本發(fā)明屬農(nóng)林領(lǐng)域的植物組織培養(yǎng)技術(shù)，具體涉及降低植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基表面微生物污染的方法。
背景技術(shù)：
植物組織培養(yǎng)技術(shù)在種苗生產(chǎn)、脫除病毒、種質(zhì)改良等具有廣闊的市場前景。微生物污染（外植體自身污染和培養(yǎng)基污染）導(dǎo)致組培苗生長緩慢，甚至死亡，污染是影響組織培養(yǎng)成功和規(guī)?；a(chǎn)苗木的主要因素。
在組培的外植體誘導(dǎo)階段，微生物污染主要原因往往是外植滅菌消毒不徹底所致。但在繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)中的污染，給組培苗生產(chǎn)帶來的損失更大，這兩階段的污染主要由兩方面原因造成，一是植物材料內(nèi)部帶菌（簡稱內(nèi)生菌）引起污染，但最常見的是不確定的環(huán)境微生物所致的培養(yǎng)基表面污染，其原因有（1）搬運(yùn)、晃動(dòng)培養(yǎng)瓶基（瓶），瓶內(nèi)空間微生物沉降到培養(yǎng)基表面造成污染。（2）培養(yǎng)瓶雖經(jīng)高壓滅菌，但經(jīng)過長期選擇出現(xiàn)一些抗高壓高溫的細(xì)菌芽孢子，殘留于瓶內(nèi)壁及瓶蓋內(nèi)面上，當(dāng)培養(yǎng)基高壓滅菌后瓶內(nèi)壁聚集冷凝水，會(huì)連帶這些芽孢流到培養(yǎng)基表面而造成培養(yǎng)基污染。（3）在瓶內(nèi)長期培養(yǎng)的芽苗等繁殖體表面往往附著較多微生物，當(dāng)芽苗轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基時(shí)，附著的微生物被抖落到培養(yǎng)基表面，也造成培養(yǎng)基污染。
目前，降低培養(yǎng)基污染的常規(guī)方法有：嚴(yán)格按照技術(shù)規(guī)程進(jìn)行接種操作，接種室定期滅菌消毒，定期更換清洗超凈臺(tái)空氣過濾網(wǎng)，注意培養(yǎng)室整潔衛(wèi)生及溫濕度調(diào)控等，如專利申請?zhí)枺?00410053516.9。非常規(guī)方法是在培養(yǎng)基添加抗菌劑，如申請?zhí)枺?01410015541.1 在培養(yǎng)基添加茶多酚，申請?zhí)枺?01310184747.2 在培養(yǎng)基添加洋蔥、螃蟹殼粉，申請?zhí)枺?01610140530.5在培養(yǎng)基添加羧化殼聚糖、抗生素、惡霉靈、烏洛托品、霜霉威鹽酸鹽。申請?zhí)枺?01010142886.5 應(yīng)用乙蒜素、鏈·土霉素、氨基寡糖素水劑、ClO2、過氧乙酸、次氯酸鈉或三氯異氰尿酸。采用添加抗菌劑的技術(shù)關(guān)鍵是能有效抑制培養(yǎng)基微生物污染，且對瓶內(nèi)植物培養(yǎng)物生長發(fā)育沒有明顯負(fù)作用，由于不同植物生長發(fā)育對抗菌劑的敏感性不同，上述專利介紹的抗菌劑是否普遍適用于其他植物還不得而知，所以，在培養(yǎng)基添加抗菌劑的污染防控方法并沒普遍應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本申請的主要目的在于提供一種降低植物組培培養(yǎng)基污染的方法，采用天然熱可逆水凝膠，具有與植物組織相容性好，環(huán)境友好，價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，凝膠與水混合加熱融化，灌注到已經(jīng)高壓滅菌的固體培養(yǎng)基表面，冷卻形成一薄凝膠層，該凝膠層透氣良好，不影響插入培養(yǎng)基內(nèi)的植物組織（根）細(xì)胞呼吸代謝，此外,在配制培養(yǎng)基時(shí)添加吸附劑活性炭，以避免或減輕培養(yǎng)基營養(yǎng)成分滲透到凝膠層。采用該技術(shù)方法降低培養(yǎng)基污染原理為：凝膠層在物理上阻隔培養(yǎng)基與瓶內(nèi)空氣的直接接觸，由于凝膠層不添加營養(yǎng)成分，掉落在凝膠層表面的微生物無法繁殖，從而有效防止培養(yǎng)基表面的微生物污染。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：
一種降低植物組培培養(yǎng)基表面污染的方法，采用天然熱可逆水凝膠，與水混合或直接投入溫水，加熱制備成水溶膠，高壓滅菌，冷凝前在無菌環(huán)境灌注到含0.05-0.5活性炭的固體培養(yǎng)基（該培養(yǎng)基高壓滅菌后平放凝固），鋪滿培養(yǎng)基表面成0.1-1cm厚的溶膠層，冷卻形成一薄凝膠層，然后常規(guī)接種。
所述水凝膠原料為瓊脂、卡拉膠、結(jié)冷膠、果膠、魔芋膠、黃原膠等熱可逆水凝膠，一種單獨(dú)使用或幾種復(fù)配。其水溶膠制備方法分別為：瓊脂用量0.2%-1.5%，與水煮成溶膠，黃原膠用量0.2-0.7%，與水煮成溶膠；卡拉膠、結(jié)冷膠、果膠、魔芋膠加入膠凝促進(jìn)劑及水加熱成溶膠，卡拉膠用量0.2-0.7%，膠凝促進(jìn)劑為氯化鉀或硝酸鉀，終濃度0.003-0.06%；結(jié)冷膠用量0.1%-0.4%，膠凝促進(jìn)劑為氯化鈣或硝酸鈣，終濃度為0.02-0.04%；LM型果膠用量0.1-1.0%，膠凝促進(jìn)劑為氯化鈣或硝酸鈣，終濃度0.01-0.03%；魔芋膠用量0.1-0.7%，加堿液調(diào)pH大于8。
如用于灌注的溶膠因自然冷卻凝滯，可加熱溶化，繼續(xù)灌注培養(yǎng)基。
本項(xiàng)技術(shù)在培養(yǎng)基表面制備凝膠層，對培養(yǎng)基起到阻隔保護(hù)作用，有效防止瓶內(nèi)環(huán)境微生物所致的培養(yǎng)基污染。該方法成本低廉、操作簡易，對植物生長沒有毒副作用，且對所培養(yǎng)植物沒有專一性，解決了培養(yǎng)基表面污染這一行業(yè)共性問題，具推廣普及可行性。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一
1．常規(guī)方法制備培養(yǎng)基（對照），配方為MS+ 2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+3%蔗糖，調(diào)pH5.8，培養(yǎng)基容器為反復(fù)使用過的玻璃瓶，常規(guī)高壓消毒，冷卻后可看見瓶內(nèi)壁聚集冷凝水。
2. 處理組培養(yǎng)基配方同對照，即MS+ 2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+3%蔗糖，附加0.1%活性炭，調(diào)pH5.8，培養(yǎng)基容器同對照（即為反復(fù)使用過的玻璃瓶），高壓消毒后放在平整桌面，自然冷卻，可看見瓶內(nèi)壁聚集冷凝水。0.8%的瓊脂與水煮沸，裝瓶高壓滅菌成溶膠，用于制備凝膠層。
3.在超凈臺(tái)吸取未冷凝瓊脂溶膠,灌注到培養(yǎng)基表面成約0.2cm厚的溶膠層，培養(yǎng)瓶加蓋，平放，自然冷卻凝固。
4.常規(guī)方法制備的培養(yǎng)基（對照），由于瓶內(nèi)壁冷凝水重力作用流到培養(yǎng)基表面，7天后在積水處長滿細(xì)菌菌落，處理組培養(yǎng)基瓶內(nèi)壁冷凝水雖然流到凝膠層表面，并沒發(fā)現(xiàn)微生物污染，說明本申請技術(shù)能有效抑制培養(yǎng)基污染。
實(shí)施例二
1．常規(guī)方法制備培養(yǎng)基（對照），配方為MS+ 2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+3%蔗糖+0.8%瓊脂，調(diào)pH5.8，高壓消毒。
2. 處理組培養(yǎng)基配方同對照，即MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+3%蔗糖+0.8%瓊脂，附加0.2%活性炭，調(diào)pH5.8，高壓消毒后放在平整桌面，自然冷卻。制備凝膠層所用凝膠為0.3%卡拉膠加0.3%黃原膠，膠凝促進(jìn)劑為0.05%的氯化鉀，混合加水煮沸至完全融化，裝瓶高壓滅菌成溶膠。
3.在超凈臺(tái)吸取未冷凝的溶膠,灌注到培養(yǎng)基表面成0.3cm厚的溶膠層，培養(yǎng)瓶加蓋，平放，自然冷卻凝固。
4.接種長期繼代的老化鐵皮石斛瓶苗，葉片帶菌，對照為常規(guī)方法制備的培養(yǎng)基，培養(yǎng)1個(gè)月，培養(yǎng)基表面污染率40%，采用本申請技術(shù)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)1個(gè)月，培養(yǎng)基表面沒有污染。對照組未被污染鐵皮石斛苗長勢（高度、葉數(shù)、顏色）與處理組沒顯著差異，說明本申請技術(shù)能有效抑制培養(yǎng)基污染。