本發(fā)明涉及煙用添加劑領(lǐng)域，具體涉及利用固定化乳酸菌制備煙用苦杏仁提取物的制備方法。
背景技術(shù)：
加香加料是卷煙工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是完善產(chǎn)品風(fēng)格的決定因素和提高卷煙香氣質(zhì)量的有效手段之一。目前煙用香精香料主要還是通過對(duì)天然動(dòng)植物的提取、化學(xué)合成制備。由于受到天然植物資源有限以及化學(xué)合成條件較苛刻限制。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，近年來，利用微生物發(fā)酵法制備煙用香原料，為煙用香原料的生產(chǎn)提供一條經(jīng)濟(jì)、高效的途徑，開發(fā)一些傳統(tǒng)方法無法生產(chǎn)的新型煙用香原料。
微生物固定化技術(shù)，是將特選的微生物固定在選證的載體上，使其高度密集并保持生物活性，在適應(yīng)條件下能夠快速、大量增殖的生物技術(shù)，能夠彌補(bǔ)懸浮微生物發(fā)酵處理效率低、固液分離困難、抗毒性差等缺點(diǎn)。因此，近年來，微生物固定化技術(shù)的研究非常活躍，發(fā)展較快，已應(yīng)用到許多工業(yè)部門如食品發(fā)酵工業(yè)，環(huán)境保護(hù)，新能源開發(fā)以及生物傳感器等，并取得了深入發(fā)展，顯示出了強(qiáng)大的優(yōu)越性。主要涉及到以下幾個(gè)方面：在食品發(fā)酵工業(yè)中用于生產(chǎn)乙醇、啤酒、酸奶等；在環(huán)境保護(hù)中用于環(huán)境監(jiān)測(cè)和工業(yè)廢水的處理；在新能源開發(fā)中用于生產(chǎn)氫氣、甲烷、生化電池、微生物電池等；固定化微生物還可作為分子識(shí)別元件，用于制作各種生物傳感器。而隨著固定微生物技術(shù)的不斷成熟、完善，逐漸向高效低能耗、低成本、簡(jiǎn)單化、安全自動(dòng)化、無污染等方向發(fā)展，在能源危機(jī)、資源短缺、環(huán)境污染日趨嚴(yán)重的情況下，由此將推動(dòng)其在廢水處理方面更加深入和廣泛的應(yīng)用，具有更加深遠(yuǎn)的意義。尤其在廢水處理方面，具有很大的應(yīng)用前景。但在利用微生物固定化技術(shù)制備煙用苦杏仁提取物卻未見報(bào)道。
苦杏仁，別名杏仁(學(xué)名：semenarmeniacaeamarum.)為薔薇科植物山杏的干燥成熟種子。夏季采收山杏成熟果實(shí)，除去果肉和核殼，取出種子曬干，制得苦杏仁。主要產(chǎn)于內(nèi)蒙古、吉林、遼寧、河北、山西、陜西等地?？嘈尤手髦喂δ苡薪禋庵箍绕酱?，潤(rùn)腸通便。用于治療咳嗽氣喘，胸滿痰多，血虛津枯，腸燥便秘等病癥。以苦杏仁為原料的苦杏仁浸膏、苦杏仁提取物在卷煙中應(yīng)用廣泛，具有豐富煙香、增加苦杏仁特征香韻的作用。
乳酸菌(lacticacidbacteria，lab)是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱。該菌在發(fā)酵過程中不僅能產(chǎn)生減少卷煙刺激性的和柔和細(xì)膩煙氣作用的乳酸，還能產(chǎn)生賦予卷煙特有風(fēng)格的風(fēng)味物質(zhì)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種固定化乳酸菌制備煙用苦杏仁提取物的方法，采用固定化乳酸菌發(fā)酵技術(shù)，開發(fā)了一種新型的苦杏仁提取物，該提取物可以在卷煙中使用，能夠豐富煙香，增加苦杏仁特征香韻、甜香香韻和酸香香韻，提升卷煙香氣質(zhì)，增加卷煙香氣透發(fā)性，增加煙氣生津感，柔和細(xì)膩煙氣，降低刺激性，改善喉部舒適性，掩蓋雜氣。
本發(fā)明提供一種固定化乳酸菌制備煙用苦杏仁提取物的方法，其特征在于具體包括以下步驟：
(1)取苦杏仁，加入其重量2～5倍的水，浸泡12-24h，在95～100℃下回流提取2～3次，每次提取時(shí)間為5～8小時(shí)，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并多次提取液，得到苦杏仁提取物a；
(2)將乳酸菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為50rpm的條件下培養(yǎng)48小時(shí)，取培養(yǎng)液于8000rpm下離心，離心后的濕菌體備用；
(3)乳酸菌的聚乙烯醇—海藻酸鈉固定化：采用聚乙烯醇水溶液與海藻酸鈉水溶液配制含質(zhì)量百分比6％～10％的聚乙烯醇和質(zhì)量百分比1％～3％的海藻酸鈉的混合溶液，然后向混合溶液中加入總?cè)芤后w積的2～5％的步驟(2)中制備的乳酸菌濕菌體，配制成混合液，用蠕動(dòng)泵經(jīng)過1～5mm孔徑的針頭將配制好的混合液逐滴加入到cacl2的質(zhì)量百分比為1～3％的硼酸飽和溶液中交聯(lián)1h形成小球，然后將小球取出再加入飽和na2so4溶液中交聯(lián)3-5h，得pva-sa固定化乳酸菌小球，最后采用無菌水沖洗，烘干備用；
(4)將苦杏仁提取物a與步驟(3)中制備的固定化乳酸菌小球按照質(zhì)量比5～10:1混合，在溫度為30～37℃，攪拌轉(zhuǎn)速為1～5rpm的條件下發(fā)酵3～5d，然后置于4℃冷柜中靜置7～14d；
(5)將步驟(4)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，料液厚度為1～2厘米，真空度為10pa，干燥時(shí)間為6～12h；
(6)將步驟(5)冷凍干燥后的發(fā)酵液，加入其質(zhì)量2～4倍的80～95％酒精溶液，沉淀24～48小時(shí)，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對(duì)密度為1.20～1.25，得苦杏仁提取物。
本發(fā)明中采用的乳酸菌為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pjh05，于2012年1月5日保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為：cctccno：m2012002。
本發(fā)明采用的微生物固定化技術(shù)具有發(fā)酵處理效率高、固液分離容易、抗毒性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)生物工藝的不足。
本發(fā)明以苦杏仁為原料，利用固定化乳酸菌發(fā)酵苦杏仁提取物，獲得了一種品質(zhì)優(yōu)良的煙用苦杏仁提取物，該提取物在卷煙中具有豐富煙香，增加苦杏仁特征香韻、增加甜香香韻、提升卷煙香氣質(zhì)、增加卷煙香氣透發(fā)性，增加煙氣生津感，柔和細(xì)膩煙氣，降低刺激性，改善喉部舒適性、掩蓋雜氣等作用，還能賦予卷煙特色的酸香風(fēng)格。與現(xiàn)有苦杏仁浸膏和苦杏仁提取物相比，該苦杏仁提取物在卷煙中降低激性和柔和細(xì)膩煙氣的效果較明顯，同時(shí)還賦予卷煙特色的酸香風(fēng)格；與懸浮乳酸菌發(fā)酵相比，該方法制備的苦杏仁提取物有機(jī)酸含量增加了2.25％～6.38％，卷煙效果評(píng)價(jià)中，口腔余味更加舒適，生津感更好，香氣更加豐富。該方法替代了苦杏仁提取物傳統(tǒng)的提取技術(shù)，更新了生物發(fā)酵制備工藝，使得其能夠在卷煙中適用性增加，對(duì)煙用苦杏仁提取物的制備提供了一條新途徑。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
本發(fā)明中采用的乳酸菌為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pjh05，于2012年1月5日保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為：cctccno：m2012002。
本發(fā)明以下實(shí)施例中的pva-sa(聚乙烯醇-海藻酸鈉)固定化乳酸菌小球是按照以下方法采用聚乙烯醇(pva)和海藻酸鈉(sa)對(duì)乳酸菌進(jìn)行固定化得到的：
(1)將乳酸菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為50rpm的條件下培養(yǎng)48小時(shí)，取培養(yǎng)液于8000rpm下離心，離心后的濕菌體備用；上述方法中養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)為常用的普通肉湯培養(yǎng)基，其具體配方為(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，最終ph7.3±0.1；
(2)乳酸菌的聚乙烯醇—海藻酸鈉固定化：采用聚乙烯醇水溶液與海藻酸鈉水溶液配制含質(zhì)量百分比6％-10％的聚乙烯醇和質(zhì)量百分比1％-3％的海藻酸鈉的混合溶液，然后向混合溶液中加入總?cè)芤后w積的2-5％的步驟(2)中制備的乳酸菌濕菌體，配制成混合液，用蠕動(dòng)泵經(jīng)過1-5mm孔徑的針頭將配制好的混合液逐滴加入到cacl2的質(zhì)量百分比為1-3％的硼酸飽和溶液中，交聯(lián)1h形成小球，然后將小球取出再加入飽和na2so4溶液中交聯(lián)3-5h，得pva-sa固定化乳酸菌小球，最后采用無菌水沖洗，烘干備用；所述含有1-3％cacl2的硼酸飽和溶液的量和并飽和na2so4溶液的兩無特殊要求，含有1-3％cacl2的硼酸飽和溶液只需要能夠使混合液產(chǎn)生沉淀，滿足乳酸菌的固定化要求即可，na2so4溶液的只需要將小球完全浸泡便可；所述硼酸飽和溶液和飽和na2so4溶液均為飽和水溶液。
實(shí)施例1，一種固定化乳酸菌制備煙用苦杏仁提取物的方法，包括以下步驟：
(1)向苦杏仁中按重量加入5倍的水，浸泡24h，在100℃下回流提取2次，每次提取時(shí)間為5小時(shí)，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并兩次提取液，得到苦杏仁提取物a，兩次提取的條件完全相同；
(2)將苦杏仁提取物a與上述方法制備的pva-sa固定化乳酸菌小球按照質(zhì)量比5:1混合，在溫度為30℃，攪拌轉(zhuǎn)速為5rpm的條件下發(fā)酵4d,然后置于4℃冷柜中靜置7d；
(3)將步驟(2)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，料液厚度為1～2厘米，真空度為10pa，干燥時(shí)間為9h；
(4)取步驟(3)冷凍干燥后的發(fā)酵液，加入其質(zhì)量2倍的80～95％酒精溶液，沉淀24小時(shí)，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對(duì)密度為1.20，得苦杏仁提取物。
實(shí)施例1中制備的苦杏仁提取物在卷煙中具有豐富煙香，增加苦杏仁特征香韻、甜香香韻和酸香香韻，提升卷煙香氣質(zhì)，增加卷煙香氣透發(fā)性，增加煙氣生津感，柔和細(xì)膩煙氣，降低刺激性，改善喉部舒適性，掩蓋雜氣。
實(shí)施例2，一種固定化乳酸菌制備煙用苦杏仁提取物的方法，包括以下步驟：
(1)取苦杏仁花，加入其重量8倍的水，浸泡12h，然后在95℃下回流提取3次，每次提取時(shí)間為8小時(shí)，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并三次提取液，得到苦杏仁提取物a；三次提取的條件完全相同；
(2)將苦杏仁提取物a與制備的固定上述方法中制備的pva-sa固定化乳酸菌小球按照質(zhì)量比8:1混合，在溫度為33℃，攪拌轉(zhuǎn)速為4rpm的條件下發(fā)酵3d，然后置于4℃冷柜中靜置12d；
(3)將步驟(2)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，料液厚度為1～2厘米，真空度為10pa，干燥時(shí)間為12h；
(4)取步驟(3)冷凍干燥后的發(fā)酵液，加入其質(zhì)量2倍的80～95％酒精溶液，沉淀36小時(shí)，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對(duì)密度為1.20，得苦杏仁提取物。
實(shí)施例2中制備的苦杏仁提取物具有豐富煙香，增加苦杏仁特征香韻、甜香香韻和酸香香韻，提升卷煙香氣質(zhì)，增加卷煙香氣透發(fā)性，增加煙氣生津感，柔和細(xì)膩煙氣，降低刺激性，改善喉部舒適性，掩蓋雜氣。
實(shí)施例3，一種固定化乳酸菌制備煙用苦杏仁提取物的方法，包括以下步驟：
(1)取苦杏仁，加入其重量5倍的水，浸泡18小時(shí)，然后在98℃下回流提取3次，每次提取時(shí)間為7小時(shí)，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并三次提取液，得到苦杏仁提取物a；三次提取條件完全相同；
(2)將苦杏仁提取物a與上述方法制備的pva-sa固定化乳酸菌小球按照質(zhì)量比10:1混合，在溫度為36℃，攪拌轉(zhuǎn)速為2rpm的條件下發(fā)酵5d；
(3)將步驟(2)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，料液厚度為1～2厘米，真空度為10pa，干燥時(shí)間為7h；
(4)取步驟(3)冷凍干燥后的發(fā)酵液，加入其質(zhì)量2倍的80～95％酒精溶液，沉淀24小時(shí)，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對(duì)密度為1.20，得苦杏仁提取物。
實(shí)施例3中制備的苦杏仁提取物具有豐富煙香，增加苦杏仁特征香韻、甜香香韻和酸香香韻，提升卷煙香氣質(zhì)，增加卷煙香氣透發(fā)性，增加煙氣生津感，柔和細(xì)膩煙氣，降低刺激性，改善喉部舒適性，掩蓋雜氣。
對(duì)比實(shí)驗(yàn)，申請(qǐng)人將本發(fā)明制備的苦杏仁提取物與現(xiàn)有傳統(tǒng)提取方法制備的苦杏仁提取物、采用懸浮乳酸菌發(fā)酵制備的苦杏仁提取物按照正常加香方式添加到煙絲中，制成卷煙，并進(jìn)行評(píng)吸，其評(píng)吸效果如下：
三種不同工藝制備的苦杏仁提取在卷煙中的感官評(píng)價(jià)效果比較
從上述對(duì)比實(shí)驗(yàn)可以看出來，本發(fā)明中制備的苦杏仁提取物添加到卷煙中效果更好，而且根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，與懸浮乳酸菌發(fā)酵相比，該方法制備的苦杏仁提取物有機(jī)酸含量增加了2.25％～6.38％，卷煙效果評(píng)價(jià)中，口腔余味更加舒適，香氣更加豐富。