技術領域
本發(fā)明屬于水產養(yǎng)殖中群體鑒定技術領域，具體的說是一種鑒定烏蘇里擬鲿性別的微衛(wèi)星標記與特異性引物及其在烏蘇里擬鲿雌、雄個體鑒定中的應用。
背景技術：
微衛(wèi)星(Microsatellites) 又稱簡單序列重復(Simple Sequence Repeats，SSR)是指由1-6個核苷酸組成的簡單串聯重復DNA 序列。迄今研究過的所有生物種類中都發(fā)現了它的存在，并且分布密度很大。由于微衛(wèi)星廣泛分布于基因組中，具有密度大、多態(tài)性豐富、高度雜合且穩(wěn)定性好、遵循孟德爾分離定律共顯性遺傳、易于PCR 擴增等特點，已成為近年來最引人注目的新型DNA 標記，并廣泛應用于生物資源的家系譜系認證、基因連鎖分析、遺傳圖譜構建、種質鑒定、種群遺傳多樣性等許多研究領域。
烏蘇里擬鲿（Pseudobagras ussuriensis）為鯰形目、鲿科、擬鲿屬魚類，在我國黑龍江至珠江水系均有分布。因其具有肉質細嫩、味道鮮美、無肌間刺、營養(yǎng)價值高、食性廣、病害少、市場形象佳等優(yōu)點，而倍受廣大消費者和養(yǎng)殖戶青睞。經過十多年的養(yǎng)殖試驗和推廣，目前烏蘇里擬鲿人工養(yǎng)殖已在全國多個省份開展。烏蘇里擬鲿具有明顯的性別生長差異，一般在一齡后這種差異更加明顯，表現為雄性生長速度和體型均明顯大于雌性。因此，全雄育種一直是研究者在該物種中進行育種研究的主要方向。
全雄育種中面臨的一個首要問題是如何快速、準確地鑒定目標個體的性別。雖然形態(tài)學方法可用于鑒別雌、雄個體，然而僅限于生理性別，對于激素處理后發(fā)生了性逆轉的個體的遺傳性別則無法鑒定。另外，雌、雄性形態(tài)特征在幼體階段很不明顯，難以通過形態(tài)進行性別鑒定。因此，需要建立一種快速、準確的方法，對烏蘇里擬鲿的雌、雄個體的遺傳性別進行有效鑒定。本團隊成員曾基于AFLP技術（Amplified Fragment Length Polymorphism）開發(fā)出1個雄性特異性SCAR標記（Sequence Characterized Amplified Regions），并成功應用于烏蘇里擬鲿的性別鑒定 (Pan ZJ, Li XY, Zhou FJ, Qiang XG, Gui JF. Identification of Sex-Specific Markers Reveals Male Heterogametic Sex Determination in Pseudobagrus ussuriensis. Marine Biotechnology, 2015,17(4): 441-451.）。然而，該方法仍存在不足之處，因為該標記是通過判斷某個個體在相應位點是否有擴增條帶來鑒定性別，如果某一個體在引物所在的側翼序列發(fā)生點突變，造成該個體中無擴增條帶，即出現了零等位基因（Null Allele），那么利用該標記對這類個體的性別判斷就可能出現錯誤。因此本發(fā)明開發(fā)了1個在烏蘇里擬鲿雌、雄間特異性微衛(wèi)星標記，該標記可排除零等位基因造成的性別鑒定錯誤，可以更加精確地對烏蘇里擬鲿的性別進行鑒定。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的是提供一種鑒定烏蘇里擬鲿雌、雄性別的微衛(wèi)星標記與特異性引物及其應用，即提供1個烏蘇里擬鲿性別特異性的微衛(wèi)星標記以及相應的PCR引物，為鑒定烏蘇里擬鲿雌、雄個體提供有效的工具。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種鑒定烏蘇里擬鲿雌、雄個體的方法。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案實現：
一種用于鑒定烏蘇里擬鲿雌、雄個體的微衛(wèi)星標記，該微衛(wèi)星標記的核苷酸序列為SEQ ID NO:1-2中的任一個。
一種特異性擴增如SEQ ID NO:1-2中任一所示微衛(wèi)星標記序列的引物對。
上述引物對上下游引物的序列如SEQ ID NO:3-4所示。
一種用于烏蘇里擬鲿雌、雄個體鑒定的試劑盒，該試劑盒包含上述的引物對。
上述的試劑盒還可以包括PCR技術常用的試劑。所述的PCR技術常用的試劑，根據實際情況，如Taq DNA 聚合酶、10×PCR Buffer、dNTPs、重蒸水、MgCl2。以上所述各種試劑的溶劑均為無菌超純水。
上述的微衛(wèi)星標記、引物對或試劑盒在烏蘇里擬鲿雌、雄個體鑒定中的應用。
一種鑒定烏蘇里擬鲿雌、雄個體的方法，包括如下步驟：
1）基因組總DNA抽提：抽提目標個體的基因組DNA；
2）微衛(wèi)星標記PCR 擴增：采用上述的引物對，以步驟1）獲得的目標個體基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得目標個體微衛(wèi)星PCR擴增產物；
3）擴增產物電泳檢測：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳及GoldView染色法檢測步驟2）獲得的微衛(wèi)星PCR擴增產物；
4）基因型分析：根據每個個體微衛(wèi)星PCR擴增產物的分子量大小確定基因型，若某一個體在該微衛(wèi)星標記表現為雌性等位基因型，則該個體為雌性；若某一個體在該位點表現為雄性等位基因型，則該個體為雄性。
上述方法的步驟4）中，若某一個體只在130 bp處有擴增條帶，則該個體為雌性；若某一個體在130 bp和118 bp處均有擴增條帶，則該個體為雄性。
步驟1）中采用苯酚-氯仿法抽提目標個體尾鰭組織的基因組DNA；但不限于此。
作為一種優(yōu)選技術方案：提取目標個體基因組DNA后，將其稀釋為30-50 ng/μL，每個PCR反應中加入1 μL，反應總體積為13 μL但不限于此。
作為一種優(yōu)選技術方案，所述PCR擴增的反應體系：以總體積13 μL為例，包含30-50 ng的模板DNA，0.5 U Taq DNA聚合酶，1.3 μL 10×PCR Buffer，0.5 μL dNTP (2.5 mM)，0.5 μL正反向混合引物（各2.5 μM），9.6 μL滅菌超純水；所述PCR擴增的程序為：95°C預變性5分鐘；（94°C變性40秒、54°C退火40秒、72°C延伸40秒）36個循環(huán)；最后72°C終延伸7分鐘，PCR產物于4°C保存。
作為一種優(yōu)選技術方案，步驟3）的詳細過程為：將微衛(wèi)星PCR擴增產物在10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，30 W 恒功率電泳2 小時10分鐘進行分離；將膠板通過1.5%的GoldView溶液顯色5-8分鐘，即可得到目標個體在該微衛(wèi)星座位的基因分型。
當引物的合成、基因組DNA 的提取、dNTPs 和Taq DNA 聚合酶試劑來自不同批次時，PCR 反應條件，包括退火溫度等都會發(fā)生一定的變化。所以每次進行大批量PCR 前，都要選擇少量個體進行溫度梯度、引物濃度梯度PCR，進行2％瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增效果，以確定最佳的PCR 反應條件。此外，由于所用到的引物對應的目標產物片段不超過300 bp，所以循環(huán)中的延伸時間均控制在45 秒左右。
應用上述引物和檢測技術可以高效鑒定烏蘇里擬鲿雌、雄個體，可對烏蘇里擬鲿自然群體和繁殖場群體的性別結構進行實時監(jiān)測，并可取代單純依靠表型特征進行性別鑒定的傳統(tǒng)檢測方法。
本發(fā)明與現有技術相比具有以下優(yōu)點：
（1）操作簡單，判斷準確；
（2）檢測速度快，由于等位基因數目少、易區(qū)分，無需進行復雜計算即可作出判斷；（3）分辨率高。
（4）根據本發(fā)明的方法開發(fā)出相應的檢測試劑盒，用于鑒定烏蘇里擬鲿雌、雄個體，本試劑盒具有使用方法簡便、快速、靈敏的優(yōu)點，不需要特殊的儀器，適合常規(guī)實驗室檢測的需要，且檢測結果可靠、穩(wěn)定、準確，為高效鑒定烏蘇里擬鲿雌、雄個體提供便利。
附圖說明
圖1為15尾雌性和12尾雄性烏蘇里擬鲿在微衛(wèi)星位點PuGT54的聚丙烯酰胺電泳帶型圖，泳道M為PBR322 DNA Marker。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍，下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如：J.薩姆布魯克等主編，科學出版社，2002，分子克隆實驗指南（第三版），或接照制造廠商所建議的條件。
實施例1 微衛(wèi)星位點的篩選
本發(fā)明中的1個烏蘇里擬鲿雌、雄間特異性微衛(wèi)星標記是通過兩輪嚴格篩選所獲得。技術人員通過磁珠富集法構建了烏蘇里擬鲿微衛(wèi)星富集文庫，并通過克隆測序獲得了含微衛(wèi)星重復的序列。從含有微衛(wèi)星的序列中，選取核心重復5次以上并符合引物設計要求的序列，采用Primer Premier5.0進行引物設計。主要參數設置為：引物長度20-25 bp，PCR 產物片段長度范圍120-350bp，最適退火溫度50-60℃。GC含量一般在40%-60%之間，盡量避免二級結構出現。最終成功獲得了61個可穩(wěn)定擴增的烏蘇里擬鲿微衛(wèi)星標記。
將這61個微衛(wèi)星標記在烏蘇里擬鲿雌、雄各5個個體中進行擴增，如果某一微衛(wèi)星標記在雌、雄間表現為不同的等位基因型，則將該位點保留用于下一輪篩選，若等位基因型無差別則直接淘汰。通過第一輪篩選后，再將篩選出的微衛(wèi)星標記在95尾雌性和90尾雄性個體中進行驗證，如果某一微衛(wèi)星標記仍在雌、雄間表現為不同的等位基因型，則將該位點保留；而如果出現了相同基因型，哪怕只有1個個體中出現，也需將其淘汰。通過這兩輪篩選后，即可獲得用于進行烏蘇里擬鲿雌、雄鑒定的微衛(wèi)星標記。最終篩選出1個可用于對烏蘇里擬鲿雌、雄個體進行分子鑒定的微衛(wèi)星標記（該微衛(wèi)星標記的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:12所示），標記的引物信息如下表所示：
實施例 2烏蘇里擬鲿雌、雄間特異性微衛(wèi)星標記鑒定PCR體系的組成與配制
A). PCR體系組成：
dNTPs（10 mM）為北京康為世紀公司產品；Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、10×PCR Buffer為大連TaKaRa公司產品；
B). 10×PCR Buffer組成：
Tris-HCl (pH8.3) 100 mM、KCl 500 mM、MgCl2 15 mM；
C). PCR反應體系配制：
總體積13 μL，包含30-50 ng的模板DNA，0.5 U Taq DNA聚合酶，1.3 μL 10×PCR Buffer，0.5 μL dNTP (2.5 mM)，0.5 μL正反向混合引物（各2.5 μM），9.6 μL滅菌超純水；
D). 聚丙烯酰胺凝膠配制：
30%（w/w）丙烯酰胺9 mL、5×TBE 5 mL、10%（w/w）過硫酸銨0.5 mL、TEMED 10 μL、蒸餾水12 mL。
實施例3烏蘇里擬鲿雌、雄間特異性微衛(wèi)星標記鑒定形態(tài)學上判斷的雌、雄個體
A). 取根據形態(tài)特征判斷為雌、雄的待鑒定個體各80尾，利用苯酚-氯仿法抽提每個個體尾鰭組織的基因組DNA，并將DNA稀釋至30-50 ng/μL的濃度。
B). 以A)步所提的基因組DNA為模板，按照實施例2 C)步的體系配制PCR反應混合液。
C). 在PCR儀上進行擴增，95°C預變性5分鐘；（94°C變性40秒、54°C退火40秒、72°C延伸40秒）36個循環(huán)；最后72°C終延伸7分鐘，PCR產物于4°C保存。
D). PCR產物用按照實施例2 D)步體系配制的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用1.5%的GoldView溶液對完成電泳電泳的凝膠進行染色，并用Gel DocTM EZ（美國Bio-RAD）凝膠成像儀對每張凝膠掃描并拍照保存。
E). 本發(fā)明中的種間特異性微衛(wèi)星標記在目標群體中進行PCR擴增后，將PCR產物在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，通過1.5%的GoldView溶液染色后即可在紫外凝膠成像儀上顯現群體中各個體的擴增帶型。通過以下方法進行雌、雄個體鑒別：在該微衛(wèi)星位點，若某一個體只在130 bp處有擴增條帶，則該個體為雌性；若某一個體在130 bp和118 bp處均有擴增條帶，則該個體為雄性，如圖1所示。
F). 本發(fā)明中的微衛(wèi)星標記鑒定出的雌性和雄性個體均與形態(tài)學鑒定的性別相吻合，說明該標記的鑒定率極高。
G). 本發(fā)明中的微衛(wèi)星標記對雌、雄個體的鑒定可有效排除零等位基因造成的性別鑒定錯誤。原因在于，該微衛(wèi)星標記擴增的條帶包括一條雌、雄個體共有的參考條帶（即大小為130 bp的條帶）和雄性個體特有的特異條帶（即大小118 bp的條帶），如果某個個體出現了零等位基因，僅憑特異條帶進行性別鑒定可能會造成錯誤判斷。然而，由于參考條帶的存在，如果出現零等位基因，則參考條帶也不能擴增，因此可避免將出現零等位基因的雄性個體判斷為雌性，從而提高了性別鑒定的準確性和可靠性。
SEQUENCE LISTING
<110> 淮陰師范學院
<120> 一種鑒定烏蘇里擬鲿雌、雄個體的微衛(wèi)星標記與特異性引物及應用
<130> 2017
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 359
<212> DNA
<213> 烏蘇里擬鲿（Pseudobagras ussuriensis）
<221> 烏蘇里擬鲿雌、雄個體的微衛(wèi)星標記核苷酸序列
<400> 1
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<212> DNA
<213> 烏蘇里擬鲿（Pseudobagras ussuriensis）
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 下游引物R
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