本發(fā)明涉及植物病害研究的農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種玉米穗腐、莖基腐等病害接種用帶菌牙簽的高效繁殖方法。

背景技術(shù)：

植物病害病原物、抗病性等鑒定是病害研究的重要內(nèi)容，而接種菌的繁殖又是其不可缺少的重要環(huán)節(jié)，簡便快速地獲得優(yōu)質(zhì)、足量的接種菌是人們探索重要方面。用帶菌牙簽接種是現(xiàn)有植物病害病原物接種技術(shù)常用的方法之一?，F(xiàn)有的帶菌牙簽繁殖方法就是先把牙簽、培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿或廣口瓶滅菌，然后在無菌條件下將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿或廣口瓶中，待培養(yǎng)基凝固后把牙簽插入其中，然后接種培養(yǎng)。這種帶菌牙簽繁殖方法存在一些局限：①種菌與牙簽結(jié)合不緊密，接種菌只是附著在牙簽上，菌種容易因摩擦而脫落；②牙簽上沒有營養(yǎng)，不利于菌種在牙簽上持續(xù)生長繁殖和不斷地提供菌源；③由于用的是一些培養(yǎng)皿、廣口瓶等器皿，不便于大量繁殖；④菌種往往先從培養(yǎng)基上某一接種點開始生長，然后再慢慢擴展至周圍的培養(yǎng)基和牙簽上，菌種長滿器皿中所有牙簽的速度較慢。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種易于大量高效地繁殖接種用帶菌牙簽的新方法。

本發(fā)明的植物病害接種用帶菌牙簽的繁殖方法，包括如下步驟：

(1)準備菌種 無菌條件下將植物病原菌接種在PDA平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)7~8d，菌種長滿平板后冷藏待用；

(2)浸泡麥粒 將麥粒放三角瓶中，用清水沖洗干凈后，浸泡12~24 h，中間沖洗一次，待麥粒吸足水后，再用清水沖洗2~3次，然后篦去三角瓶中的水，蓋上棉塞，待用；

(3)清洗牙簽 將牙簽在清水中浸泡12~24 h，用清水沖洗后在鍋中用清水煮10~15min，倒掉煮水再用清水沖洗2~3次，待用；

(4)牙簽滲入營養(yǎng) 將（3）處理后的牙簽放在容器中，加足量清水淹過牙簽，根據(jù)水量，按(1)中培養(yǎng)基制作的原料成份配比加入相應(yīng)量的營養(yǎng)成份即去皮馬鈴薯小塊和葡萄糖，一起煮20~30 min，待用；

(5)粘拌面粉 將小麥面粉加1%的瓊脂粉放在干燥的容器中拌勻，然后將（4）處理后表面濕潤的牙簽放入面粉中攪拌，使牙簽表面均勻地粘滿面粉，待用；

(6)裝袋滅菌 將（5）準備的牙簽輕放在菌袋中，使牙簽之間保持一定的空隙，裝滿后扎住菌袋口，與（2）準備的麥粒一起高壓滅菌20 min，待用；

(7)麥粒拌菌 無菌條件下，先用接種針或接種環(huán)將（1）準備的菌種連同培養(yǎng)基一起劃碎，再將其放入（6）處理后的裝麥粒的三角瓶中，攪拌麥粒，搖動三角瓶，使菌種混勻并粘附在麥粒上，待用；

(8) 牙簽接種 無菌條件下，將經(jīng)（7）處理的帶菌麥粒倒入經(jīng)（6）滅菌的牙簽袋中，輕輕扎住袋口，緩緩地轉(zhuǎn)動并左右上下翻動袋子，以便使麥粒上的菌種充分粘著到牙簽上，使麥粒均勻地分散在牙簽之間的縫隙中，待用；

(9) 培養(yǎng)與保存 將（8）準備的接種后牙簽袋放20~30℃溫度下培養(yǎng)7~10d，待牙簽表面長滿了菌，即完成帶菌牙簽的培養(yǎng)，對暫時不用的帶菌牙簽先將菌袋放4℃條件下冷藏保存，使用時，將帶菌牙簽從菌袋取出，把連成一團的牙簽輕輕分開即可。

所述PDA培養(yǎng)基制作的原料成份配比是：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15~20g，自來水1000ml。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：（1）可以進行大量繁殖；（2）多點接種，菌種在塑料袋的牙簽和麥粒上多點同時生長，繁殖速度快；（3）由于牙簽上粘著和滲入營養(yǎng)物質(zhì)，菌種直接在其上生長，因而菌種不僅生長茂密，而且與牙簽結(jié)合緊密，操作時菌種不易從牙簽上因磨蹭而脫落；（4）接種后牙簽上菌種可持續(xù)生長繁殖，能不斷地為接種部位提供菌源，保證接種效果；（5）操作方便、高效，易于推廣。

實施例1

采用本發(fā)明方法繁殖1000根帶菌接種牙簽，包括如下步驟：

(1)準備菌種 無菌條件下將禾谷鐮刀菌接種在直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)制作的PDA平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)7d，菌種長滿平板后冷藏待用；

(2)浸泡麥粒 稱取麥粒50g放在300ml三角瓶中，用清水沖洗干凈后，浸泡12 h，中間換一次水，麥粒吸足水后，再用清水沖洗2次，然后篦去三角瓶中的水，蓋上棉塞，待用；

(3)清洗牙簽 取1000根一端尖、另一端鈍圓帶槽、木質(zhì)疏松、表面粗糙的牙簽在清水中浸泡24 h，然后放在鍋中用清水煮10 min，倒掉煮水再用清水沖洗2次，待用；

(4)牙簽滲入營養(yǎng) 將1000根清洗干凈的牙簽放在容器中，加1000ml清水淹過牙簽，再在水中加入200g去皮馬鈴薯小塊和20g葡萄糖，一起煮30 min，待用；

(5)粘拌面粉 稱取小麥面粉50g和瓊脂粉0.5g放在干燥的容器中拌勻，然后將用營養(yǎng)水煮過的牙簽趁表面濕潤時放入面粉中攪拌，使牙簽表面均勻地粘滿面粉，待用；

(6)裝袋滅菌 將粘滿面粉的牙簽輕放在1個長36 cm、寬10cm的耐高壓菌袋中，使牙簽之間保持一定的空隙，裝完后輕輕扎住菌袋口，與（2）浸泡好的麥粒一起高壓滅菌20 min，待用；

(7)麥粒拌菌 無菌條件下，先用接種針或接種環(huán)將（1）準備的禾谷鐮刀菌菌種和培養(yǎng)基一起劃碎，再將其放入滅菌后的麥粒三角瓶中，攪拌麥粒，搖動三角瓶，使菌種混勻并粘附在麥粒上，待用；

(8)牙簽接種 無菌條件下，將三角瓶中粘附有禾谷鐮刀菌菌種的帶菌麥粒倒入滅菌后的牙簽袋中，輕輕扎住袋口，輕輕地轉(zhuǎn)動并左右上下翻動袋子，以便使麥粒上的菌種充分粘著到牙簽上，使麥粒均勻地分散在牙簽之間的縫隙中，待用；

(9)培養(yǎng)與保存 將接種后牙簽袋放20℃恒溫下培養(yǎng)10d，待牙簽表面長滿了菌，即完成帶菌牙簽的培養(yǎng)。對完成培養(yǎng)但暫時不用的帶菌牙簽先將菌袋放4℃條件下冷藏保存，使用時，將帶菌牙簽從菌袋取出，把連成一團的牙簽輕輕分開即可。

PDA培養(yǎng)基制作的原料成份配比是：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15~20g，自來水1000ml。

實施例2

采用本發(fā)明方法繁殖1000根帶菌接種牙簽，包括如下步驟：

(1)準備菌種 無菌條件下將禾谷鐮刀菌接種在直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)放置PDA平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)8d，菌種長滿平板后冷藏待用；

(2)浸泡麥粒 稱取麥粒30g放在300ml三角瓶中，用清水沖洗干凈后，浸泡24 h，中間換一次水，麥粒吸足水后，再用清水沖洗3次，然后篦去三角瓶中的水，蓋上棉塞，待用；

(3)清洗牙簽 取1000根一端尖、另一端鈍圓帶槽、木質(zhì)疏松、表面粗糙的牙簽在清水中浸泡12 h，然后放在鍋中用清水煮15 min，倒掉煮水再用清水沖洗3次，待用；

(4)牙簽滲入營養(yǎng) 將1000根清洗干凈的牙簽放在容器中，加1000ml清水淹過牙簽，再在水中加入200g去皮馬鈴薯小塊和20g葡萄糖，一起煮20 min，待用；

(5)粘拌面粉 稱取小麥面粉50g和瓊脂粉0.5g放在干燥的容器中拌勻，然后將用營養(yǎng)水煮過的牙簽、趁表面濕潤時將牙簽放入面粉中攪拌，使牙簽表面均勻地粘滿面粉，待用；

(6)裝袋滅菌 將粘滿面粉的牙簽輕放在1個長36 cm、寬10cm的耐高壓菌袋中，使牙簽之間保持一定的空隙，裝滿后扎住菌袋口，與（2）浸泡好的麥粒一起高壓滅菌20 min，待用；

(7) 麥粒拌菌 無菌條件下，先用接種針或接種環(huán)將（1）準備的直徑為9cm的培養(yǎng)皿平板培養(yǎng)基菌種1/2的禾谷鐮刀菌菌種和培養(yǎng)基一起劃碎，再將其放入滅菌后的麥粒三角瓶中，攪拌麥粒，搖動三角瓶，使菌種混勻并粘附在麥粒上，待用；

(8) 牙簽接種 無菌條件下，將三角瓶中粘附有禾谷鐮刀菌菌種的帶菌麥粒倒入滅菌后的牙簽袋中，輕輕扎住袋口，輕輕地轉(zhuǎn)動并左右上下翻動袋子，以便使麥粒上的菌種充分粘著到牙簽上，使麥粒均勻地分散在牙簽之間的縫隙中，待用；

(9) 培養(yǎng)與保存 將接種后牙簽袋放30℃恒溫下培養(yǎng)7d，待牙簽表面長滿了菌，即完成帶菌牙簽的培養(yǎng)。對完成培養(yǎng)但暫時不用的帶菌牙簽先將菌袋放4℃條件下冷藏保存，使用時，將帶菌牙簽從菌袋取出，把連成一團的牙簽輕輕分開即可。

PDA培養(yǎng)基制作的成份配比實施例1。