含有標(biāo)記基因的菌落，將其接種到另一培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)3次挑取培養(yǎng)過(guò)程，直至達(dá)到純度要求；
[0037](6)基因表達(dá):經(jīng)過(guò)分離純化的工程菌置于發(fā)酵罐中培養(yǎng)，控制溫度為37°C，PH為6.8，從發(fā)酵罐流出液中即可提取，得到干擾素；
[0038](7)修飾:向反應(yīng)釜里加入分子量20000直鏈單甲氧基聚乙二醇、步驟(6)所得干擾素、50mmol/L磷酸鹽緩沖液，混合均勻，在溫度為25°C、PH為8.5、200r/min震蕩反應(yīng)4h，用30%的冰醋酸終止反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)0.45 μ m尼龍膜過(guò)濾、脫氣后，讓流動(dòng)相通過(guò)色譜柱，采用線性梯度洗脫和等度洗脫相結(jié)合的方法進(jìn)行提純，得修飾干擾素；
[0039](8)凍干:將樣品稀釋至lX106IU/ml，加入2%蔗糖、3%甘氨酸、0.5%吐溫-80，0.2%明膠作為保護(hù)劑，分裝至西林瓶中，每瓶1ml，放入凍干箱凍干，得產(chǎn)品。
[0040]其中，所述步驟⑵中，所述DNA聚合酶為TaqDNA聚合酶，關(guān)鍵的是，所述步驟
(2)中，所述緩沖液為lOmmol/L的磷酸緩沖液、50mmol/L的KCl、5mmol/L的二硫蘇糖醇、100 μ g/mL的牛血清白蛋白、0.5mmol/L的Mg2+的混合溶液，而且，所述步驟⑶中，所述保護(hù)劑中各物質(zhì)含量為2%蔗糖、3%甘氨酸、0.5%吐溫-80，0.2%明膠。
[0041]實(shí)施例2:
[0042]其余與所述實(shí)施例1相同，不同之處在于，所述步驟⑵中，所述DNA聚合酶體系為2.5U/50 μ L的DNA聚合酶體系，0.5 μ mo I/L合成DNA的引物，體系PH為7.8，。
[0043]實(shí)施例3:
[0044]其余與所述實(shí)施例1相同，不同之處在于，所述步驟⑵中，所述DNA聚合酶體系為2U/50yL的DNA聚合酶體系，0.3ymol/L合成DNA的引物，體系PH為7，所述步驟(2)中，所述緩沖液為30mmol/L的磷酸緩沖液、50mmol/L的KCl、5mmol/L的二硫蘇糖醇、100 μ g/mL的牛血清白蛋白、1.5mmol/L的Mg2+的混合溶液。
[0045]上述三個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)到的DNA聚合酶活性在0.8X108IU/mg以上，PCR擴(kuò)增效果明顯，經(jīng)過(guò)聚乙二醇氨基化學(xué)修飾后，單鏈聚乙二醇-干擾素含量和修飾率分別達(dá)到0.25mg/ml和36.63%,具有典型的聚乙二醇修飾蛋白的特性，體外抗原活性保留了天然抗原活性的15%，凍干后的干擾素，6個(gè)月后生物活性在1.0X108IU/mg以上。
[0046]經(jīng)實(shí)際應(yīng)用中可知，通過(guò)獲取目的基因、PCR擴(kuò)增、基因重組、轉(zhuǎn)化、分離純化、基因表達(dá)、修飾、凍干八大步驟完成病毒性肝炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工藝，能夠在短時(shí)間內(nèi)大量生產(chǎn)，用聚乙二醇修飾之后，延長(zhǎng)了干擾素的半衰期，提高了對(duì)肝炎病毒靶向性，并且抗原性弱，不會(huì)引起人體的免疫反應(yīng)，藥效好，固定化生產(chǎn)，穩(wěn)定性好，整個(gè)成產(chǎn)過(guò)程嚴(yán)格控制溫度和PH，得到的干擾素穩(wěn)定性好，可以有效進(jìn)行批量化生產(chǎn)，在PCR擴(kuò)增步驟中，PCR技術(shù)具有速度快，靈敏度高的特點(diǎn)，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行，擴(kuò)增精確，另外擴(kuò)增量大，所選DNA聚合酶為TaqDNA聚合酶，TaqDNA聚合酶耐熱性能好，保證DNA鏈在高溫條件下正常聚合，緩沖液中的100 μ g/mL牛血清白蛋白、二硫蘇糖醇具有很好的穩(wěn)定酶活性的作用，Mg2+是DNA聚合酶的激活劑，影響酶的活性和真實(shí)性，濃度在0.5mmol/L-2mmol/L之間時(shí)，酶的活性高，采用聚乙二醇對(duì)干擾素進(jìn)行氨基化修飾，增加了干擾素的分子量，穩(wěn)定性得到提高，減少藥物排泄，屏蔽了一些干擾素分子表面的抗原決定簇，減少免疫原性，降低體內(nèi)清除率，并減緩了蛋白酶的水解，延長(zhǎng)干擾素的半衰期，凍干步驟中加入2%蔗糖、3%甘氨酸、0.5%吐溫-80，0.2%明膠，有效的保證了干擾素的生物活性在1.4 X 108IU/mg以上，且在4°C、6個(gè)月的環(huán)境下仍具有良好的溫定性能。
[0047]以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種病毒性肝炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括如下步驟: (1)獲取目的基因:從病毒性肝炎患者體內(nèi)獲取效應(yīng)T細(xì)胞，在溫度為37°C，PH為7.0的條件下，用限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA進(jìn)行部分酶解，得到控制干擾素合成的目的基因，備用； (2)PCR擴(kuò)增:在微量離心管中，以步驟(I)中得到的lyg/mL目的基因?yàn)槟０錎NA,加入適量的緩沖液、4種dNTP混合物、0.5-2.5U/50 μ L的DNA聚合酶體系、一對(duì)0.1-0.5 ymol/L合成DNA的引物，體系PH為6.8-7.8，PCR擴(kuò)增包括如下基本反應(yīng)步驟: ①預(yù)變性:溫度92°C，反應(yīng)5min，使雙鏈DNA模板解離成為單鏈； ②變形:溫度92°C，反應(yīng)65s，使雙鏈DNA模板解離成為單鏈 ③復(fù)性:溫度55°C，反應(yīng)45s，引物與模板DNA單鏈互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合； ④延伸:溫度72°C，反應(yīng)5min，“模板-引物結(jié)合物”在DNA聚合酶作用 下，以脫氧核糖核苷為原料，以靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成新的DNA鏈。 ⑤重復(fù)“變性一復(fù)性一延伸”的循環(huán)25次，得到所需數(shù)量的目的基因； (3)基因重組:以質(zhì)粒作為運(yùn)載體，運(yùn)用步驟⑴中的限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒以及目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端，再經(jīng)過(guò)DNA聚合酶將步驟(2)中得到的擴(kuò)增后的目的基因?qū)胭|(zhì)?；蛑?，得重組質(zhì)粒； (4)轉(zhuǎn)化:將大腸桿菌懸浮于:TC的0.4mol/L氯化鈣溶液中，并加入步驟(3)中的重組質(zhì)粒，混合后放置約半小時(shí)，然后短暫升溫至42°C使細(xì)菌進(jìn)入熱休克狀態(tài)，加入富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基以進(jìn)行復(fù)蘇，使之處于感受態(tài)主動(dòng)攝取外源遺傳物質(zhì)。 (5)分離純化:在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)步驟(4)得到的大腸桿菌，挑取含有標(biāo)記基因的菌落，將其接種到另一培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)挑取培養(yǎng)過(guò)程，直至達(dá)到純度要求； (6)基因表達(dá):經(jīng)過(guò)分離純化的工程菌置于發(fā)酵罐中培養(yǎng)，控制溫度為37°C，PH為6.8，從發(fā)酵罐流出液中即可提取，得到干擾素； (7)修飾:向反應(yīng)釜里加入分子量20000直鏈單甲氧基聚乙二醇、步驟(6)所得干擾素、50mmol/L磷酸鹽緩沖液，混合均勻，在溫度為25°C、PH為8.5、200r/min震蕩反應(yīng)4h，用30%的冰醋酸終止反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)0.45 μπι尼龍膜過(guò)濾、脫氣后，讓流動(dòng)相通過(guò)色譜柱，采用線性梯度洗脫和等度洗脫相結(jié)合的方法進(jìn)行提純，得修飾干擾素； (8)凍干:將樣品稀釋至lX106IU/ml，加入2%蔗糖、3%甘氨酸、0.5%吐溫-80，0.2%明膠作為保護(hù)劑，分裝至西林瓶中，每瓶Iml，放入凍干箱凍干，得產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒性肝炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述步驟(2)中，所述DNA聚合酶為TaqDNA聚合酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒性肝炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述步驟⑵中，所述緩沖液為10-50mmol/L的磷酸緩沖液、50mmol/L的KCl、5mmol/L的二硫蘇糖醇、100 μ g/mL的牛血清白蛋白、0.5mmol/L-2mmol/L的Mg2+的混合溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒性肝炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述步驟(8)中，所述保護(hù)劑中各物質(zhì)含量為2%蔗糖、3%甘氨酸、0.5%吐溫-80，0.2%明膠。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種病毒性肝炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工藝，包括如下步驟：(1)獲取目的基因；(2)PCR擴(kuò)增：在微量離心管中,以步驟(1)中得到的1μg/mL目的基因?yàn)槟０錎NA，加入適量的緩沖液、4種dNTP混合物、0.5-2.5U/50μL的DNA聚合酶體系、一對(duì)0.1-0.5μmol/L合成DNA的引物,體系pH為6.8-7.8；(3)基因重組；(4)轉(zhuǎn)化；(5)分離純化；(6)基因表達(dá)；(7)修飾；(8)凍干，本發(fā)明的干擾素能夠在短時(shí)間內(nèi)大量生產(chǎn)，用聚乙二醇修飾之后，延長(zhǎng)了干擾素的半衰期，提高了對(duì)肝炎病毒靶向性，并且抗原性弱，不會(huì)引起人體的免疫反應(yīng)，藥效好，固定化生產(chǎn)，穩(wěn)定性好，適于推廣應(yīng)用。
【IPC分類】C07K14-555, C07K1-107, A61K38-21, A61P31-14, A61K47-48, A61P1-16, C12N15-70, A61P31-20
【公開號(hào)】CN104530213
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410681723
【發(fā)明人】肖大年, 張政, 余煉
【申請(qǐng)人】廣西大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年11月24日