專利名稱：:了哥王提取物、其制備方法及其在制備抗炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種了哥王提取物、其制備方法及其在制備藥物中的應(yīng)用，特別是涉及從植物了哥王中提取一種具有抗炎效果的化合物。技術(shù)背景困擾人們的日常炎性疾病包括，關(guān)節(jié)炎癥例如骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊椎炎、痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎等；炎性皮膚病例如濕疹、牛皮癬、皮炎等；炎性眼疾例如眼色素層炎、結(jié)膜炎等；肺部疾病例如哮喘、支氣管炎、急性呼吸窘迫綜合癥等；菌血癥、那毒素血癥、口瘡潰瘍、齦炎、胰腺炎等；胃腸道疾病例如節(jié)段性回腸炎、萎縮性胃炎、潰瘍性結(jié)腸炎、腹腔炎、消化性潰瘍、應(yīng)激性腸道綜合癥例如由幽門螺旋桿菌感染而引起的粘膜炎癥或者由非甾體類抗炎藥引起的腸胃病等等。有關(guān)各種炎癥致病作用的機理是已知體內(nèi)一氧化氮(N0)是介導(dǎo)細胞免疫和炎癥的毒性物質(zhì)。其前體是左旋精氨酸(L-arg)，L-arg在NO合成酶(N0S)的作用下生成N0。目前已經(jīng)分離出三種不同類型的NOS，包括內(nèi)皮NO合成酶(eN0S)，神經(jīng)元N0合成酶(nN0S)及誘導(dǎo)型NO合成酶(iN0S)。目前已知，巨噬細胞、肝細胞、平滑肌細胞、腺癌細胞以及上皮細胞均能表達iNOS。某些炎性細胞因子和微生物產(chǎn)物如脂多糖(LPS)則可誘導(dǎo)iNOS表達。iN0S—旦被誘導(dǎo)即可表達出高度活性，產(chǎn)生大量N0，進而導(dǎo)致細胞損傷，造成炎癥惡化，甚至導(dǎo)致癌癥。因此，長時間以來，人們致力于尋找N0合成酶的抑制劑來治療與之相關(guān)的炎性疾病。但這些抑制劑大多局限于化學(xué)合成的物質(zhì)，副作用較大。由于各種炎癥長期困擾人類的健康生活，有關(guān)的科學(xué)工作者始終不遺余力地試圖開發(fā)新型的療效確切、副作用少、研制成本低的抗炎活性化合物。加深對中草藥的研究可能是實現(xiàn)這個愿望的良好載體。了哥王(WikstroemiaindicaC.A.Mey)是分布在中國廣東、廣西、臺灣等地的瑞香科植物。很早就開始用于消腫、止痛、風(fēng)濕、腫瘤等。此植物治療慢性支氣管炎和癌的臨床效果已得到肯定。在《中藥大辭典》(上海人民出版社，1977年出版，51-53頁)記載了哥王生于山腳及山坡潮濕的灌叢中，該植物的莖、葉、根、果實均可入藥，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、止痛功效，治癰腫、風(fēng)濕痛、跌打損傷。在中國專利申請?zhí)枮?811403.9的"抗艾滋病新藥了哥王提取物的制備方法"專利中描述了提取了哥王中活性物質(zhì)的方法，但并沒有確認該活性物質(zhì)群的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化參數(shù)，從而不能清楚地了解到起作用的物質(zhì)性能，也就不能進一步的深入研究等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的一是是通過分析提取了哥王中的活性成分，來尋找可用于制備抗炎藥物的有效活性化合物。本發(fā)明的另一個目的是提供一種從了哥王植物中提取活性成分的方法。3[0010]本發(fā)明還提供了從了哥王中提取的化合物用于制備治療有關(guān)炎性疾病的藥物用途。OH在本發(fā)明中提供了從了哥王中提取的式(1)化合物。^f^(1),本發(fā)明從了哥王中提取活性式(1)化合物的方法包括如下步驟1)了哥王經(jīng)甲醇提取后的提取液減壓濃縮、干燥得到提取物；2)將提取物用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃?。?)將乙酸乙酯的萃取物經(jīng)層析柱用甲醇洗脫；4)對步驟3)收集到的洗脫液經(jīng)高壓液相色譜進一步分離精制，得到活性式(1)化合物。在上述提取方法中，減壓濃縮優(yōu)選在40攝氏度進行。在上述提取方法中，高壓液相色譜的流動相為甲醇水=30:70。本發(fā)明的另一個方面是提供式(1)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、對映體、外消旋體或互變異構(gòu)體在用于治療或預(yù)防需抑制N0生成活性的疾病的藥物制備中的用途。本發(fā)明的另一個方面是提供式(1)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、對映體、外消旋體、互變異構(gòu)體或生理官能衍生物在用于治療或預(yù)防炎性疾病的藥物制備中的用途。適宜的鹽包括與有機和無機酸或堿形成的鹽；藥學(xué)上可接受的鹽包括與下列酸形成的鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、草酸、富馬酸、馬來酸、丁酮二酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、苯磺酸、羥乙磺酸；藥學(xué)上可接受的堿式鹽包括銨鹽、堿金屬鹽、如鈉鹽和鉀鹽、堿土金屬鹽如鈣鹽和鎂鹽以及與有機堿如二環(huán)己基胺和N-甲基-D-葡糖胺形成的鹽。生理官能衍生物的實例包括酯、酰胺、氨基甲酸酯，優(yōu)選酯和酰胺。本發(fā)明的化合物還可有利地與第二種藥學(xué)活性物質(zhì)，尤其是可誘導(dǎo)的環(huán)氧酶(C0X-2)同工酶的選擇性抑制劑聯(lián)合用藥，具體地本發(fā)明提供的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、對映體、外消旋體或互變異構(gòu)體與C0X-2抑制劑聯(lián)合用藥以治療炎癥、炎性疾病以及與炎癥相關(guān)的疾病的用途。炎性疾病及臨床病癥包括關(guān)節(jié)疾病，特別是關(guān)節(jié)炎(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎)、或胃腸道疾病(如潰瘍性結(jié)腸炎、胃炎、以及其它感染引起的粘膜炎癥、由非甾體抗炎藥引起的腸病)、肺部疾病(如成人呼吸道窘迫癥、哮喘、囊纖維化、慢性阻塞性肺部疾病)、心臟病(如心肌炎)、神經(jīng)組織疾病(如多發(fā)性硬化病)、胰腺疾病(如糖尿病及并發(fā)癥)、腎疾病(如腎小球性腎炎)、皮膚病(如皮炎、牛皮癬、濕疹、蕁麻疹)、眼部疾病(如青光眼)、移植器官疾病(如排斥反應(yīng))、多器官疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡)及病毒和細菌感染后的炎性后遺癥。此外，本發(fā)明提供的化合物可以有助于預(yù)防或治療與HIV感染有關(guān)的淋巴細胞的丟失、增加放射治療期間腫瘤細胞的放射性敏感性、降低腫瘤的生長、腫瘤發(fā)展、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移。本發(fā)明提供的化合物還可以用于制備保健食品、飲料、或飼料等。在本發(fā)明中提供的提取了哥王中活性化合物的方法簡單實用，所提取的活性化合4物結(jié)構(gòu)明確，并具有確切的NO抑制生成活性，達到抗炎的作用，沒有細胞毒性。具體實施方式實施例1:提取物的制備與化合物結(jié)構(gòu)的確定將2.3kg的了哥王的莖或全草粉碎，加入80X甲醇(甲醇水=8:2)10升，提取三次，在4(TC減壓濃縮干燥，得到286g提取物。把全部的提取物溶解于2升水中，依次用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇各2升分3次萃取，這些萃取液在4(TC下減壓濃縮干燥，得到正己烷萃取物6.5g、乙酸乙酯萃取物62.Og、正丁醇萃取物25.Og。對各種萃取物進行NO生成抑制活性實驗(參照實施例2)，在供試品濃度為100iig/ml的條件下，正己烷萃取物(76.1%)、乙酸乙酯萃取物(86.9%)、丁醇萃取物(6.45%)，NO生成抑制率得到肯定；全部萃取物在MTT細胞毒性實驗中都被認定沒有細胞毒性。取活性最強的乙酸乙酯萃取物62g，用S印hadexLH-20層析柱(6.5X35cm)進行分離，依次用30%甲醇、70%的甲醇、甲醇洗脫，401:下減壓濃縮干燥，得出四個洗脫餾分fr.1(6.9g)、fr.2(14.7g)、fr.3(12.lg)、fr.4(2.7g)。對這些萃取物再次進行NO生成抑制實驗，NO生成抑制率為fr.1(22.6%)、fr.2(89.7%)、fr.3(58.6%)、fr.4(89.7%)。取萃取物fr.2，用silica層析柱(wakogelC_300、2.2X22cm)進行分離，用氯仿甲醇(100:0-0:100)洗脫，40。C下減壓濃縮干燥，得ll個(fr.2-1至fr.2-11)洗脫餾分。取fr.2-3(1.lg)，用CHP-20層析柱(4X48cm)進行分離，依次用30%甲醇、50%甲醇、70%的甲醇、甲醇洗脫，得四個餾分fr.2-3-A(0.12g)、fr.2-3-B(0.65g)、fr.2-3-C(0.03g)、fr.2-3-D(0.07g)。用反相的HPLC對fr.2-3-C進行精制，層析柱預(yù)CGuardparkODS-AL、流動相H20-甲醇(30:70)、流速4ml/min、測定波長254nm，收集保留時間為6.4分鐘的峰，4(TC下減壓濃縮干燥，得化合物(1)〔3.5mg〕。經(jīng)確定結(jié)構(gòu)后發(fā)現(xiàn)未見文獻記載。實施例2:確定理化參數(shù)及化合物的結(jié)構(gòu)式(1)化合物的性狀見表1/H和13C_NMR的數(shù)據(jù)見表2。并由以上數(shù)據(jù)最終確定了化合物的結(jié)構(gòu)式。表1:化合物1性狀白色油狀HR-EI-MS(m/z)計算值232.1463232.1464分子量2325<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2化合物(1)的^和13C-NMR光譜數(shù)據(jù)(500MHz,CDC13)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>[0040]S:—重線、d:二重線、t:三重線、m:多重線(1)化合物的結(jié)構(gòu)式確定如下m實施例3:抑制N0生成的活性試驗由于干擾素r以及脂多糖剌激而產(chǎn)生的巨噬細胞對NO生成的阻礙效果(抑制NO生成的效果)通過下面的實驗方法求得。并且根據(jù)阻礙效果的IC50(ym)來評價N0生成的抑制效果。[0045]所用材料RAW264.7細胞(大日本制藥)N-l-鹽酸萘乙二胺(lg和光純藥)磺胺(500g和光純藥)Ham，sF12培養(yǎng)基(SIGMAN488500mL)IFN_y(Geneyme/Techne100lig)脂多糖(LPS,055:B510mg，Sigma)磷酸(500ml和光純藥)DMS0(500ml和光純藥)96孔微滴定板(50/盒住友電木，商品名〔8096R〕)NO生成抑制活性的試驗方法將RAW264.7細胞(2盤)放入50mlFalcon軟管中。用離心機(1000rpm，3min，4°C)使細胞沉淀，用移液器將上清除去。加入新鮮培養(yǎng)基10ml，使之懸濁。濃度調(diào)整為1.5X105個/ml，以每孔200iiL的標準分別注入到96孔板(住友電工8096R)，將細胞在C(V恒溫箱中培養(yǎng)1-2小時后。加入LPS(10iig/Ml，Sigma，055:B5)2yL，鼠INF-y(33ng/mL，Genzyme)2yL，樣品0.4yL。在C02恒溫箱中培養(yǎng)16小時。最終濃度為INF-y0.33ng/ml、LPS100ng/ml。樣品溶解于匿SO，匿SO相對培養(yǎng)基的含量調(diào)整為0.2%。取培養(yǎng)上清100yL，加入0.1%萘二胺溶液50iiL、對氨基苯磺酰胺溶液50iiL，室溫中避光放置10分鐘。用分光光度計測定570nm(對照655nm)的吸光度0.D.。STD使用亞硝酸鈉溶液(100，50，20，10，5，2，1，Oum)。對細胞成活率，進行鏡檢觀察和MTT實驗。細胞毒性通過MTT法、由鏡檢確定。MTT法是已知的常規(guī)方法。S卩，于96孔微滴定板，每孔200iU細胞濃度為1.0Xl()5細胞/ml，添加不同濃度的提取物或單體組分，將細胞培養(yǎng)16小時，加入MTT試劑，再培養(yǎng)4小時。棄上清，添加150iiLDMSO，將生成的甲臜(formazane)完全溶解，測定570nm下的吸光度。活性評價7[0059]計算出N02—的量，代入下面的公式求出抑制效果抑制效果(％)={1-(X-Y)/(Z_Y)}X100X:在實驗化合物存在下，由IFN-Y和LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的N02—的量，Y;在實驗化合物、IFN-Y和LPS均不存在的情況下，誘導(dǎo)產(chǎn)生的N02—的量，Z:IFN-Y禾PLPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的N02—的量?；衔?1)的NO生成抑制效果的IC5。如下所示IC50(iiM)19.3實施例4:制備藥物劑型化合物(1)或其藥學(xué)上可接受的鹽、對映體、外消旋體、互變異構(gòu)體或生理官能衍生物單獨給藥時，優(yōu)選以藥用制劑提供，該制劑包括當化合物(1)或其藥學(xué)上可接受的鹽、對映體、外消旋體、互變異構(gòu)體或生理官能衍生物、其藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑以及可任選的一種或多種其它的治療成份。所述制劑包括口服給藥制劑、胃腸外給藥制劑(包括皮內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、靜脈注射以及關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射)、吸入制劑(包括由不同劑量的加壓氣霧器、噴霧器、吹入器中產(chǎn)生的微粒粉劑或霧劑)、直腸和局部給藥制劑(包括皮膚給藥、口腔給藥、舌下給藥、眼內(nèi)給藥)。最適合的給藥途徑取決于用藥患者的狀況和疾病。制劑通常以單位劑型提供，并且可以通過藥學(xué)領(lǐng)域中已知的任何方法進行制備。所有的方法都包括將活性成份與載體混合的步驟，載體由一個或多個輔助成分構(gòu)成。通常情況下通過使活性成分與液體或精細固體載體或兩者均勻緊密結(jié)合，隨后根據(jù)需要將所述產(chǎn)物制成制劑；適宜口服給藥的本發(fā)明制劑可以以獨立的單位如膠囊劑、扁囊劑或片劑提供，而每單位含有預(yù)定量的活性成分；散劑或顆粒劑；水溶性液體或懸浮液；或水包油型乳劑或油包水型乳劑；也可以是大丸劑、藥糖劑或糊劑。通過任選與一種或多種輔助成分一起壓片或塑型可以制備片劑；通過在適當?shù)臋C器上壓制自由流動形式如粉末或顆粒(任選與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、表面活性劑或分散劑混合)中的活性組分可以制備壓制片劑；所述片劑可任選為包衣或壓痕的，并且配成制劑以提供活性成分的緩釋或控釋。胃腸外給藥的制劑包括水性和非水性無菌注射液，該注射液可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抗菌劑及使制劑與患者血液等張的溶質(zhì)，水性和非水性的無菌懸浮液，該懸浮液可以含有懸浮劑和增稠劑；所述制劑可以以單位劑量或多劑量包裝，例如用密封的安瓿管和管制瓶提供；并且可以在冷凍干燥的條件下儲存，自使用前僅需提供無菌的液體載體如鹽水或注射用水；可以用散劑、顆粒劑及前面描述的各種片劑制備臨時注射溶液和懸浮液。直腸給藥的制劑可用常見的載體(如可可脂或聚乙二醇)的栓劑形式提供。用于口腔的局部給藥的制劑(如口腔含化劑或舌下給藥劑)，包括在調(diào)味基質(zhì)(如蔗糖、阿拉伯糖)中的活性成份的錠劑?？梢岳斫?，除上面特別提到的成分外，本發(fā)明的制劑還包括本領(lǐng)域相關(guān)制劑類型8的其它常規(guī)成分，例如適于口服給藥的調(diào)味劑等。①將從了哥王提取的化合物(1)10g與玉米淀粉40g混合，加水制成軟材，過12目篩造粒、干燥，得到顆粒劑，在本顆粒劑中每500mg中含化合物(1)100mg。②將從了哥王提取的化合物(1)40g與乳糖100g、硬脂酸鎂10g混合，以每600mg填充腸溶膠囊，本腸溶膠囊劑中，每個膠囊含化合物(1)160mg。③將從了哥王提取的化合物(1)25g以普通的注射劑制造法，用加熱至60攝氏度的注射用蒸餾水1000ml溶解，用NaCL調(diào)解等張，封入安瓿瓶。本注射液10ml中含有化合物(1)250mg。實施例5、制備食品本發(fā)明提供的化合物(1)也可以以食品的形式提供，優(yōu)選的食品形式包括粉末、顆粒、糊劑、膠狀物等，顆粒形式可以添加糖(如乳糖)來增加甜味；也可以制備成飲料的形式；這些食物或飲料除了哥王提取物外，還可以加入維生素、無機元素，如鈣、醇類、去味劑，如多酚。這些食物包括特殊的健康食品、醫(yī)用食品等種類。9權(quán)利要求一種從了哥王中提取的式(1)化合物F2004800437624C00011.tif2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物在制備治療或預(yù)防與NO合成酶有關(guān)的炎性疾病的藥物中的用途。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述化合物可與C0X-2的選擇性抑制劑聯(lián)合用于制備治療或預(yù)防與NO合成酶有關(guān)的炎性疾病的藥物的用途。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物在制備保健食品、飲料或飼料中的用途。5.—種從了哥王中提取由式(1)表示的活性化合物的方法，包括如下步驟1)了哥王經(jīng)甲醇提取后的提取液減壓濃縮、干燥得到提取物；2)將提取物用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃??；3)將乙酸乙酯的萃取物經(jīng)層析柱用甲醇洗脫；4)對步驟3)收集到的洗脫液經(jīng)高壓液相色譜進一步分離精制，得到活性化合物("。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于減壓濃縮在40攝氏度進行。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述高壓液相色譜的流動相的組成比為甲醇水=30:70。專利摘要本發(fā)明涉及一種了哥王提取物、其制備方法及其在制備藥物中的應(yīng)用，提取的化合物的結(jié)構(gòu)式為文檔編號A61P19/02GKCN101014560B發(fā)布類型授權(quán)專利申請?zhí)朇N200480043762公開日2010年4月28日申請日期2004年8月6日發(fā)明者北中進,王立巖申請人:學(xué)校法人日本大學(xué);王立導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan專利引用(1),非專利引用(2),