本發(fā)明涉及養(yǎng)殖廢棄物處理領域，具體而言，涉及一株四環(huán)素降解菌，經鑒定為蠟狀芽孢桿菌，及其在畜禽糞便堆肥化處理中的應用。
背景技術：
四環(huán)素類抗生素在我國獸藥抗生素中生產和使用比例均高于其他獸藥抗生素，但其中30～90％的四環(huán)素類抗生素不能被動物完全吸收，將以原型或母體化合物的形式排出體外，在畜禽糞便中產生大量殘留。畜禽糞便應用過程中，殘留的獸藥抗生素可通過土壤的吸附、迀移、降解和植物吸收，以各種途徑進入到環(huán)境介質如土壤、水體及大氣中；也可在食物鏈累積迀移，最終通過攝食進入人體，構成對人類健康的潛在危害?；谏鲜錾鷳B(tài)安全威脅，有關畜禽糞便中殘留四環(huán)素類抗生素的降解及消除方法與途徑越來越受到人們的重視，已成為當前研究的重點和熱點。
四環(huán)素是四環(huán)素類抗生素的主要種類之一，目前已有多篇文章和專利報道了對其進行降解的方法，主要包括光電催化、理物-化學氧化、水解、礦物降解和微生物降解等方法。其中，微生物降解因其條件簡單、容易控制、專一性較強且不會引起二次污染的特點成為四環(huán)素主要降解途徑，也是最經濟有效的方法。微生物降解的主要功能物為降解微生物，在與抗生素的交互作用中，降解微生物可通過各類生物酶的作用將抗生素降解轉化為能源物質或對自身無毒害作用的其他代謝產物，從而降低甚至消除抗生素的生態(tài)風險。因此，篩選到合適的高效的降解菌株顯得尤為重要，微生物降解是一種很有潛力的處理有機污染物的方法，在工業(yè)生產的各個方面具有很高的推廣價值。目前報道的四環(huán)素降解微生物種類仍然較少，亟需補充新的菌種資源，且現有菌種的應用方法略顯單一，降解效率難再提高。
有鑒于此，特提出本發(fā)明。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的在于提供一株四環(huán)素降解細菌，該菌的四環(huán)素降解功能此前未見報道；進一步將該降解菌與堆肥化處理相結合應用于畜禽糞便處理中，完善優(yōu)化堆肥化處理工藝和條件，可顯著提高四環(huán)素降解效率，最終減少甚至消除堆肥產品四環(huán)素殘留。
為了實現本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術方案：
一株四環(huán)素降解菌，所述菌株經鑒定為蠟狀芽孢桿菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC NO.13546；保藏時間為：2017年01月09日。
篩選該菌的樣品為新鮮雞糞，培養(yǎng)于以四環(huán)素作為唯一碳源的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為30℃，170r/min搖床培養(yǎng)，通過多次轉接和耐受馴化，最終獲得能以四環(huán)素作為唯一碳源生長的降解菌菌液，應用連續(xù)梯度稀釋涂布的方法，吸取0.1mL降解菌菌液涂布于LB平板上，置于微生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，培養(yǎng)溫度為30℃，獲得降解菌單菌落并進行劃線純化。經生理生化及16S rRNA基因測序鑒定，本發(fā)明所述四環(huán)素降解菌為蠟狀芽孢桿菌，拉丁學名為Bacillus cereus，菌株名為TC-1，該菌是一種好氧、中溫和產芽孢的革蘭氏陽性桿菌，具有很強的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等活性，能產生抗菌素，目前已有大量研究報道了該菌在降解環(huán)境污染物如有機磷農藥、苯酚和芘污染物上的作用及對重金屬鎘、鉻和鉛等的強耐受性。
有關所述降解菌在四環(huán)素降解方面的研究未見報道。目前報道的四環(huán)素降解菌主要包括缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)和人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi)、無丙二酸檸檬酸桿菌(Citrobacter amalonaticus)和酵母菌Trichosporon mycotoxinivorans等。本發(fā)明篩選獲得的蠟狀芽孢桿菌TC-1能以四環(huán)素作為唯一碳源生長，具有降解性能，有利于豐富四環(huán)素降解菌資源庫，為四環(huán)素污染的治理提供有效的生物降解方法。
上述的經過分離純化的蠟狀芽孢桿菌，其為革蘭氏陽性細菌，菌落大，表面粗糙，扁平，不規(guī)則。菌體細胞桿狀，(1.0～1.2)×(3.0～5.0)微米。產芽孢，芽孢圓形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5微米，無莢膜，運動。
平板菌落形態(tài)：在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上，30℃，培養(yǎng)24h，可形成圓形或近似圓形、質地軟、無色素、稍有光澤的白色菌落(似蠟燭樣顏色)直徑5-7mm。在LB平板上菌落為灰白色，不透明，表面較粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀，菌落較大。
含有所述的蠟狀芽孢桿菌的菌劑也屬于本申請要求保護的范圍。對于該菌株而言，是只要能夠加入到含有四環(huán)素的有機物中即可發(fā)揮凈化的效果。然而在實際應用的過程中，考慮到其可能需要運輸及分解效率等原因，有必要將其擴大培養(yǎng)制成微生物菌劑的形式以擴大其應用范圍。
含有上述四環(huán)素降解菌的微生物菌劑，優(yōu)選的，所述微生物菌劑為液體菌劑，且在該液體菌劑中，活菌的數量是1×109-10CFU/mL。
該液體菌劑中，培養(yǎng)液可優(yōu)選為LB液體培養(yǎng)基、或者進一步添加葡萄糖、硫胺素、生物素和煙酸等營養(yǎng)物。
本發(fā)明基于上述的液體微生物菌劑提供了一種制備方法，包括以下步驟：
將如上所述菌株的菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液；
將所述培養(yǎng)液中的細菌培養(yǎng)物離心后用無菌水重懸，得到液體菌劑。
優(yōu)選的，所述培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：
28℃～32℃，150r/min～190r/min搖床培養(yǎng)10h～16h后轉接至新鮮LB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)60h～80h，獲得所述培養(yǎng)液。
如上所述的四環(huán)素降解菌或如上所述的微生物菌劑在畜禽糞便堆肥化處理中的應用。
一種畜禽糞便堆肥化處理的方法，將如上所述的微生物菌劑加入堆肥原料中進行堆肥化處理；所述堆肥原料包括畜禽糞便、蘑菇渣和米糠。
優(yōu)選的，所述畜禽糞便包括雞糞、豬糞、牛糞、羊糞、鴨糞等；最優(yōu)選采用雞糞和豬糞；
優(yōu)選的，將雞糞或豬糞、蘑菇渣和米糠按照比例(3～7)：(2～6)：1，更優(yōu)選5：4：1混合使用；
優(yōu)選的，如上所述的方法，加入所述微生物菌劑后，所述堆肥原料的水分含量控制在55wt％～60wt％得到堆體，所述微生物菌劑中的四環(huán)素降解菌在所述堆體中的初始含量為1.0×108～9CFU/g。
優(yōu)選的，如上所述的方法，所述堆肥化處理在密閉式堆肥反應器中進行，每隔2～3d翻堆一次所述堆體，正壓鼓風，堆體維持高溫55～65℃達5～8d，降溫至45℃以下后干燥所述堆體水分含量至30wt％～40wt％。
優(yōu)選的，如上所述的方法，所述堆肥化處理在槽式堆肥工藝條件下進行，供氧方式采用翻堆和曝氣兩種方式相結合。
優(yōu)選的，如上所述的方法，所述堆肥化處理具體包括：
調整所述堆肥原料的混合比例使所述堆體的碳氮比為28～32：1，將混合均勻的堆體推入堆肥槽進行堆肥化處理，堆肥化過程維持26～30d后將堆體移出堆肥槽，干燥所述堆體水分含量至30wt％～40wt％；
或；
調整所述堆肥原料的混合比例使所述堆體的碳氮比為28～32：1，將混合均勻的堆體推入堆肥槽進行堆肥化處理，堆肥化過程維持19～23d后再次在堆體中添加所述菌劑并調節(jié)堆體含水量至55wt％～60wt％，繼續(xù)處理5～9d后移出堆肥槽，干燥所述堆體水分含量至30wt％～40wt％。
為提高堆肥化處理效率，在原料混合物期間即接種降解菌，可有效降解堆體有機殘體，釋放養(yǎng)分，加快腐熟。在堆肥化處理高溫期結束時，再次接種降解菌，保障對未完全降解的殘留四環(huán)素的降解效率，減少甚至消除雞糞或豬糞堆肥化處理產品中的殘留四環(huán)素含量。制成的堆肥產品堆肥化處理周期短、腐熟度好、四環(huán)素殘留顯著減少，應用于土壤中可改善土壤團粒結構和作物根部環(huán)境，增強根系對養(yǎng)分的吸收，從而達到省時、高效、安全的效果。
與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：
提供了一株可應用于降解四環(huán)素類抗生素的菌株，該菌株具有較為寬泛的生長條件，可有效地實現消除殘留四環(huán)素類抗生素的危害的目的，為生物降解四環(huán)素類抗生素提供了一種新的途徑。
本申請?zhí)峁┑南灎钛挎邨U菌(Bacillus cereus)，菌株名為TC-1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏時間為：2017年01月09日，保藏編號CGMCC NO.13546。經保藏中心于2017年01月09日檢測為存活菌株。
具體實施方式
下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過購買獲得的常規(guī)產品。
實施例1
本發(fā)明處理目標物為新鮮雞糞，堆肥化處理添加的有機物料為蘑菇渣和米糠，所用雞糞中四環(huán)素初始含量為60mg/Kg。四環(huán)素降解菌發(fā)酵液中的降解菌數量為1.0×109CFU/mL。
堆肥化處理過程在密閉式堆肥反應器(VTD-100)中進行，具體步驟和工藝條件如下：
(1)將水分含量為80％的雞糞125kg、含水率為15％的蘑菇渣100kg、含水率為8％的米糠25kg用攪拌機混合均勻，此時混合堆料的水分含量約46％左右；分成2份，每份為125kg。
(2)其中一份添加上述四環(huán)素降解菌發(fā)酵液8L，與堆料進一步混合均勻后裝入堆肥反應器(VTD-100)，每箱裝堆料44kg，共裝3箱。
(3)另外一份作對照，添加清水8L，與堆料進一步混合均勻，然后裝入堆肥反應器(VTD-100)，同樣每箱裝堆料44kg，共裝3箱。
(4)堆肥反應器按相同的反應條件進行堆肥化試驗：每隔2-3d翻堆一次堆體，正壓鼓風，堆體維持高溫55～65℃達5d以上，降溫至45℃以下后干燥所述堆體水分含量至30wt％～40wt％。堆肥化處理進行28d。
堆肥化處理結束時，取樣分析其中四環(huán)素殘留量，結果見表1。本發(fā)明的應用方法堆肥產品中四環(huán)素殘留量顯著低于對照，對四環(huán)素的降解率達98.8％，而對照堆肥處理的降解率為80.6％。
表1 四環(huán)素降解菌在雞糞堆肥化處理中的應用結果
實施例2
本發(fā)明處理目標物為新鮮豬糞，堆肥化處理添加的有機物料為蘑菇渣和米糠，所用豬糞中四環(huán)素初始含量為78mg/Kg。四環(huán)素降解菌發(fā)酵液中的降解菌數量為1.0×109CFU/mL。
堆肥化處理過程在密閉式堆肥反應器(VTD-100)中進行，具體步驟和工藝條件如下：
(1)將水分含量為78％的豬糞125kg、含水率為15％的蘑菇渣100kg、含水率為8％的米糠25kg用攪拌機混合均勻，此時混合堆料的水分含量約46％左右；分成2份，每份為125kg。
(2)其中一份添加上述四環(huán)素降解菌發(fā)酵液8L，與堆料進一步混合均勻后裝入堆肥反應器(VTD-100)，每箱裝堆料44kg，共裝3箱。
(3)另外一份作對照，添加清水8L，與堆料進一步混合均勻，然后裝入堆肥反應器(VTD-100)，同樣每箱裝堆料44kg，共裝3箱。
(4)堆肥反應器按相同的反應條件進行堆肥化試驗：每隔2-3d翻堆一次堆體，正壓鼓風，堆體維持高溫55～65℃達5d以上，降溫至45℃以下后干燥所述堆體水分含量至30wt％～40wt％。堆肥化處理進行28d。
(5)堆肥化處理結束時，取樣分析其中四環(huán)素殘留量，結果見表2。本發(fā)明的應用方法堆肥產品中四環(huán)素殘留量顯著低于對照，對四環(huán)素的降解率達97.9％，而對照堆肥處理的降解率為82.4％。
表2 四環(huán)素降解菌在豬糞堆肥化處理中的應用結果
實施例3
本發(fā)明處理目標物為新鮮雞糞，堆肥化處理添加的有機物料為蘑菇渣和米糠，所用雞糞中四環(huán)素初始含量為60mg/Kg。四環(huán)素降解菌發(fā)酵液中的降解菌數量為1.0×109CFU/mL。
堆肥化處理過程采用槽式堆肥工藝進行，該工藝的供氧方式采用翻堆和曝氣兩種方式相結合。
以不添加四環(huán)素降解菌的常規(guī)堆肥為對照，按常規(guī)調整堆料的混合比例，使堆料C/N為30：1，含水率為55％左右。按1000kg堆料再添加清水50kg，進一步混合均勻，混合均勻的物料推入堆肥槽進行堆肥化處理。第28d將堆料移出堆肥槽，取樣檢測四環(huán)素殘留量：12.32mg/Kg，降解率為79.5％。
同樣按常規(guī)調整堆料的混合比例，使堆料C/N為30：1，含水率為55％左右。按1000kg堆料添加本發(fā)明的四環(huán)素降解菌發(fā)酵液50L，進一步混合均勻?；旌暇鶆虻奈锪贤迫攵逊什圻M行堆肥化處理。按與對照相同的堆肥工藝參數進行。至第28d將堆料移出堆肥槽，取樣檢測四環(huán)素殘留量結果：1.45mg/Kg，降解率達97.6％。
表3 四環(huán)素降解菌在雞糞堆肥化處理中的應用結果
實施例4
本發(fā)明處理目標物為新鮮豬糞，堆肥化處理添加的有機物料為蘑菇渣和米糠，所用豬糞中四環(huán)素初始含量為78mg/Kg。四環(huán)素降解菌發(fā)酵液中的降解菌數量為1.0×109CFU/mL。
堆肥化處理過程采用槽式堆肥工藝進行，該工藝的供氧方式采用翻堆和曝氣兩種方式相結合。
以不添加四環(huán)素降解菌的常規(guī)堆肥為對照，按常規(guī)調整堆料的混合比例，使堆料C/N為30：1，含水率為55％左右。按1000kg堆料再添加清水50kg，進一步混合均勻，混合均勻的物料推入堆肥槽進行堆肥化處理。第28d將堆料移出堆肥槽，取樣檢測四環(huán)素殘留量：11.26mg/Kg，降解率為85.6％。
同樣按常規(guī)調整堆料的混合比例，使堆料C/N為30：1，含水率為55％左右。按1000kg堆料添加本發(fā)明的四環(huán)素降解菌發(fā)酵液50L，進一步混合均勻。混合均勻的物料推入堆肥槽進行堆肥化處理。按與對照相同的堆肥工藝參數進行。至第28d將堆料移出堆肥槽，取樣檢測四環(huán)素殘留量結果：0.83mg/Kg，降解率達98.9％。
表4 四環(huán)素降解菌在豬糞堆肥化處理中的應用結果
實施例5
本發(fā)明處理目標物為新鮮雞糞，堆肥化處理添加的有機物料為蘑菇渣和米糠，所用豬糞中四環(huán)素初始含量為60mg/Kg。四環(huán)素降解菌發(fā)酵液中的降解菌數量為1.0×109CFU/mL。
堆肥化處理過程采用槽式堆肥工藝進行，該工藝的供氧方式采用翻堆和曝氣兩種方式相結合。
開始試驗前，以不添加四環(huán)素降解菌的常規(guī)堆肥為對照，按常規(guī)調整堆料的混合比例，使堆料C/N為30：1，含水率為55％左右。按1000kg堆料再添加清水50kg，進一步混合均勻，混合均勻的物料推入堆肥槽進行堆肥化處理。第28d將堆料移出堆肥槽，取樣檢測四環(huán)素殘留量：12.30mg/Kg，降解率為79.5％。
同樣按常規(guī)調整堆料的混合比例，使堆料C/N為30：1，含水率為55％左右。按1000kg堆料添加本發(fā)明的四環(huán)素降解菌發(fā)酵液50L，進一步混合均勻。混合均勻的物料推入堆肥槽進行堆肥化處理。按與對照相同的堆肥工藝參數進行。至第21d時，再次添加四環(huán)素降解菌發(fā)酵液10L，混合均勻繼續(xù)處理7d后移出堆肥槽，取樣檢測四環(huán)素殘留量結果：0.085mg/Kg，降解率達99.9％。
表5 四環(huán)素降解菌在雞糞堆肥化處理中的應用結果
盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內的所有這些變化和修改。