈較高的退火溫度，因此3'端MGB分子修飾的探針檢 測點(diǎn)突變的特異性會增加。MGB探針較一般TaqMan探針Tm值高10°C以上，長度只需12-15 堿基即可。但是MGB分子只能修飾在探針的3'端。一條探針只能修飾一個MGB探針，在檢 測復(fù)雜的位點(diǎn)時，特異性還達(dá)不到完全區(qū)分突變和野生型的要求。
[0009] 而鎖核酸（LNA-LockedNucleicAcid，簡稱LNA)是一種類寡核苷酸衍生物，結(jié)構(gòu) 中含有一個或多個2'-0, 4'-C-亞甲基-D-呋喃核糖核酸單體，核糖的2'-0位和4'-C 位通過不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋，并連接成環(huán)形，這個環(huán) 形橋鎖定了呋喃糖C3'-內(nèi)型的N構(gòu)型，降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，增加了磷酸鹽骨架局部 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，由于LNA與DNA/RNA在結(jié)構(gòu)上具有相同的磷酸鹽骨架，故其對DNA、RNA有很 好的識別能力和強(qiáng)大的親和力。和MGB探針的作用類似，鎖核酸修飾的TaqMan探針在降低 了探針的長度時，還能保持探針和DNA模板形成的雜交體保持較高的融解溫度（Tm值），并 且由于LNA堿基可以在探針的任何位置進(jìn)行修飾，因此在特異性方面具有很大的靈活性。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0010] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種鎖核酸增敏的檢測MTHFR基因C677T突變的探 針。本發(fā)明的鎖核酸增敏的檢測MTHFR基因C677T突變的探針在合適的位置上進(jìn)行鎖核酸 修飾，以增加探針的特異性。
[0011] 本發(fā)明的鎖核酸增敏的檢測MTHFR基因C677T突變的探針，其特征在于，所述的探 針序列如下：
[0012] 突變探針MTHFR677T:5' -熒光基團(tuán)-CGGG+AG+T+CGAITT-淬滅基團(tuán)；
[0013] 野生探針MTHFR677C:5' -熒光基團(tuán)-CGGG+AG+C+CGAITT-淬滅基團(tuán)；
[0014] 其中" + "表示3'端的堿基為鎖核酸修飾堿基。
[0015] LNA修飾堿基不局限于上述三個堿基位置，但必須包括針對突變檢測的堿基。
[0016] 所述的鎖核酸修飾，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式I所示。
[0017]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鎖核酸增敏的檢測MTHFR基因 C677T突變的探針，其特征在于，所述的探針序列 如下： 突變探針MTHFR 677T :5' -熒光基團(tuán)-CGGG+AG+T+CGATTT-淬滅基團(tuán)； 野生探針MTHFR 677C :5' -熒光基團(tuán)-CGGG+AG+C+CGATTT-淬滅基團(tuán)； 其中" + "表示3'端的堿基為鎖核酸修飾堿基。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鎖核酸增敏的檢測MTHFR基因 C677T突變的探針，其特征在 于，所述的鎖核酸修飾，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式I所示：
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鎖核酸增敏的檢測MTHFR基因 C677T突變的探針，其特征在 于，所述的熒光基團(tuán)為FAM、TET、VIC、HEX或ROX中的一種；所述的淬滅基團(tuán)為能與熒光基 團(tuán)配套的TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3基團(tuán)中的一種。
4. 一種鎖核酸增敏的檢測MTHFR基因 C677T突變的引物，其特征在于，所述的引物其序 列如下： 上游引物 MTHFR 677F:5' -CCGAAGCAGGGAGCTTTG-3' ； 下游引物 MTHFR 677R: 5 ' -CGGTGCATGCCTTCACAA-3 '。
5. -種鎖核酸增敏的檢測MTHFR基因 C677T突變的檢測試劑盒，包括含Mg2 +的PCR反 應(yīng)緩沖液、dNTP混合物、Taq酶、ddH20、探針和引物，其特征在于，所述的探針為權(quán)利要求1 中所列的探針，所述的引物為權(quán)利要求4中所列的引物。
6. -種鎖核酸增敏的檢測MTHFR基因 C677T突變的檢測方法，其特征在于，包括以下步 驟： ⑴、提取待測的樣本基因組DNA ; (2)、采用權(quán)利要求1所列的探針和權(quán)利要求4所列的引物對步驟（1)得到的樣本基因 組DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，測出野生型探針的Ct值和突變型探針的Ct值；設(shè)定Ct值 在小于35個循環(huán)數(shù)為檢出陽性；則只有野生型探針檢出陽性的樣本為野生純合型CC ;只有 突變型探針檢出陽性的為突變純合型TT ;而野生型探針和突變型探針都檢出陽性的為CT 雜合子。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的鎖核酸增敏的檢測MTHFR基因 C677T突變的檢測方法，其特 征在于，所述的熒光PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增反應(yīng)體系為：含Mg2+的10XPCR反應(yīng)緩沖液2.0yL、 2. 4 μ L 25mM MgCl2溶液、2. 5mM 的 dNTP 混合液 1. 6 μ L、5U/ul Taq 酶 0· 1 μ L、10 ?IOOng 的DNA模板1 μ L、20 μ M權(quán)利要求3所列的引物各0. 5 μ L、10 μ M權(quán)利要求1所列的探針各 0· 5 μ L，ddH20 12. 7 μ L，共計 20 μ Lo
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的鎖核酸增敏的檢測MTHFR基因C677T突變的檢測方法，其特 征在于，所述的熒光PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增反應(yīng)條件優(yōu)選為：94°C 3分鐘變性和酶激活，94°C 30 秒變性，60°C 30秒退火，72°C 30分鐘延長，循環(huán)45次。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種鎖核酸增敏的檢測MTHFR基因C677T突變的探針及引物、試劑盒和檢測方法。本發(fā)明利用鎖核酸能靈活修飾TaqMan探針的特點(diǎn)，在檢測MTHFR基因C677T突變的探針的合適的位置上進(jìn)行鎖核酸修飾，以增加探針的特異性。采用上述鎖核酸增敏的檢測MTHFR基因C677T突變的探針和引物對步驟(1)得到的樣本基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，測出野生型探針的Ct值和突變型探針的Ct值；設(shè)定Ct值在小于35個循環(huán)數(shù)為檢出陽性；則只有野生型探針檢出陽性的樣本為野生純合型CC；只有突變型探針檢出陽性的為突變純合型TT；而野生型探針和突變型探針都檢出陽性的為CT雜合子。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104531852
【申請?zhí)枴緾N201410767859
【發(fā)明人】張亮, 尹愛華, 麥明琴, 馬健, 張彥
【申請人】廣東省婦幼保健院
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月12日