本發(fā)明屬于生物化學(xué)，涉及一類具有非天然氨基酸的低毒廣譜抗菌肽及其應(yīng)用，本發(fā)明同時還涉及該抗菌肽在制備臨床抗菌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、近幾十年來，抗生素的過度使用導(dǎo)致了微生物耐藥性的出現(xiàn)，從而給公共衛(wèi)生帶來了前所未有的危機(nature?medicine,2018,24,1097-1103.)。根據(jù)美國疾病控制和預(yù)防中心(centers?for?disease?control?and?prevention)的最新調(diào)查，細菌是危及生命的感染(如肺部和傷口感染)的罪魁禍首，這些感染因長期治療而帶來巨大的社會成本和醫(yī)療系統(tǒng)負擔(dān)(jama,2013,310(16),1661-1663.)。

2、細菌耐藥性的出現(xiàn)是一個全球性問題，對人類健康構(gòu)成嚴重威脅。大多數(shù)抗生素通過干擾細胞壁、蛋白質(zhì)和核酸的合成或代謝來殺死細菌。然而，細菌可以通過改變其細胞膜結(jié)構(gòu)或進化溶菌酶等酶來輕易地產(chǎn)生耐藥性以應(yīng)對抗生素(international?journal?ofmolecular?sciences,2023,24(6),5777.)?？咕?amps)是自然界中各種有機體固有免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一類生物分子。由于它們能夠與帶負電荷的脂質(zhì)結(jié)合，會導(dǎo)致細菌膜滲透。此外，許多研究結(jié)果表明，amps還具有靶向內(nèi)部作用目標的能力(antibiotics,2024,13(3),202.)。在這種情況下，誘導(dǎo)細胞死亡可能涉及與dna/rna相互作用，在細胞內(nèi)對蛋白質(zhì)合成和酶活性產(chǎn)生不利影響或抑制形成細胞壁/膜。因此，開發(fā)新型抗生素已經(jīng)變得至關(guān)重要，并且抗菌肽代表了一類具有巨大潛力的新型抗生素。

3、天然抗菌肽由于具有代謝不穩(wěn)定性、生產(chǎn)成本高、容易引起溶血副作用等缺點限制了它們的進一步臨床應(yīng)用。此外，最近有越來越多的觀點認為，臨床使用序列與人類amps過于接近的天然抗菌肽將不可避免地損害自身的自然防御，可能對公眾健康構(gòu)成威脅(science,2020,1；368(6490):eaau5480)。在這種觀點下，非天然(或合成)肽被開發(fā)出來，以提供更廣泛的amps武器庫。在此基礎(chǔ)上，申請人將非天然氨基酸引入抗菌肽基序gxxyyxxyyi-nh2，研究設(shè)計具有抗菌譜廣且低毒性、高穩(wěn)定性的抗菌肽，在制備臨床抗菌藥物方面有很好的應(yīng)用前景，有希望成為新型抗生素的候選藥物。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一是提供一類具有非天然氨基酸的低毒廣譜抗菌肽。

2、本發(fā)明的目的之二是提供上述抗菌肽在制備臨床抗菌藥物中的應(yīng)用。

3、為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

4、一、具有非天然氨基酸的低毒廣譜抗菌肽的結(jié)構(gòu)設(shè)計

5、本發(fā)明具有非天然氨基酸的低毒廣譜抗菌肽，是以gxxyyxxyyi-nh2為模板，對xxyy氨基酸序列重復(fù)兩次，并將c端酰胺化得到，記作xy；

6、其中，x為疏水氨基酸：w(d-色氨酸)、b(l-4,4'-聯(lián)苯基丙氨酸)、n(3-(1-萘基)-l-丙氨酸)或fu(4-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸)；y為帶電氨基酸氨酸：o(鳥氨酸)、k(d-賴氨酸)或r(d-精氨酸)；

7、n端g為谷氨酸(gly)，能夠保持一定的穩(wěn)定性，c端i為異亮氨酸(ile)，能夠提供一定的活性；c端酰胺化可保持高的凈正電荷性。

8、具體的，所述抗菌肽為gwwoowwooi-nh2，記作wo；

9、或：gb(l-4,4'-聯(lián)苯基丙氨酸)bo(鳥氨酸)obbooi-nh2，記作bo；

10、或：gn(3-(1-萘基)-l-丙氨酸)no(鳥氨酸)onnooi-nh2，記作no；

11、或：gfu(4-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸)fuo(鳥氨酸)ofufuooi-nh2，記作fuo；

12、或：gw(d-色氨酸)wk(d-賴氨酸)kwwkki-nh2，記作wk；

13、或：gb(l-4,4'-聯(lián)苯基丙氨酸)bk(d-賴氨酸)kbbkki-nh2，記作bk；

14、或：gn(3-(1-萘基)-l-丙氨酸)nk(d-賴氨酸)knnkki-nh2，記作nk；

15、或：gfu(4-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸)fuk(d-賴氨酸)kfufukki-nh2，記作fuk；

16、或：gw(d-色氨酸)wr(d-精氨酸)rwwrri-nh2，記作wr；

17、或：gb(l-4,4'-聯(lián)苯基丙氨酸)br(d-精氨酸)rbbrri-nh2，記作br；

18、或：gn(3-(1-萘基)-l-丙氨酸)nr(d-精氨酸)rnnrri-nh2，記作nk；

19、或：gfu(4-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸)fur(d-精氨酸)rfufurri-nh2，記作fur。

20、優(yōu)選為含氟的fuo、fuk或fur；更優(yōu)選為fuk。

21、上述具有非天然氨基酸的低毒廣譜抗菌肽均采用經(jīng)典固相合成法制備得到。

22、二、具有非天然氨基酸的低毒廣譜抗菌肽在制備臨床抗菌藥物中的應(yīng)用

23、1、體外抑菌實驗

24、采用經(jīng)典微量連續(xù)二倍稀釋法測定抗菌肽對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌)及革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌)的最小抑菌濃度。實驗以抗生素methicillin、polymyxin?b、cephalothin、gentamicin、streptomycin和rifampicin作為陽性對照，平行重復(fù)3次，結(jié)果見表1。

25、表1本發(fā)明抗菌肽對常見標準菌株的最低抑菌濃度

26、

27、表1結(jié)果顯示，本發(fā)明抗菌肽對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌)及革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌)都具有很強的抑制作用，表現(xiàn)為廣譜抗菌活性，且抗革蘭氏陽性菌的效果優(yōu)于抗生素polymyxin?b。

28、根據(jù)溶血活性圖，擬合并計算多肽引起10％的小鼠紅細胞破裂的濃度，記作：hc10。計算多肽對所測試的革蘭氏陽性菌、陰性菌和所有細菌的mic的幾何平均值，記作：g+，g-和gall，評估多肽對革蘭氏陽性菌、陰性菌活性的差異。通過計算治療指數(shù)ti(ti＝hc10/g，hc10>256μm時，以512μm進行計算)評估多肽的安全性。結(jié)果見表2。

29、表2本發(fā)明抗菌肽對革蘭氏陽性菌/陰性菌的幾何平均值和選擇性指數(shù)

30、

31、

32、表2結(jié)果同樣顯示，本發(fā)明抗菌肽對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌都具有很強的抑制作用，表現(xiàn)為廣譜抗菌活性。尤其是含有fu(4-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸)的多肽，普遍表現(xiàn)出高活性，其中以抗菌肽fuk活性最佳，以下以抗菌肽fuk為例進行溶血活性實驗、lps結(jié)合實驗、誘導(dǎo)耐藥實驗和掃描電鏡實驗。

33、2、溶血活性實驗

34、為了考察本發(fā)明合成的抗菌肽對正常哺乳動物細胞的毒性，對本發(fā)明抗菌肽fuk與小鼠紅細胞孵育1h后的溶血情況進行測定，結(jié)果見圖1。

35、圖1結(jié)果顯示，本發(fā)明抗菌肽fuk在發(fā)生10％的溶血時對應(yīng)的的濃度均大于256μm，遠高于所測其對五種細菌的最低抑菌濃度。該結(jié)果說明，本發(fā)明合成的抗菌肽毒性較低，用藥安全。

36、3、lps結(jié)合實驗

37、內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分之一，也是多粘菌素b的靶標。因此，申請人設(shè)計了競爭抑制實驗，通過與不同濃度的內(nèi)毒素孵育來驗證抗菌肽fuk是否能作用于內(nèi)毒素，然后測定其對肺炎克雷伯菌的殺菌活性，結(jié)果見圖3。

38、圖3結(jié)果顯示，內(nèi)毒素對抗菌肽fuk和多粘菌素b的抗菌活性有劑量依賴性的抑制作用，fuk和內(nèi)毒素的結(jié)合效率(256μg/ml)比多粘菌素b和內(nèi)毒素(128μg/ml)低2倍，表明fuk可以與內(nèi)毒素相互作用，但結(jié)合率較低。

39、4、誘導(dǎo)耐藥實驗

40、抗菌肽與傳統(tǒng)抗生素相比，最突出的優(yōu)勢是難以產(chǎn)生耐藥性。由于其膜溶解作用機制，細菌很難改變細胞膜成分從而產(chǎn)生耐藥。因此，為了研究本發(fā)明抗菌肽是否具有不易產(chǎn)生耐藥性的特質(zhì)，申請人測定了抗菌肽fuk和抗生素(gentamicin/polymyxin?b)對金黃色葡萄球菌s.aureus?atcc?25923和肺炎克雷伯菌k.pneumoniae?atcc?700603連續(xù)作用15天的抗菌活性。

41、一般而言，mic在1-4倍范圍內(nèi)波動屬于正常情況，若mic大于4倍，表明抗生素已產(chǎn)生耐藥。如圖2所示，傳統(tǒng)抗生素gentamicin對對金黃色葡萄球菌s.aureus?atcc?25923連續(xù)作用第7天時就已產(chǎn)生耐藥，在連續(xù)作用15天后，對金黃色葡萄球菌的mic已提高了128倍。多肽抗生素polymyxin?b對肺炎克雷伯菌k.pneumoniae?atcc?700603連續(xù)作用15天的抗菌活性沒有產(chǎn)生明顯的變化。而fuk對對金黃色葡萄球菌s.aureus?atcc?25923和肺炎克雷伯菌k.pneumoniae?atcc?700603連續(xù)作用15天的抗菌活性均沒有產(chǎn)生耐藥性，說明多肽抗菌藥物相比傳統(tǒng)抗生素，在耐藥性方面有明顯的優(yōu)勢。

42、5、掃描電鏡實驗

43、本實驗中，申請人利用掃描電鏡顯微鏡(sem)來直觀觀察抗菌肽作用后引起的細菌形態(tài)的改變。具體的實驗方法如下：將生長過夜的金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌在mh培養(yǎng)基中稀釋為10×108cfu/ml，離心10000rpm×5min，pbs洗兩次，半體積重懸于pbs中，500μl菌液與500μl多肽溶液混合(多肽終濃度為2×mic)，在37℃培養(yǎng)箱中孵育分別孵育30min和2h。時間到后，樣品離心10000rpm×10min，加入500μl2.5％戊二醛在4℃條件下固定過夜，隨后，pbs洗2遍，用乙醇梯度洗脫(乙醇濃度依次為50％、70％、80％、90％和100％)，加入乙醇靜置10min后離心。乙醇梯度洗脫后，加入150μl叔丁醇室溫放置2h，離心后將細菌沉淀置于圓形載玻片。樣品干燥，噴金，使用apreo?s掃描電鏡(thermo?fisherscientific,ma,usa)進行分析。

44、由圖5可觀察到，正常的和金黃色葡萄球菌表面光滑完整，但與抗菌肽fuk和polymyxin?b作用30min后，肺炎克雷伯菌開始出現(xiàn)表面皺縮，細胞內(nèi)容物泄露，喪失了完整的細胞形態(tài)，抗菌肽的效果好于polymyxin?b。而金黃色葡萄球菌與抗菌肽fuk和vancomycin作用30min后，主要呈現(xiàn)細菌細胞壁產(chǎn)生小泡，并且隨著抗菌肽作用時間的延長，造成了更大規(guī)模的細菌細胞形態(tài)的改變。掃描電鏡結(jié)果很明顯的觀察到本發(fā)明的抗菌肽對肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌的膜破壞能力遠遠強于polymyxin?b和vancomycin。

45、本發(fā)明的有益效果在于：

46、1、本發(fā)明將非天然氨基酸引入抗菌肽基序gxxyyxxyyi，其中，x是疏水氨基酸：w(d-色氨酸)，b(l-4,4'-聯(lián)苯基丙氨酸)，n(3-(1-萘基)-l-丙氨酸)，fu(4-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸)；y為帶電氨基酸氨酸：o(鳥氨酸)，k(d-賴氨酸)，r(d-精氨酸)；n端的g為谷氨酸(gly)，能夠保持一定的穩(wěn)定性，c端的i為(ile)，能夠提供一定的活性。其抗菌試驗、溶血試驗和誘導(dǎo)耐藥試驗表明所述抗菌肽具有抗菌譜廣且低毒性的優(yōu)勢、安全性較高。誘導(dǎo)耐藥實驗表明，本發(fā)明的抗菌肽均具有低耐藥發(fā)生性特點，在制備臨床抗菌藥物方面有很好的應(yīng)用前景，有希望成為新型抗生素的候選藥物。

47、2、本發(fā)明最終篩選得到抗菌活性最高、在所測試濃度范圍(256μm)內(nèi)沒有明顯溶血現(xiàn)象的抗菌肽fuk：gfufukkfufukki-nh2。