本發(fā)明屬于化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種功能多肽及其制藥用途，尤其涉及：(一)利用功能多肽對上述兩類核糖核酸的包裹、靶向性細胞內(nèi)運輸；(二)利用功能多肽運輸上述兩類核糖核酸實現(xiàn)的核糖核酸干擾治療；(三)利用功能多肽實現(xiàn)的核糖核酸干擾治療效果的實時評估。

背景技術(shù)：

核糖核酸干擾(rnainterference,rnai)是近年來發(fā)現(xiàn)的針對體內(nèi)特定靶基因進行調(diào)節(jié)的生物過程。在rnai過程中，小分子非編碼rna，如內(nèi)源性的微小核糖核酸(microrna,mirna)和外源性的小干擾核糖核酸(smallinterferingrna,sirna)可通過堿基互補配對的原則使它們的靶信使核糖核酸(mrna)被降解或抑制它們的翻譯。rnai不僅與體內(nèi)生理過程緊密相關(guān)，并且在眾多疾病的發(fā)生發(fā)展中也有著舉足輕重的作用。因而，sirna和mirna近年來已經(jīng)被視為可通過rnai實現(xiàn)治療目的的一類新型的先導(dǎo)藥物。然而，由于sirna和mirna本身的負電性及在血清等復(fù)雜生理環(huán)境中的不穩(wěn)定性，sirna和mirna的運輸仍然需要額外的載體實現(xiàn)，這就要求所用的載體需要具有優(yōu)良的生物相容性、可降解性及運輸操作過程的簡便性。另外，在rnai治療過程中仍有兩個需要解決的關(guān)鍵問題：運輸過程中如何實現(xiàn)sirna和mirna的靶向運輸以提高rnai治療的效率；運輸過程中如何實現(xiàn)rnai治療效果的實時成像以用于評估rnai治療的效率。

多肽是一類具有優(yōu)良生物相容性的化學(xué)分子，其可通過化學(xué)手段輕易修飾各類不同的功能基團，具有良好的生物應(yīng)用潛力。在本發(fā)明中，發(fā)明人發(fā)明了可在陽離子九聚精氨酸的兩端通過特定化學(xué)方法引入靶向細胞膜表面受體的分子，以及可對rnai治療效果評估的成像探針，利用得到的功能多肽可實現(xiàn)小干擾核糖核酸和微小核糖核酸的細胞內(nèi)靶向運輸、治療以及治療效果的實時成像。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：本發(fā)明提供一種功能多肽及其制藥用途，可實現(xiàn)小干擾核糖核酸和微小核糖核酸的細胞內(nèi)靶向運輸、治療以及治療效果的實時成像。

技術(shù)方案：功能多肽，結(jié)構(gòu)如下所示：

其中r代表l-構(gòu)型的精氨酸，x為連接基團，yy為靶向分子，pyr為吡唑啉熒光團，z為可被不同蛋白酶識別剪切的短肽，quencher為對應(yīng)于pyr的熒光淬滅基團；y或pyr-z-quencher可分別連接在九聚精氨酸的n端或c端。

上述x為含一至十個碳的烷基、低聚或多聚乙二醇、二硫鍵、酰胺鍵、酯鍵、醚鍵或三氮唑。

上述y為葉酸、透明質(zhì)酸、鏈狀rgd肽、環(huán)狀rgd肽、rvg肽、tat肽、mpg肽、eb1肽、egfr抗體或her2抗體。

上述z為蛋白酶底物肽段devd、plgvr、gpgpnq或kk。

上述quencher為dabcyl、qsy21或bhq。

上述pyr為光點擊化學(xué)反應(yīng)熒光產(chǎn)物吡唑啉，化學(xué)結(jié)構(gòu)特征如下：

其中x或z可以連接在任意位置上，ar1和ar2分別為苯環(huán)或萘環(huán)。

功能多肽的優(yōu)選結(jié)構(gòu)如fa-r9-fpcas3所示：

上述功能多肽在制備核糖核酸干擾診療藥物中的應(yīng)用。

上述功能多肽在篩選核糖核酸干擾診療藥物中的應(yīng)用。

有益效果：本發(fā)明提供的功能多肽及其制藥用途，可用于sirna和mirna細胞內(nèi)靶向運輸、治療及診斷。能夠?qū)崿F(xiàn)小干擾核糖核酸和微小核糖核酸的細胞內(nèi)靶向運輸、治療以及治療效果的實時成像。適用于制備核糖核酸干擾診療藥物，及篩選核糖核酸干擾診療藥物。

附圖說明

圖1為fa-r9-fpcas3的質(zhì)譜圖；

圖2為凝膠電泳分析圖；

圖3為納米顆粒尺寸及電位趨勢圖；

圖4為hela細胞內(nèi)mir-34a運輸定量分析圖；

圖5為hepg2、mcf-7、a549細胞內(nèi)mir-34a運輸定量分析圖；每組柱狀數(shù)據(jù)自左往右依次為blank、mirnc-nc、mirnc-34a、lipo-34a。

圖6為hela細胞內(nèi)熒光素酶實驗結(jié)果圖；

圖7為hela細胞內(nèi)sirt1、caspase-3蛋白表達測試結(jié)果圖；

圖8為hela細胞凋亡結(jié)果圖；

圖9為hela細胞內(nèi)mir-34a的功能實時成像結(jié)果圖；

圖10為hela細胞內(nèi)caspase-3蛋白量隨時間變化結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但是，應(yīng)理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的保護范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神下，可以對技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。

(一)功能多肽與sirna或mirna的納米復(fù)合物的制備

將功能多肽與sirna或mirna以一定比例稀釋于高糖培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖液中，混勻后置于室溫放置30分鐘。

(二)sirna和mirna的靶向運輸

選取細胞膜表面富含上述靶向基團受體的細胞系，將上述得到的rna納米復(fù)合物加入到細胞內(nèi)，一定時間后，提取細胞內(nèi)rna并用定量rt-pcr對細胞內(nèi)sirna或mirna的表達量進行測定。

(三)熒光素酶實驗

通過功能多肽運輸?shù)膕irna和mirna刺激細胞內(nèi)的熒光素酶信號變化判斷其生物活性，具體流程如下：

(1)構(gòu)建含有sirna或mirna結(jié)合位點的熒光素酶質(zhì)粒；

(2)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到測試細胞內(nèi)后，用功能多肽運輸相應(yīng)的sirna或mirna；

(3)72小時后測定細胞內(nèi)熒光素酶信號。

(四)蛋白印跡實驗

利用功能多肽運輸相應(yīng)的sirna或mirna到細胞內(nèi)，在培養(yǎng)不同時間后，提取細胞內(nèi)的總蛋白，利用sds-page進行分離，并將蛋白轉(zhuǎn)印到pvdf膜上后利用相應(yīng)抗體進行檢測。

(五)流式細胞凋亡測試

利用功能多肽運輸相應(yīng)的sirna或mirna到細胞內(nèi)。在培養(yǎng)不同時間后，收集細胞，利用細胞凋亡檢測試劑盒對凋亡細胞進行染色，并用流式細胞儀進行定量分析。

(六)共聚焦熒光成像

利用功能多肽運輸相應(yīng)的sirna或mirna到細胞內(nèi)。在培養(yǎng)不同時間后，利用pyr的熒光對運輸?shù)膕irna或mirna在細胞內(nèi)的功能進行直接成像。

實施例1、fa-r9-fpcas3的合成

1、pa-r(pbf)9的合成

通過標準固相合成方法，以氯三苯甲基氯樹脂為固相載體合成九聚精氨酸，最后在末端通過o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(hbtu)連接丁炔酸，隨后加入1％三氟乙酸(tfa)/二氯甲烷(體積比)從樹脂上切除，再用hplc分離得到pa-r(pbf)9。

2、1b的合成

通過標準固相合成方法，以氨基樹脂為固相載體合成devdk序列，最后在末端通過hbtu連接3-馬來酰亞胺基丙酸，隨后加入tfa切除保護基團，再用hplc分離得到中間產(chǎn)物。將37mg中間產(chǎn)物(0.049mmol)與18mgdabcylnhs酯(0.049mmol，百靈威)(溶解在dmso中，加入87μln，n-二異丙基乙胺(dipea，0.5mmol)，室溫反應(yīng)過夜，隨后用hplc分離得到1b(31mg，62.9％)。

3、tet-nh2的合成

將175mg化合物1a(1mmol)溶解在二氯甲烷中，隨后在冰浴條件下加入205mg氯甲酸異丁酯(1.5mmol)以及152mg4-甲基嗎啉(1.5mmol)，室溫攪拌4小時后加入237mg化合物1b(1mmol)。室溫下繼續(xù)反應(yīng)4小時后，柱層析分離得到283mg1c(71％)。將1c溶解于二氯甲烷中，加入50％(體積比)tfa，室溫反應(yīng)1小時后，蒸干溶劑后得到196mgtet-nh2(92.8％)。

其中1b的合成方法:

(1)化合物1b-1(1.5g，10mmol)和對甲基苯磺酰肼(1.86g，10mmol)溶于甲醇(50ml)及水(50ml)中，室溫攪拌5分鐘，析出大量白色固體，過濾得1b-23g(產(chǎn)率93％)。

(2)苯胺重氮鹽是通過將2ml冷的亞硝酸鈉溶液(5mmol)在5℃以下倒入含有1.3ml濃鹽酸的苯胺(5mmol)的50wt.％乙醇水溶液中制備得到。將重氮鹽滴加到30ml溶有1b(1.6g，5mmol)的吡啶溶液中，控制反應(yīng)溫度在-10℃至-15℃。滴加完全后繼續(xù)反應(yīng)3小時后，用二氯甲烷和水萃取反應(yīng)，有機層合并后用稀鹽酸洗滌并用無水硫酸鈉干燥。減壓蒸餾去除溶劑后，通過柱層析提出得到黃色粉末1b-30.7g(產(chǎn)率53％)。

(3)1b-3(0.6g，2.5mmol)溶解于dioxane(10ml)中，加熱回流(80℃)na2s(3g，7.5mmol)的水溶液(5ml)滴加到dioxane中。繼續(xù)加熱回流2小時，二氯甲烷和水萃取反應(yīng)，有機層合并后用無水硫酸鈉干燥。減壓蒸餾去除溶劑后，通過柱層析提出得到黃色粉末1b0.5g(產(chǎn)率80％)。

4、fa-n3的合成

將44mg葉酸(2a，0.1mmol)溶解于dmso中，加入51mg二環(huán)己基碳二亞胺(dcc，0.2mmol)以及22mgn-羥基琥珀酰亞胺(nhs，0.2mmol)。室溫反應(yīng)過夜后，濾去沉淀，加入44mg氨基三聚乙二醇疊氮(2b，0.2mmol，tci)以及61mg4-二甲氨基吡啶(dmap，0.5mmol)，室溫反應(yīng)4小時以后，用hplc分離得到fa-n3(15mg，23.4％)。

5、1a的合成

將175mg的pa-r(pbf)9(0.046mmol)與14mg的氨基修飾的四氮唑分子(tet-nh2)(0.046mmol)溶解在二氯甲烷中，隨后加入30mg的hbtu(0.08mmol)以及28μl的n，n-二異丙基乙胺(dipea，百靈威)(0.016mmol)?；旌弦涸谑覝叵聰嚢柽^夜，蒸去溶劑后，加入tfa切除保護基團，隨后用hplc分離得到1a(41mg，50.1％)。

5、r9-fpcas3的合成

將18mg的1a(0.01mmol)與20mg的1b(0.02mmol)溶解在乙腈/pbs的混合溶液中(ch3cn/pbs，體積比1/1)，隨后用發(fā)射波長為302nm的手提紫外燈光照30分鐘，隨即用hplc分離得到r9-fpcas3(18mg，65％)。

6、fa-r9-fpcas3的合成

將10mg的r9-fpcas3(0.0036mmol)與5mg的fa-n3(0.0072mmol)溶解在dmso/h2o的混合溶液中(dmso/h2o，體積比2/1)，隨后加入200mg抗壞血酸鈉，3.2mg的硫酸銅，50mg的thpta，在30℃反應(yīng)4小時。隨后用hplc分離得到fa-r9-fpcas3(3.6mg，29.4％)。分子量理論值為3398.7425，實際測量值為3399.4939(圖1)。

fa-r9-fpcas3對mir-34a的包裹

將100pmolemir-34a溶解于100μldmem中，后將0.2μl，0.4μl，0.6μl，0.8μl的5mmfa-r9-fpcas3分別加入到dmem中，得到幾組不同摩爾比的混合液，將混合液置于室溫中放置30分鐘。

凝膠電泳分析

配制2％瓊脂糖凝膠，分別取上述混合液進行電泳分析，并用溴化乙錠對mir-34a進行顯色。如圖2所示，在fa-r9-fpcas3的比例逐漸增加時，游離的mir-34a逐漸消失，表明兩者的納米復(fù)合物逐漸生成，且復(fù)合物的大小和電位也隨之變化(圖3)。

靶向細胞內(nèi)運輸

將hela細胞種入12孔板中，24小時后，將mir-34a或陰性對照nc與fa-r9-fpcas3的混合液加入到細胞培養(yǎng)基中，mir-34a或陰性對照nc的終濃度為100nm，培養(yǎng)24小時后，用trizol提取細胞內(nèi)rna。如圖4所示，當(dāng)fa-r9-fpcas3的摩爾比例逐漸增加時，進入細胞內(nèi)的mir-34a的量也逐漸增加，當(dāng)摩爾比例為30/1時達到最佳轉(zhuǎn)運效果，該比例的復(fù)合物定義為mirnc-34a，陰性對照為mirnc-nc，且轉(zhuǎn)運效率與商業(yè)化的試劑lipofectamine2000相當(dāng)。

取葉酸受體陰性的hepg2、mcf-7、a549細胞作為對照，進行上述相同實驗。如圖5所示，mirnc-34a向陰性細胞中轉(zhuǎn)運mir-34a的效率較低，驗證了靶向運輸?shù)哪芰Α?/p>

mirna表達量的測定

取出1μg的rna進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備相應(yīng)的cdna樣品。具體逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)10μl體系為：

5×amvbuffer(takara)2μl

amv(takara)0.5μl

rtprimer(abi)0.5μl

dntpmixture(takara)1μl

depch2o5μl

rna1μl

反應(yīng)程序為：16℃30min，42℃30min，85℃5min，4℃保存。制備好的cdna再用探針法(taqman)pcr對mir-122進行實時定量。

20μltaqmanpcr反應(yīng)體系為：

10×buffer(takara)2μl

mgcl2(25mm)(takara)1.2μl

taq(takara)0.3μl

dntpmixture(10mm)0.4μl

probe(abi)0.33μl

cdna1μl

distilledh2o14.77μl

pcr反應(yīng)程序為95℃5min，95℃15s后60℃1min40個循環(huán)擴增，實時熒光信號均在每個循環(huán)的60℃采集。

熒光素酶實驗

(1)報告質(zhì)粒的構(gòu)建

使用hindiii和spel(itakara)內(nèi)切酶剪切l(wèi)uciferase報告質(zhì)粒(promega)的3’utr端，將得到的片斷進行電泳分離純化。mir-34a的互補序列分別通過dna連接酶，t4ligase(takara)，插入到純化得到的luciferase報告質(zhì)粒中，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌內(nèi)，再通過含有氨芐的篩選平板篩選得到可能的陽性質(zhì)粒。最終將該報告質(zhì)粒進行測序確認其正確性(invitrogen)。

(2)熒光素酶分析

鑒定后的報告質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染進入hela細胞中。首先將細胞種到24孔板中，當(dāng)細胞密度達到70-80％時，將0.25μgmir-34a報告質(zhì)粒和0.15μgβ-galactosidase內(nèi)參質(zhì)粒用lipofectamine2000試劑轉(zhuǎn)染進細胞，轉(zhuǎn)染操作遵循invitrogen產(chǎn)品說明。在轉(zhuǎn)染4小時后，將mir-34a或陰性對照nc用fa-r9-fpcas3運輸?shù)郊毎?摩爾比1/30)，mir-34a或陰性對照nc的終濃度為100nm，繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，測定luciferase和β-galactosidase內(nèi)參信號。如圖6所示，mirnc-34a向細胞內(nèi)運輸?shù)膍ir-34a仍然具有抑制靶基因表達的功能。

蛋白印跡實驗

將hela細胞種入6厘米培養(yǎng)皿中，24小時后，將mir-34a或陰性對照nc與fa-r9-fpcas3的混合液(摩爾比1/30)加入到細胞培養(yǎng)基中，mir-34a或陰性對照nc的終濃度為300nm，培養(yǎng)24小時到72小時后，提取蛋白裂解液。將蛋白裂解液與1×sdsloadingbuffer混勻后，根據(jù)蛋白的大小選擇不同濃度(一般10％)的sds-page對樣品進行蛋白分離。蛋白成功分離后，將蛋白濕轉(zhuǎn)到pvdf膜上，再用含有5wt.％脫脂奶粉的tbst/tween-20緩沖液進行1小時封膜，然后用一抗4℃過夜孵育，tbst/tween-2010min洗滌四次，二抗室溫孵育1小時，再用tbst/tween-2010min洗滌四次，最后用ecl試劑顯影蛋白條帶。如圖7所示，相比于空白細胞或mirnc-nc處理的細胞，mirnc-34a處理的細胞內(nèi)mir-34a的直接靶標sirt1的表達量顯著下降，而下游的caspase-3表達量顯著上升，表明mir-34a具有調(diào)控功能。

流式凋亡檢測實驗

將hela細胞種入6孔板中，24小時后，將mir-34a或陰性對照nc與fa-r9-fpcas3的混合液(摩爾比1/30)加入到細胞培養(yǎng)基中，mir-34a或陰性對照nc的終濃度為300nm，培養(yǎng)24小時到72小時后，收集細胞并用流式凋亡檢測試劑盒進行染色，隨后用流式細胞儀式進行定量檢測。如圖8所示，相比于空白細胞或mirnc-nc處理的細胞，mirnc-34a處理的細胞凋亡顯著上升。

細胞內(nèi)mir-34a功能實時成像實驗

將hela細胞種入35毫米共聚焦培養(yǎng)皿中，24小時后，將mir-34a與fa-r9-fpcas3的混合液(摩爾比1/30)加入到細胞培養(yǎng)基中，mir-34a的終濃度為300nm，培養(yǎng)24小時到72小時后，在共聚焦熒光顯微鏡下直接觀察pyr的熒光，細胞核選用draq5染色。如圖9所示，在mirnc-34a處理后，對應(yīng)于激活caspase-3表達量的pyr熒光也隨孵育時間逐漸增強，而細胞表型也提示細胞逐漸凋亡。而蛋白印跡結(jié)果也驗證了成像結(jié)果(圖10)。

上述具體實施方式不以任何形式限制本發(fā)明的技術(shù)方案，凡是采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案均落在本發(fā)明的保護范圍。