專利名稱:傳染性脾腎壞死病毒Nest-PCR的檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種傳染性脾腎壞死病毒Nest-PCR的檢測方法。
背景技術(shù)：
i^MiWW^^i'MM (Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV) 屬于虹彩病毒科(Iridoviridae)細(xì)胞腫大病毒屬(Megalocytivirus) (Chinchar et al.， 2005)。何建國等Q001)測定了 ISKNV的全基因組序列(AF371960)，為首個(gè)被全基因組測定的腫大細(xì)胞病毒屬病毒。ISKNV基因組大小約為1101Λ，具有胞嘧啶5’端高度甲基化，含有IM個(gè)開放讀碼框(ORFs)，其中有35個(gè)ORFs與其他種類的虹彩病毒在蛋白組成上有較為顯著的同源性(He et al.，2001)。
ISKNV具有很強(qiáng)的傳染性和致病性，目前尚無有效控制措施和藥物，因此，建立有效的診斷系統(tǒng)，采取預(yù)防措施，消滅傳染源，切斷傳播途徑系當(dāng)務(wù)之急。
目前，通過組織學(xué)和電鏡觀察進(jìn)行檢測，但此法操作繁瑣，在其細(xì)胞腫大之前難以鑒定，而且檢測誤差較大，因?yàn)榧?xì)胞腫大也可能是由別的原因引起的。公開號為 CN101624636的發(fā)明公開了一種傳染性脾腎壞死病毒的LAMP-LFD檢測方法。該方法通過設(shè)計(jì)三對LAMP的引物BIP、FIP、B3、F3、LF、LB和一條探針FITC-Probe步驟，其中FIP為5， 端BIPO生物素標(biāo)記引物，F(xiàn)ITC-Probe為5，端FITC標(biāo)記探針，配制含三對引物和樣品模板的LAMP反應(yīng)體系，對LAMP反應(yīng)體系擴(kuò)增，用探針雜交然后用LFD檢測。該方法是將三對弓I 物在同一反應(yīng)體系同時(shí)擴(kuò)增，易產(chǎn)生引物二聚體，與目的基因不易分辨。而且LAMP方法也比較容易產(chǎn)生核酸污染，一旦開蓋容易形成氣溶膠污染(岳志芹等，2006)。
鄧敏等Q002)以真鯛虹彩病毒(ISKNV)核苷酸還原酶小亞基(RNRS)序列為模板設(shè)計(jì)了一對引物，建立了一種ISKNV PCR檢測方法。但由于只進(jìn)行一輪PCR，所有該方法檢測靈敏度較低，尤其是對患病早期的宿主的檢測，同時(shí)一輪PCR的方法特異性也相對較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供檢測傳染性脾腎壞死病毒Nest-PCR的引物，其序列為
外引物P1:TTACAGGATAGGGAAGCC
P2 :ATGTCTGCAATCTC AGGTGC
內(nèi)引物P3 :ATGCTGGGCGCAAAGTAGTAG
P4 :CGCGTCTACCTTAA TTTGCCC。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種傳染性脾腎壞死病毒Nest-PCR的檢測方法，包括如下步驟以染病的宿主脾腎總DNA或細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathogenic effect, CPE)完全的敏感細(xì)胞系總DNA為模板，以標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對照，用外引物Pl和P2先進(jìn)行一輪PCR，再以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，內(nèi)引物P3和P4再進(jìn)行一輪PCR，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。[0012]所述染病瀕死的宿主選自鱖魚、大口黑鱸或者美國紅魚；所述敏感細(xì)胞系為Grimt fin (GF)。
所述第一輪PCR的反應(yīng)體系為
DNA 模板 0. 5 μ 1，IOX 含 Mg2+ 的 PCR 緩沖液 2 μ 1，5pmol 的 dNTPs,所述引物 PU P2 各 15pmol, Taq DNA 聚合酶 IU，ddH20 補(bǔ)至 20 μ 1 ；
反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，46 57°C，優(yōu)選為50°C退火30s， 72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin，10°C保溫。
所述第二輪PCR的反應(yīng)體系為
第一輪PCR 產(chǎn)物 0. 5 μ 1，IOX 含 Mg2+ 的 PCR 緩沖液 2 μ 1，5pmol 的 dNTPs，所述引物 P3、P4 各 15pmol, Taq DNA 聚合酶 IU，ddH20 補(bǔ)至 20 μ 1 ；
反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性:3min，94°C變性308，50 601退火308，721延伸lmin， 30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin，10°C保溫。優(yōu)選的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性:3min，94°C變性30s， 55°C退火 30s，72°C延伸 lmin, 30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 lOmin，10°C保溫。
本發(fā)明所檢測的是傳染性脾腎壞死病毒主衣殼蛋白基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有引物PI、P2、P3和P4的傳染性脾腎壞死病毒Nest-PCR檢測試劑盒。所述試劑盒含包括Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTPs、標(biāo)準(zhǔn)品和(MH2O。
所述標(biāo)準(zhǔn)品是攜帶以PI、P2為引物擴(kuò)增得到的傳染性脾腎壞死病毒主衣殼蛋白基因片段的質(zhì)粒。
本發(fā)明提供的方法發(fā)明建立的ISKNV Nest-PCR檢測方法特異性強(qiáng)，與水生動(dòng)物皰疹病毒、彈狀病毒等無交叉反應(yīng)；靈敏度高，檢測限達(dá)到IO2個(gè)拷貝數(shù)，比普通PCR方法高 10 100倍；反應(yīng)時(shí)間短，3小時(shí)左右即可得到檢測結(jié)果，縮短了檢測時(shí)間，而且所需儀器設(shè)備較為常見，操作較為方便，簡單。


圖1不同退火溫度的第一輪PCR結(jié)果電泳圖。
圖2不同退火溫度的第二輪PCR結(jié)果電泳圖，CON 以ddH20為模板的陰性對照。
圖3染病瀕死鱖魚脾腎組織總DNA的Nest-PCR結(jié)果。A^ P1/P2為引物的第一輪PCR結(jié)果，1 以ddH20為模板的陰性對照，2 以DNA為模板擴(kuò)增目的基因；B 以P3/P4為引物的第二輪PCR結(jié)果，1 以ddH20為模板的陰性對照，2 4為一擴(kuò)產(chǎn)物為模板的擴(kuò)增結(jié)果。
圖4 一輪PCR的檢測極限，CON 以ddH20為模板的陰性對照，5 IO5拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品模板，4 1依次類推。
圖5兩輪PCR的檢測極限，陰性以ddH20為模板的陰性對照，9 IO9拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品模板，8 1依次類推。
圖6Nest_PCR交叉反應(yīng)檢測結(jié)果，陰性以ddH20為模板的陰性對照。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
實(shí)施例1
1) IOOmg染病瀕死鱖魚脾腎組織，懸浮Iml IXPBS,冰上勻漿。
2)8000rpm，低溫離心 lOmin。
3)上清放入離心管，加入500 μ 1 Tris飽和酚和500 μ 1氯仿:異戊醇(24 1)?；靹颉?br>4)12000rpm，lOmin。
5)吸上清。注意不要吸中間層和下層，以免混入蛋白質(zhì)污染。
6)加入十分之一體積NaAc，Iml無水乙醇，混勻，-20°C 30min。
7)12000rpm，lOmin。
8)棄上清，沉淀用70%乙醇洗兩次，每次12000rpm，5min。
9)室溫下，空氣中晾至半干，50 μ 1水融解。
10)_20°C 保存?zhèn)溆谩?br>實(shí)施例2
1) Iml CPE完全的GF細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融3次。
2)8000rpm，低溫離心 lOmin。
3)上清放入離心管，加入500 μ 1 Tris飽和酚和500 μ 1氯仿:異戊醇(24 1)?；靹颉?br>4)12000rpm，lOmin。
5)吸上清。注意不要吸中間層和下層，以免混入蛋白質(zhì)污染。
6)加入十分之一體積NaAc，Iml無水乙醇，混勻，-20°C 30min。
7)12000rpm，lOmin。
8)棄上清，沉淀用70%乙醇洗兩次，每次12000rpm，5min。
9)室溫下，空氣中晾至半干，50 μ 1水融解。
10)_20°C 保存?zhèn)溆谩?br>實(shí)施例3
1) IOOmg染病瀕死美國紅魚脾腎組織，懸浮Iml IXPBS,冰上勻漿。
2)8000rpm，低溫離心 lOmin。
3)上清放入離心管，加入500 μ 1 Tris飽和酚和500 μ 1氯仿:異戊醇(24 1)?；靹?。
4)12000rpm，lOmin。
5)吸上清。注意不要吸中間層和下層，以免混入蛋白質(zhì)污染。
6)加入十分之一體積NaAc，Iml無水乙醇，混勻，-20°C 30min。
7)12000rpm，lOmin。
8)棄上清，沉淀用70%乙醇洗兩次，每次12000rpm，5min。
9)室溫下，空氣中晾至半干，50 μ 1水融解。
10)_20°C 保存?zhèn)溆谩?br>實(shí)施例4[0065]Nest-PCR 的夕卜弓丨物 P 1 :5 ‘ TTACAGGATAGGGAAGCC 禾口 P2 5 ‘ ATGTCTGCAATCTCAGGTGC,內(nèi)弓丨物 P3 :5 ‘ ATGCTGGGCGCAAAGTAGTAG3，和 P4 5 ‘ CGCGTCTACCTTAATTTGCCC3’。
以制備的染病瀕死鱖魚的脾腎組織總DNA為模板，PCR體系為20 μ 1 =DNA模板 0. 5μ 1，含Mg2+的 10XPCR緩沖液2μ l，dNTP0. 5μ 1，引物(50pmol/y 1)各0. 3μ l，Taq DNA 聚合酶0. 5μ1，ddH20補(bǔ)足至20μ 1。反應(yīng)條件為94°C預(yù)處理:3min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)反應(yīng)包括 94°C 30s, (46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57) "C 30s, 72°C lmin，循環(huán)完成后，72°C充分延伸10min，10°C保溫。
取0.5μ 1第一輪PCR產(chǎn)物作為模板，使用內(nèi)引物P3/P4進(jìn)行Nest-PCR擴(kuò)增。內(nèi)引物擴(kuò)增時(shí)退火溫度設(shè)置為50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,600C 10個(gè)溫度，其他反應(yīng)體系與反應(yīng)條件與第一次擴(kuò)增相同。取5μ 1反應(yīng)液在0. 8%瓊脂糖凝膠上電泳觀察。
結(jié)果表明，第一輪PCR在46 57°C退火溫度范圍內(nèi)都可擴(kuò)增出1400bp左右的目的條帶，其中50°C條帶最明顯(圖1)，目的條帶通過測序確認(rèn)。因此優(yōu)選的外引物擴(kuò)增的退火溫度為50°C。第二輪PCR在50 60°C退火溫度范圍內(nèi)都可擴(kuò)增出600bp左右的目的條帶，其中51°C附近非特異性擴(kuò)增較明顯(圖2)，因此避開此溫度區(qū)域，優(yōu)選的內(nèi)引物擴(kuò)增的退火溫度為55°C。
實(shí)施例5
以染病瀕死的鱖魚脾腎組織總DNA為模板，以P1/P2為引物進(jìn)行第一輪PCR，退火溫度為^°C，其他反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實(shí)施例1。取5 μ 1反應(yīng)液在0. 8%瓊脂糖凝膠上電泳觀察，檢測到1400bp左右的條帶(圖3A)。取0. 5 μ 1第一輪PCR產(chǎn)物為模板，以Ρ3/ Ρ4為引物再進(jìn)行一輪PCR，退火溫度為55°C，其他反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實(shí)施例1。PCR結(jié)束后，取5μ 1反應(yīng)液在0. 8%瓊脂糖凝膠上電泳觀察，檢測到600bp左右的條帶(圖:3B)。 表明該瀕死的鱖魚感染了傳染性脾腎壞死病毒。
實(shí)施例6
1)以 TakaRa DNA Fragment Purification試劑盒對外引物 P1/P2PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。
2)將回收的目的基因與pGEM-T Easy Vector按摩爾比10 1混合，連接構(gòu)建組質(zhì)粒。連接體系(10 μ 1)如下[0074]10X ligation buffer1. 0μ 1[0075]pGEM-T Easy Vector1. 0μ 1[0076]PCR回收產(chǎn)物2. 0μ 1[0077]T4DNA連接酶1. 0μ 1[0078](MH2O5. 0μ 1[0079]充分混勻，16 °C過夜。[0080]3)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，具體步驟如下
①從_80°C取出DH5a感受態(tài)細(xì)胞，室溫迅速溶解后，立刻置于冰水上。
②取100 μ 1感受態(tài)細(xì)胞加于10 μ 1連接混合物中，輕輕吹吸混勻。
③靜置冰水浴中，約30min。
④42°C水浴熱擊90s，立刻放于冰上冷卻5min。[0085]⑤加900 μ 1 LB,置于 37°C溫浴 60min。
⑥在含氨芐青霉素(lOOyg/ml)的LB平板表面均勻涂抹40 μ IIPTG和40 μ 1 X-gal貯存液，置于37°C培養(yǎng)箱。
⑦將溫浴的感受態(tài)細(xì)胞，5000rpm離心3min，去上清，留約100 μ 1液體懸浮細(xì)菌， 均勻涂于LB/Amp/IPTG/X-gal平板上。
⑧37°C溫箱倒置培養(yǎng)過夜。
4)測序鑒定
將單個(gè)陽性重組菌株接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)液，37°C搖菌過夜，取1. Oml菌液于指管，密封，送上海生工測序檢測。若目的基因成功連接，則相應(yīng)陽性菌落搖菌過夜后， 以 TaKaRa MiniBESTPlasmid Purification Kit Ver 2. 0 試劑盒提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒命名為 PGEM-T-S，作為陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品備用。
實(shí)施例7
將陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品(1014copy/ml)以10倍倍比稀釋，分別以10°拷貝數(shù)、101、IO2、 IO3UO4UO5重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用P3/P4為引物，擴(kuò)增后取5μ 1反應(yīng)液在0. 8%瓊脂糖凝膠電泳觀察。
經(jīng)電泳檢測，結(jié)果如圖4所示。隨著模板稀釋倍數(shù)遞增PCR產(chǎn)物的量逐級遞減，模板稀釋到IO4個(gè)拷貝數(shù)，目的基因條帶很淺，模板稀釋到IO3拷貝數(shù)PCR擴(kuò)增結(jié)果則為陰性。
實(shí)施例8
將陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品以10倍倍比稀釋，分別以10°拷貝數(shù)、IO1UO2UO3UO4UO5UO^ IO7UO8UO9重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行Nest-PCR擴(kuò)增，取5μ 1反應(yīng)液在0. 8%瓊脂糖凝膠上電泳觀察。
經(jīng)電泳檢測，結(jié)果如圖5所示。隨著模板稀釋倍數(shù)遞增PCR產(chǎn)物的量逐級遞減，模板稀釋到IO2個(gè)拷貝數(shù)，PCR擴(kuò)增結(jié)果仍為陽性，模板稀釋到IO1拷貝數(shù)PCR擴(kuò)增結(jié)果則為陰性。由此可得出Nest-PCR擴(kuò)增能檢測出100個(gè)拷貝數(shù)的病毒粒子，表明Nest-PCR的檢測靈敏度比普通PCR方法高10 100倍。
實(shí)施例9
以中華鱉虹彩病毒(Soft-shelled turtle iridovirus，STIV)、流行性造血
(Epizootic haematopoietic necrosis virus, EHNV) > 1 |XM￠1 ^^f # (Tiger frog virus, TFV)、__f§[JBifilt§Jl(ifilSg__ (Viral Haemorrhagic Septicaemia virus，VHSV)、鯉春病毒(Springviraemia of carp virus, SVCV)、傳染性胰臟壞死病毒 (Infectiouspancreatic necrosis, IPNV)、牙Sf ^單狀病毒(hirame rhabdovirus, HRV) > 傳染性造血器官壞死病毒infectious haematopoietic necrosis, IHNV)、斑點(diǎn)叉尾鮰病毒(Channel catfish virus，CCV)、錦鯉皰疹病毒(Koi Herpesvirus，KHV)、傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleenand kidney necrosis virus, ISKNV)基因組為模板,進(jìn)行 Nest-PCR檢測，檢測方法同實(shí)施例5。
電泳觀察Nest-PCR擴(kuò)增的結(jié)果，除ISKNV外，其他病毒則無特異性條帶出現(xiàn)(圖 6)。說明這種Nest-PCR檢測方法可以特異性檢測ISKNV。
序列說明
SEQ ID NO. 1 4 分別是引物 P1、P2、P3 禾口 P4。
權(quán)利要求
1.傳染性脾腎壞死病毒Nest-PCR的引物，其序列為 外引物P1 :TTACAGGATAGGGAAGCCP2 :ATGTCTGCAATCTC AGGTGC 外引物P3 :ATGCTGGGCGCAAAGTAGTAGP4 :CGCGTCTACCTTAA TTTGCCC。
2.傳染性脾腎壞死病毒Nest-PCR的檢測方法，其特征在于，以細(xì)胞病變效應(yīng)完全的敏感細(xì)胞系總DNA為模板，以標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對照，用權(quán)利要求
1所述外引物先進(jìn)行一輪PCR，再以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，用權(quán)利要求
1所述內(nèi)引物再進(jìn)行一輪PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的檢測方法，其特征在于，所述敏感細(xì)胞系為Gruntfin。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的檢測方法，其特征在于，所述第一輪PCR的反應(yīng)體系為 DNA模板0. 5 μ 1，IOX含Mg2+的PCR緩沖液2 μ 1，5pmol的dNTPs,權(quán)利要求
1所述引物 P1、P2 各 15pmol，Taq DNA 聚合酶 IU，ddH20 補(bǔ)至 20 μ 1 ；反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，46 57°C退火30s，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，10°C保溫。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的檢測方法，其特征在于，所述第一輪PCR的反應(yīng)條件為94°C 預(yù)變性 3min, 94°C變性 30s, 50°C退火 30s, 72°C延伸 lmin, 30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin, 10°C 保溫。
6.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的檢測方法，其特征在于，所述第二輪PCR的反應(yīng)體系為 第一輪PCR產(chǎn)物0. 5 μ 1，IOX含Mg2+的PCR緩沖液2 μ 1，5pmol的dNTPs，權(quán)利要求
1所述引物 P3、P4 各 15pmol，Taq DNA 聚合酶 IU，ddH20 補(bǔ)至 20 μ 1 ；反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，50 60°C退火30s，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，10°C保溫。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的檢測方法，其特征在于，所述第二輪PCR的反應(yīng)條件為94°C 預(yù)變性 3min, 94°C變性 30s, 55°C退火 30s, 72°C延伸 lmin, 30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin, 10°C 保溫。
8.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的檢測方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)品為攜帶權(quán)利要求
1所述引物P1、P2的擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)粒。
9.含有權(quán)利要求
1所述引物的檢測試劑盒。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9所述的檢測試劑盒，其特征在于，還包括TaqDNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTPs、陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品和ddH20。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種傳染性脾腎壞死病毒Nest-PCR的檢測方法，該方法以染病的宿主脾腎或細(xì)胞病變效應(yīng)完全的敏感細(xì)胞系總DNA為模板，以標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對照，用外引物P1TTACAGGATAGGGAAGCC和P2ATGTCTGCAATCTCAGGTGC先進(jìn)行一輪PCR，再以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，用內(nèi)引物P3ATGCTGGGCGCAAAGTAGTAG 和P4CGCGTCTACCTTAATTTGCCC再進(jìn)行一輪PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。該方法檢測特異性強(qiáng)，靈敏度度高，而且檢測時(shí)間短，操作簡單。
文檔編號C12N15/11GKCN101956022 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201010256267
公開日2011年12月28日 申請日期2010年8月17日
發(fā)明者張旻, 江育林 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1),