本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及kras作為胰腺癌中生物標(biāo)志物的用途。

背景技術(shù)：

胰腺癌是患者存活率最低的腫瘤之一，其5年生存率低于5％。胰腺癌被認(rèn)為是由于多年積累的體細(xì)胞突變所導(dǎo)致的，在疾病的后期伴隨有典型的臨床表現(xiàn)。很大程度上，由于對驅(qū)動疾病進(jìn)程的體細(xì)胞突變的認(rèn)知有限，往往在治療前無法準(zhǔn)確表征胰腺癌，所以對胰腺癌患者往往缺乏足夠的治療手段。在疾病的進(jìn)程中，通過生物標(biāo)志物的鑒定可以更早地獲得患者的預(yù)后信息，很大程度上可以使得治療方法得到改進(jìn)，也可以使得胰腺癌患者的病情得到監(jiān)控。

游離dna(cell-freedna，cfdna)測序已經(jīng)被證實是一種具有可行性和靈敏性的可用于腫瘤相關(guān)突變和預(yù)后的非侵害性鑒定的工具?；赾fdna測序的液體活檢已經(jīng)被證實在諸多臨床適應(yīng)癥中具有預(yù)后的價值，且近期的報道也支持了cfdna生物標(biāo)志物的檢測可用于診斷胰腺癌的結(jié)論。在胰腺癌后期患者中，對具有潛在治療效用的基因突變進(jìn)行觀測，診斷和術(shù)后過程中cfdna的存在被認(rèn)為與腫瘤標(biāo)志物的動態(tài)和疾病復(fù)發(fā)相關(guān)。cfdna測序提供了一種相當(dāng)快速的監(jiān)控胰腺癌疾病進(jìn)展工具(相比于ct影像快6個月)。所以，在胰腺癌的相關(guān)研究中，基于cfdna的生物標(biāo)志物分析技術(shù)的開發(fā)是一個熱點課題，任何在cfdna變異檢測技術(shù)的改進(jìn)均可能可以在現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)預(yù)后因素的基礎(chǔ)上提供一種新的、重要的腫瘤進(jìn)程信息。盡管已經(jīng)有了上述所提及的研究報道，cfdna在可切除胰腺癌中的臨床應(yīng)用中依然有很多方面有待研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供了kras(kirstenratsarcomaviraloncogene)作為胰腺癌中生物標(biāo)志物的用途，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。

為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供用于檢測kras基因或其活性片段中g(shù)12v突變的物質(zhì)在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于評估胰腺癌的治療效果和/或判斷胰腺癌的預(yù)后。本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，kras基因中的g12v突變與胰腺癌的治療效果和/或判斷胰腺癌的預(yù)后有著密切關(guān)系，存在g12v突變的患者明顯相較于其他患者具有更差的治療效果和/或預(yù)后。

本發(fā)明中，所述用于檢測kras基因或其活性片段中g(shù)12v突變的物質(zhì)應(yīng)該是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，其制備方法亦應(yīng)該是現(xiàn)有技術(shù)。例如，所述物質(zhì)可以是可以特異性結(jié)合kras或其活性片段中的g12v突變密碼子的物質(zhì)，通過檢測該物質(zhì)的特異性結(jié)合，即可以檢測kras或其活性片段中是否存在g12v突變。在本發(fā)明一具體實施方式中，所述物質(zhì)可以是能夠特異性結(jié)合存在g12v突變的kras基因的探針。再例如，所述物質(zhì)可以是能夠特異性擴增kras基因的物質(zhì)和pcr-hrm法可適用的染料，通過對特異性擴增所得的基因片段進(jìn)行染色并檢測染色后的基因片段的鏈接溫度，即可以檢測kras或其活性片段中是否存在g12v突變。在本發(fā)明一具體實施方式中，所述物質(zhì)可以是能夠特異性擴增kras基因的引物和/或pcr-hrm法可適用的染料。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述物質(zhì)具體為用于檢測cfdna中kras或其活性片段的物質(zhì)。在本發(fā)明另一些實施方式中，所述物質(zhì)具體為用于檢測血漿樣品和/或全血樣品中的kras基因或其活性片段中g(shù)12v突變的物質(zhì)。本發(fā)明中，用于檢測kras基因或其活性片段中g(shù)12v突變的物質(zhì)通?？梢允轻槍fdna的，cfdna已經(jīng)被證實是一種具有可行性和靈敏性的可用于腫瘤相關(guān)突變和預(yù)后的非侵害性鑒定的工具。對于健康的人來說，血液中的cfdna主要來源是體細(xì)胞正常的新陳代謝，因此應(yīng)該維持在一個較低的水平。當(dāng)有很嚴(yán)重的系統(tǒng)性器官損傷打破這種平衡時，大量死亡的細(xì)胞會產(chǎn)生大量的cfdna，使得血液中的cfdna含量大大增加，所以對于腫瘤患者cfdna的檢測，血液樣本是理想的液體活檢對象。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述試劑盒為pcr-hrm法試劑盒或taqman-arms法試劑盒。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述試劑盒的檢測樣本為血液樣品(例如，血漿樣品和/或全血樣品)、腫瘤組織或其病理切片提取的dna，所述病理切片優(yōu)選為石蠟病理切片。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述試劑盒為pcr-hrm法試劑盒，試劑盒的使用方法包括如下步驟(或者，所述試劑盒用于包括如下步驟的方法)：

1)通過pcr方法特異性擴增kras目的基因片段；

2)對擴增所得的基因片段進(jìn)行染色；

3)通過hrm(highresolutionmeltinganalysis，高分辨熔解曲線)法分析染色后的基因片段。

本發(fā)明中，通過pcr-hrm法檢測kras基因外顯子中第12密碼子g12v熱點突變位點的方法應(yīng)該是已知的，例如，可使用thermofisher公司的meltdoctor^tmhrmreagentkit，meltdoctor^tmhrmmastermix，qiagen公司hrm^tmpcr-等試劑盒，再例如，可使用abihrm等軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，從而確定待分析的基因片段(樣本)中是否存在突變型基因。這些試劑盒通?？梢园ㄡ槍ras基因的特異性引物、染料等，還可以包括dna聚合酶、去rna酶水、dntp(包括dutp)、鎂鹽等。在本發(fā)明一具體實施方式中，pcr的反應(yīng)體系可以包括2xhrmpcrmastermix緩沖液10μl、20μm引物kras-f1μl、20μm引物kras-r1μl、模板dna1μl、rnase-freewate7μl，pcr的反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃1min，40個循環(huán)，hrm的分析條件為95℃熔解10s，60℃1min，從60℃到95℃收集熔解曲線數(shù)據(jù)，溫度上升速率為0.3％，每0.1℃進(jìn)行一次數(shù)據(jù)采集，最后50℃冷卻。

在本發(fā)明一些實施方式中，對擴增所得的基因片段進(jìn)行染色時所使用的染料通常是飽和染料，這些染料通常能飽和結(jié)合于dna雙鏈小溝位置，染料的使用量相對于dsdna通常是相對過量，以使dsdna沒有更多位置結(jié)合染料。所述染料可以是小分子熒光飽和染料，具體可使用的染料包括但不限于lcgreen、lygreen、greener^tm和syto9等染料。染料可以在pcr反應(yīng)之前即加入反應(yīng)體系中，也可以在pcr反應(yīng)完成后再加入反應(yīng)體系中。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述試劑盒為taqman-arms法試劑盒，試劑盒的使用方法包括如下步驟(或者，所述試劑盒用于包括如下步驟的方法)：

1)通過pcr方法特異性擴增kras目的基因片段；

2)使用探針對檢測基因片段中是否存在突變。

本發(fā)明中，通過taqman-arms定性檢測kras基因外顯子中第12密碼子g12v熱點突變位點的方法應(yīng)該是已知的，例如，可使用人kras基因突變檢測試劑盒(taqman-arms法)(為真生物醫(yī)藥科技,國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第3400363號)，從而確定待分析的基因片段(樣本)中是否存在突變型基因。這些試劑盒通常可以包括針對kras基因的特異性引物、針對g12v突變位點的探針等，還可以包括dna聚合酶、純化水、dntp、mgcl2、熒光信號、陽性指控品等。在本發(fā)明一具體實施方式中，pcr的反應(yīng)體系可以包括2xmicrodiagmutationdetectionmix10μl(其組分為0.5μm引物、0.2μm探針0.5mmdntp、5mmmgcl2及純化水，含熒光信號fam)、樣品dna/陽性質(zhì)控品/無模板對照(純化水)2μl、dna聚合酶(5u/μl)0.2μl、純化水7.8μl。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述試劑盒是根據(jù)樣品(例如，血漿樣品和/或全血樣品等)中kras基因是否存在g12v突變，評估胰腺癌的治療效果和/或判斷胰腺癌的預(yù)后，所述樣品優(yōu)選為術(shù)前樣品。在本發(fā)明另一些實施方式中，所述試劑盒是根據(jù)樣品中的cfdna中kras基因是否存在g12v突變，評估胰腺癌的治療效果和/或判斷胰腺癌的預(yù)后。本發(fā)明發(fā)明人通過對源自患者的術(shù)前樣品(如血漿樣品和/或全血樣品等)中的cfdna進(jìn)行檢測，以確定kras基因中是否存在g12v突變，從而進(jìn)一步評估胰腺癌的治療效果和/或判斷胰腺癌的預(yù)后。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述胰腺癌為可切除性胰腺癌，所述試劑盒用于評估胰腺癌切除后的治療效果和/或判斷胰腺癌切除后的預(yù)后。所述可切除性胰腺癌通常指未包繞主要血管(包括腹腔干、腸系膜上動脈、腸系膜上靜脈或門靜脈)，且未發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的胰腺癌。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述評估胰腺癌的治療效果和/或判斷胰腺癌的預(yù)后具體指評估胰腺癌患者的總生存期和/或無進(jìn)展生存期。所述總生存期(overallsurvival，os)通常指胰腺癌患者自接受胰腺癌腫瘤切除手術(shù)至因任何原因引起死亡之間的時間。所述無進(jìn)展生存期(progression-freeservival，pfs)通常指胰腺癌患者自接受胰腺癌腫瘤切除手術(shù)至發(fā)現(xiàn)局部或區(qū)域進(jìn)展(localorregionalprogression)之間的時間段，或指胰腺癌患者自接受胰腺癌腫瘤切除手術(shù)至發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移(distantmetastase)之間的時間段，或指胰腺癌患者自接受胰腺癌腫瘤切除手術(shù)至死亡之間的時間段。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述胰腺癌為早期胰腺癌。所述早期胰腺癌通常指胰腺癌一期或胰腺癌二期，胰腺癌的分期通常參照nccn指南和ajcc第七版)。

本發(fā)明第二方面提供用于檢測kras基因或其活性片段中g(shù)12v突變的物質(zhì)在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于評估對象是否易發(fā)預(yù)后性較差的胰腺癌。本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，kras基因突變的存在與胰腺癌的發(fā)生有著密切的關(guān)系，大約90％的胰腺癌伴隨有kras基因突變，從而使得kras成為胰腺癌的重要候選生物標(biāo)志物，此外，kras基因中的g12v突變的存在與胰腺癌的治療效果和/或判斷胰腺癌的預(yù)后有著密切關(guān)系，存在g12v突變的患者明顯相較于其他患者具有更差的治療效果和/或預(yù)后。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述物質(zhì)具體為用于檢測cfdna中kras基因或其活性片段的物質(zhì)。在本發(fā)明另一些實施方式中，所述物質(zhì)具體為用于檢測血漿樣品和/或全血樣品中的kras基因或其活性片段中g(shù)12v突變的物質(zhì)。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述試劑盒是根據(jù)樣品(例如，血漿樣品和/或全血樣品等)中kras基因是否存在g12v突變，評估對象是否易發(fā)預(yù)后性較差的胰腺癌，所述樣品優(yōu)選為術(shù)前樣品，優(yōu)選為評估對象是否易發(fā)手術(shù)切除后預(yù)后性較差的胰腺癌。在本發(fā)明另一些實施方式中，所述試劑盒是根據(jù)樣品中的cfdna中kras基因是否存在g12v突變，評估對象是否易發(fā)預(yù)后性較差的胰腺癌。

本發(fā)明第三方面提供用于檢測kras基因或其活性片段中g(shù)12v突變的物質(zhì)在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于診斷胰腺癌。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述物質(zhì)具體為用于檢測cfdna中kras基因或其活性片段的物質(zhì)。在本發(fā)明另一些實施方式中，所述物質(zhì)具體為用于檢測血漿樣品和/或全血樣品中的kras基因或其活性片段中g(shù)12v突變的物質(zhì)。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述試劑盒是根據(jù)樣品(例如，血漿樣品和/或全血樣品等)中kras基因是否存在g12v突變，診斷胰腺癌是否為預(yù)后性較差的胰腺癌，所述樣品優(yōu)選為術(shù)前樣品，優(yōu)選為診斷胰腺癌是否為手術(shù)切除后預(yù)后性較差的胰腺癌。在本發(fā)明另一些實施方式中，所述試劑盒是根據(jù)樣品中的cfdna中kras基因是否存在g12v突變，診斷胰腺癌是否為預(yù)后性較差的胰腺癌。

本發(fā)明為“上海市級醫(yī)院新興前沿技術(shù)聯(lián)合攻關(guān)項目”資助項目，編號：shdc12014108，本發(fā)明發(fā)明人通過ddpcr和/或靶向的高通量測序技術(shù)(下一代測序技術(shù)，nextgenerationsequencing，ngs)對早期可切除胰腺癌患者進(jìn)行評估(85名可切除胰腺癌的患者)，以確定cfdna中是否存在kras突變，并進(jìn)一步研究了早期胰腺癌患者中的術(shù)前cfdna中的kras突變的存在與總生存期(overallsurvival)和無進(jìn)展生存期(progression-freesurvival)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)術(shù)前cfdna中kras突變的存在與總生存期和無進(jìn)展生存期的變短存在顯著關(guān)聯(lián)(p分別為0.004和0.041)，由此揭示krascfdna評估的預(yù)后價值，并發(fā)現(xiàn)了如何基于cfdna的生物標(biāo)志物的檢測幫助提供用于胰腺癌患者臨床治療的信息，從而可以促進(jìn)胰腺癌的個體化治療。

附圖說明

圖1血漿cfdna突變對于可切除胰腺癌患者的總生存期(os)和無進(jìn)展生存期(pfs)的影響示意圖。(a)術(shù)前血漿cfdna中kras突變可檢出(n＝32，紅)和未檢出(n＝53，黑)的患者的總生存期。92.5％和63.％的kras突變未檢出的患者術(shù)后分別存活6個月和12個月，相對來說，53.8％和42.1％的kras突變檢出的患者術(shù)后分別存活6個月和12個月。(b)術(shù)前血漿cfdna中kras突變可檢出和未檢出的患者的無進(jìn)展生存期。77.4％和51.4％的術(shù)前血漿cfdna中kras突變未檢出的患者術(shù)后分別存活6個月和12個月，相對而言，50.0％和32.1％的術(shù)前血漿cfdna中kras突變檢出的患者術(shù)后分別存活6個月和12個月。

圖2kras突變檢測中ngs的靈敏度和特異性(與ddpcr相比)示意圖：對40例血漿cfdna樣品進(jìn)行kras多重ddpcr，40例樣本中的28例通過fireflyngs進(jìn)行測序。三個具有各自等位基因頻率的樣本(基于ddpcr的結(jié)果分別為～0.1％，1％，40％)被用于ngs平行反應(yīng)。將自ddpcr方法獲得的kras等位基因頻率與ngs方法獲得的等位基因頻率進(jìn)行比較。只有12個樣品在ddpcr中被劃分為陽性(大于3個事件，n＝12，r2＝0.97)。三個重復(fù)樣品數(shù)據(jù)組被標(biāo)記為亮灰色。即使等位基因頻率～0.1％，kras突變?nèi)源_實地重復(fù)，從而顯示出高檢測靈敏度。16個樣品中未發(fā)現(xiàn)假陽性，從而顯示出高檢測特異性。

圖3krasg12v與其他kras突變和kras未突變相比預(yù)后示意圖。具有krasg12v突變的患者(n＝8，紅色)的總生存期(a)和無進(jìn)展生存期(b)與未檢出kras突變的患者相比(n＝53，黑色)，顯著變短。除g12v以外的kras突變的患者(n＝24)的總生存期(c)和無進(jìn)展生存期(d)與kras突變患者(n＝53)相比，沒有顯著區(qū)別。

具體實施方式

以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復(fù)數(shù)形式。

當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組dna技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。

實施例中所提及的85位胰腺癌患者均在中國上海長海醫(yī)院進(jìn)行招募，招募時間為在2014年8月至2015年6月之間，患者被診斷為患有可切除性胰腺癌，大多數(shù)患者(65，76.5％)為癌癥二期，患者群體的平均年齡為62.7歲，男性比例為(56，65.9％)，所有患者均接受腫瘤切除手術(shù)，同時接受或未接受化療(所有患者均收到輔助性化療的處方，但只有43位患者(50.6％)接受輔助性化療)(患者的詳細(xì)信息見表1)。所有患者均填寫了知情同意書以同意使用他們的臨床數(shù)據(jù)，研究嚴(yán)格依照赫爾辛基宣言進(jìn)行操作，且同時經(jīng)長海醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)。

表1

縮寫：癌胚抗原，cea,carcinoembryonicantigen；糖抗原19-9，ca-19-9,carbohydrateantigen19-9；循環(huán)腫瘤脫氧核糖核酸，ctdna,circulatingtumordeoxyribonucleicacid.

實施例1

1.樣品收集

術(shù)前靜脈血收集采用乙二胺四乙酸試管(vacutainer血液收集試管，美國bd公司)，樣品在室溫條件下被送至安可濟生物科技有限公司(中國上海)進(jìn)行血漿分離。所有85位患者均進(jìn)行了10ml全血樣本采集。用于獲取血漿和白血細(xì)胞(whitebloodcell，wbc)樣本的血樣于手術(shù)當(dāng)天進(jìn)行抽取。cfdna測序結(jié)果并不提供給患者，治療決策也不根據(jù)cfdna的結(jié)果進(jìn)行制定。

2.cfdna和基因組dna(genomicdna)的提取

外周血(每個樣品10ml)離心，離心條件為4℃，1600g，10分鐘。收集血漿和血沉棕黃層(白血細(xì)胞層)，并于-70℃保存。使用qiaamp循環(huán)核酸試劑盒(qiagen)自3-5ml血漿中提取cfdna。使用qiaampdna血液maxi試劑盒(qiagen)自白血細(xì)胞中提取gdna(genomicdna)。所有dna的提取均參照試劑盒供應(yīng)商的說明書進(jìn)行操作，通過qubit熒光計(生命科技公司,carlsbad,ca)定量，并于-20℃下保存至被使用。

3.微滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(dropletdigitalpolymerasechainreaction，ddpcr)

使用qx200系統(tǒng)(bio-rad公司)進(jìn)行ddpcr試驗。使用多個用于ddpcr的kras產(chǎn)品(ddpcr^tmkrasg12/g13screeningkit#1863506,bio-rad公司)，，其中包括7個kras突變(g12a，g12c，g12d，g12r，g12s，g12v和g13d)。ddpcr的反應(yīng)體系為20ul，其中包括4-80ngcfdna(以體積計加入8ulcfdna，不足部分nuclease-freewater補至8ul)，探針fam和hex分別用于檢測突變和野生型kras等位基因。

2xddpcrsupermixforprobes(nodutp)10μl

20xtargetprimers/probe(fam)1μl

20xtargetprimers/probe(hex)1μl

將該體系連同70μl微滴發(fā)生油分別置入微滴發(fā)生器的樣本孔與油滴孔中生成8*20000個油包水微滴，將微滴轉(zhuǎn)移至96孔pcr反應(yīng)板中并密封，以減少交叉污染，隨后乳化pcr反應(yīng)在96孔板上進(jìn)行，采用mj循環(huán)變溫加熱器(bio-rad公司)，使用時，參照供應(yīng)商的說明書進(jìn)行操作。將96孔pcr反應(yīng)板轉(zhuǎn)移至微滴分析儀(qx200^tmdropletreader,bio-rad)，使用qx200微滴讀取器(bio-rad公司)對孔板讀取檢測結(jié)果，使用quantasoft軟件(1.4.0版本，bio-rad公司)對孔板上野生型kras和/或kras突變顯陽性的微滴的數(shù)量進(jìn)行評估。對隨機選擇的40位胰腺癌患者ddpcr血漿中的cfdna進(jìn)行數(shù)字pcr分析。一份不含有血漿cfdna的樣品作為陰性對照。以3個陽性微滴(3-positive-event)作為kras突變的檢出標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)由軟件自動統(tǒng)計給出。在40個血漿cfdna樣品中，使用多重ddpcr篩選kras突變?？蓹z出kras突變的樣品(n＝12)和未檢出kras突變的樣品sampleswithoutkras(n＝16)均通過以下胰腺癌研究平臺進(jìn)行測序。

4.高通量測序(next-generationsequencing，ngs)和體細(xì)胞突變的鑒定

具體方法可參照：xu,ting,etal."cross-platformcomparisonoffourleadingtechnologiesfordetectingegfrmutationsincirculatingtumordnafromnon-smallcelllungcarcinomapatientplasma."theranostics7.6(2017):1437.

基于高通量測序的cfdna評估在firefly平臺(安可濟生物科技有限公司)上進(jìn)行。使用含有與胰腺癌相關(guān)的50個基因的所有外顯子(詳見表2)的面板進(jìn)行捕獲。白血細(xì)胞和cfdna測序均在胰腺癌研究平臺上進(jìn)行，ngs文庫在hi-seq2500(illumina公司)上進(jìn)行測序，探針的平均覆蓋深度約為7000x，測序結(jié)果與hg19/grch37人參考序列進(jìn)行比對，由隨機ngs錯誤造成的本底噪聲被去除，隨后就可以識別出真正的變體，通過將包含變體的獨有測序結(jié)果的數(shù)量與用于映射變體位置的所有測序結(jié)果的數(shù)量進(jìn)行對比，以計算等位基因頻率。種系變體通過白血細(xì)胞測序確定，并在總的cfdna變體中移除種系變體以確定體細(xì)胞突變。32位患者被發(fā)現(xiàn)cfdna中存在kras突變，53位患者的血漿cfdna中不存在kras突變。

表2

我們在ddpcr和ngs之間比較kras等位基因頻率，并驗證了通過ddpcr和ngs技術(shù)平臺對kras進(jìn)行檢測的結(jié)果整體上是相同的。對于ddpcr檢測中的陰性子群(小于3個陽性事件)，ngs并未檢出假陽性，可見，基于ngs的kras檢測具有100％的特異性。對于ddpcr檢測中的陽性子群(大于等于3個陽性事件)，ddpcr中未進(jìn)行擴增的cfdna和ngs報告之間，等位基因頻率具有很高的一致性(r²＝0.97，圖2)。在等位基因頻率為0.01％,0.59％and60％的三個樣品中(通過ddpcr確定)，重復(fù)ngs檢測。平行樣品通過ngs檢測所得的等位基因頻率檢測結(jié)果分別為0.08％/0.09％，0.83％/1％，和45％/50％(圖2)。這些結(jié)果驗證了基于ngs的平臺的可靠性和準(zhǔn)確性。

5.統(tǒng)計學(xué)分析

cox回歸分析與費希爾精確檢驗被用于與患者結(jié)果相關(guān)的數(shù)據(jù)分析。使用kaplan-meier法生成總生存期的曲線和無進(jìn)展生存期的曲線，并通過時序檢驗進(jìn)行對比。單變量和多變量cox回歸分析被用于評估預(yù)后因素對于總生存期無進(jìn)展生存期的影響。p值低于0.05被認(rèn)為統(tǒng)計學(xué)上具有顯著意義。使用windowsspss20.0和r統(tǒng)計軟件包(v3.1.1，http://www.r-project.org/)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

6.kras突變和病人結(jié)果估量之間的聯(lián)系

總生存期(overallsurvival，os)，總生存期通常指從手術(shù)至患者死亡之間的時間段，或者從手術(shù)至2015年11月最后一次隨訪之間的時間段，或從手術(shù)至術(shù)后研究14個月的時間段。

無進(jìn)展生存期(progression-freesurvival，pfs)，無進(jìn)展生存期通常指從手術(shù)至發(fā)現(xiàn)局部或區(qū)域進(jìn)展(localorregionalprogression)之間的時間段，或從手術(shù)至發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(distantmetastase)之間的時間段，或從手術(shù)至死亡之間的時間段。

我們檢測了術(shù)前cfdna樣品中存在kras突變和疾病進(jìn)程之間的聯(lián)系。術(shù)前cfdnakras突變檢出的患者(n＝32)和未檢出kras突變的患者(n＝53)進(jìn)行對比可發(fā)現(xiàn)，總生存期l(p＝0.004，圖1a)和無進(jìn)展生存期(p＝0.041，圖1b)均有顯著性差異。kras陽性和kras陰性的患者，術(shù)后6個月的總生存期分別為53.8％和92.5％，kras陽性和kras陰性的患者，術(shù)后6個月的無進(jìn)展生存期分別為50.0％和77.4％。

32位存在kras突變的患者中，相對于那些未檢出kras突變的患者(n＝53)，具有krasg12v變體型(n＝8)的患者的總生存期(p<0.0001)和無進(jìn)展生存期(p＝0.007)顯著變短(圖3a和3b)。具有其他kras變體型的患者(n＝24)(g12a，g12c，g12d，g12r，g12s和g13d)(圖3c和3d)則未發(fā)現(xiàn)與其他患者類似的聯(lián)系。

7.影響生存率的因素

我們隨后對如下患者特征進(jìn)行了研究：年齡、性別、癌胚抗原(cea)、糖康源(ca19-9)、腫瘤大小、腫瘤分期、腫瘤位置、在淋巴結(jié)中存在、輔助性化療的使用、以及kras突變，從而確定他們是否是影響總生存期和無進(jìn)展生存期的可能風(fēng)險因素。單變量分析顯示輔助性化療(危害比(hazardratio，hr)，0.46，95％；置信區(qū)間(confidenceinterval，ci)0.236–0.890，p＝0.02)、cfdna中存在kras突變(hr,2.513,95％；ci1.313-4.810,p＝0.0006)是總生存期的風(fēng)險因素(表2)。通過多變量分析，這些因素對于總生存期同樣被確認(rèn)為是顯著因素：輔助性化療(hr，0.413，95％；ci0.211–0.808，p＝0.01)，cfdna中存在kras突變(hr，2.769，95％；ci1.439–5.326，p＝0.002)(表2)。單變量分析顯示輔助性化療(危害比(hr)，0.509，95％；置信區(qū)間(ci)0.284–0.911，p＝0.021)、cfdna中存在kras突變(hr，1.806，95％；ci1.016-3.210，p＝0.047)是無進(jìn)展生存期的風(fēng)險因素。通過多變量分析，這些因素對于無進(jìn)展生存期同樣被確認(rèn)為是顯著因素：輔助性化療(hr，0.021，95％；ci0.266–0.861，p＝0.014)，cfdna中存在kras突變(hr，1.939，95％；ci1.087–3.458，p＝0.025)(表3)。

表3

胰腺癌發(fā)展過程中，kras突變不僅很早就會出現(xiàn)，而且kras突變也是普遍存在的，患者中的發(fā)生率為75％-95％。根據(jù)kinguasaetal.報道，cfdna中kras突變可檢出的四期患者的中位生存時間(mediansurvivaltime，mst)相較于野生型顯得大大變短。而通過上述實驗可知，對于已經(jīng)接受臨床切除手術(shù)的早期胰腺癌患者，術(shù)前cfdna可檢出率與癌癥復(fù)發(fā)和死亡密切相關(guān)。在復(fù)發(fā)的患者中，通過cfdna檢出的方法診斷復(fù)發(fā)比ct影響的方法早六個月以上，進(jìn)一步支持了cfdna循環(huán)的存在可能可以作為胰腺癌早期診斷的一種標(biāo)志物。術(shù)前檢出cfdna中存在體細(xì)胞突變與早期胰腺癌患者(一期和二期)的低總生存期和低無進(jìn)展生存期之間存在密切關(guān)系。具體來說，我們發(fā)現(xiàn)，kras陽性和kras陰性的患者在術(shù)后6個月的總生存期分別為53.8％和92.5％，cfdna中kras突變可檢出的胰腺癌早期患者的總生存期(中值，10.30,95％；ci，6.8-13.3)和無發(fā)展生存期(中值，6.30,95％；ci，5.2-na)相對于kras野生型患者的總生存期(中值，>14，95％；ci，na)和無發(fā)展生存期(中值，>14,95％；ci，na)來說，總生存期和無發(fā)展生存期更短(圖1)。這是首次在胰腺癌早期患者(一期和二期)中對術(shù)前cfdna的預(yù)后價值進(jìn)行研究，且我們的研究結(jié)果與之前支持癌癥預(yù)后中cfdna檢測重要性的報道一致。此外，發(fā)明人進(jìn)一步對6個kras突變((g12a，g12d，g12r，g12s，g12v和q61r))進(jìn)行充分地研究。在kras突變可檢出的患者中，相對于那些存在其他變體型組合的患者，那些只存在g12v變體型的患者明顯更差。我們發(fā)現(xiàn)，g12v的可檢出與患者最差表現(xiàn)密切相關(guān)(總生存期，中值7.0，95％；ci，2.015-12.240；無進(jìn)展生存期，中值5.4，95％；ci，1.8-7.1)(圖3)。將我們的發(fā)現(xiàn)與前期研究結(jié)合可發(fā)現(xiàn)，由于我們驗證了術(shù)前cfdna中kras突變的存在與胰腺癌早期患者的總生存期和無進(jìn)展生存期的縮短密切相關(guān)，所以kras有希望作為可切除胰腺癌患者的生物標(biāo)志物，作為癌癥進(jìn)程的預(yù)后預(yù)測因子。

綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點而具高度產(chǎn)業(yè)利用價值。

上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。