一種土壤抗生素污染的診斷方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于污染環(huán)境修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種土壤抗生素污染的診斷方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在二十世紀(jì)，抗生素可以說是醫(yī)藥界最偉大的發(fā)明之一?？股乇粡V泛用于人類、 畜禽業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖中各種疾病的防治。但絕大部分抗生素不能完全被機(jī)體吸收，以原形或 者代謝物形式經(jīng)由病人和畜禽的糞、尿排入環(huán)境，經(jīng)不同途徑對畜類食品、禽類食品、水產(chǎn) 品、水體和土壤造成了污染，進(jìn)而通過食物鏈危害人類健康。
[0003] 中國是世界上濫用抗生素最為嚴(yán)重的國家之一，抗生素一方面可以導(dǎo)致器官的損 傷，另一方面可以引起細(xì)菌的耐藥性增強(qiáng)，形成超級細(xì)菌，使人類無藥可醫(yī)，我國每年有8 萬人死于濫用抗生素。在眾多的抗生素中，四環(huán)素類和青霉素類抗生素是在世界范圍內(nèi)應(yīng) 用最為廣泛的抗生素。近年來，四環(huán)素和青霉素類抗生素的使用呈上升勢頭，導(dǎo)致其藥物 殘留問題日趨嚴(yán)重，排放到環(huán)境中的藥物及其潛在的影響也引起了越來越多的科學(xué)家的關(guān) 注。
[0004] 土壤是抗生素等污染物質(zhì)的最終歸宿地，大量抗生素的使用必將造成嚴(yán)重的抗生 素類土壤污染問題。隨著抗生素長期暴露于土壤環(huán)境中，抗生素對土壤環(huán)境中的動植物產(chǎn) 生毒性影響，土壤中的抗生素極易向植物體內(nèi)富集，并在食物鏈中經(jīng)生物富集、濃縮和傳 遞，對人類健康造成危害。綜上，控制和檢測抗生素的殘留，研宄抗生素污染的生態(tài)毒性效 應(yīng)是非常必要的。
[0005] 歐盟規(guī)定的環(huán)境中藥物安全的限量值為100yg?L'目前，抗生素殘留的檢測方 法主要包括高效液相色譜法、色譜/質(zhì)譜聯(lián)用測定法等，大多數(shù)的檢測方法具有一定可靠 性和較好的靈敏度，但是這些方法也存在一定的局限性，如費時，操作繁瑣，需要昂貴的儀 器，另外還會受到儀器檢測限的限制；還有一些快速的檢測方法，如微生物抑制法、酶聯(lián)免 疫法等，這些方法對實驗條件要求比較高，試劑容易受到污染；而且這些傳統(tǒng)的檢測方法只 能定量計算抗生素的濃度，而無法評估抗生素的生物毒性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種土壤抗生素污染的診斷方法，具有簡單、快速、成本低廉的優(yōu) 點。
[0007] 一種土壤抗生素污染的診斷方法，包括以下步驟：
[0008] (1)將肝細(xì)胞接種到一組抗生素濃度呈梯度分布的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間 后檢測培養(yǎng)基中肝細(xì)胞分泌的酶的活性；
[0009] (2)建立培養(yǎng)基中抗生素濃度與所述酶的活性之間的關(guān)系曲線；
[0010] (3)將肝細(xì)胞接種到含待測土壤浸提液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后檢測相 應(yīng)酶的活性，根據(jù)關(guān)系曲線計算得到待測土壤中抗生素的濃度；
[0011] 所述酶為乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶或丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。
[0012] 本發(fā)明對肝細(xì)胞培養(yǎng)基中抗生素濃度與所述酶的活性之間建立關(guān)系曲線，再根據(jù) 關(guān)系曲線計算得到待測土壤中抗生素的濃度，方法簡單快速；所述乳酸脫氫酶的活性指示 肝細(xì)胞膜的通透性，堿性磷酸酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性可以指示肝細(xì)胞的功能，本發(fā)明 通過檢測酶的活性，還可以評估抗生素的生物毒性。
[0013] 本發(fā)明中所述肝細(xì)胞為人體肝細(xì)胞HL-7702,采用人體肝細(xì)胞HL-7702的酶的活 性作為檢測抗生素的指標(biāo)，可以評估抗生素對人體的毒性。
[0014] 本發(fā)明中所述抗生素為四環(huán)素或青霉素，四環(huán)素和青霉素的應(yīng)用范圍最為廣泛， 更具代表性。
[0015] 本發(fā)明步驟（2)中采用線性回歸或一元二次方程擬合建立關(guān)系曲線，所述關(guān)系曲 線為：
【主權(quán)項】
1. 一種土壤抗生素污染的診斷方法，包括以下步驟： (1) 將肝細(xì)胞接種到一組抗生素濃度呈梯度分布的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后檢 測培養(yǎng)基中肝細(xì)胞分泌的酶的活性； (2) 建立培養(yǎng)基中抗生素濃度與所述酶的活性之間的關(guān)系曲線； (3) 將肝細(xì)胞接種到含待測土壤浸提液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后檢測相應(yīng)酶 的活性，根據(jù)關(guān)系曲線計算得到待測土壤中抗生素的濃度； 所述酶為乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶或丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤抗生素污染的診斷方法，其特征在于，所述肝細(xì)胞為人 體肝細(xì)胞HL-7702。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤抗生素污染的診斷方法，其特征在于，所述抗生素為四 環(huán)素或青霉素。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤抗生素污染的診斷方法，其特征在于，采用線性回歸或 一元二次方程擬合建立關(guān)系曲線。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的土壤抗生素污染的診斷方法，其特征在于，所述關(guān)系曲線為： y:= 0. 1258x !+146. 67, R2= 0. 9591,0 ^ y ^ 2500 ； y:= 0. 0002x 2+0. 9604, R2= 0. 8757,0 ^ y ^ 2500 ； y:= 0. 0091x 3+2. 685, R2= 0. 9677,0 ^ y ^ 500 ； y2= 0. 1009x !+69. 717, R2= 0. 8727,0 ^ y 2500 ； y2= 0. 0003x 2+0. 9681, R2= 0. 9135,0 ^ y2^ 2500 ； y2= 0? 0025x 3+3. 1936, R2= 0? 9552,0 彡 y 2彡 2500 ; 71為四環(huán)素的濃度，單位為青霉素的濃度，單位為乳酸脫 氫酶的活性，單位為U/L ;x2為堿性磷酸酶的活性，單位為Kim unit/100ml ;x 3為丙氨酸氨 基轉(zhuǎn)移酶的活性，單位為卡門氏單位；R2為相關(guān)系數(shù)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤抗生素污染的診斷方法，其特征在于，步驟（1)和（3)中 細(xì)胞培養(yǎng)時間為不少于4小時。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤抗生素污染的診斷方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為無 血清DMEM高糖培養(yǎng)基。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤抗生素污染的診斷方法，其特征在于，所述肝細(xì)胞的接 種密度為1 X 105?1 X 10 6個/ml。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤抗生素污染的診斷方法，其特征在于，所述肝細(xì)胞的培 養(yǎng)條件：溫度為37°C，C02體積濃度為5%。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤抗生素污染的診斷方法，其特征在于，所述土壤浸提液 稀釋50?100倍。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種土壤抗生素污染的診斷方法，包括以下步驟：(1)將肝細(xì)胞接種到一組抗生素濃度呈梯度分布的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后檢測培養(yǎng)基中肝細(xì)胞分泌的酶的活性；(2)建立培養(yǎng)基中抗生素濃度與所述酶的活性之間的關(guān)系曲線；(3)將肝細(xì)胞接種到含待測土壤浸提液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后檢測相應(yīng)酶的活性，根據(jù)關(guān)系曲線計算得到待測土壤中抗生素的濃度；所述酶為乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶或丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明具有靈敏、低廉和簡便的優(yōu)點，不僅能檢測土壤中抗生素的濃度，又能反映土壤中抗生素的生物毒性。
【IPC分類】C12Q1-42, C12Q1-32, C12Q1-52
【公開號】CN104531835
【申請?zhí)枴緾N201410764095
【發(fā)明人】楊肖娥, 劉娣, 盧玲麗, 馮英, 李廷強(qiáng)
【申請人】浙江大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月12日