本技術(shù)涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及基于氨基酸衰減子的生物傳感器及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、氨基酸及其前體化合物作為生物體內(nèi)重要的代謝中間體和蛋白質(zhì)合成的基本單元，在生物合成、代謝工程、藥物開發(fā)以及食品工業(yè)等多個領(lǐng)域中占據(jù)著關(guān)鍵地位。隨著合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)的飛速發(fā)展，對氨基酸及其前體化合物的精準(zhǔn)檢測、高效篩選以及動態(tài)調(diào)控的需求日益增長。氨基酸生物傳感器作為一種能夠特異性識別并響應(yīng)氨基酸濃度變化的生物分子工具，在功能元件篩選、代謝途徑調(diào)控、工業(yè)生產(chǎn)菌株篩選等方面展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力，近年來受到了廣泛關(guān)注。目前，基于不同設(shè)計原理的氨基酸生物傳感器層出不窮，主要包括基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、核糖體開關(guān)、以及代謝途徑中間體感應(yīng)等機制的傳感器。其中，基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的生物傳感器因其對氨基酸種類響應(yīng)的廣泛性、性能的優(yōu)越性以及易于進一步改造的特點，成為了應(yīng)用最為廣泛的一類。然而，這類傳感器在氨基酸響應(yīng)特異性上存在不足，容易在篩選過程中產(chǎn)生假陽性結(jié)果，限制了其應(yīng)用精度。相比之下，基于核糖體開關(guān)的生物傳感器在響應(yīng)靈敏度和特異性上表現(xiàn)更佳，但其動態(tài)范圍和操作范圍相對較小，難以在復(fù)雜的代謝途徑動態(tài)調(diào)控中發(fā)揮全面作用。因此，開發(fā)具有高靈敏度、高特異性、寬動態(tài)范圍以及良好操作性的氨基酸生物傳感器成為了當(dāng)前研究的重要方向。

2、盡管氨基酸生物傳感器在多個領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用前景，但目前仍面臨諸多問題和挑戰(zhàn)。首先，氨基酸種類覆蓋不全：盡管已有針對大多數(shù)蛋白質(zhì)氨基酸的生物傳感器報道，但針對全部20種天然氨基酸的生物傳感器尚未完全成熟。特別是針對l-天冬氨酸、l-蘇氨酸、l-脯氨酸等重要氨基酸的生物傳感器尚待開發(fā)，這在一定程度上影響了相關(guān)氨基酸高產(chǎn)菌株的篩選效率。其次，性能提升需求迫切，現(xiàn)有氨基酸生物傳感器在靈敏度、特異性、動態(tài)范圍等方面的性能仍存在局限。特別是在工業(yè)菌株中，由于細胞內(nèi)代謝環(huán)境的復(fù)雜性，傳感器的響應(yīng)容易飽和，導(dǎo)致檢測精度下降，限制了其在工業(yè)應(yīng)用中的可靠性。因此，構(gòu)建更具專一性的生物傳感器，并通過提高其綜合性能來提升其在工業(yè)應(yīng)用中的可靠性成為了亟待解決的問題。再次，報告基因選擇與應(yīng)用場景受限，傳統(tǒng)的氨基酸生物傳感器多采用熒光蛋白或參與顯色反應(yīng)的酶等作為報告基因，這些報告基因的翻譯水平信號輸出在氨基酸響應(yīng)過程中存在偏差，且易受菌株生長情況等因素的影響。此外，傳統(tǒng)傳感器大多選擇在體內(nèi)進行氨基酸感應(yīng)，應(yīng)用場景受限，難以滿足多樣化的檢測需求。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有氨基酸生物傳感器存在的問題與挑戰(zhàn)，本技術(shù)提出了一種基于大腸桿菌氨基酸調(diào)控反饋抑制機制衰減子的新型氨基酸生物傳感器。大腸桿菌作為模式生物，其氨基酸調(diào)控反饋抑制機制主要依托于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和衰減子兩種機制。其中，衰減子通過原核生物翻譯和轉(zhuǎn)錄的偶聯(lián)作用，在rna聚合酶轉(zhuǎn)錄mrna的過程中，利用核糖體對衰減子前導(dǎo)肽的翻譯情況來調(diào)控下游結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。

2、本技術(shù)通過改造大腸桿菌衰減子機制，實現(xiàn)了對20種天然氨基酸的特異性響應(yīng)。具體而言，將天然衰減子中目標(biāo)氨基酸的密碼子序列更改為其他氨基酸的密碼子序列，使得該系統(tǒng)能夠響應(yīng)全部20種天然氨基酸的濃度變化。同時，本技術(shù)選擇rna適配體作為報告基因，將信號輸出限制在轉(zhuǎn)錄水平，減少了氨基酸濃度對翻譯水平信號輸出的干擾。特別地，本技術(shù)利用了一種名為3wjdb的高親和力核糖核苷酸適配體，該適配體能夠以納摩爾親和力結(jié)合一種熒光團衍生物dfhbi-1t，并在結(jié)合時發(fā)出綠色熒光。通過設(shè)計4個3wjdb單元重復(fù)的3wjdb-iv作為報告基因，進一步增強了信號輸出。

3、此外，本技術(shù)還利用無細胞系反應(yīng)體系建立了體外轉(zhuǎn)錄翻譯平臺，提高了氨基酸生物傳感器的靈敏度并擴大了其應(yīng)用范圍。這一創(chuàng)新性的設(shè)計不僅克服了傳統(tǒng)氨基酸生物傳感器在氨基酸種類覆蓋、性能提升以及報告基因選擇與應(yīng)用場景受限等方面的問題，還為氨基酸及其前體化合物的精準(zhǔn)檢測、高效篩選以及動態(tài)調(diào)控提供了新的技術(shù)手段。

4、本技術(shù)的第一方面在于提供一種氨基酸傳感器。

5、該氨基酸傳感器包括依次連接的組成型啟動子，大腸桿菌天然轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件氨基酸衰減子的編碼基因，報告基因和終止子；

6、進一步地，所述組成型啟動子是trc啟動子；

7、更進一步地，所述組成型啟動子trc啟動子的核酸序列，如seq?id?no?.2所示；

8、進一步地，所述報告基因是熒光核酸適配體編碼基因；

9、更進一步地，所述熒光核酸適配體編碼基因包括維持dfhbi-1t熒光的3wjdb編碼基因和3wjdb-iv編碼基因；

10、具體地，所述3wjdb如seq?id?no?.3所示，3wjdb-iv編碼基因的核酸序列如seq?idno?.4所示;

11、進一步地，所述終止子是rrnb?t1終止子;

12、更進一步地，所述rrnb?t1終止子的核酸序列如seq?id?no?.5所示。

13、在一些具體的實施方案中，氨基酸衰減子的編碼基因的核酸序列包括seq?idno.1所示的序列，以用于檢測組氨酸；

14、在另一些具體的實施方案中，(1)?將所述seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為亮氨酸的密碼子cttcttcttctt用于檢測亮氨酸；

15、(2)?將如入序列表中seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為精氨酸的密碼子cgtcgtcgtcgt用于檢測精氨酸；

16、(3)?將所述seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為甲硫氨酸的密碼子atgatgatgatg用于檢測甲硫氨酸；

17、(4)?將所述seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為異亮氨酸的密碼子atcatcatcatc用于檢測異亮氨酸；

18、(5)?將所述seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為天冬氨酸的密碼子gacgacgacgac用于檢測天冬氨酸；

19、(6)?將所述seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為谷氨酸的密碼子gaggaggaggag用于檢測谷氨酸；

20、(7)?將所述seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為天冬酰胺的密碼子aataataataat用于檢測天冬酰胺；

21、(8)?將所述seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為苯丙氨酸的密碼子ttcttcttcttc用于檢測苯丙氨酸；

22、(9)?將所述seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為丙氨酸的密碼子gctgctgctgct用于檢測丙氨酸；

23、(10)?將所述seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為色氨酸的密碼子tggtggtggtgg用于檢測色氨酸；

24、(11)?將所述seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為谷氨酰胺的密碼子caacaacaacaa用于檢測谷氨酰胺；

25、(12)?將所述seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為酪氨酸的密碼子tactactactac用于檢測酪氨酸；

26、(13)?將所述seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為甘氨酸的密碼子gggggggggggg用于檢測甘氨酸；

27、(14)?將所述seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為纈氨酸的密碼子gtagtagtagta用于檢測纈氨酸；

28、(15)?將所述seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為賴氨酸的密碼子aagaagaagaag用于檢測賴氨酸；

29、(16)?將所述seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為絲氨酸的密碼子agtagtagtagt用于檢測絲氨酸；

30、(17)?將所述seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為蘇氨酸的密碼子actactactact用于檢測蘇氨酸；

31、(18)?將所述seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為脯氨酸的密碼子ccaccaccacca用于檢測脯氨酸；

32、(19)?將所述seq?id?no.1?所示的dna序列的第53至64位的caccatcatcac替換為半胱氨酸的密碼子tgctgctgctgc用于檢測半胱氨酸。

33、seq?id?no.1：

34、atcagttgaataaacattcacagagacttttatgacacgcgttcaatttaaacaccaccatcatcaccatcatcctgactagtctttcaggcgatgtgtgctggaagacattcagatcttccagtggtgcatgaacgcatgagaaagcccccggaagatcaccttccgggggcttttttatt

35、seq?id?no?.2:

36、ttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtgg

37、seq?id?no?.3:

38、ggacccacatactctgatgatccgagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcggatcattcatggcaagagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcttgccatgtgtatgtggg

39、seq?id?no?.4:

40、ggacccacatactctgatgatccgagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcggatcattcatggcaagagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcttgccatgtgtatgtgggttttttttttggagcacgtacctctgatgatccgagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcggatcattcatggcaagagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcttgccatgtggtacgtgcttttttttttggagacatgccctctgatgatccgagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcggatcattcatggcaagagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcttgccatgtgggcatgtcttttttttttggaggtgcatcctctgatgatccgagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcggatcattcatggcaagagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcttgccatgtggatgcacc

41、seq?id?no?.5:

42、caaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaat

43、seq?id?no?.6:

44、tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcggacccacatactctgatgatccgagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcggatcattcatggcaagagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcttgccatgtgtatgtgggttttttttttggagcacgtacctctgatgatccgagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcggatcattcatggcaagagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcttgccatgtggtacgtgcttttttttttggagacatgccctctgatgatccgagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcggatcattcatggcaagagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcttgccatgtgggcatgtcttttttttttggaggtgcatcctctgatgatccgagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcggatcattcatggcaagagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtaga

45、本技術(shù)的第二方面在于，提供本技術(shù)的第一方面中提供的氨基酸傳感器在體外檢測氨基酸濃度變化中的應(yīng)用。

46、本技術(shù)的第三方面在于，提供一種用于檢測環(huán)境中氨基酸濃度的試劑盒試劑盒包括本技術(shù)的第一方面中提供的氨基酸傳感器。

47、進一步地，該試劑盒還包括待檢測氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)品。

48、本技術(shù)的第四方面在于，提供一種體外檢測氨基酸濃度變化的方法，其包括以下步驟：

49、（1）根據(jù)待檢測氨基酸種類，構(gòu)建本技術(shù)的第一方面中提供的氨基酸傳感器；所述氨基酸傳感器包括組成型啟動子trc啟動子序列、如本技術(shù)的第二方面中提供的任一種能感受氨基酸濃度變化的氨基酸衰減子編碼基因的核酸序列、熒光rna適配體編碼基因序列和終止子rrnb?t1序列；

50、（2）利用pcr方法擴增并純化步驟(1)中所述氨基酸傳感器轉(zhuǎn)錄模板；

51、（3）將待測氨基酸樣品或標(biāo)準(zhǔn)液與步驟(2)所述氨基酸傳感器轉(zhuǎn)錄模板和所述熒光rna適配體的配體混合，開啟rna轉(zhuǎn)錄和信號報告的過程；

52、（4）使用具有熒光強度動力學(xué)測定的酶標(biāo)儀測定反應(yīng)液熒光強度變化。

53、在一些具體實施例中，在（3）步驟中，還加入大腸桿菌體外轉(zhuǎn)錄及翻譯表達所需的組分包括rna聚合酶、核糖體、atp、gtp、ctp、utp。

54、進一步地，以上組分可來自大腸桿菌的細胞裂解液。

55、在一些具體實施例中，熒光rna適配體包括3wjdb或3wjdb-iv；所述熒光rna適配體的配體包括dfhbi-1t。

56、發(fā)明的有益效果

57、本技術(shù)通過精準(zhǔn)調(diào)控衰減子元件中的關(guān)鍵堿基位點，實現(xiàn)單一傳感器體系對全部20種天然氨基酸的特異性識別與檢測，突破了傳統(tǒng)傳感器需針對不同氨基酸設(shè)計獨立檢測模塊的技術(shù)瓶頸，大幅降低系統(tǒng)復(fù)雜度與開發(fā)成本。

58、同時，本技術(shù)創(chuàng)新性地采用熒光核酸適配體作為報告基因，有效規(guī)避了傳統(tǒng)熒光蛋白信號易受氨基酸直接調(diào)控的干擾問題，確保檢測信號與氨基酸濃度呈現(xiàn)嚴(yán)格線性相關(guān)，顯著提升檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。另外，基于多單元串聯(lián)結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計，在保持熒光核酸適配體特異性識別能力的同時，實現(xiàn)信號輸出強度3-5倍的增強，突破了單鏈核酸適配體信號輸出弱的固有缺陷，為高靈敏度檢測提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐。因此，通過建立體外反應(yīng)體系，突破傳統(tǒng)傳感器受限于細胞內(nèi)環(huán)境的局限，使該技術(shù)可廣泛應(yīng)用于食品檢測、環(huán)境檢測、生物制藥等多元化場景，顯著拓展了氨基酸傳感器的應(yīng)用邊界。