一株富含油脂的纖維藻及其培養(yǎng)應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)和生物能源領(lǐng)域，具體涉及一株耐受高濃度C〇2和NO、的富含 油脂的纖維藻及其培養(yǎng)應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于化石能源的日趨減少和使用化石能源造成溫室效應(yīng)的增加，越來越多的科研 工作者把目光集中到可再生能源的開發(fā)和利用上。生物質(zhì)能作為地球上最重要的可再生能 源，它包括林業(yè)生物質(zhì)、農(nóng)作物、水生植物、農(nóng)業(yè)廢棄物等。在諸多的生物質(zhì)能源中，微藻是 重要的可再生資源。它們具有分布廣泛、生物量大、光合作用效率高、環(huán)境適應(yīng)能力強、生長 周期短、生物量產(chǎn)量高等特點。其細胞中含獨特的初級或次級代謝產(chǎn)物，化學(xué)成分復(fù)雜。微 藻的太陽能轉(zhuǎn)化效率可達到3. 5%，是生產(chǎn)藥品、精細化工品和新型燃料的潛在資源，從微藻 中得到的脂肪酸可轉(zhuǎn)化成脂肪酸甲脂，即生物柴油。
[0003] 隨著世界經(jīng)濟的發(fā)展，大量的化石能源的使用和消耗，導(dǎo)致能源的短缺和環(huán)境的 日益惡化，特別是(?的急劇增加引起的溫室效應(yīng)越來越嚴重，除此之外來自石油和化工行 業(yè)的工業(yè)廢氣中，除了含有高濃度C〇2氣體外，S化、NOx等酸性氣體的濃度也很高。微藻的 生長周期短、光合效率高，C〇2固定效率高，一定條件下可達陸生植物的10倍W上，不僅可 W減少C〇2排放，同時也降低了培養(yǎng)成本；除CO 廢氣中的一些SOx、NOx等成分也隨著 微藻的代謝被凈化處理，有效減少有害氣體排放，因此利用微藻油脂作為原料生產(chǎn)的生物 柴油是目前最有可能滿足世界運輸所需燃料的可再生能源。
[0004] 但是實際應(yīng)用中，當(dāng)環(huán)境中C〇2體積分數(shù)大于5v%時，大部分微藻的生長將受到抑 巧[|，影響固碳效率；而通入的化石燃料廢氣中含有高濃度的SOx、NOx等氣體也會抑制微藻 生長并降低固碳效率。目前對于小球藻、柵藻等產(chǎn)油微藻研究的較多。CN20110144545.6公 開了一株柵藻藻株，該藻株的生長可利用人工培養(yǎng)基或經(jīng)適當(dāng)處理的廢水生長，其特點是 油脂產(chǎn)率高于目前大多數(shù)分藻株，該藻株應(yīng)用領(lǐng)域包括C02的固定，廢水的凈化，油脂、蛋白 質(zhì)、色素、淀粉、多糖、核酸的生產(chǎn)。CN20120154470.4公開了一株富油海洋微藻微擬球藻（ )藻株及其應(yīng)用，該藻株可在？護4. 5的環(huán)境下正常生長，其油 脂含量可達35%。CN20111019480. X公開了一株微藻藻株（i知此邱.）及其用于生 產(chǎn)生物柴油的應(yīng)用，利用該藻株可生產(chǎn)高附加值的多不飽和脂肪酸，包括亞麻酸C18:3和 神經(jīng)酸C24:1，其在獲得生物柴油的同時，獲得高附加值的副產(chǎn)品。CN102703326A公開了一 種高C02耐受性和固定率的微藻及其選育方法，但該專利所提供的藻株并未涉及該藻株的 油脂含量。
[0005] 劉平懷等(有機碳源對單針藻細胞生長、油脂積累和光合作用的影響，生物工程， 2012, 33 (18) : 224-246)介紹了利用有機碳源培養(yǎng)單針藻的一種生產(chǎn)方式，培養(yǎng)結(jié)束雖然 生物量超過了 lOg/l，但送種方式為單針藻異養(yǎng)培養(yǎng)方式，培養(yǎng)過程中利用葡萄糖等有機碳 源來實現(xiàn)細胞生長，送種培養(yǎng)方式?jīng)]有利用C〇2等無機碳源經(jīng)濟，而且有機碳源的加入，在 培養(yǎng)過程易產(chǎn)生染菌問題，影響藻細胞的生長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一株富含油脂的纖維藻及其培養(yǎng)應(yīng)用。本發(fā)明 的纖維藻能夠耐受高濃度的C〇2和NOx,固碳效率高，獲得的生物質(zhì)中細胞總脂含量占細胞 干重的40% W上，能夠進行生物柴油的生產(chǎn)。
[0007] 本發(fā)明富含油脂的藻株SS-B7,其分類命名為纖維藻（心左i別roofed皿S邱.），已 于2013年4月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中必，保藏編號為 CGMCC No. 7478O
[0008] 本發(fā)明提供的纖維藻SS-B7在顯微鏡下藻細胞為綠色，鑲形或弓形、叢生、彎曲， 自中央向兩端漸尖細，末端尖，長大約5-6 U m，中央寬約2 U m，具體形態(tài)見附圖1。
[0009] 本發(fā)明的纖維藻SS-B7可W耐受的C〇2濃度可達40v%，可W耐受的NOx的濃度可 達 400X 10 6 (v/v)。
[0010] 本發(fā)明富含油脂的纖維藻SS-B7的培養(yǎng)方法，在光照生物反應(yīng)器中，利用BGlUSE 等淡水培養(yǎng)基培養(yǎng)，在光照強度1500-10000LUX，pH值為6-9,溫度為15-4(TC下培養(yǎng)，從反 應(yīng)器底部通入C〇2含量為5v%-40v%的氣體；培養(yǎng)8天W上進入穩(wěn)定期，結(jié)束培養(yǎng)，收獲藻細 胞，藻細胞干重達到lOg/L W上，細胞總脂含量占細胞干重的40% W上。
[0011] 本發(fā)明的纖維藻SS-B7在固定(?中的應(yīng)用。該藻株能夠耐受高達40v%的CO 2濃 度，具有較高的C〇2固定效率。
[0012] 本發(fā)明的纖維藻SS-B7在生產(chǎn)微藻油脂中的應(yīng)用。該纖維藻在適宜的生長條件 下，細胞總脂含量可占細胞干重的40% W上，能夠進行生物柴油的生產(chǎn)。
[0013] 本發(fā)明纖維藻SS-B7在凈化含C〇2和NOx的廢氣或煙氣中的應(yīng)用。該藻株可W 利用含C〇2和NOx的廢氣或煙氣進行光照自養(yǎng)生長獲取富含油脂的生物質(zhì)，廢氣或煙氣 中C〇2含量不超過30v%，NOx含量不超過400X 10 6 (v/v)。在光照生物反應(yīng)器中，利用 BGl 1或SE淡水培養(yǎng)基培養(yǎng)，從反應(yīng)器底部通入C〇2含量為5v%-30v%，NO和/或NO 2含量為 100X 10 6-400X 10 6 (v/v)的廢氣或煙氣，在光照強度1500-10000LUX，抑值為7-9,溫度 為20-4(TC下處理廢氣，處理8天后結(jié)束；收獲藻細胞，藻細胞干重達到lOg/L W上，細胞總 脂含量占細胞干重的40% W上。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可W帶來W下有益效果： 1、 本發(fā)明選育的纖維藻SS-B7能夠耐受高濃度的C〇2和NOx,可W利用廢氣中的CO 2 進行自養(yǎng)生長，固定0)2,緩解目前工業(yè)社會帶來的溫室效應(yīng)問題；同時能夠耐受廢氣中的 NOx,避免了微藻利用廢氣生長時高濃度的NOx對微藻光合作用的抑制，維持微藻的正常生 長； 2、 該藻株在固定煙氣中C〇2的同時，可W利用煙氣中的部分NOx作為氮源生長使用，在 促進藻株生長的同時能夠很好的進行0)2的固定，并能脫除煙氣的NOx,凈化煙氣； 3、 該藻株的生長速率快，生長周期短，僅為8天左右，最終生物量較高，細胞干重超過 lOg/l，生物量產(chǎn)率超過了 1. 3g/化? d)，所含的總脂含量高，適于生產(chǎn)生物柴油，可W解決 生物柴油生產(chǎn)的油脂來源的問題。
[0015] 生物材料保藏說明 本發(fā)明提供的纖維藻SS-B7 別邱.）藻株，保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中必；地址；北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物 研究所；保藏編號；CGMCC No. 7478 ;保藏日期：2013年4月15日。
【具體實施方式】
[0016] 下面通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。本發(fā)明中，V%為體積分數(shù)。
[0017] 實施例1分離和馴化篩選獲得單針藻SS-B7 (1)出發(fā)藻株的獲得：2011年10月從黑龍江杜博爾特蒙古族自治縣壽山休閑度假村龍 虎湖取回水樣50mU將水樣接種到200mL的BGll培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)的光照強度 為5000LUX，溫度為25°C，光暗周期為2地，光暗時間比為14:10,培養(yǎng)約半個月后，培養(yǎng)基呈 現(xiàn)綠色。將富集培養(yǎng)的水樣稀釋至10 5倍，在無菌條件下涂布到BGll固體平板上培養(yǎng)，培 養(yǎng)的光照強度為5000LUX，溫度為25C，培養(yǎng)約10天后平板上出現(xiàn)綠色的單藻落，挑取單藻 落在搖瓶上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25°C，光照強度為5000LUX，培養(yǎng)8天后，顯微鏡觀察確定是否 為純藻種，若不是純種，重復(fù)上述步驟，直到確定為純培養(yǎng)藻株為止。經(jīng)過反復(fù)培養(yǎng)，獲得純 藻株編號為SS-7。
[0018] (2)C02的馴化培養(yǎng)；將步驟（1)中的搖瓶培養(yǎng)的純藻種接入微藻通氣培養(yǎng)裝置中 進行馴化培養(yǎng)，光照強度為5000LUX，溫度為25C，通入的氣體中C〇2的含量從5v%逐級提 高至40v%，每次提高5v%，培養(yǎng)8天后結(jié)束，反復(fù)馴化培養(yǎng)3次。
[0019] (3)將步驟（2)中馴化培養(yǎng)的藻液采用平板劃線的方式培養(yǎng)獲得純藻種，培養(yǎng)步驟 同（2)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。
[0020] (4)N0x的馴化培養(yǎng)；將步驟（3)藻株的對數(shù)生長期的藻液通入C〇2含量為20v%的 混合氣，光照強度為5000LUX，溫度為25C，混合氣中注入NO氣體對藻種進行NOx的耐受性 培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中混合氣中NO的含量從IOOX 10 6 (v/v)逐級提高到400X 10 6 (v/v)，培 養(yǎng)過程中每兩天提高100 X 10 6 (v/v)，培養(yǎng)8天結(jié)束，反復(fù)馴化培養(yǎng)3次，收獲耐受NOx的 藻液。
[0021] (5)將步驟（4)馴化得到的藻液采用平板劃線的方式獲得純藻落，培養(yǎng)步驟同 (2)，培養(yǎng)結(jié)束后，挑選較大的藻落進行搖瓶培養(yǎng)，獲得目的藻株命名為SS-B7。
[0022] 實施例2藻株的鑒定 獲得的SS-B7藻細胞的DNA的提取采用CTAB法，并采用18S rDNA基因克隆，將得到的 3個陽性克隆送至上海生工公司測序。18S rDNA基因測序分析結(jié)果見序列表。將18S rDNA 序列登錄到Genbank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，結(jié)果顯示與別邱.有最大的相 似性，其BLASh值為2702, Max index值為99%，可W確定SS-B7為纖維藻UiAiWrwZewww 邱.）。
[0023] 實施例3纖維藻SS-B7的培養(yǎng)應(yīng)用 將對數(shù)生長期的SS-B7的藻液接種在BGll培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，BGll培養(yǎng)基的配方見表 1和表2,培養(yǎng)在光生物反應(yīng)器中進行，接種后培養(yǎng)液的ODew為0. 2。從反應(yīng)器底部通入CO 2 含量為30v%的煙氣，其中N02含量為300X 10 6(v/v)。培養(yǎng)過程中光照強度為5000LUX，培 養(yǎng)溫度為28。抑值控制在7-9之間，光照周期為2地，光暗時間比為14:10,培養(yǎng)時間為8 天處于穩(wěn)定期。結(jié)束培養(yǎng)，離必收集藻液，在-6(TC條件下真空冷凍干燥至恒重后測量藻粉 干重，計算生物質(zhì)產(chǎn)量，并采用正己焼；己酸己醋法測得總脂含量。測得培養(yǎng)8天的SS-B7 藻株的生物質(zhì)產(chǎn)量為11. 2g/L細胞總脂含量占細胞干重的43. 43%。
[0024] 表1 BGll培養(yǎng)基

實施例4 SS-B7和SS-7的生長效果的比較 將對數(shù)生長期的SS-B7和SS-7的藻液分別接種在BGll培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)在光生 物反應(yīng)器中進行，接種后的培養(yǎng)液的ODew為0. 2。根據(jù)試驗需要，組配不同含量的CO2和NO 混合氣，然后從反應(yīng)器底部通入。培養(yǎng)過程中光照強度為5000LUX，溫度為28°C，pH值控制 在7-9之間，光照周期為2地，光暗時間比為14:10,培養(yǎng)時間為10天，培養(yǎng)結(jié)束后收集藻細 胞，測定細胞干重，結(jié)果如表3所示。
[00巧]表3 SS-B7和SS-7培養(yǎng)結(jié)果對比

從結(jié)果可W看出，經(jīng)過馴化篩選的SS-B7比初始藻株SS-7對C〇2和NO有更好的耐受 性。
【主權(quán)項】
1. 一株富含油脂的纖維藻，該藻株為SS-B7,其分類命名為纖維藻（ 耶），已于2013年4月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏 編號為 CGMCCNo. 7478。2. 按照權(quán)利要求1所述的纖維藻，其特征在于：該藻株在顯微鏡下藻細胞為綠色，鐮形 或弓形、叢生、彎曲，自中央向兩端漸尖細，末端尖，長大約5 -6 μ m，中央覽約2μηι。3. 按照權(quán)利要求1所述的纖維藻，其特征在于：該藻株能夠耐受CO 2的濃度可達40ν%， 耐受勵1的濃度可達400/106(>八）。4. 按照權(quán)利要求1所述的纖維藻SS-B7的培養(yǎng)方法，其特征在于：該藻株在光照生物 反應(yīng)器中，利用BG11或SE淡水培養(yǎng)基培養(yǎng)，在光照強度1500-10000Lux，pH值為6-9,溫度 為15-40°C下培養(yǎng)，從反應(yīng)器底部通入C0 2含量為5v%-40v%的氣體；培養(yǎng)8天以上進入穩(wěn)定 期，結(jié)束培養(yǎng)，收獲藻細胞，藻細胞干重達到l〇g/L以上，細胞總脂含量占細胞干重的40%以 上。5. 按照權(quán)利要求1所述的纖維藻SS-B7在固定C02中的應(yīng)用。6. 按照權(quán)利要求1所述的纖維藻SS-B7在生產(chǎn)微藻油脂中的應(yīng)用。7. 按照權(quán)利要求1所述的纖維藻SS-B7在凈化含0)2和NOx的廢氣或煙氣中的應(yīng)用。8. 按照權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：該藻株可以利用含0)2和NOx的廢氣或煙 氣進行光照自養(yǎng)生長獲取富含油脂的生物質(zhì)，廢氣或煙氣中C0 2不超過30v%，NOx含量不超 過 400X 10 6 (v/v)。9. 按照權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于：在光照生物反應(yīng)器中，利用BG11或 SE淡水培養(yǎng)基培養(yǎng)，從反應(yīng)器底部通入C02含量為5v%-30v%，NO和/或NO 2含量為 100X 10 6-400X 10 6 (v/v)的廢氣或煙氣，在光照強度1500-10000Lux，pH值為7-9,溫度 為20-40°C下處理廢氣，處理8天后結(jié)束；收獲藻細胞，藻細胞干重達到10g/L以上，細胞總 脂含量占細胞干重的40%以上。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株富含油脂的纖維藻及其培養(yǎng)應(yīng)用，該藻株為SS-B7，其分類命名為纖維藻（<i>Ankistrodesmus</i><i> sp.</i>），已于2013年4月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 7478。本發(fā)明的纖維藻SS-B7能夠耐受高濃度的CO2和NOx，固碳效率高，獲得的生物質(zhì)中細胞總脂含量占細胞干重的40%以上，能夠進行生物柴油的生產(chǎn)。CGMCC No. 747820130415
【IPC分類】B01D53/56, C12N1/12, B01D53/62, C12R1/89, C12P7/64, B01D53/84
【公開號】CN105713836
【申請?zhí)枴緾N201410730989
【發(fā)明人】師文靜, 廖莎, 姚新武, 樊亞超, 孫啟梅, 王領(lǐng)民, 高大成, 李曉姝
【申請人】中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院