本發(fā)明涉及單光子光學材料領域，具體地說涉及一種可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針及其制備方法。

背景技術：

利用活細胞成像工作站進行細胞和基因的功能研究，是生物醫(yī)學研究的最新趨勢。固定細胞觀察僅能提供固定瞬間細胞的靜態(tài)信息，無法反映細胞在正常生理生化條件下的狀態(tài)活細胞觀察，對處于正常生理狀況下的細胞進行全程掃描和記錄，獲得其連續(xù)、全面、動態(tài)過程。由于其顯示的正常細胞動態(tài)的活動過程，很容易發(fā)現和確定細胞間相互作用和信號傳導的過程，以及在活細胞水平上的生物分子間的相互作用，不僅可以解決長期以來懸而未解的問題，更為未來的研究提出新的問題，指出新的方向。

化學熒光探針在對客體的識別過程中展現出較好的選擇性，因而，在環(huán)境監(jiān)測、分子催化和生物熒光成像等領域展具有潛在的應用價值，受到廣泛關注?；瘜W熒光探針主要利用測試過程中發(fā)生的熒光信號變化(增強、減弱或發(fā)射波長位移等)對客體進行檢測，具有成本低廉、操作簡單、檢測限低、靈敏性和選擇性高等優(yōu)點?；罴毎上窦夹g正是利用這些熒光探針，比如小分子有機染料或者量子點來特異性的標記感興趣的分子。

銅是人體內第三大過渡金屬元素，銅與蛋白質結合生成的酶，參與氧處理過程，也可以作為催化劑促進人體機能的正常運行。低濃度的銅離子是人體內一個重要的微量營養(yǎng)素，高濃度的銅離子對人體卻是有毒的，如果在大腦和肝臟積累大量過剩的銅離子，則會導致老年癡呆癥、帕金森、朊病毒、門克斯和威爾遜氏病。因此，在生物環(huán)境中檢測低濃度的銅離子是非常重要的。

線粒體是細胞的能量工廠，參與眾多的新陳代謝過程，許多病理學過程均與它相關，是一種重要的細胞器，一直以來都是研究的熱點。因此，利用熒光探針對線粒體的動態(tài)形態(tài)進行實時成像，能夠為我們診斷、治療疾病提供了重要的手段。

因此如果能研究出一種可檢測活細胞線粒體的，且能裸眼識別銅離子的可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針，將會對疾病的診斷、治療具有重大的意義。

技術實現要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針及其制備方法，該生物探針具備低毒性和良好的光學性能，能夠在細胞線粒體部位成像，并且對銅離子有可逆的探測能力。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案：一種可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針，其結構式如下：

本發(fā)明還提供上述可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針的制備方法，包括以下步驟：

A、中間體I的制備

冰浴條件下，向N,N-二甲基甲酰胺中依次加入三氯氧磷和三苯胺，然后升溫至40～70℃進行反應，反應結束后，在弱堿性溶液中析出固體，之后經過濾、提純，得到中間體I；

B、中間體II的制備

將中間體I溶于甲醇中，然后加入NaBH₄進行反應，反應結束后，加入水析出固體，之后經過濾、洗滌、干燥，得到中間體II；

C、中間體III的制備

將KI、PPh₃、HAc、CHCl₃和Aliquat336加入到中間體II中，然后在60～100℃的條件下進行反應，反應結束后，經旋干、重結晶，得到中間體III；

D、中間體IV的制備

N₂保護下，將3-羥基-4-硝基苯甲醛、K₂CO₃、N,N-二甲基乙酰胺和Aliquat336加入到中間體III中，然后在100～160℃的條件下進行反應，反應結束后，經水洗、萃取、提純，得到中間體IV；

E、中間體V的制備

N₂保護下，將中間體IV溶于乙醇中，再加入Pd/C和水合肼，然后在50～80℃的條件下進行反應，反應結束后，經過濾、重結晶，得到中間體V；

F、中間體VI的制備

將中間體V溶于甲醇中，再加入2-吡啶甲醛和冰乙酸，然后在60～90℃的條件下進行反應，反應結束后，冷卻析出固體，之后經過濾，得到中間體VI；

G、目標產物L的制備

將中間體VI溶于甲醇中，再加入硼氫化鈉，然后在10～40℃的條件下進行反應，反應結束后，經過濾、洗滌、干燥，得到目標產物L，即為所述可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針。

進一步地，所述三苯胺是以與氯仿配制成溶液的形式加入的。這樣設計可以保證反應充分進行。

進一步地，步驟A中，N,N-二甲基甲酰胺、三氯氧磷和三苯胺的摩爾比為1:1:1。采用此摩爾比，可保證反應目標產物具有較高的產率、純度。

進一步地，步驟B中，中間體I和NaBH₄的摩爾用量比為1:1。采用此摩爾比，可保證反應目標產物具有較高的產率、純度。

進一步地，步驟C中，中間體II、KI和PPh₃的摩爾用量比為1:1:1。采用此摩爾比，可保證反應目標產物具有較高的產率、純度。

進一步地，步驟D中，中間體III、3-羥基-4-硝基苯甲醛和K₂CO₃的摩爾用量比為2:1:1。采用此摩爾比，可保證反應目標產物具有較高的產率、純度。

進一步地，步驟F中，中間體V和2-吡啶甲醛的摩爾用量比為1:1。采用此摩爾比，可保證反應目標產物具有較高的產率、純度。

進一步地，步驟G中，硼氫化鈉和中間體VI的摩爾用量比為2:1。采用此摩爾比，可保證反應目標產物具有較高的產率、純度。

本發(fā)明的有益效果體現在：

1.本發(fā)明可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針在450nm左右具有良好的單光子熒光性質，能夠裸眼識別銅離子；HepG2細胞被探針染色后，可清晰地觀察到有機材料對HepG2細胞細胞質中的線粒體具有高的成像能力，并能可逆地檢測線粒體中的銅離子，本發(fā)明生物探針對于有機染料的設計、制備和生命科學研究具有重大的意義。

2.本發(fā)明可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針是一類具有細胞質中線粒體成像功能的單光子光學材料。對細胞無損傷，可用于活體細胞檢測，具有明顯的應用價值。

3.本發(fā)明以具有較高反應活性和良好生物相容性的三苯胺基團作為主體，簡潔高效地制備了三苯胺硝基衍生物，通過甲?；磻⒊上┓磻?、還原反應、縮合反應等，得到可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針。

4.本發(fā)明制備方法原料易得，成本低，合成步驟簡單，易于操作。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的制備方法路線圖。

圖2a是本發(fā)明可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針在乙腈中加入金屬離子的可見紫外吸收光譜圖。

圖2b是本發(fā)明可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針在乙腈中加入金屬離子的單光子熒光發(fā)射光譜圖。

圖3a-3c是本發(fā)明可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針對HepG2細胞熒光共聚焦顯微成像圖，其中圖3a是目標產物著色的HepG2細胞的熒光共聚焦顯微照片；圖3b是明場作用圖；圖3c是疊合的照片。

圖4a是本發(fā)明可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針與線粒體的商品染色劑Mito-Tracker對HepG2細胞熒光共聚焦顯微成像。

圖4b是本發(fā)明可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針與線粒體的商品染色劑Mito-TrackerL間的共定位輪廓圖。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步描述：

實施例1

一種可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針的制備方法，包括以下步驟：

A、中間體I的制備

冰水浴條件下，向250mL燒瓶中加入0.1mol N,N-二甲基甲酰胺，隨后逐滴加入0.1mol三氯氧磷，繼續(xù)攪拌，15min后瓶中液體變得粘稠，最后得到白色略帶紅色固體凍鹽，將100ml含有0.1mol三苯胺的氯仿溶液加入上述燒瓶中，升溫度至50℃，約30min至凍鹽全溶，65℃下回流反應16h，薄層色譜法判定反應完全，然后旋蒸完氯仿，剩余物倒入1000mL冷水中，以碳酸鉀調節(jié)pH值至弱堿性，有大量黃綠色固體析出，之后抽濾，旋干溶劑，殘余物經色譜柱(洗脫劑是純石油醚)分離提純，得到7.81g淡黃色固體狀的產物，即中間體Ⅰ，產率71.5％。

中間體Ⅰ的¹H NMR:(DMSO-d₆,400Hz),δ(ppm):6.89(d,J＝8.80Hz,2H),7.23(q,6H),7.42(t,J＝7.80Hz,4H),7.72(d,J＝8.80Hz,2H),9.771(s,1H)。

B、中間體II的制備

向圓底燒瓶中加入1.00g(3.66×10^-3mol)中間體Ⅰ，用20mL甲醇溶解，室溫下邊攪拌邊分批(等量分四次加入，間隔時間10～30min，越靠后，間隔時間越長)加入3.66×10^-3mol NaBH₄，反應3h，薄層色譜跟蹤反應完全，加入60mL水，大量絮狀白色固體在溶液中析出，之后抽濾，加入大量水抽濾，干燥，得0.78g白色固體狀的產物，即中間體II，產率77.5％。

中間體II的¹H NMR:(DMSO-d₆,400Hz),δ(ppm):4.64(s,2H),5.65(s,1H),6.54-6.67(m,6H),6.85(t,J＝8.00Hz,2H),7.12(d,J＝8.00Hz,2H),7.31(t,J＝8.00Hz,4H)。

C、中間體III的制備

將1.06g(3.85×10^-3mol)中間體II，3.85×10^-3mol KI，3.85×10^-3mol PPh₃，0.1mL HAc，20mL CHCl₃及5mL的水加入150mL的圓底燒瓶中，攪拌溶解，再加入50μL Aliquat336，70℃下劇烈攪拌，70℃下回流反應72h，薄層色譜跟蹤反應完全，旋干，得黃色油狀物，之后用20m苯回流重結晶，得2.22g白色產物，即中間體III，產率88.9％。

中間體III的¹H NMR:(DMSO-d₆,400Hz),δ(ppm):3.54(S,2H),6.76-6.86(d,J＝8.00,4H),6.97(d,J＝8.00Hz,4H),7.06(d,J＝8.00Hz,2H),7.24-7.31(m,4H),7.67-7.78(m,12H),7.89-7.93(m,3H)。

D、中間體IV的制備

N₂保護下，向50mL三口燒瓶中加入20g(3.10×10^-2mol)中間體III，1.55×10^-2mol 3-羥基-4-硝基苯甲醛，1.55×10^-2mol K₂CO₃，20mL N,N-二甲基乙酰胺及50μL Aliquat336，120℃下反16h，薄層色譜跟蹤反應完全，加入500mL水洗，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱色譜(石油醚和乙酸乙酯＝100:1為洗脫劑)分離提純，得1.28g紅色固體狀的產物，即中間體IV，產率52.5％。

中間體IV的¹H NMR:(DMSO-d₆,400Hz),δ(ppm):6.95(d,J＝8.00Hz,2H),7.05-7.15(m,7H),7.24-7.40(m,7H),7.56(d,J＝8.00Hz,2H),7.94(d,J＝8.00Hz,1H),10.90(s,1H)。

E、中間體V的制備

N₂保護下，向100mL三口燒瓶中加入0.1g(2.45×10^-3mol)中間體IV，用30mL乙醇溶解，再加入0.018g Pd/C，0.5mL水合肼，55℃下反應1.5h，薄層色譜跟蹤反應完全，過濾，旋干，乙醇重結晶，抽濾，得0.05g灰白色的產物，即中間體V，產率53.8％。

中間體V的¹H NMR:(DMSO-d₆,400Hz),δ(ppm):4.75(s,2H),6.56(d,J＝8.00Hz,1H),6.72-7.06(m,11H),7.28-7.32(m,5H),7.43(d,J＝8.80Hz,2H),9.07(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,TMS,ppm):δ147.62,146.10,144.39,137.51,133.06,129.98,129.87,128.66,127.34,124.19,123.63,123.38,119.61,114.50,112.29；MALDI-TOF m/z:計算值,378.17；實驗值381.20。

F、中間體VI的制備

稱取0.1372g(3.6×10^-4mol)中間體V溶解在15mL乙醇中，加入3.6×10^-4mol吡啶-2-甲醛和50μL冰乙酸，75℃下回流反應4.5h，薄層色譜跟蹤反應完全，冷卻析出固體，抽濾，得到0.1375g棕黃色粉末狀的產物，即中間體VI，產率81.7％。

中間體VI的¹H NMR:(DMSO-d₆,400Hz),δ(ppm):6.96(d,J＝8.00Hz,2H),7.03-7.19(m,10H),7.30-7.38(m,5H),7.51-7.53(m,3H),7.94(t,J＝8.00Hz,1H),8.45(d,J＝8.00Hz,1H),8.70(d,J＝4.00Hz,1H),8.78(s,1H),9.29(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,TMS,ppm):δ158.25,154.66,151.99,149.44,146.93,146.76,137.78,136.70,135.62,131.29,129.54,128.01,127.66,126.48,125.22,124.12,123.66,123.24,122.96,121.51,119.74,118.10,113.63；MS(APCI)m/z:計算值,467.20；實驗值,468.20。

G、目標產物L的制備

稱取1g(2.6×10^-3mol)中間體VI溶解在20mL乙醇中，分批(等量分四次加入，間隔時間10～30min，越靠后，間隔時間越長)加入5.2×10^-3mol硼氫化鈉，35℃下攪拌1h，薄層色譜跟蹤反應完全，抽濾，加入50mL水，抽濾，干燥，得0.084g淡黃色固體狀的產物，即目標產物L，也即為所述可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針，產率68.8％。

目標產物L的¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):9.50(s,1H),8.55(J＝4,d,1H),7.74(J＝8,d,2H),7.42(J＝8,d,2H),7.25-7.36(m,6H),6.72-7.06(m,12H),6.36(J＝8,d,1H),5.80(J＝4,t,1H),4.42(J＝4,d,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ(ppm):159.13,148.79,147.09,145.67,144.25,137.19,136.60,132.54,129.47,128.04,126.87,125.46,123.71,123.63,122.89,122.56,122.00,121.23,119.38,110.61,109.73,48.12.MS(APCI):理論值469.22；實驗值470.58。

實施例2

一種可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針的制備方法，包括以下步驟：

A、中間體I的制備

冰水浴條件下，向250mL燒瓶中加入0.1mol N,N-二甲基甲酰胺，隨后逐滴加入0.1mol三氯氧磷，繼續(xù)攪拌，15min后瓶中液體變得粘稠，最后得到白色略帶紅色固體凍鹽；將100ml含有0.1mol三苯胺的氯仿溶液加入上述燒瓶中，升溫度至50℃，約30min至凍鹽全溶，40℃下回流反應18h，薄層色譜法判定反應完全，然后旋蒸完氯仿，剩余物倒入1000mL冷水中，以碳酸鉀調節(jié)pH值至弱堿性，有大量黃綠色固體析出，之后抽濾，旋干溶劑，殘余物經色譜柱(洗脫劑是純石油醚)分離提純，得到7.60g淡黃色固體狀的產物，即中間體Ⅰ，產率69.6％。

中間體Ⅰ的¹H NMR:(DMSO-d₆,400Hz),δ(ppm):6.89(d,J＝8.80Hz,2H),7.23(q,6H),7.42(t,J＝7.80Hz,4H),7.72(d,J＝8.80Hz,2H),9.771(s,1H)。

B、中間體II的制備

向圓底燒瓶中加入1.00g(3.66×10^-3mol)中間體Ⅰ，用20mL甲醇溶解，室溫下邊攪拌邊分批(等量分四次加入，間隔時間10～30min，越靠后，間隔時間越長)加入3.66×10^-3mol NaBH₄，反應2h，薄層色譜跟蹤反應完全，加入50mL水，大量絮狀白色固體在溶液中析出，之后抽濾，加入大量水抽濾，干燥，得0.82g白色固體狀的產物，即中間體II，產率81.5％。

中間體II的¹H NMR:(DMSO-d₆,400Hz),δ(ppm):4.64(s,2H),5.65(s,1H),6.54-6.67(m,6H),6.85(t,J＝8.00Hz,2H),7.12(d,J＝8.00Hz,2H),7.31(t,J＝8.00Hz,4H)。

C、中間體III的制備

將1.06g(3.85×10^-3mol)中間體II，3.85×10^-3mol KI，3.85×10^-3mol PPh₃，0.1mL HAc，20mL CHCl₃及5mL的水加入150mL的圓底燒瓶中，攪拌溶解，再加入50μL Aliquat336，90℃下劇烈攪拌，100℃下回流反應48h，薄層色譜跟蹤反應完全，旋干，得黃色油狀物，之后用20m苯回流重結晶，得2.46g白色產物，即中間體III。

中間體III的¹H NMR:(DMSO-d₆,400Hz),δ(ppm):3.54(S,2H),6.76-6.86(d,J＝8.00,4H),6.97(d,J＝8.00Hz,4H),7.06(d,J＝8.00Hz,2H),7.24-7.31(m,4H),7.67-7.78(m,12H),7.89-7.93(m,3H)。

D、中間體IV的制備

N₂保護下，向50mL三口燒瓶中加入20g(3.10×10^-2mol)中間體III，1.55×10^-2mol 3-羥基-4-硝基苯甲醛，1.55×10^-2mol K₂CO₃，20mL N,N-二甲基乙酰胺及50μL Aliquat336，100℃下反36h，薄層色譜跟蹤反應完全，加入600mL水洗，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱色譜(石油醚和乙酸乙酯＝100:1為洗脫劑)分離提純，得1.40g紅色固體狀的產物，即中間體IV，產率57.4％。

中間體IV的¹H NMR:(DMSO-d₆,400Hz),δ(ppm):6.95(d,J＝8.00Hz,2H),7.05-7.15(m,7H),7.24-7.40(m,7H),7.56(d,J＝8.00Hz,2H),7.94(d,J＝8.00Hz,1H),10.90(s,1H)。

E、中間體V的制備

N₂保護下，向100mL三口燒瓶中加入0.1g(2.45×10^-3mol)中間體IV，用30mL乙醇溶解，再加入0.018g Pd/C，0.5mL水合肼，50℃下反應3h，薄層色譜跟蹤反應完全，過濾，旋干，乙醇重結晶，抽濾，得0.055g灰白色的產物，即中間體V，產率59.2％。

中間體V的¹H NMR:(DMSO-d₆,400Hz),δ(ppm):4.75(s,2H),6.56(d,J＝8.00Hz,1H),6.72-7.06(m,11H),7.28-7.32(m,5H),7.43(d,J＝8.80Hz,2H),9.07(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,TMS,ppm):δ147.62,146.10,144.39,137.51,133.06,129.98,129.87,128.66,127.34,124.19,123.63,123.38,119.61,114.50,112.29；MALDI-TOF m/z:計算值,378.17；實驗值381.20。

F、中間體VI的制備

稱取0.1372g(3.6×10^-4mol)中間體V溶解在15mL乙醇中，加入3.6×10^-4mol吡啶-2-甲醛和50μL冰乙酸，90℃下回流反應4h，薄層色譜跟蹤反應完全，冷卻析出固體，抽濾，得到0.1402g棕黃色粉末狀的產物，即中間體VI，產率83.3％。

中間體VI的¹H NMR:(DMSO-d₆,400Hz),δ(ppm):6.96(d,J＝8.00Hz,2H),7.03-7.19(m,10H),7.30-7.38(m,5H),7.51-7.53(m,3H),7.94(t,J＝8.00Hz,1H),8.45(d,J＝8.00Hz,1H),8.70(d,J＝4.00Hz,1H),8.78(s,1H),9.29(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,TMS,ppm):δ158.25,154.66,151.99,149.44,146.93,146.76,137.78,136.70,135.62,131.29,129.54,128.01,127.66,126.48,125.22,124.12,123.66,123.24,122.96,121.51,119.74,118.10,113.63；MS(APCI)m/z:計算值,467.20；實驗值,468.20。

G、目標產物L的制備

稱取1g(2.6×10^-3mol)中間體VI溶解在20mL乙醇中，分批(等量分四次加入，間隔時間10～30min，越靠后，間隔時間越長)加入5.2×10^-3mol硼氫化鈉，10℃下攪拌2h，薄層色譜跟蹤反應完全，抽濾，加入50mL水，抽濾，干燥，得0.090g淡黃色固體狀的產物，即目標產物L，也即為所述可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針，產率73.7％。

目標產物L的¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):9.50(s,1H),8.55(J＝4,d,1H),7.74(J＝8,d,2H),7.42(J＝8,d,2H),7.25-7.36(m,6H),6.72-7.06(m,12H),6.36(J＝8,d,1H),5.80(J＝4,t,1H),4.42(J＝4,d,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ(ppm):159.13,148.79,147.09,145.67,144.25,137.19,136.60,132.54,129.47,128.04,126.87,125.46,123.71,123.63,122.89,122.56,122.00,121.23,119.38,110.61,109.73,48.12.MS(APCI):理論值469.22；實驗值470.58。

實施例3

一種可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針的制備方法，包括以下步驟：

A、中間體I的制備

冰水浴條件下，向250mL燒瓶中加入0.1mol N,N-二甲基甲酰胺，隨后逐滴加入0.1mol三氯氧磷，繼續(xù)攪拌，15min后瓶中液體變得粘稠，最后得到白色略帶紅色固體凍鹽；將100ml含有0.1mol三苯胺的氯仿溶液加入上述燒瓶中，升溫度至50℃，約30min至凍鹽全溶，70℃下回流反應14h，薄層色譜法判定反應完全，然后旋蒸完氯仿，剩余物倒入1000mL冷水中，以碳酸鉀調節(jié)pH值至弱堿性，有大量黃綠色固體析出，之后抽濾，旋干溶劑，殘余物經色譜柱(洗脫劑是純石油醚)分離提純，得到7.70g淡黃色固體狀的產物，即中間體Ⅰ，產率70.5％。

中間體Ⅰ的¹H NMR:(DMSO-d₆,400Hz),δ(ppm):6.89(d,J＝8.80Hz,2H),7.23(q,6H),7.42(t,J＝7.80Hz,4H),7.72(d,J＝8.80Hz,2H),9.771(s,1H)。

B、中間體II的制備

向圓底燒瓶中加入1.00g(3.66×10^-3mol)中間體Ⅰ，用20mL甲醇溶解，室溫下邊攪拌邊分批(等量分四次加入，間隔時間10～30min，越靠后，間隔時間越長)加入3.66×10^-3mol NaBH₄，反應4h，薄層色譜跟蹤反應完全，加入100mL水，大量絮狀白色固體在溶液中析出，之后抽濾，加入大量水抽濾，干燥，得0.74g白色固體狀的產物，即中間體II，產率73.5％。

中間體II的¹H NMR:(DMSO-d₆,400Hz),δ(ppm):4.64(s,2H),5.65(s,1H),6.54-6.67(m,6H),6.85(t,J＝8.00Hz,2H),7.12(d,J＝8.00Hz,2H),7.31(t,J＝8.00Hz,4H)。

C、中間體III的制備

將1.06g(3.85×10^-3mol)中間體II，3.85×10^-3mol KI，3.85×10^-3mol PPh₃，0.1mL HAc，20mL CHCl₃及5mL的水加入150mL的圓底燒瓶中，攪拌溶解，再加入50μL Aliquat336，65℃下劇烈攪拌，60℃下回流反應78h，薄層色譜跟蹤反應完全，旋干，得黃色油狀物，之后用20m苯回流重結晶，得2.34g白色產物，即中間體III

中間體III的¹H NMR:(DMSO-d₆,400Hz),δ(ppm):3.54(S,2H),6.76-6.86(d,J＝8.00,4H),6.97(d,J＝8.00Hz,4H),7.06(d,J＝8.00Hz,2H),7.24-7.31(m,4H),7.67-7.78(m,12H),7.89-7.93(m,3H)。

D、中間體IV的制備

N₂保護下，向50mL三口燒瓶中加入20g(3.10×10^-2mol)中間體III，1.55×10^-2mol 3-羥基-4-硝基苯甲醛，1.55×10^-2mol K₂CO₃，20mL N,N-二甲基乙酰胺及50μL Aliquat336，160℃下反12h，薄層色譜跟蹤反應完全，加入700mL水洗，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱色譜(石油醚和乙酸乙酯＝100:1為洗脫劑)分離提純，得1.31g紅色固體狀的產物，即中間體IV，產率53.7％。

中間體IV的¹H NMR:(DMSO-d₆,400Hz),δ(ppm):6.95(d,J＝8.00Hz,2H),7.05-7.15(m,7H),7.24-7.40(m,7H),7.56(d,J＝8.00Hz,2H),7.94(d,J＝8.00Hz,1H),10.90(s,1H)。

E、中間體V的制備

N₂保護下，向100mL三口燒瓶中加入0.1g(2.45×10^-3mol)中間體IV，用30mL乙醇溶解，再加入0.018g Pd/C，0.5mL水合肼，80℃下反應1h，薄層色譜跟蹤反應完全，過濾，旋干，乙醇重結晶，抽濾，得0.045g灰白色的產物，即中間體V，產率48.4％。

中間體V的¹H NMR:(DMSO-d₆,400Hz),δ(ppm):4.75(s,2H),6.56(d,J＝8.00Hz,1H),6.72-7.06(m,11H),7.28-7.32(m,5H),7.43(d,J＝8.80Hz,2H),9.07(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,TMS,ppm):δ147.62,146.10,144.39,137.51,133.06,129.98,129.87,128.66,127.34,124.19,123.63,123.38,119.61,114.50,112.29；MALDI-TOF m/z:計算值,378.17；實驗值381.20。

F、中間體VI的制備

稱取0.1372g(3.6×10^-4mol)中間體V溶解在15mL乙醇中，加入3.6×10^-4mol吡啶-2-甲醛和50μL冰乙酸，60℃下回流反應6h，薄層色譜跟蹤反應完全，冷卻析出固體，抽濾，得到0.1298g棕黃色粉末狀的產物，即中間體VI，產率77.12％。

中間體VI的¹H NMR:(DMSO-d₆,400Hz),δ(ppm):6.96(d,J＝8.00Hz,2H),7.03-7.19(m,10H),7.30-7.38(m,5H),7.51-7.53(m,3H),7.94(t,J＝8.00Hz,1H),8.45(d,J＝8.00Hz,1H),8.70(d,J＝4.00Hz,1H),8.78(s,1H),9.29(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,TMS,ppm):δ158.25,154.66,151.99,149.44,146.93,146.76,137.78,136.70,135.62,131.29,129.54,128.01,127.66,126.48,125.22,124.12,123.66,123.24,122.96,121.51,119.74,118.10,113.63；MS(APCI)m/z:計算值,467.20；實驗值,468.20。

G、目標產物L的制備

稱取1g(2.6×10^-3mol)中間體VI溶解在20mL乙醇中，分批(等量分四次加入，間隔時間10～30min，越靠后，間隔時間越長)加入5.2×10^-3mol硼氫化鈉，40℃下攪拌0.5h，薄層色譜跟蹤反應完全，抽濾，加入50mL水，抽濾，干燥，得0.081g淡黃色固體狀的產物，即目標產物L，也即為所述可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針，產率66.3％。

目標產物L的¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):9.50(s,1H),8.55(J＝4,d,1H),7.74(J＝8,d,2H),7.42(J＝8,d,2H),7.25-7.36(m,6H),6.72-7.06(m,12H),6.36(J＝8,d,1H),5.80(J＝4,t,1H),4.42(J＝4,d,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ(ppm):159.13,148.79,147.09,145.67,144.25,137.19,136.60,132.54,129.47,128.04,126.87,125.46,123.71,123.63,122.89,122.56,122.00,121.23,119.38,110.61,109.73,48.12.MS(APCI):理論值469.22；實驗值470.58。

請參見圖1，實施例1-3以三苯胺為母體通過Vilsmeier-Haack反應進行三苯胺甲酰化(中間體I)，還原成醇(中間體II)、進而形成膦鹽(中間體Ⅲ)，再通過成烯反應制備出5-(4-(二苯胺)苯乙烯)-2-硝基苯酚(中間體Ⅳ)，5-(4-(二苯胺)苯乙烯)-2-硝基苯酚在Pd/C，水合肼作用下還原得到的5-(4-(二苯胺)苯乙烯)-2-氨基苯酚(中間體Ⅴ)，接著與2-吡啶甲醛通過簡單的縮合反應得到席夫堿(中間體VI)，席夫堿在硼氫化鈉的作用下還原為乙烯基橋聯(lián)三苯胺苯酚基胺類衍生物探針(目標產物L)，也即可檢測活細胞線粒體的銅離子生物探針。實施例4

目標產物L對銅離子的識別

選擇性行為是熒光探針的最重要的特征之一。如圖2a、圖2b所示，當用370nm激發(fā)時，熒光強度是強的。當加入和目標產物L相等量的廣泛的環(huán)境和生理上重要的金屬離子，如：Cu²⁺,Hg²⁺,Zn²⁺,Ni²⁺,Mg²⁺,Pb²⁺,Ca²⁺,Cd²⁺,Ag⁺,Fe³⁺,Al³⁺,Mn²⁺,Co²⁺,Cr³⁺,Li⁺,K⁺,Na⁺,La⁺,Ba²⁺時，室溫下，加入銅離子的目標產物L在溶液(四氫呋喃:水，1:1)中的熒光強度下降40倍，其他金屬離子的加入沒有引起明顯的熒光強度改變。干擾試驗顯示，其它各種金屬離子的存在不干擾目標產物L對銅離子識別。我們運用銅離子螯合劑半胱氨酸(L-Cysteine)檢測了目標產物L在溶液(四氫呋喃:水，1:1)中識別Cu²⁺的可逆性，結果顯示目標產物L具有良好的可循環(huán)的識別能力。

實施例5

目標產物L單光子細胞顯影效果的測試

將清洗干凈且滅菌的蓋玻片放入6孔組織培養(yǎng)板中，肝癌組織細胞(HepG2細胞)5×10⁵個/孔的密度接種在直徑35mm的6孔板培養(yǎng)皿中，并用DMEM作為細胞培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)基中含有胎牛血清(10％)、青霉素(100μg/mL)和鏈霉素(100ug/mL)。細胞培養(yǎng)皿置于含5％CO₂和95％O₂的培養(yǎng)箱中維持溫度37℃進行細胞培養(yǎng)24h，用PBS(磷酸緩沖液，pH＝7.4，Gibco試劑公司生產)洗滌HepG2細胞三次，洗去培養(yǎng)基。然后分別加入4μL目標化合物A或B的DMSO溶液(1mM)，培養(yǎng)0.5h，用PBS緩沖溶液(pH＝7.4)沖洗蓋玻片6～7次，滴1mL 4％多聚甲醛/PBS溶液固定細胞10min，蒸餾水沖洗蓋玻片6～7次。將蓋玻片卡在潔凈載玻片上，置于激光共聚焦顯微鏡(LSM-710，Zeiss，德國)下觀察細胞形態(tài)及熒光攝取情況，結果見圖3a-3c和圖4a-4b。

從圖3a-3c和圖4a-4b可以清楚地看到，目標產物L均透過HepG2細胞的細胞膜，進入細胞質中的線粒體中，并對它完全均勻的著色，對目標產物的攝取率很高，說明目標產物對HepG2的線粒體具有很高的識別能力。這種有機材料的制備對于細胞顯影材料的遴選、制備、對于生命科學、材料科學等方面都有著重要的意義。

應當理解本文所述的例子和實施方式僅為了說明，本領域技術人員可根據它做出各種修改或變化，在不脫離本發(fā)明精神實質的情況下，都屬于本發(fā)明的保護范圍。