本發(fā)明屬于水稻育種技術(shù)領域，具體涉及一種水稻普通核不育系的創(chuàng)制方法和應用。

背景技術(shù)：

水稻是全世界重要的糧食作物，世界上約有50％的人口以水稻為主食，大米也是加工許多食品的原材料。“三系法”和“兩系法”是當前水稻雜交優(yōu)勢利用的主要途徑，但是“三系法”的問題在于受嚴格的恢保關系制約，可以利用的親本資源有限；“兩系法”在制種安全性問題上存在較大的風險，限制了這兩種途徑全面開發(fā)水稻雜種優(yōu)勢的潛力。

普通核不育具有來源廣泛、無恢保關系限制、敗育徹底且育性不受環(huán)境影響、單隱性基因控制易于轉(zhuǎn)育等特點，是理想的雜種優(yōu)勢利用資源，但普通核不育的繁殖問題是制約普通核不育發(fā)展的重要問題。水稻工程核不育體系的創(chuàng)制研究，建設“第三代雜交水稻”應用體系?！暗谌s交水稻”技術(shù)就是擬通過基因工程手段解決普通核不育的繁殖問題的技術(shù)方法。主要的技術(shù)方法有spt技術(shù)、工程核不育技術(shù)?！暗谌s交水稻”是基于普通核不育資源的一種雜種優(yōu)勢利用方式。雜種優(yōu)勢利用水平的提高，可以有更多的水稻資源被用于作為雜交稻的父母本，為選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗等綜合性狀優(yōu)良的品種提供了更好的平臺。

普通核不育資源主要來源于人工誘變和自然突變，屬于非定向突變，然后從不定向的突變中，經(jīng)過大量的篩選，獲得具有感興趣目的性狀的材料。應用中遇到的問題是：構(gòu)建“第三代雜交水稻”體系所需要的普通核不育資源，需要已經(jīng)被基因克隆的普通核不育基因(即基礎研究比較透徹的基因)在基因組層面上定點改變基因的表達，從而改變目的性狀，這些突變體來源的材料通常不是育種家當前最期待直接利用的材料(基礎研究的材料在生產(chǎn)中已經(jīng)不是最好最新的材料)，所以要將這些材料用于生產(chǎn)中，還必須通過回交轉(zhuǎn)育等方式，是一個耗時較長、工作量較大的一項工作。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種水稻普通核不育系的創(chuàng)制方法和應用，采用基因編輯的技術(shù)，讓普通的可育材料，變成普通核不育系，再由普通核不育系通過雜交產(chǎn)生可持續(xù)恢復育性的方法，極大程度上拓寬了“第三代雜交水稻”不育系資源的來源。

為解決上述問題，一方面，本發(fā)明在于提供一種水稻普通核不育系的創(chuàng)制方法，其具體步驟如下：

1)通過基因編輯技術(shù)使水稻普通可育株系msms的育性基因表達水平降低或消失，獲得水稻普通核不育材料，自交后獲得含有不育性狀且不含基因編輯載體的新的水稻普通核不育系msms；

2)構(gòu)建工程核不育中間父本載體，將該載體導入水稻普通核不育系msms，獲得轉(zhuǎn)基因苗；種植轉(zhuǎn)基因苗，收獲t0代種子，種植t0代種子，獲得t1代植株，pcr檢測，以獲得含有目的基因的擬可育中間父本材料，收獲t1代種子；

3)種植t1代種子，pcr檢測，獲得不含篩選標記基因的可育中間父本材料msms^ms-l；

4)以水稻普通核不育系msms為母本，以可育中間父本材料msms^ms-l為父本，雜交，產(chǎn)生混合種子；

5)對混合種子進行熒光分選，分選出不含熒光的種子msms，實現(xiàn)水稻普通核不育系的繁殖，用于與可育恢復系水稻msms進行雜交制種，產(chǎn)生的f1代雜交種子msms，用于大田生產(chǎn)；分選出含熒光的種子msms^ms-l繼續(xù)用于繁殖不含熒光的種子msms。

進一步地，本發(fā)明提供一種水稻普通核不育系的創(chuàng)制方法，所述步驟1)中，選擇普通可育株系msms作為受體，利用基因編輯crispr-cas9的方法，定點突變普通可育株系msms的雄性不育基因的靶標序列，培育、測序、篩選，得到普通核不育株系msms。

更進一步地，本發(fā)明提供一種水稻普通核不育系的創(chuàng)制方法，步驟1)中所述靶標序列如seqidno.2所示。

進一步地，本發(fā)明提供一種水稻普通核不育系的創(chuàng)制方法，步驟2)所述的中間父本載體為包含可育基因和分選基因的水稻雙元表達載體。

更進一步地，本發(fā)明提供一種水稻普通核不育系的創(chuàng)制方法，步驟2)所述的中間父本載體中包含的分選基因為紅色熒光蛋白dsred。

進一步地，本發(fā)明提供一種水稻普通核不育系的創(chuàng)制方法，所述步驟1)中的育性基因為cyp703a3。

進一步地，本發(fā)明提供一種水稻普通核不育系的創(chuàng)制方法，所述步驟2)中構(gòu)建工程核不育中間父本載體的過程如下：

以普通可育株系msms提取的基因組dna作為模板，設計并合成特異性引物：

9311gdnaf(其序列如seqidno.7所示)：gggatgggtgtttgactctg；

9311gdnar(其序列如seqidno.8所示)：cctgtgctcactcggaag；

擴增出如seqidno.9所示的大小為4429bp的基因組序列片段后，以該基因組序列片段構(gòu)建“育性恢復基因-分選基因”的工程核不育中間父本載體。

進一步地，本發(fā)明提供一種水稻普通核不育系的創(chuàng)制方法，所述工程核不育中間父本載體構(gòu)建過程為：通過in-fusion轉(zhuǎn)化體系將擴增調(diào)控后如seqidno.9所示的dna片段插入到含有分選基因紅色熒光蛋白dsred的載體中；獲得水稻雙元表達載體pcambia1300-dsred-cyp703a3，其基因序列如seqidno.10所示。

進一步地，本發(fā)明提供一種水稻普通核不育系的創(chuàng)制方法，所述擬可育中間父本材料創(chuàng)制過程如下：將水稻雙元表達載體pcambia1300-dsred-cyp703a3導入根癌農(nóng)桿菌中得到互補根癌農(nóng)桿菌eha105轉(zhuǎn)化體，通過與水稻普通核不育系msms的細胞或組織接觸，從而使編碼不育基因的核苷酸轉(zhuǎn)入水稻細胞，并且整合到水稻細胞的染色體上，獲得轉(zhuǎn)基因苗；種植轉(zhuǎn)基因苗，收獲t0代種子，種植t0代種子，獲得t1代植株，pcr檢測，獲得擬可育中間父本材料。

另一方面，本發(fā)明提供一種水稻普通核不育系的水稻雙元表達載體，其核苷酸序列如seqidno.10所示。

另一方面，本發(fā)明提供一種本發(fā)明所述的水稻普通核不育系的創(chuàng)制方法用于水稻普通核不育系的育性恢復的應用。

本發(fā)明列舉的雄性可育基因為cyp703a3基因，其堿基序列如seqidno.1所示。

cyp703a3的靶基因序列如seqidno.2所示，進行突變后得到如seqidno.3所示或如seqidno.4所示的突變序列基因cyp703a3-a。

進一步地，本發(fā)明列舉的水稻品種為秈稻品種9311。

cyp703a3基因?qū)儆赾ytochromep450家族，基因功能非常保守，在所有水稻品種中都有這個基因，因此本發(fā)明所適用的范圍為所有水稻品種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明提供一種水稻普通核不育系的創(chuàng)制方法和應用，通過應用普通可育的育種材料創(chuàng)制為不育系，再由不育系與中間父本材料雜交，將混合種子通過分選基因表達性狀分選后，得到大量不含轉(zhuǎn)基因成分的不育系種子，實現(xiàn)了普通核不育系的繁殖。利用普通核不育系與恢復系制種，得到雜交種子，該育種程序簡單，將生產(chǎn)中綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的育種材料或品系直接創(chuàng)制為不育系，可以節(jié)省大量回交轉(zhuǎn)育的時間(具體表現(xiàn)為將回交選育不育系的時間由3～5年縮短為6個月內(nèi))，且不改變受體材料其它背景基因，將普通核不育的不育性狀快速導入可育材料中，大幅度的縮短育種周期。

本發(fā)明著眼點是在雜種優(yōu)勢的利用，利用雄性育性基因及其蛋白參與調(diào)控水稻雄性育性的特點，及利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)控制水稻雄性生殖發(fā)育，通過突變該蛋白序列或抑制該蛋白的表達產(chǎn)生新的水稻雄性不育株系，全面拓展不育系的材料范圍，提升雜種優(yōu)勢的利用水平，為選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗等綜合性狀優(yōu)良的品種提供了更好的技術(shù)方法，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應用。

本發(fā)明所獲得的水稻突變體在營養(yǎng)期與來源親本無明顯差異，進入生殖生長階段后雄性生殖發(fā)育異常，花粉敗育，得到完全不育的植株，在雜交水稻構(gòu)建和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應用。

附圖說明

圖1為水稻普通核不育系在水稻制種中的應用的雜交流程圖；

圖2為基因突變位點的圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等分子克?。簩嶒炇沂謨?newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

所述cyp703a3基因的核苷酸如seqidno.1所示序列，其編碼的氨基酸如seqidno.11所示序列，其cds區(qū)如seqidno.12所示序列。

實施例1創(chuàng)制水稻普通核不育系cyp703a3-a

1.從已克隆的基因資源中，獲得雄性不育基因序列

genebank上獲得目的水稻雄性不育基因cyp703a3，其基因序列如seqidno.1所示；選取的靶序列如seqidno.2所示。

2.通過crispr-cas9的手段降低水稻品種中cyp703a3蛋白的表達水平

以普通可育材料(基因型為msms)秈稻9311作為受體，通過農(nóng)桿菌eha105-bgko5的介導，利用常規(guī)的水稻轉(zhuǎn)基因操作方法，在轉(zhuǎn)基因群體中，選擇表型為不育的單株，對靶標序列進行一代測序，得到不育單株cyp703a3-a(基因型為msms)。

為了對cyp703a3蛋白進行應用，構(gòu)建了cyp703a3基因crispr-cas9的載體cyp703a3-bgko5(載體來自百格公司，貨號bgko5)，并轉(zhuǎn)化野生型9311植株，以降低cyp703a3蛋白的表達，從而達到將野生型水稻9311變成不育系的目的。

設計并合成cyp703a3突變位點檢測引物：

cyp703a3crisprup(seqidno.5)：tgtgtggcggcgccggcgacgcactg

cyp703a3crisprdown(seqidno.6)：aaaccagtgcgtcgccggcgccgcca

對構(gòu)建含有水稻cyp703a3基因靶序列的cyp703a3-bgko5質(zhì)粒進行測序，測序正確確定構(gòu)建成功。

將含有cyp703a3-bgko5質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化成含cyp703a3-bgko5的根癌農(nóng)桿菌在含有kan(50μg/μl)的yeb平板上劃線，獲的單菌落。挑單菌落接種到3ml含抗生素的yeb液體培養(yǎng)基中，于28℃振蕩培養(yǎng)過夜，第2天按1％接種量轉(zhuǎn)接入50ml含抗生素的yeb液體培養(yǎng)基中，200rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至od600為0.4至0.6左右后，將新鮮的根癌農(nóng)桿菌菌液于5000rpm、離心5分鐘，收集并重懸于1/3體積的aam液體培養(yǎng)基中，此時獲得可用于轉(zhuǎn)化水稻各種受體的材料。

采用常規(guī)的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化秈稻品種9311的幼胚愈傷。取授粉后12-15天的秈稻品種9311未成熟種子經(jīng)70％乙醇浸泡1分鐘后，于次氯酸鈉溶液中(與水1∶3混合，加2-3滴吐溫20)消毒90分鐘以上，用無菌水沖洗4-5次，然后用解剖刀和鑷子挑出幼胚并轉(zhuǎn)入到n6d2培養(yǎng)基上誘導愈傷組織，在26±1℃、避光條件下培育，4天后可用于轉(zhuǎn)化。將幼胚愈傷浸泡入新鮮的aam根癌農(nóng)桿菌菌液中并不時搖動，20分鐘后將水稻材料移出，在無菌濾紙上吸去過多的菌液，隨即轉(zhuǎn)移到n6d2c培養(yǎng)基上，于26℃共培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)時，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮，使用濃度為100μm。3天后，從共培養(yǎng)培養(yǎng)基上取出愈傷組織，切去胚芽并轉(zhuǎn)入含有25mg/l潮霉素的選擇培養(yǎng)基上進行選擇培養(yǎng)。7-12天后將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)到含有50mg/lhyg的選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選。10-12天后生長旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到預分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周左右，再移至分化培養(yǎng)基上分化(12小時光照/天)。再生的小苗在1/2ms0h培養(yǎng)基上生根壯苗，隨后移入人工氣候室營養(yǎng)液栽培。

轉(zhuǎn)化植株提取葉片總dna，利用cyp703a3突變位點檢測引物，即cyp703a3crisprup(如seqidno.5所示)和cyp703a3crisprdown(如seqidno.6所示)，經(jīng)pcr進一步鑒定轉(zhuǎn)化植株。測序檢測靶位點基因序列，如果發(fā)生純合突變則為有效的基因敲除植株cyp703a3-a(基因型為msms)，得到水稻雄性不育系cyp703a3-a能實現(xiàn)完全不育。不育單株cyp703a3-a中兩條同源染色體均發(fā)生了插入，一個插入堿基a，一個插入堿基g，不育單株為含兩個不同的等位突變基因，后代表型一致為不育。具體如seqidno.3所示或如seqidno.4所示的核苷酸。如圖2所示，在箭頭所示位點插入了a堿基或g堿基。

3創(chuàng)制具有熒光分選基因的cyp703a3中間父本材料cyp703a3-b

構(gòu)建工程核不育中間父本載體pcambia1300-dsred-cyp703a3，導入cyp703a3-a，轉(zhuǎn)基因群體中選擇可育株cyp703a3-b(基因型為msms^ms-l)。

從野生型9311幼苗葉片中提取基因組dna作為模板，設計并合成特異性引物：

9311gdnaf(其序列如seqidno.7所示)：gggatgggtgtttgactctg

9311gdnar(其序列如seqidno.8所示)：cctgtgctcactcggaag

擴增出如seqidno.9所示的大小為4429bp的基因組序列片段；

通過大連寶生物公司的in-fusion轉(zhuǎn)化體系將擴增如seqidno.9所示的dna片段插入到含有分選基因紅色熒光蛋白dsred的用于轉(zhuǎn)化水稻雙元載體pcambia1300-dsred中；測序驗證正確，獲得水稻雙元表達載體pcambia1300-dsred-cyp703a3，其基因序列如seqidno.10所示；

將上述步驟所得載體通過電擊導入根癌農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105得到cyp703a3互補根癌農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105轉(zhuǎn)化體，使用遺傳轉(zhuǎn)化手段轉(zhuǎn)化突變體cyp703a3-a營養(yǎng)生殖生長期的幼穗愈傷，從而使編碼如seqidno.10所示氨基酸的核苷酸轉(zhuǎn)入水稻細胞，并且整合到水稻細胞的染色體上，獲得轉(zhuǎn)基因苗；種植轉(zhuǎn)基因苗，收獲t0代種子，種植t0代種子，獲得t1代植株；pcr檢測，以獲得含有目的基因的擬可育單株材料，收獲t1代種子；種植t1代種子，pcr檢測，獲得不含篩選標記基因的可育中間父本材料cyp703a3-b(基因型為msms^ms-l)。

4普通核不育系的創(chuàng)制及其繁殖方法

具體流程如圖1所示。以不育單株獲得的cyp703a3-a做母本，可育單株cyp703a3-b為父本，雜交，產(chǎn)生混合種子。

利用美亞光電定制的熒光色選機ak-1，對混合種子進行熒光分選，選擇不含熒光的種子cyp703a3-a(基因型為msms)，實現(xiàn)了普通核不育cyp703a3-a的繁殖。

利用cyp703a3-a與恢復性(基因型為msms)雜交制種，生產(chǎn)f1代雜交種子，用于大田生產(chǎn)。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。