一種黃綠木霉菌株及用其制備薔薇煙用香料的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵及其應(yīng)用領(lǐng)域，具體設(shè)及一株黃綠木霉新菌株HLMM-04,同 時，本發(fā)明還設(shè)及利用該菌株制備菩薇煙用香料的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 加香加料是卷煙工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是有效提升卷煙抽吸品質(zhì)，形成卷煙特有風(fēng) 格的有效手段之一。目前我國煙草中添加的煙用香料大多是采用傳統(tǒng)方法萃取再加 W調(diào)配 所得，雖然生產(chǎn)操作簡單，但也存在香氣單調(diào)、改善卷煙抽吸效果不明顯等缺點。利用微生 物對香原料進行發(fā)酵可W增加傳統(tǒng)提取香料中多種香氣物質(zhì)的含量，提升香氣豐富性，進 而生產(chǎn)出香氣豐富、高品質(zhì)的卷煙，滿足消費者對卷煙品質(zhì)的要求。
[0003] 木霉菌(Trichoderma spp.)廣泛分布于自然界，在腐木、種巧、植物殘體、有機肥、 ±壤和空氣中尤多。木霉菌生長營養(yǎng)要求簡單，生長速度快，對于工業(yè)化生產(chǎn)十分有利。黃 綠木霉(Trichoderma aureoviride)為木霉屬的一種，作為一種重要的生防因子，對植物病 原的括抗作用具有廣譜性、多制性，還能產(chǎn)生多種酶類分解±壤中的動植物殘體，增加±壤 肥力。已有對黃綠木霉的報道多集中在±壤改良、生物防治及生物肥料等方面?，F(xiàn)有技術(shù)中 尚未見將黃綠木霉用于菩薇發(fā)酵制備煙用香料的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株黃綠木霉的新菌株，該菌株具 有產(chǎn)纖維素酶，進而促進纖維素分解成寡糖或單糖的能力。
[0005] 本發(fā)明的目的還在于提供一種利用該菌株發(fā)酵菩薇制備煙用香料的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的通過W下技術(shù)方案予W實現(xiàn)。
[0007] 除非另有說明，本發(fā)明所采用的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
[000引一種黃綠木霉（Trichoderma aureoviride化LMM-04菌株，CGMCC No. 10839,其具 有產(chǎn)纖維素酶，進而促進纖維素分解成寡糖或單糖的能力。
[0009] 利用所述菌株制備煙用香料的方法，包括W下步驟：
[0010] (1)將黃綠木霉HLMM-04 CGMCC No. 10839菌株活化兩次后，接種于裝有200血PDA 液體培養(yǎng)基的S角瓶中，在20~35 °C，1 SOrpm下發(fā)酵培養(yǎng)1~7d;所述的PDA液體培養(yǎng)基：馬 鈴馨200g，葡萄糖20g，補蒸饋水至lL，p冊.5~8.5，115°C高壓滅菌15min;
[0011] (2)發(fā)酵液過濾去除菌體，取上清液緩慢加入硫酸氨至80%飽和度，4°C下靜置過 夜，離屯、收集沉淀物并溶于2mL緩沖液中，再用緩沖液進行透析，得到粗酶液;所述的緩沖液 為：0.02mol/L Na2HP〇4-fe也P〇4，pH 7.3;
[0012 ] (3)將香格里拉野生菩薇干花朵進行破碎后，噴灑黃綠木霉HLMM-04粗酶液，發(fā)酵， 粗酶液添加量為野生菩薇質(zhì)量的20%，發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵時間2~化;再加入兩倍重量 的水，回流提取化，過濾除渣，將上清液減壓濃縮，即得所需煙用香料。
[0013]進一步的，為防止香料變質(zhì)，按煙用香料重量的5%添加丙二醇。
[0014] 步驟(1)中最適宜的產(chǎn)酶條件為初始抑6.5,培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時間5d。
[0015] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有W下優(yōu)點：
[0016] (1)本發(fā)明首次將黃綠木霉應(yīng)用于煙用香料制備領(lǐng)域。采用黃綠木霉HLMM-04菌株 發(fā)酵液處理香格里拉野生菩薇，與未處理對照相比，在原有香格里拉野生菩薇特征香氣保 持的同時，花香突出，香氣豐富性增加。
[0017] (2)本發(fā)明成本低廉，操作簡單，便于實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，應(yīng)用前景良好。
[0018] 保藏生物材料的說明
[0019] 本發(fā)明的菌株，已于2015年5月22日，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中屯、(CGMCG);該中屯、地址：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生 物研究所。該菌株分類命名為黃綠木霉（Trichoderma aureoViride)HLMM-04，保藏號為 CGMCC No.10839。
【具體實施方式】
[0020] 下面通過實施例對本發(fā)明做進一步的詳細(xì)說明，但實施例并不是對本發(fā)明技術(shù)方 案的限定。
[0021] 實施例1
[0022] 1、黃綠木霉HLMM-04菌株的適宜產(chǎn)酶條件
[0023] 1.1培養(yǎng)基初始pH對HLMM-04菌株產(chǎn)酶的影響
[0024] 將液體培養(yǎng)基的抑分別調(diào)到5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，在281：、120巧111下振 蕩培養(yǎng)3天后，測定纖維素酶活，表明最適宜的初始抑為6.5。
[0025] 1.2培養(yǎng)溫度對HLMM-04菌株產(chǎn)酶的影響
[0026] 將接種后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別置于20°C、25°C、28°C、32°C、35°C下，120r/min振 蕩培養(yǎng)3d后，測定纖維素酶活，表明最適宜的培養(yǎng)溫度為28°C。
[0027] 1.3培養(yǎng)時間對HLMM-04菌株產(chǎn)酶的影響
[002引將接種好的液體培養(yǎng)基(pH 6.5)置于恒溫恒濕箱中，281：，120以111111振蕩培養(yǎng)，每 24h測定一次纖維素酶活，培養(yǎng)到第5天時纖維素酶活達到最大值。
[0029] 2、黃綠木霉HLMM-04粗酶液制備方法
[0030] 根據(jù)W上優(yōu)化結(jié)果，將黃綠木霉HLMM-04菌株活化兩次后，接種于裝有200mL PDA 液體培養(yǎng)基(pH 6.5)的=角瓶中，在28°C，ISOrpm下發(fā)酵培養(yǎng)5d。過濾去除菌體。取上清液 緩慢加入硫酸氨至80 %飽和度，4 °C下靜置過夜，離屯、收集沉淀物并溶于2mL緩沖液 (0.02mol/L化抽P04-化此P04的緩沖液，pH7.3)中，用同樣的緩沖液進行透析，得到粗酶 液。
[0031 ] 3、黃綠木霉HLMM-04菌株發(fā)酵制備煙用香料的方法
[0032] 將香格里拉野生菩薇干花朵進行破碎后，噴灑黃綠木霉HLMM-04粗酶液，發(fā)酵，粗 酶液添加量為野生菩薇質(zhì)量的20%，發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵時間化;再加入兩倍重量的水， 回流提取化，過濾除渣，將上清液減壓濃縮，即得菩薇煙用香料。
[0033] 為防止變質(zhì)，按發(fā)酵香料重量的5%添加丙二醇。
[0034] 4、產(chǎn)品特征及理化性質(zhì)
[0035] 所得發(fā)酵煙用香料為紅棟色流狀膏體，不澄清。產(chǎn)品理化性質(zhì)見表1。
[0036] 表1黃綠木霉HLMM-04發(fā)酵野生菩薇香料的理化指標(biāo)
[0037]

[0038] 5、卷煙加香實驗
[0039] 取香格里拉野生菩薇發(fā)酵煙用香料0.1 g,取無菌水稀釋50倍后，均勻噴灑在50g未 加香葉組中，裝入干凈的密封袋內(nèi)，于室溫下放置化后，將煙絲于12(TC烘箱中烘干，使水分 含量達到11%~13%。將處理后的煙絲及對照放入恒溫恒濕箱中，在溫度22°C、濕度60%條 件下平衡2地，手工卷制成卷煙，由評吸專家組成的評吸小組進行感官評吸。W未發(fā)酵菩薇 提取香料及枯草芽抱桿菌發(fā)酵菩薇香料為對照。加香結(jié)果表明，香格里拉野生菩薇黃綠木 霉HLMM-04發(fā)酵香料與對照區(qū)別明顯，具有豐富香氣，突出花香的作用。評價結(jié)果見表2。
[0040] 表2香格里拉野生菩薇發(fā)酵香料評吸結(jié)果
[0041]
[004：


【主權(quán)項】
1. 一種黃綠木霉（Trichoderma aureoviride)HLMM_04菌株，CGMCC No. 10839,其具有 產(chǎn)纖維素酶，進而促進纖維素分解成寡糖或單糖的能力。2. 利用權(quán)利要求1所述菌株制備薔薇煙用香料的方法，包括以下步驟： (1) 將黃綠木霉1麗-04 061〇：如.1()839菌株活化兩次后，接種于裝有2()()1^?0纟液體 培養(yǎng)基的三角瓶中，在20~35°C，180rpm下發(fā)酵培養(yǎng)1~7d;所述的PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯 200g，葡萄糖20g，補蒸餾水至lL，pH5.5~8.5,115°C高壓滅菌15min; (2) 發(fā)酵液過濾去除菌體，取上清液緩慢加入硫酸氨至80%飽和度，4°C下靜置過夜，離 心收集沉淀物并溶于2mL緩沖液中，再用緩沖液進行透析，得到粗酶液;所述的緩沖液為： 0.02mol/L Na2HP〇4-NaH2P〇4,pH 7.3； (3) 將香格里拉野生薔薇干花朵進行破碎后，噴灑黃綠木霉HLMM-04粗酶液，發(fā)酵，粗酶 液添加量為野生薔薇質(zhì)量的20%，發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵時間2~5h;再加入兩倍重量的水， 回流提取3h，過濾除渣，將上清液減壓濃縮，即得所需煙用香料。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備薔薇煙用香料的方法，其特征在于：為防止香料變質(zhì)，按 煙用香料重量的5%添加丙二醇。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備薔薇煙用香料的方法，其特征在于：步驟（1)中最適宜的 發(fā)酵培養(yǎng)條件為初始pH 6.5，培養(yǎng)溫度28 °C，培養(yǎng)時間5d。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種黃綠木霉菌株及用其制備薔薇煙用香料的方法。所述菌株為黃綠木霉(Trichoderma aureoviride)HLMM?04 CGMCC No.10839，具有產(chǎn)纖維素酶，進而促進纖維素分解成寡糖或單糖的能力。將菌株通過活化、發(fā)酵、過濾、透析制得纖維素酶粗酶液，用于發(fā)酵香格里拉野生薔薇，再經(jīng)提取、過濾、減壓濃縮制成煙用香料。HLMM?04菌株的最適產(chǎn)酶條件為培養(yǎng)基初始pH為6.5，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為5d。卷煙加香結(jié)果表明，所制備的香料具有豐富香氣，突出花香的作用。CGMCC No.1083920150522
【IPC分類】C12P1/02, C12N1/14, A24B3/12, C12R1/885
【公開號】CN105713846
【申請?zhí)枴緾N201610240445
【發(fā)明人】陳興, 張?zhí)鞐? 張健, 張建榮, 段焰青, 葉靈, 黨立志
【申請人】云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司