本發(fā)明屬于微生物
技術領域：
，具體涉及一種從巴山榧樹中分離出的內(nèi)生菌，命名為黑曲霉bp12±3，該菌株具有高產(chǎn)紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ的特性，還涉及黑曲霉bp12±3在制備治療腫瘤細胞藥物中的應用。
背景技術：
：紫杉醇(taxol)，國際通用名paclitaxel，是上世紀六十年代美國科學家從植物太平洋紅豆杉中分離提取的一種二萜類化合物，通過ⅱ-ⅲ臨床驗證，證明具有良好的抗腫瘤作用，特別是對癌癥發(fā)病率較高的卵巢癌、子宮癌、乳腺癌等有特效，對肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效，是近年來在抗癌領域的重大發(fā)現(xiàn)，已于1992年被美國食品和藥物管理局(fda)批準為治療轉(zhuǎn)移性卵巢癌的新藥，并已上市。紫杉醇為白色結(jié)晶粉末，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有機溶劑。分子式為c47h5lnol4，相對分子量為853.92，溶點為213～216℃(wanimc,taylorhl,wallme,etal.plantantitumoragents.vi.theisolationandstructureoftaxol,anovelantileukemicandantitumoragentfromtaxusbrevifolia[j].jamchemsoc,1971,93:2325～2327.)。經(jīng)研究表明，目前發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性物質(zhì)主要是紫杉烷二萜類化合物，多達7大類，100多種骨架。這為擴大抗腫瘤范圍、半合成新藥，以避免抗藥性提供了更大的開發(fā)領域。紫杉醇是紅豆杉屬植物中的一種復雜的次生代謝產(chǎn)物，也是目前所了解的唯一一種可以促進微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管的藥物。同位素示蹤表明，紫杉醇只能結(jié)合到聚合的微管上，不與未聚合的微管蛋白發(fā)生二聚體反應。細胞接觸紫杉醇后會在細胞內(nèi)積累大量的微管，這些微管的積累干擾了細胞的各種功能，特別是使細胞分裂停止于有絲分裂期，阻斷了細胞的正常分裂。因此，紫杉醇能抑制腫瘤細胞的生長。經(jīng)測定表明，紫杉醇在紅豆杉屬植物樹皮中的含量約為0.003％-0.069％，每提取1kg紫杉醇，要砍伐大約2000棵樹，即便將全部天然資源采伐，也只能滿足短期需要，且造成對森林和人類生存環(huán)境以及生物多樣性不可彌補的損失。因此，紫杉醇的原料保障就成為該藥能否成功走向市場的關鍵因素。紫杉醇內(nèi)生真菌的分離，是近年來發(fā)展起來的一種有效解決紫杉醇資源問題的新途徑。內(nèi)生菌(endophyte)一詞由debary(debarya,1866,morphologeandphysiologiederpilze,flechtenandmyxomyceten.engelman,leipzig,1-316.)首先提出，是指生活在植物組織內(nèi)存在的微生物，用以區(qū)分那些生活在植物表面的表生菌(epiphyte)。petrini(petrinio,fungalendophytesoftreeleaves.in:andrewsjhhiranoandsseds.microbialecologyofleaves.newyorkspringer-verlag.1991,179-197.)將內(nèi)生菌定義為在其生活史中的某一段時期生活在植物組織內(nèi)，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的菌，這個定義包括那些在其生活史中的某一階段營表面生的腐生菌，對宿主暫時沒有傷害的潛伏性病原菌(latentpathogens)和菌根菌。1993年，strobel等從短葉紅豆杉(t.brevifoia)中分離篩選出了一株內(nèi)生真菌(taxomycesandreanae)，發(fā)現(xiàn)它竟然能夠在離體培養(yǎng)的時候合成紫杉醇，產(chǎn)率達到24-50μg/l。同時strobel認為，內(nèi)生真菌之所以要合成紫杉醇，可能與抵抗由根部侵入的真菌作用有關，同時更好的模擬寄主的化學環(huán)境，在種間競爭中獲得優(yōu)勢(stierlea,stierled,strobelg，eta1.,1994,endophytixfungiofpacificyew(taxus—brevifo1ia)asasourceoftaxol,taxanes,andotherpharmacophoresacssymposiumseries.557:64—77.)。這是一個全新的發(fā)現(xiàn)，無疑富有開創(chuàng)性。此后，各國科學家們相繼分離得到了多種能夠合成紫杉醇的內(nèi)生真菌，它們的產(chǎn)率高低不等。紫杉醇產(chǎn)生菌的宿主多見于裸子植物紅豆杉科(taxaceae)的紅豆杉屬(taxus)和澳洲紅豆杉屬(austrotaxus)中。前者廣泛分布于歐亞大陸和北美，如中國的東北三省、中原地區(qū)、云南、貴州、四川、西藏以及美國和加拿大等地區(qū)；在寒帶、溫帶及亞熱帶地區(qū)也有分布，極少成林，且生長緩慢。后者僅見于南半球，數(shù)量極少。如此可見，任何與紅豆杉屬植物存在物質(zhì)、能量交換的生物都有可能出現(xiàn)紫杉醇類次生代謝產(chǎn)物的遺傳基因傳遞，尤其是附生菌類最有可能。有研究表明，紅豆杉中的紫杉醇含量與其種屬無明顯的相關性，而與紅豆杉的產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境密切相關。所以人們有待于從和紅豆杉有相同環(huán)境要求的其他植物中分離出更多的紫杉醇產(chǎn)生菌，而且紅豆杉樹的主干和側(cè)枝、枝條的樹皮、韌皮部以及皮下部分、根、成熟莖、果實及葉子中的內(nèi)生真菌的研究已有報道。野生型真菌產(chǎn)紫杉醇或類似物的含量普遍偏低，其產(chǎn)量均未達到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。迄今為止，產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌菌株主要從瀕危物種紅豆杉屬的植物中分離到的，卻忽略了紅豆杉科中其它屬植物。因為有研究表明，紅豆杉科榧屬植物中也發(fā)現(xiàn)有紫杉烷類化合物，但含量極低，紫杉醇含量低于0.003％，認為藥用開發(fā)價值不大(易官美，邱迎春.榧樹的研究現(xiàn)狀與發(fā)展[j].資源與環(huán)境，2013，29(8)：844-848)。劉艷等從海南粗榧(cephalotaxushainanensisli)中分離到的產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的菌種，主要產(chǎn)生的可能抗腫瘤物質(zhì)是三尖杉酯堿類化合物(劉艷等.海南粗榧內(nèi)生真菌ch1307鑒定及其抗腫瘤活性研究[d].海南大學,2012.蔣春潔.海南粗榧內(nèi)生真菌抗腫瘤活性菌株篩選[d].海南大學,2014.)本發(fā)明從神農(nóng)架國家地質(zhì)森林公園巴山榧樹(紅豆杉科，榧屬；torreyafargesii)組織中分離出一株內(nèi)生真菌；通過高效液相色譜分析和抗腫瘤活性分析，篩選出產(chǎn)生紫杉醇或類似物次生代謝產(chǎn)物的菌種；并通過用液質(zhì)聯(lián)用儀(hplc-ms)進行定性檢測，判斷該菌株產(chǎn)生的紫杉烷類化合物為巴卡亭ⅲ(baccatinⅲ)。通過微生物發(fā)酵的方法大量生產(chǎn)紫杉醇，有望改善目前紫杉醇價格昂貴、供不應求的現(xiàn)狀。即使其產(chǎn)量與植物中紫杉醇含量相當或略低，但由于真菌發(fā)酵周期短(10～15天)，發(fā)酵規(guī)?？梢匀藶榭刂?，其生產(chǎn)能力大大優(yōu)于植物材料的生產(chǎn)能力。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是在于提供了一種從巴山榧樹中分離出的內(nèi)生菌黑曲霉(aspergillusniger)bp12±3，該菌株具有高產(chǎn)紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ的特性。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種黑曲霉bp12±3的培養(yǎng)方法，通過在培養(yǎng)基中添加前體物質(zhì)l-苯丙氨酸，巴卡亭ⅲ的產(chǎn)量可增長129.84％。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種黑曲霉bp12±3在制備治療腫瘤細胞藥物中的應用，經(jīng)試驗證明，黑曲霉bp12±3發(fā)酵液提取物對hela腫瘤細胞有明顯的抑制作用，且隨著紫杉醇的濃度的升高，對細胞增殖的抑制作用增強。為了達到上述的目的，本發(fā)明通過下述技術方案實現(xiàn)：黑曲霉bp12±3的分離篩選，其步驟是：1、將巴山榧樹的根、莖、葉、樹皮分別用無菌水沖洗后，無菌吸水紙吸干，依次經(jīng)75％(v/v)的酒精消毒5min和2％(v/v)次氯酸消毒8min，然后用無菌水沖洗，用無菌刀將采集到的根、莖和樹皮切成小段，取各部位的材料置于pda固體培養(yǎng)基平皿中，于28℃培養(yǎng)，待上述平皿中接種物切面邊緣長出細小菌絲，挑取菌絲轉(zhuǎn)接入新的pda固體平板上純化直至為純培養(yǎng)物；2、用菌絲尖端接種法將純化的真菌接種至pda平板上，28℃培養(yǎng)。記錄菌落大小、顏色、菌絲致密程度、菌落邊緣是否整齊、菌落生長速度以及產(chǎn)色素等菌落形態(tài)；3、用瓊脂塊法測定內(nèi)生真菌的抑菌活性：將待測供試細菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌)用lb培養(yǎng)基活化后，分別涂布于lb固體培養(yǎng)基表面，每個平皿中接種帶有瓊脂培養(yǎng)基的內(nèi)生菌，37℃培養(yǎng)1-2天，觀察瓊脂塊周圍的抑菌圈，如此獲得了一株同時具有抗金黃色葡萄球菌(g+)和大腸桿菌(g-)活性的菌株，記為bp12±3；4、經(jīng)過平皿培養(yǎng)特性觀察該菌株菌落顏色呈暗黑色，菌落反面顏色黃至黃褐色，菌落質(zhì)地為絲絨狀，有放射性溝紋，顯微鏡下觀察，其分生孢子頭呈疏松放射狀，頂囊球形，直徑50-80μm，小梗雙層，梗基(4-6μm)×(2-3μm)，分生孢子球形，直徑3-4.5μm，鑒定為黑曲霉(aspergillusniger)，記為bp12±3；5、將菌株黑曲霉bp12±3在pda液體培養(yǎng)基中，180rpm、28℃活化3天，作為種子液，將種子液以5％(v/v)的接種量，接入pda液體培養(yǎng)基中，180rpm，28℃培養(yǎng)7-9天收獲發(fā)酵液；6、發(fā)酵結(jié)束后，收集濾液，濾液中加入1/3體積的乙酸乙酯，逆流萃取3次，收集上層有機相，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中除去有機溶劑，獲得脂溶性提取物，其含量約為120mg/l；7、高效液相色譜(hplc)發(fā)現(xiàn)脂溶性提取物中含有與紫杉醇標準品保留時間基本一致的成分，測得保留時間為12.08min，與紫杉醇標準品保留時間相近，表明其含有紫杉醇或類似物，其相對百分含量為10.5％；8、液質(zhì)聯(lián)用(hplc-ms)測定代謝抽提物中紫杉醇類似物的結(jié)構(gòu)，表明其母離子da為609.200，子離子da分別為549.200、367.000和427.100，源電壓均為146，碰撞能分別為34、40和40，與紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ標準品完全一致，故判斷黑曲霉(aspergillusniger)bp12±3產(chǎn)生的紫杉醇類似物為巴卡亭ⅲ。所述的巴山榧樹的組織中分離出來的黑曲霉(aspergillusniger)bp12±3，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏日期為2016年6月8日，保藏編號cctccno.m2016319，其特征是具有高產(chǎn)紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ的特性，發(fā)酵液中巴卡亭ⅲ的含量達到12.6mg/l，抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。黑曲霉bp12±3高產(chǎn)紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ的培養(yǎng)方法：在pda培養(yǎng)基中添加前體物質(zhì)l-苯丙氨酸可增加巴卡亭ⅲ的產(chǎn)量，實驗表明添加3.0mg/l的l-苯丙氨酸，可將黑曲霉bp12±3的巴卡亭ⅲ產(chǎn)量增長129.84％。黑曲霉bp12±3在治療抗腫瘤細胞中的應用：通過cck-8法測定黑曲霉bp12±3的發(fā)酵液提取物對hela細胞的抑制作用，結(jié)果表明隨著發(fā)酵液提取物濃度的升高，對細胞增殖的抑制作用增強，當發(fā)酵液提取物的濃度為11.55μg/ml時，抑制率達到62.91％。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和有益效果：1、迄今為止，產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌菌株主要從瀕危物種紅豆杉屬的植物中分離，本發(fā)明是從巴山榧樹(紅豆杉科，榧屬)組織中分離的內(nèi)生真菌，這是又一例從紅豆杉屬以外的植物中分離到具有產(chǎn)生紫杉醇或類似物能力的植物內(nèi)生真菌，這大大擴大了獲取產(chǎn)生紫杉醇或類似物菌種的資源范圍，有利于更廣泛地利用微生物資源。2、有研究報道，某些植物內(nèi)生菌產(chǎn)生紫杉醇的能力并不穩(wěn)定，往往需要有前體物質(zhì)的存在，而本發(fā)明的植物內(nèi)生菌黑曲霉bp12±3可以非常穩(wěn)定地產(chǎn)生紫杉醇類似物，發(fā)酵液中紫杉醇類似物的粗提取物含量可達120mg/l，其中紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ的相對百分含量為10.5％，巴卡亭ⅲ的產(chǎn)量約為12.6mg/l，高于現(xiàn)有技術已公開的產(chǎn)量；以l-苯丙氨酸為前體，巴卡亭ⅲ的產(chǎn)量可增長129.84％。3、采用cck-8試劑法檢驗黑曲霉bp12±3對hela腫瘤細胞的抑制作用，表明所黑曲霉bp12±3發(fā)酵液的紫杉醇類似物對腫瘤細胞有明顯的抑制作用，且隨著紫杉醇的濃度的升高，對細胞增殖的抑制作用增強，當藥物濃度為0.1155μg/ml時，抑制率為29.82％，濃度增加到1.155μg/ml時，抑制率達到40.27％，當濃度增加到11.55μg/ml時，抑制率達到62.91％。4、液質(zhì)聯(lián)用儀進行定性檢測，判斷該菌株產(chǎn)生的紫杉烷類化合物為巴卡亭ⅲ(baccatinⅲ)。這為擴大抗腫瘤范圍、半合成新藥，以避免抗藥性等提供了更大的開發(fā)領域。5、利用本發(fā)明的植物內(nèi)生菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇或類似物，可以不受資源、環(huán)境、條件、設備等的各種限制，短時間、大規(guī)模進行生產(chǎn)。附圖說明圖1為黑曲霉bp12±3的菌苔，菌株bp12±3的菌落顏色呈暗黑色，菌落反面顏色黃至黃褐色，菌落質(zhì)地為絲絨狀，有放射性溝紋。圖2為黑曲霉bp12±3的顯微鏡照片圖，分生孢子頭呈疏松放射狀，頂囊球形，直徑50-80μm，小梗雙層，?；?4-6μm)×(2-3μm)，分生孢子球形，直徑3-4.5μm。圖3為紫杉醇標準品的色譜圖，箭頭所示峰為紫杉醇標準品。圖4為黑曲霉bp12±3的代謝抽提物中紫杉醇類似物的色譜圖，箭頭所示峰為紫杉醇類似物。具體實施方式實施例1：巴山榧樹植物內(nèi)生菌的分離1、巴山榧樹材料的預處理于湖北省神農(nóng)架國家地質(zhì)森林公園采集巴山榧樹的根、莖、葉、樹皮，用無菌水沖洗后，用吸水紙吸干；分別經(jīng)75％(v/v)的酒精消毒5min和2％(v/v)次氯酸消毒8min，然后用無菌水沖洗；將采集到的根、莖和樹皮切成大致約2-3cm的小段，葉片從中間切出剖面。2、巴山榧樹植物內(nèi)生菌的分離取預處理的各部位的材料置于pda固體培養(yǎng)基平皿，28℃培養(yǎng)，pda培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g，水1000ml，ph自然，加瓊脂(15g/l)為pda固體培養(yǎng)基。3、巴山榧樹植物內(nèi)生菌的純化當平皿中接種物切面邊緣長出細小菌絲時，挑取菌絲接入新配制pda固體平板上，在pda斜面培養(yǎng)基上純化幾次，直至得到純培養(yǎng)物。實施例2：內(nèi)生菌bp12±3抑菌活性檢測1、將待測供試細菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌)用lb液體培養(yǎng)基活化后，分別涂布于lb固體培養(yǎng)基表面；2、切下實施例1獲得的純化植物內(nèi)生菌瓊脂培養(yǎng)基塊，分別放置接種于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌平皿中，37℃培養(yǎng)1-2天，觀察瓊脂塊周圍的抑菌圈，通過上述方法，篩選獲得一株同時具有抗金黃色葡萄球菌(g+)和大腸桿菌(g-)活性的菌株，記為bp12±3。實施例3：內(nèi)生真菌bp12±3的鑒定經(jīng)過平皿培養(yǎng)特性觀察(圖1)，該菌株菌落顏色呈暗黑色，菌落反面顏色黃至黃褐色，菌落質(zhì)地為絲絨狀，有放射性溝紋；顯微鏡下觀察(圖2)，其分生孢子頭呈疏松放射狀，頂囊球形，直徑50-80μm，小梗雙層，?；?4-6μm)×(2-3μm)，分生孢子球形，直徑3-4.5μm。根據(jù)《中國真菌志第五卷曲霉屬及其相關有性型》(齊祖同主編，中國真菌志(第五卷)曲霉屬及其相關有性型[m].北京：科學出版社，1997，5～10.)可初步鑒定為黑曲霉(aspergillusniger)bp12±3。實施例4：黑曲霉bp12±3發(fā)酵液中脂溶性物質(zhì)提取1、將實施例2獲得的植物內(nèi)生菌黑曲霉bp12±3于pda液體培養(yǎng)基中活化(活化條件：28℃，180rpm，培養(yǎng)5-7天)，作為種子液；2、按照5％(v/v)的接種量接入pda液體培養(yǎng)基中，28℃，180rpm，培養(yǎng)7-10天；3、過濾收集濾液，濾液中加入1/3體積的乙酸乙酯，逆流萃取3次，收集上層有機相；4、于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35℃除去有機溶劑，用甲醇溶解粘在壁上的物質(zhì)并揮發(fā)干燥，通過重量法測定發(fā)酵液粗取物含量；其中內(nèi)生菌bp12±3發(fā)酵液粗取物含量平均約為120mg/l。實施例5：高效液相色譜(hplc)定量檢測黑曲霉bp12±3含紫杉醇類似物代謝活性物質(zhì)1、實施例4中獲得的脂溶性物質(zhì)及流動相處理：將實施例4獲得的濃縮產(chǎn)物13200r/min離心2min，吸取上清液，經(jīng)0.22μm孔徑濾膜過濾除去雜質(zhì)，然后同配好的流動相(甲醇/水＝65/35，v/v)一起超聲波排氣，時間分別為3min、10～15min；2、色譜條件為：色譜柱，ods(c18)柱4.6×250mm，5nm；柱溫，常溫；樣品及流動相，甲醇/水＝65/35(v/v)；流速，1.0ml/min；樣品進樣量，20μl；紫外檢測波長，227nm；3、測得紫杉醇標準品(購自sigma)的rt(保留時間)為13～14min(圖3)；4、在實施例4制得的脂溶性提取物中發(fā)現(xiàn)與紫杉醇標準品的rt(保留時間)相似的成分(圖4)，出峰時間為12.8min，可將內(nèi)生菌bp12±3代謝活性物質(zhì)鑒定為紫杉醇類似物；5、使用hplc伍豐液相色譜工作站軟件根據(jù)色譜圖測算出bp12±3代謝抽提物中紫杉醇類似物的相對峰面積為29445.61，相對百分含量為10.5％。實施例6：黑曲霉bp12±3發(fā)酵液提取物對hela腫瘤細胞的抑制作用1、取對數(shù)生長期的hela細胞(華聯(lián)科生物技術有限公司)鋪板，將細胞按100μl/孔(1～5×103個細胞/孔)接種于96孔板中，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；2、將實施例4制備的含紫杉醇類似物的黑曲霉bp12±3發(fā)酵液提取物配置不同濃度(表1)，取10μl分別加入樣品孔中(1～5×103個細胞/孔)，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；3、取出培養(yǎng)板，吸去上清，每孔加入90μl新鮮培養(yǎng)液(含有10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液)和cck-810μl，同樣的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h；4、用酶標儀在450nm處讀取吸光值(a450值)，計算細胞生長抑制率，細胞生長抑制率計算：hela細胞抑制率(ir)＝(對照孔a值—樣品孔a值)/對照孔a值×100％(表1)。通過上述實驗，發(fā)現(xiàn)黑曲霉bp12±3發(fā)酵液粗取物對hela腫瘤細胞有明顯的抑制作用，抑制作用與提取物濃度呈正相關關系；當藥物濃度為0.1155μg/ml時，抑制率為29.82％，濃度增加到1.155μg/ml時，抑制率達到40.27％，當濃度增加到11.55μg/ml時，抑制率達到62.91％。表1黑曲霉bp12±3發(fā)酵液提取物對hela細胞的抑制作用實施例7：液質(zhì)聯(lián)用儀(hplc-ms)確定bp12±3發(fā)酵液中紫杉醇類似物為巴卡亭ⅲ1、液相色譜儀器型號：島津lc-30auplc(1)樣品及流動相處理：將實施例4制備的脂溶性濃縮產(chǎn)物13200r/min離心2min，吸取上清液，經(jīng)0.22μm孔徑濾膜過濾除去雜質(zhì)，然后同配好的流動相(乙腈/水＝65/35，v/v)一起超聲波排氣，時間分別為3min、10～15min；(2)色譜條件為：色譜柱，ods(c18)柱4.6x250mm，5nm；柱溫，常溫；樣品及流動相，甲醇/水＝65/35(v/v)；流速，1.0ml/min；樣品進樣量，20μl；紫外檢測波長，227nm；2、質(zhì)譜儀器型號為absciex4500qqq(三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀)利用液質(zhì)聯(lián)用儀對實施例4中提取的和實施例5中初步鑒定的紫杉醇類似物進行進一步結(jié)構(gòu)鑒定(表2)，表明其母離子da為609.200，子離子da分別為549.200、367.000和427.100，源電壓均為146，碰撞能分別為34、40和40，與紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ標準品完全一致。由此，可將內(nèi)生菌bp12±3產(chǎn)生的紫杉醇類似物定性為巴卡亭ⅲ。表2巴卡亭ⅲ標準品及bp12±3紫杉醇類化合物質(zhì)譜分析參數(shù)q1mass(da)q3mass(da)dpcedwell(msec)609.200549.2001463450609.200367.0001464050609.200427.1001464050實施例8：不同前體物質(zhì)對黑曲霉bp12±3產(chǎn)紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ的影響1、配制苯甲酸鈉、乙酸鈉、l-苯丙氨酸3種前體溶液，在0.08mpa下滅菌20min；2、將黑曲霉bp12±3接種于pda液體培養(yǎng)基，28℃，180rpm，發(fā)酵培養(yǎng)至第5天，將3種前體分別加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中一瓶不加任何前體做為對照，前體添加量分別為l-苯丙氨酸終濃度3.0mg/l，乙酸鈉終濃度3.5g/l，苯甲酸鈉終濃度32.0mg/l；3、每種發(fā)酵培養(yǎng)基中均補加蔗糖溶液，終濃度5.0g/l；4、培養(yǎng)至第8天，通過實施例4所述的方法提取黑曲霉bp12±3代謝粗產(chǎn)物并采用高效液相色譜(hplc)對代謝抽提物中紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ進行定性和定量檢測，并計算紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ增長率，結(jié)果見表3。以l-苯丙氨酸為前體，巴卡亭ⅲ的產(chǎn)量增加最多，增長率為129.84％。結(jié)果表明，l-苯丙氨酸能夠作為一種有效的前體物質(zhì)，用于培養(yǎng)黑曲霉bp12±3并高效生產(chǎn)紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ。表3不同前體對黑曲霉bp12±3產(chǎn)紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ的影響當前第1頁12