【
技術(shù)領(lǐng)域：
】本發(fā)明涉及環(huán)狀dna的擴(kuò)增方法。更具體而言，涉及可在無細(xì)胞系統(tǒng)中指數(shù)擴(kuò)增環(huán)狀dna的方法。
背景技術(shù)：
：成為生物技術(shù)發(fā)展的基盤的dna克隆技術(shù)是將由dna片段的環(huán)化調(diào)制的環(huán)狀dna在大腸桿菌等的細(xì)胞內(nèi)作為質(zhì)粒擴(kuò)增的方法。當(dāng)使用利用細(xì)胞的dna克隆技術(shù)而擴(kuò)增環(huán)狀dna時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)及擴(kuò)增產(chǎn)物的提?。兓鹊臒┈嵉捻樞蜃兊帽匾?。另外，由于為了進(jìn)行使用細(xì)胞的dna克隆而有必要制出基因重組生物，可實(shí)驗(yàn)的環(huán)境上有限制。作為在試管內(nèi)擴(kuò)增dna的方法，一般使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)。但是，在由pcr的試管內(nèi)dna擴(kuò)增法中，無法直接擴(kuò)增環(huán)狀dna。作為環(huán)狀dna的試管內(nèi)擴(kuò)增法，有滾環(huán)擴(kuò)增法(rca)等(非專利文獻(xiàn)1、專利文獻(xiàn)1、專利文獻(xiàn)2、專利文獻(xiàn)3)。但是，為了用滾環(huán)擴(kuò)增法擴(kuò)增環(huán)狀dna有每次設(shè)計(jì)對(duì)目標(biāo)dna具有特異性的引物的必要。另外，由滾環(huán)擴(kuò)增法的直接的擴(kuò)增產(chǎn)物是直鏈型dna，為了使得到的擴(kuò)增產(chǎn)物環(huán)狀化，與重組酶溫育的等的進(jìn)一步的環(huán)狀化工序變得必要。雖也報(bào)告有復(fù)制大腸桿菌的小染色體(oric環(huán)狀dna)之后，將其分離，得到單體的復(fù)制產(chǎn)物的方法(非專利文獻(xiàn)2)，但可擴(kuò)增的只是6kbp程度的環(huán)狀dna。另外，雖也報(bào)告有使用大腸桿菌來源的純化酶組而再構(gòu)成大腸桿菌的小染色體的復(fù)制(非專利文獻(xiàn)3)，但還不知在1個(gè)試管內(nèi)重復(fù)復(fù)制循環(huán)，在試管內(nèi)指數(shù)擴(kuò)增長(zhǎng)的環(huán)狀dna的方法。這樣，為了用以往的試管內(nèi)dna擴(kuò)增法擴(kuò)增環(huán)狀dna需要引物與模板dna的結(jié)合，擴(kuò)增產(chǎn)物是直鏈型dna，另外，有能擴(kuò)增的dna尺寸只有數(shù)kb的問題。作為調(diào)制長(zhǎng)的dna的技術(shù)，提議有slic法或gibsonassembly法等，但當(dāng)使用任何這些技術(shù)時(shí)，為了最終調(diào)制長(zhǎng)鏈環(huán)狀dna也需要細(xì)胞的利用(非專利文獻(xiàn)4)。作為利用細(xì)胞制成長(zhǎng)鏈環(huán)狀dna的方法，例如，報(bào)告有使用枯草芽孢桿菌的方法(非專利文獻(xiàn)5)?！粳F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)】【專利文獻(xiàn)】專利文獻(xiàn)1：特開2005-229950專利文獻(xiàn)2：特開2008-161182專利文獻(xiàn)3：特表2012-501173【非專利文獻(xiàn)】非專利文獻(xiàn)1：fakruddinmetal.,jpharmbioalliedsci.2013,5：245-252非專利文獻(xiàn)2：pengh&marianskj.pnas.1993,90：8571-8575非專利文獻(xiàn)3：kagunijm&kornberga.cell.1984,38:183-90非專利文獻(xiàn)4：chaoretal.,femsyeastres.2014非專利文獻(xiàn)5：tsugeetal.,nucleicacidsres.2003,31:e133技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】本發(fā)明旨在提供可在無細(xì)胞系統(tǒng)中簡(jiǎn)便并且指數(shù)擴(kuò)增環(huán)狀dna、特別是長(zhǎng)鏈環(huán)狀dna的方法?！窘鉀Q課題的技術(shù)方案】本發(fā)明人等為解決上述課題重復(fù)銳意研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過使有復(fù)制起始序列(originofchromosome(oric))的環(huán)狀dna與含以下的酶組的反應(yīng)液混合而生成的反應(yīng)混合物于等溫反應(yīng)：(1)催化環(huán)狀dna的復(fù)制的第一酶組；(2)催化岡崎片段連接反應(yīng)而合成形成連環(huán)體的2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的第二酶組；及(3)催化2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的分離反應(yīng)的第三酶組，“復(fù)制的開始(dna雙鍵斷裂)·延伸(復(fù)制叉進(jìn)行)·復(fù)制的姊妹dna的分離(decatenation)”的循環(huán)重復(fù)，可指數(shù)擴(kuò)增環(huán)狀dna。即，雖無限制，本發(fā)明包含以下的實(shí)施方式的發(fā)明。[1]環(huán)狀dna的擴(kuò)增方法，其包括以下的工序：(1)形成含下列酶組的反應(yīng)液和成為模板的環(huán)狀dna的反應(yīng)混合物的工序：催化環(huán)狀dna的復(fù)制的第一酶組；催化岡崎片段連接反應(yīng)而合成形成連環(huán)體的2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的第二酶組；及催化2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的分離反應(yīng)的第三酶組，其中環(huán)狀dna含能與有dnaa活性的酶結(jié)合的復(fù)制起始序列(originofchromosome(oric))；及(2)在等溫條件下保溫在工序(1)中形成的反應(yīng)混合物的工序。[2][1]所述的方法，其中催化環(huán)狀dna的復(fù)制的第一酶組是有dnaa活性的酶、1種以上的擬核蛋白質(zhì)、有dna促旋酶活性的酶或酶組、單鏈dna結(jié)合蛋白質(zhì)(single-strandbindingprotein(ssb))、有dna解螺旋酶活性的酶、有dna解螺旋酶裝載體活性的酶、有dna引發(fā)酶活性的酶、有dna夾活性的酶、及有dna聚合酶iii活性的酶或酶組的組合，催化岡崎片段連接反應(yīng)而合成形成連環(huán)體的2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的第二酶組是有rna酶h活性的酶、有dna聚合酶i活性的酶、及有dna連接酶活性的酶的組合，催化2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的分離反應(yīng)的第三酶組是有拓?fù)洚悩?gòu)酶iv活性的酶、有拓?fù)洚悩?gòu)酶iii活性的酶、及有recq活性的酶的組合。[3][2]所述的方法，其中能與有dnaa活性的酶結(jié)合的復(fù)制起始序列是大腸桿菌的復(fù)制起始序列。[4][2]或[3]之任一項(xiàng)所述的方法，其中環(huán)狀dna的尺寸是50kb以上。[5][2]～[4]之任一項(xiàng)所述的方法，其中1種以上的擬核蛋白質(zhì)是ihfa及ihfb的組合。[6][2]～[5]之任一項(xiàng)所述的方法，其中有dna促旋酶活性的酶或酶組是gyra及gyrb的組合。[7][2]～[6]之任一項(xiàng)所述的方法，其中有dna解螺旋酶活性的酶是dnab解螺旋酶。[8][2]～[7]之任一項(xiàng)所述的方法，其中有dna解螺旋酶裝載體活性的酶是dnac解螺旋酶裝載體。[9][2]～[8]之任一項(xiàng)所述的方法，其中有dna引發(fā)酶活性的酶是dnag引發(fā)酶。[10][2]～[9]之任一項(xiàng)所述的方法，其中有dna夾活性的酶是dnan夾。[11][2]～[10]之任一項(xiàng)所述的方法，其中有dna聚合酶iii活性的酶或酶組是dnax、hola、holb、holc、hold、dnae、dnaq、及hole的組合。[12][2]～[11]之任一項(xiàng)所述的方法，其中有dnaa活性的酶、1種以上的擬核蛋白質(zhì)、有dna促旋酶活性的酶或酶組、單鏈dna結(jié)合蛋白質(zhì)(single-strandbindingprotein(ssb))、有dna解螺旋酶活性的酶、有dna解螺旋酶裝載體活性的酶、有dna引發(fā)酶活性的酶、有dna夾活性的酶、有dna聚合酶iii活性的酶或酶組、有rna酶h活性的酶、有dna聚合酶i活性的酶、有dna連接酶活性的酶、有拓?fù)洚悩?gòu)酶iv活性的酶、有拓?fù)洚悩?gòu)酶iii活性的酶、及有recq活性的酶是大腸桿菌來源。[13][1]～[12]之任一項(xiàng)所述的方法，其中在工序(1)中的反應(yīng)液還含抑制副產(chǎn)物的生成的成分。[14][1]～[13]之任一項(xiàng)所述的方法，其中在工序(2)中的等溫條件是25℃～50℃所含的范圍的一定的溫度。[15]環(huán)狀dna的擴(kuò)增用組合物，其含催化環(huán)狀dna的復(fù)制的第一酶組；催化岡崎片段連接反應(yīng)而合成形成連環(huán)體的2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的第二酶組；及催化2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的分離反應(yīng)的第三酶組。[16][15]所述的組合物，其中催化環(huán)狀dna的復(fù)制的第一酶組是有dnaa活性的酶、1種以上的擬核蛋白質(zhì)、有dna促旋酶活性的酶或酶組、單鏈dna結(jié)合蛋白質(zhì)(single-strandbindingprotein(ssb))、有dna解螺旋酶活性的酶、有dna解螺旋酶裝載體活性的酶、有dna引發(fā)酶活性的酶、有dna夾活性的酶、及有dna聚合酶iii活性的酶或酶組的組合，催化岡崎片段連接反應(yīng)而合成形成連環(huán)體的2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的第二酶組是有rna酶h活性的酶、有dna聚合酶i活性的酶、及有dna連接酶活性的酶的組合，催化2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的分離反應(yīng)的第三酶組是有拓?fù)洚悩?gòu)酶iv活性的酶、有拓?fù)洚悩?gòu)酶iii活性的酶、及有recq活性的酶的組合。[17]環(huán)狀dna的擴(kuò)增用試劑盒，其含催化環(huán)狀dna的復(fù)制的第一酶組；催化岡崎片段連接反應(yīng)而合成形成連環(huán)體的2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的第二酶組；及催化2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的分離反應(yīng)的第三酶組。[18][17]所述的試劑盒，其中催化環(huán)狀dna的復(fù)制的第一酶組是有dnaa活性的酶、1種以上的擬核蛋白質(zhì)、有dna促旋酶活性的酶或酶組、單鏈dna結(jié)合蛋白質(zhì)(single-strandbindingprotein(ssb))、有dna解螺旋酶活性的酶、有dna解螺旋酶裝載體活性的酶、有dna引發(fā)酶活性的酶、有dna夾活性的酶、及有dna聚合酶iii活性的酶或酶組的組合，催化岡崎片段連接反應(yīng)而合成形成連環(huán)體的2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的第二酶組是有rna酶h活性的酶、有dna聚合酶i活性的酶、及有dna連接酶活性的酶的組合，催化2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的分離反應(yīng)的第三酶組是有拓?fù)洚悩?gòu)酶iv活性的酶、有拓?fù)洚悩?gòu)酶iii活性的酶、及有recq活性的酶的組合。【發(fā)明效果】由本發(fā)明提供可不使用大腸桿菌細(xì)胞或質(zhì)粒載體，簡(jiǎn)便并且指數(shù)擴(kuò)增環(huán)狀dna、特別是長(zhǎng)鏈環(huán)狀dna的方法。由本發(fā)明，擴(kuò)增環(huán)狀dna不需要溫度控制循環(huán)或引物，超200kb的長(zhǎng)鏈環(huán)狀dna的擴(kuò)增也是可能的。另外，由本發(fā)明得到的擴(kuò)增產(chǎn)物是與原來的模板相同的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的拷貝。再者，連接多個(gè)dna片段之后，直接加到所述反應(yīng)系統(tǒng)，則也可僅特異性地?cái)U(kuò)增由連接環(huán)狀化的dna而調(diào)制?！靖綀D說明】【圖1】圖1顯示由本發(fā)明的復(fù)制循環(huán)的模型?！緢D2】圖2顯示由使用gibsonassembly法的試管內(nèi)連接環(huán)狀化的dna的結(jié)構(gòu)?！緢D3】圖3顯示對(duì)以9.6kb的環(huán)狀dna作為模板使用時(shí)的每反應(yīng)時(shí)間的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，由sybergreen檢測(cè)的結(jié)果?！緢D4】圖4顯示對(duì)以200kb及80kb的長(zhǎng)鏈環(huán)狀dna作為模板使用時(shí)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，由sybergreen檢測(cè)的結(jié)果。圖4a顯示以200kb的長(zhǎng)鏈環(huán)狀dna(15pm,20ng)作為模板使用時(shí)的每反應(yīng)時(shí)間的增副產(chǎn)物的結(jié)果。圖4b顯示以80kb(15pm,8ng)及200kb(5pm,6.7ng)的長(zhǎng)鏈環(huán)狀dna作為模板使用時(shí)的反應(yīng)3小時(shí)后的增副產(chǎn)物的結(jié)果?！緢D5】圖5顯示對(duì)以由使用gibsonassembly法在試管內(nèi)連接環(huán)狀化的dna作為模板使用時(shí)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，由sybergreen檢測(cè)的結(jié)果?！緢D6】圖6顯示以微量(1分子水平)的9.6kb的環(huán)狀dna作為模板使用的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖6a顯示對(duì)以9.6kb的環(huán)狀dna作為模板使用時(shí)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，由sybergreen檢測(cè)的結(jié)果。圖6b是顯示將增副產(chǎn)物的dna量由picogreen法或大腸桿菌轉(zhuǎn)化法定量，顯示其擴(kuò)增程度的結(jié)果的坐標(biāo)圖?！緢D7】圖7是顯示對(duì)于使用9.6kb的環(huán)狀dna作為模板時(shí)的擴(kuò)增時(shí)間的擴(kuò)增的環(huán)狀dna分子數(shù)的坐標(biāo)圖?！緢D8】圖8是顯示來自混合物的單一的環(huán)狀dna克隆的擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果的圖。圖8a是對(duì)于環(huán)狀dna的混合物的稀釋的模式圖。圖8b顯示對(duì)稀釋環(huán)狀dna的混合物而擴(kuò)增時(shí)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，由sybergreen檢測(cè)的結(jié)果。【圖9】圖9是顯示環(huán)狀dna的傳代擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果的圖。圖9a是對(duì)于實(shí)驗(yàn)順序的模式圖。圖9b顯示將擴(kuò)增反應(yīng)后的dna產(chǎn)物在新的反應(yīng)液中稀釋，再次重復(fù)10次導(dǎo)致擴(kuò)增的傳代擴(kuò)增時(shí)的結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物由瓊脂糖電泳及sybergreen檢測(cè)。【實(shí)施方式】<環(huán)狀dna>作為模板使用的環(huán)狀dna優(yōu)選是雙鍵。作為模板使用的環(huán)狀dna只要含能與有dnaa活性的酶結(jié)合的復(fù)制起始序列(originofchromosome(oric))，就不特別限制，可例示向?qū)⑽⑸锏沫h(huán)狀染色體等的天然的環(huán)狀dna、天然的環(huán)狀dna由酶處理等切斷的等連接別的dna片段，使其環(huán)狀化的環(huán)狀dna、全部人工合成的環(huán)狀dna等。作為能與有dnaa活性的酶結(jié)合的復(fù)制起始序列(originofchromosome(oric))(以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為“復(fù)制起始序列”)，可從ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等的公的數(shù)據(jù)庫得到例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等的細(xì)菌中存在的公知的復(fù)制起始序列。另外，通過克隆能與有dnaa活性的酶結(jié)合的dna片段，解析其堿基序列，也可得到復(fù)制起始序列。在本發(fā)明中作為模板使用的環(huán)狀dna可為原本含復(fù)制起始序列的環(huán)狀dna，也可為向原本不含復(fù)制起始序列的環(huán)狀dna導(dǎo)入復(fù)制起始序列的。在本發(fā)明中作為模板使用的環(huán)狀dna，根據(jù)目的，可為含卡那霉素、氨芐西林、四環(huán)素等的藥劑抗性標(biāo)志物基因序列的。在本發(fā)明中作為模板使用的環(huán)狀dna可為純化的，也可為含環(huán)狀dna的菌體提取物等的懸浮液的形態(tài)。另外，可以1種環(huán)狀dna作為模板使用，也可為如例如，將dna庫一樣的多種環(huán)狀dna的混合物在1個(gè)試管內(nèi)作為模板使用。在每1反應(yīng)中使用的模板dna的量無特別限制，也可以每1反應(yīng)1分子的環(huán)狀dna作為模板使用。在本發(fā)明中作為模板使用的環(huán)狀dna的長(zhǎng)度無限制，可設(shè)為例如1kb(1000堿基長(zhǎng))以上、5kb(5000堿基長(zhǎng))以上、8kb(8,000堿基長(zhǎng))以上、10kb(10,000堿基長(zhǎng))以上、50kb(50,000堿基長(zhǎng))以上、100kb(100,000堿基長(zhǎng))以上、200kb(200,000堿基長(zhǎng))以上、500kb(500,000堿基長(zhǎng))以上、1000kb(1,000,000堿基長(zhǎng))以上、或者2000kb(2,000,000堿基長(zhǎng))以上的長(zhǎng)度。在本發(fā)明中，以上述的環(huán)狀dna作為模板使用，可將其擴(kuò)增至少10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、或者10000倍。<第一、第二及第三酶組>本發(fā)明涉及使有復(fù)制起始序列(originofchromosome(oric))的環(huán)狀dna與含以下酶組的反應(yīng)液混合而生成的反應(yīng)混合物于等溫反應(yīng)：(1)催化環(huán)狀dna的復(fù)制的第一酶組；(2)催化岡崎片段連接反應(yīng)而合成形成連環(huán)體的2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的第二酶組；及(3)催化2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的分離反應(yīng)的第三酶組。不受理論限制，本發(fā)明重復(fù)如圖1所示復(fù)制循環(huán)，指數(shù)擴(kuò)增環(huán)狀dna。<(1)催化環(huán)狀dna的復(fù)制的第一酶組>作為催化環(huán)狀dna的復(fù)制的第一酶組，可使用例如kagunijm&kornberga.cell.1984,38:183-90中記載的酶組。具體而言，作為第一酶組，可例示選自以下的酶或酶組之一，或者所述酶或酶組的組合：有dnaa活性的酶、1種以上的擬核蛋白質(zhì)、有dna促旋酶活性的酶或酶組、單鏈dna結(jié)合蛋白質(zhì)(single-strandbindingprotein(ssb))、有dna解螺旋酶活性的酶、有dna解螺旋酶裝載體活性的酶、有dna引發(fā)酶活性的酶、有dna夾活性的酶、及有dna聚合酶iii活性的酶或酶。第一酶組也可在反應(yīng)液中以1nm～10μm的范圍含有。優(yōu)選為，第一酶組在反應(yīng)液中以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm的范圍含有，但不限于此。作為有dnaa活性的酶，只要是與作為大腸桿菌的起始物蛋白質(zhì)的dnaa有同樣的起始物活性的酶，其生物學(xué)來源就無特別限制，可適宜地使用例如大腸桿菌來源的dnaa。dnaa，在反應(yīng)液中，可以1nm～10μm的范圍含有，也可優(yōu)選以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm、1nm～1.0μm、1nm～500nm、50nm～200nm、50nm～150nm的范圍含有，但不限于此。擬核蛋白質(zhì)是指擬核中所含的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中使用的1種以上的擬核蛋白質(zhì)只要是與大腸桿菌的擬核蛋白質(zhì)有同樣的活性的酶，其生物學(xué)來源就無特別限制，可適宜地使用例如大腸桿菌來源的ihf、即ihfa及ihfb的組合或，hu、即hupa及hupb的復(fù)合物。ihf或hu在反應(yīng)液中，可以1nm～10μm的范圍含有，也可優(yōu)選以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm、1nm～1.0μm、1nm～500nm、1nm～200nm,1nm～100nm的范圍含有，但不限于此。作為有dna促旋酶活性的酶或酶組，只要是與大腸桿菌的dna促旋酶有同樣的活性的酶，其生物學(xué)來源就無特別限制，可適宜地使用例如大腸桿菌來源的gyra及gyrb的組合。gyra及gyrb的組合在反應(yīng)液中，可以1nm～10μm的范圍含有，也可優(yōu)選以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm、1nm～1.0μm、1nm～500nm、1nm～200nm,1nm～100nm的范圍含有，但不限于此。作為單鏈dna結(jié)合蛋白質(zhì)(single-strandbindingprotein(ssb))，只要是與大腸桿菌的單鏈dna結(jié)合蛋白質(zhì)有同樣的活性的酶，其生物學(xué)來源就無特別限制，可適宜地使用例如大腸桿菌來源的ssb。ssb，在反應(yīng)液中，可以1nm～10μm的范圍含有，也可優(yōu)選以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm、1nm～1.0μm、1nm～500nm、50nm～500nm、100nm～500nm的范圍含有，但不限于此。作為有dna解螺旋酶活性的酶，只要是與大腸桿菌的dnab有同樣的活性的酶，其生物學(xué)來源就無特別限制，可適宜地使用例如大腸桿菌來源的dnab。dnab在反應(yīng)液中，可以1nm～10μm的范圍含有，也可優(yōu)選以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm、1nm～1.0μm、1nm～500nm、1nm～200nm,1nm～100nm的范圍含有，但不限于此。作為有dna解螺旋酶裝載體活性的酶，只要是與大腸桿菌的dnac有同樣的活性的酶，其生物學(xué)來源就無特別限制，可適宜地使用例如大腸桿菌來源的dnac。dnac在反應(yīng)液中，可以1nm～10μm的范圍含有，也可優(yōu)選以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm、1nm～1.0μm、1nm～500nm、1nm～200nm,1nm～100nm的范圍含有，但不限于此。作為有dna引發(fā)酶活性的酶，只要是與大腸桿菌的dnag有同樣的活性的酶，其生物學(xué)來源就無特別限制，可適宜地使用例如大腸桿菌來源的dnag。dnag，在反應(yīng)液中，可以1nm～10μm的范圍含有，也可為優(yōu)選以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm、1nm～1.0μm、1nm～500nm、50nm～500nm、100nm～500nm的范圍含有，但不限于此。作為有dna夾活性的酶，只要是與大腸桿菌的dnan有同樣的活性的酶，其生物學(xué)來源就無特別限制，可適宜地使用例如大腸桿菌來源的dnan。dnan在反應(yīng)液中，可以1nm～10μm的范圍含有，也可優(yōu)選以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm、1nm～1.0μm、1nm～500nm、1nm～200nm,1nm～100nm的范圍含有，但不限于此。作為有dna聚合酶iii*活性的酶或酶組，只要是與大腸桿菌的dna聚合酶iii*復(fù)合物有同樣的活性的酶或酶組，其生物學(xué)來源就無特別限制，可適宜地使用例如大腸桿菌來源的dnax、hola、holb、holc、hold、dnae、dnaq、及hole的組合。dna聚合酶iii*復(fù)合物在反應(yīng)液中，可以1nm～10μm的范圍含有，也可為優(yōu)選以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm、1nm～1.0μm、1nm～500nm、1nm～100nm、1nm～50nm的范圍含有，但不限于此。<(2)催化岡崎片段連接反應(yīng)而合成形成連環(huán)體的2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的第二酶組>在本發(fā)明中，形成連環(huán)體的2個(gè)姊妹環(huán)狀dna是指由dna復(fù)制反應(yīng)合成的2個(gè)環(huán)狀dna處于連接的狀態(tài)的。作為催化岡崎片段連接反應(yīng)而合成形成連環(huán)體的2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的第二酶組，例如可例示選自下列的1個(gè)酶或所述酶的組合：有rna酶h活性的酶、有dna聚合酶i活性的酶、及有dna連接酶活性的酶。第二酶組也可以1nm～10μm的范圍含有在反應(yīng)液中。優(yōu)選為，第二酶組在反應(yīng)液中以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm、1nm～1.0μm、1nm～500nm、50nm～200nm的范圍含有，但不限于此。作為有rna酶h活性的酶，只要是有分解rna:dna雜交體的rna鏈的活性的，其生物學(xué)來源就無特別限制，可適宜地使用例如大腸桿菌來源的rna酶h。rna酶h在反應(yīng)液中，可以1nm～10μm的范圍含有，也可優(yōu)選以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm、1nm～1.0μm、1nm～500nm、1nm～200nm,1nm～100nm的范圍含有，但不限于此。作為有dna聚合酶i活性的酶，只要是與大腸桿菌的dna聚合酶i有同樣的活性的，其生物學(xué)來源就無特別限制，可適宜地使用例如大腸桿菌來源的dna聚合酶i。dna聚合酶i在反應(yīng)液中，可以1nm～10μm的范圍含有，也可優(yōu)選以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm、1nm～1.0μm、1nm～500nm、1nm～200nm,1nm～100nm的范圍含有，但不限于此。作為有dna連接酶活性的酶，只要是與大腸桿菌的dna連接酶有同樣的活性的，其生物學(xué)來源就無特別限制，可適宜地使用例如大腸桿菌來源的dna連接酶。dna連接酶在反應(yīng)液中，可以1nm～10μm的范圍含有，也可為優(yōu)選以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm、1nm～1.0μm、1nm～500nm、1nm～200nm,1nm～100nm的范圍含有，但不限于此。<(3)催化2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的分離反應(yīng)的第三酶組>作為催化2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的分離反應(yīng)的第三酶組，可使用例如peng&marians1993pnas中記載的酶組。具體而言，作為第三酶組，可例示選自下列的1個(gè)酶或所述酶的組合：有拓?fù)洚悩?gòu)酶iv活性的酶、有拓?fù)洚悩?gòu)酶iii活性的酶、及有recq活性的酶。第三酶組也可以1nm～10μm的范圍含有在反應(yīng)液中。優(yōu)選為，第三酶組在反應(yīng)液中以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm、1nm～1.0μm、1nm～500nm、50nm～200nm的范圍含有，但不限于此。作為有拓?fù)洚悩?gòu)酶iv活性的酶，只要是與大腸桿菌的拓?fù)洚悩?gòu)酶iv有同樣的活性的，其生物學(xué)來源就無特別限制，可適宜地使用例如作為parc和pare的復(fù)合物的大腸桿菌來源的拓?fù)洚悩?gòu)酶iv。拓?fù)洚悩?gòu)酶iv在反應(yīng)液中，可以1nm～10μm的范圍含有，也可優(yōu)選以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm、1nm～1.0μm、1nm～500nm、1nm～100nm、1nm～50nm的范圍含有，但不限于此。作為有拓?fù)洚悩?gòu)酶iii活性的酶，只要是與大腸桿菌的拓?fù)洚悩?gòu)酶iii有同樣的活性的，其生物學(xué)來源就無特別限制，可適宜地使用例如大腸桿菌來源的拓?fù)洚悩?gòu)酶iii。拓?fù)洚悩?gòu)酶iii在反應(yīng)液中，可以1nm～10μm的范圍含有，也可優(yōu)選以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm、1nm～1.0μm、1nm～500nm、1nm～200nm,1nm～100nm的范圍含有，但不限于此。作為有recq活性的酶，只要是與大腸桿菌的recq有同樣的活性的，其生物學(xué)來源就無特別限制，可適宜地使用例如大腸桿菌來源的recq。recq在反應(yīng)液中，可以1nm～10μm的范圍含有，也可為優(yōu)選以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm、1nm～1.0μm、1nm～500nm、1nm～200nm,1nm～100nm的范圍含有，但不限于此。特別適宜地是，作為第一酶組，均可使用大腸桿菌來源的dnaa、ihf、gyra及gyrb、ssb、dnab及dnac、dnag、dnan、以及poliii*的組合；作為第二酶組，均可使用大腸桿菌來源的rna酶h、dna聚合酶i、及dna連接酶的組合；以及，作為第三酶組，均可使用大腸桿菌來源的拓?fù)洚悩?gòu)酶iv、拓?fù)洚悩?gòu)酶iii、及recq的組合。進(jìn)而，作為使用上述的酶組的組合時(shí)的適宜的各酶的濃度，如下例示，但不限于此?！颈?】上述的第一、第二及第三酶組可使用市售的，也可使用從微生物等提取，根據(jù)需要純化的。來自微生物的酶的提取及純化可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員能利用的方法適宜實(shí)施。也可使含上述酶的無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的反應(yīng)液直接與成為模板的環(huán)狀dna混合而形成用于環(huán)狀dna的擴(kuò)增的反應(yīng)混合液。無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)可以含由與編碼上述酶的基因的堿基序列互補(bǔ)的序列構(gòu)成的rna的總rna(totalrna)、mrna、或者體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等作為模板rna的無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，也可以編碼各酶的基因或含編碼各酶的基因的表達(dá)載體等作為模板dna的無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)。<環(huán)狀dna的擴(kuò)增方法>本發(fā)明的方法包括形成含上述第一至第三酶組的反應(yīng)液和成為模板的環(huán)狀dna的反應(yīng)混合物的工序。含第一至第三酶組的反應(yīng)液的組成只要是可進(jìn)行dna復(fù)制反應(yīng)的，就無特別限制，例如，可使用將第一至第三酶組添加到向tris鹽酸緩沖液等的緩沖液添加rntp、dntp、鎂離子源、atp源等的溶液中的等。另外，上述反應(yīng)液可為還含抑制副產(chǎn)物的生成的成分等的追加的成分的。作為具體的反應(yīng)液，可例示后述的實(shí)施例中記載的。本發(fā)明的方法還包括在等溫條件下保溫上述反應(yīng)混合物的工序。作為等溫條件，只要是可進(jìn)行dna復(fù)制反應(yīng)的，就無特別限制，例如可設(shè)為含作為dna聚合酶的最適溫度的20～80℃的范圍的一定的溫度，可設(shè)為25℃～50℃所含的范圍的一定的溫度，可設(shè)為30℃左右。保溫時(shí)間可根據(jù)作為目的環(huán)狀dna的擴(kuò)增產(chǎn)物的量適宜設(shè)定，例如可設(shè)為1～24小時(shí)。本發(fā)明的方法在等溫條件下保溫上述反應(yīng)混合物的工序之后，根據(jù)目的，也可包括純化環(huán)狀dna的擴(kuò)增產(chǎn)物的工序。環(huán)狀dna的純化可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員能利用的方法適宜實(shí)施。使用本發(fā)明的方法擴(kuò)增的環(huán)狀dna可在轉(zhuǎn)化等的其后的目的中使用直接或者適宜純化反應(yīng)后的反應(yīng)混合物的。<環(huán)狀dna的擴(kuò)增用組合物及試劑盒>本發(fā)明也涉及環(huán)狀dna的擴(kuò)增用組合物，其含催化環(huán)狀dna的復(fù)制的第一酶組；催化岡崎片段連接反應(yīng)而合成形成連環(huán)體的2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的第二酶組；及催化2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的分離反應(yīng)的第三酶組。本發(fā)明的組合物只要是不妨礙本發(fā)明的效果，就也可含穩(wěn)定劑、還原劑、反應(yīng)緩沖液等的追加的成分。另外，本發(fā)明也涉及環(huán)狀dna的擴(kuò)增用試劑盒，其含催化環(huán)狀dna的復(fù)制的第一酶組；催化岡崎片段連接反應(yīng)而合成形成連環(huán)體的2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的第二酶組；及催化2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的分離反應(yīng)的第三酶組。本發(fā)明的試劑盒可為含將上述酶的混合物包裝為1個(gè)的，也可為含將上述酶?jìng)€(gè)別地，或者將數(shù)種綜合混合的個(gè)別地包裝的。另外，本發(fā)明也涉及環(huán)狀dna的擴(kuò)增用試劑盒，其含屬于催化環(huán)狀dna的復(fù)制的第一酶組；催化岡崎片段連接反應(yīng)而合成形成連環(huán)體的2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的第二酶組；及催化2個(gè)姊妹環(huán)狀dna的分離反應(yīng)的第三酶組的各酶的無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明的試劑盒，根據(jù)目的，可為含反應(yīng)緩沖液的濃縮物或反應(yīng)緩沖液等的追加的構(gòu)成品的?！緦?shí)施例】以下，基于實(shí)施例具體說明本發(fā)明。再者，本發(fā)明不限于下述實(shí)施例中記載的范圍?！緦?shí)施例1：環(huán)狀dna的擴(kuò)增】<材料和方法>向表1所示的組成的反應(yīng)液添加模板dna，在冰上混合之后，在30℃的溫育器中保溫1小時(shí)、2小時(shí)、或者3小時(shí)。每1反應(yīng)的總?cè)萘吭O(shè)為10μl。在30℃反應(yīng)后，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(0.5％1×tae、150v、100分鐘、14℃)之后，使用sybergreen(寶生物株式會(huì)社)檢測(cè)dna?！颈?】表中，ssb表示大腸桿菌來源ssb、ihf表示大腸桿菌來源ihfa及ihfb的組合，dnag表示大腸桿菌來源dnag、dnan表示大腸桿菌來源dnan、poliii*表示由大腸桿菌來源dnax、hola、holb、holc、hold、dnae、dnaq、及hole的組合構(gòu)成的dna聚合酶iii*復(fù)合物、dnab表示大腸桿菌來源dnab、dnac表示大腸桿菌來源dnac、dnaa表示大腸桿菌來源rna酶h、ligase表示大腸桿菌來源dna連接酶、poli表示大腸桿菌來源dna聚合酶i、gyra表示大腸桿菌來源gyra、gyrb表示大腸桿菌來源gyrb、topoiv表示大腸桿菌來源parc及pare的組合，topoiii表示大腸桿菌來源拓?fù)洚悩?gòu)酶iii、recq表示大腸桿菌來源recq。ssb是從ssb的表達(dá)大腸桿菌的株，用含硫酸銨沉淀及離子交換柱層析的工序純化，調(diào)制。ihf是從ihfa及ihfb的共表達(dá)大腸桿菌的株，用含硫酸銨沉淀及親和性柱層析的工序純化，調(diào)制。dnag是從dnag的表達(dá)大腸桿菌的株，用含硫酸銨沉淀、陰離子交換柱層析、及凝膠過濾柱層析的工序純化，調(diào)制。dnan是從dnan的表達(dá)大腸桿菌的株，用含硫酸銨沉淀及陰離子交換柱層析的工序純化，調(diào)制。poliii*是從dnax、hola、holb、holc、hold、dnae、dnaq及hole的共表達(dá)大腸桿菌的株，用含硫酸銨沉淀、親和性柱層析、及凝膠過濾柱層析的工序純化，調(diào)制。dnab,dnac是從dnab及dnac的共表達(dá)大腸桿菌的株，用含硫酸銨沉淀、親和性柱層析、及凝膠過濾柱層析的工序純化，調(diào)制。dnaa是從dnaa的表達(dá)大腸桿菌的株，用含硫酸銨沉淀、透析沉淀、及凝膠過濾柱層析的工序純化，調(diào)制。gyra,gyrb是從gyra的表達(dá)大腸桿菌的株和gyrb的表達(dá)大腸桿菌的株的混合物，用含硫酸銨沉淀、親和性柱層析、及凝膠過濾柱層析的工序純化，調(diào)制。topoiv是從parc的表達(dá)大腸桿菌的株和pare的表達(dá)大腸桿菌的株的混合物，用含硫酸銨沉淀、親和性柱層析、及凝膠過濾柱層析的工序純化，調(diào)制。topoiii是從topoiii的表達(dá)大腸桿菌的株，用含硫酸銨沉淀及親和性柱層析的工序純化，調(diào)制。recq是從recq的表達(dá)大腸桿菌的株，用含硫酸銨沉淀、親和性柱層析、及凝膠過濾柱層析的工序純化，調(diào)制。rna酶h、ligase、poli使用市售的大腸桿菌來源的酶(寶生物株式會(huì)社)。作為模板dna，使用9.6kb的環(huán)狀dna(具有復(fù)制起始序列oric的環(huán)狀dna、卡那霉素抗性(km))、80kb的長(zhǎng)鏈環(huán)狀dna(具有復(fù)制起始序列oric的環(huán)狀dna、卡那霉素抗性(km))、200kb的長(zhǎng)鏈環(huán)狀dna(具有復(fù)制起始序列oric的環(huán)狀dna、卡那霉素抗性(km))、或者由試管內(nèi)連接環(huán)狀化的dna。9.6kb的環(huán)狀dna及80kb、200kb的長(zhǎng)鏈環(huán)狀dna由大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)重組反應(yīng)調(diào)制。具體而言，使用表達(dá)λ噬菌體的重組蛋白質(zhì)組的大腸桿菌，由細(xì)胞內(nèi)重組反應(yīng)調(diào)制含卡那霉素抗性盒和在大腸桿菌染色體之中含oric的區(qū)域的期望的長(zhǎng)度的環(huán)狀dna。由試管內(nèi)連接的環(huán)狀化dna的調(diào)制方法示于圖2。具體而言，通過使具有復(fù)制起始序列oric和卡那霉素抗性(km)的pcr片段(2.3kb)與有dnaa基因及dnan基因序列的pcr片段(以下，記作dnaa-dnan片段)(2.6kb)由gibsonassembly法反應(yīng)連接。2個(gè)pcr片段經(jīng)附加到兩端的20堿基的相同序列(記作h1,h2)連接成為環(huán)狀結(jié)構(gòu)。反應(yīng)通過向gibsonassemblymastermix(neb公司)混合上述2種pcr片段，于50℃反應(yīng)15分鐘而進(jìn)行。反應(yīng)后，以每0.1μl反應(yīng)溶液(每1μl反應(yīng)溶液的10倍稀釋溶液)作為模板dna，向10μl的擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng)(表2的組成)直接添加，于30℃反應(yīng)1小時(shí)。<結(jié)果1>以9.6kb的環(huán)狀dna(0.08ng、約107個(gè)環(huán)狀分子數(shù))作為模板使用時(shí)由sybergreen的擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果示于圖3。盡管也見到副產(chǎn)物(反應(yīng)中間產(chǎn)物)，但可確認(rèn)超螺旋結(jié)構(gòu)的環(huán)狀dna擴(kuò)增產(chǎn)物(以黑框表示)。通過直接使用反應(yīng)后的溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α株，用含有卡那霉素的瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，測(cè)量集落數(shù)而求出環(huán)狀dna的擴(kuò)增量的結(jié)果示于表3。作為對(duì)照，使用保溫時(shí)間0小時(shí)的反應(yīng)溶液。【表3】保溫時(shí)間0小時(shí)3小時(shí)轉(zhuǎn)化體(集落數(shù))95.4×104由本發(fā)明的方法，可以9.6kb的環(huán)狀dna作為環(huán)狀dna擴(kuò)增大概6,000倍。<結(jié)果2>以80kb及200kb的長(zhǎng)鏈環(huán)狀dna作為模板使用時(shí)由sybergreen的擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果示于圖4?？纱_認(rèn)超螺旋結(jié)構(gòu)的環(huán)狀dna擴(kuò)增產(chǎn)物(以黑框或箭頭表示)。得知，即使在將80kb或200kb的長(zhǎng)的環(huán)狀dna作為模板使用時(shí)，也由本發(fā)明的方法良好地得到擴(kuò)增產(chǎn)物。<結(jié)果3>以由試管內(nèi)連接環(huán)狀化的dna作為模板使用時(shí)由sybergreen的擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果示于圖5。得知，在以由試管內(nèi)連接環(huán)狀化的dna作為模板使用時(shí)，也由本發(fā)明的方法良好地得到擴(kuò)增產(chǎn)物。通過直接使用反應(yīng)后的溶液而轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α株，用含有卡那霉素的瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，測(cè)量集落數(shù)而求出環(huán)狀dna的擴(kuò)增量的結(jié)果示于表4。作為對(duì)照，使用未進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的樣品?！颈?】擴(kuò)增反應(yīng)-+轉(zhuǎn)化體(集落數(shù))3.2×1026.6×105得知，使用gibsonassembly法環(huán)狀化的dna由本發(fā)明的方法而作為環(huán)狀分子擴(kuò)增大概2,000倍?！緦?shí)施例2：來自少數(shù)的模板分子的環(huán)狀dna的擴(kuò)增】使用實(shí)施例1中記載的9.6kb的環(huán)狀dna，進(jìn)行與實(shí)施例1同樣地?cái)U(kuò)增反應(yīng)。(2-1)擴(kuò)增效率的探討通過向擴(kuò)增反應(yīng)液(實(shí)施例1、表2)10μl加9.6kb的環(huán)狀dna至作為環(huán)狀分子含1～1000分子，于30℃保溫3小時(shí)而進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。對(duì)于反應(yīng)物，進(jìn)行0.5％瓊脂糖凝膠電泳，用sybrgreen(寶生物株式會(huì)社)染色，檢測(cè)擴(kuò)增dna(圖6a)。另外，將增副產(chǎn)物的總dna量由picogreen檢測(cè)試劑盒(thermofisher公司)定量(圖6b：picogreen法)。通過將擴(kuò)增產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，求出卡那霉素抗性集落數(shù)而定量作為環(huán)狀dna分子的擴(kuò)增量(圖6b：轉(zhuǎn)化法)。從定量結(jié)果求出(擴(kuò)增)相對(duì)于初期dna量的擴(kuò)增程度，示于坐標(biāo)圖。從上述的結(jié)果得知，能將作為模板dna，1分子的環(huán)狀dna用僅3小時(shí)的等溫反應(yīng)擴(kuò)增至約1011分子(約1,000億倍的擴(kuò)增)。(2-2)倍增時(shí)間的探討通過向80μl擴(kuò)增反應(yīng)液(實(shí)施例1、表2)加上述的環(huán)狀dna，于30℃保溫而進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。加環(huán)狀dna至每1μl反應(yīng)液成105分子。通過經(jīng)時(shí)采樣，將樣品直接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，求出卡那霉素抗性集落數(shù)而對(duì)被擴(kuò)增的環(huán)狀dna分子數(shù)進(jìn)行定量(圖7)。從上述的結(jié)果確認(rèn)，9.6kb的環(huán)狀dna分子的倍增時(shí)間是約5分鐘?！緦?shí)施例3：從混合物擴(kuò)增單一的環(huán)狀dna克隆】從實(shí)施例1中記載的9.6kb的環(huán)狀dna及12.0kb的環(huán)狀dna(具有復(fù)制起始序列oric的環(huán)狀dna、卡那霉素抗性(km))的混合物進(jìn)行單一的環(huán)狀dna克隆的擴(kuò)增。12.0kb的環(huán)狀dna由大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)重組反應(yīng)調(diào)制。具體而言，使用表達(dá)λ噬菌體的重組蛋白質(zhì)組的大腸桿菌，由細(xì)胞內(nèi)重組反應(yīng)調(diào)制含由oric和卡那霉素抗性基因構(gòu)成的盒和大腸桿菌染色體的一部分的區(qū)域的期望的長(zhǎng)度的環(huán)狀dna。通過將上述2種環(huán)狀dna的混合物稀釋至在反應(yīng)液中成各15分子或各1.5分子而加到擴(kuò)增反應(yīng)液(實(shí)施例1、表2)10μl中，于30度保溫6小時(shí)而進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。對(duì)于反應(yīng)物，進(jìn)行0.5％瓊脂糖凝膠電泳，用sybrgreen(寶生物株式會(huì)社)染色，檢測(cè)擴(kuò)增dna(圖8)。結(jié)果，在環(huán)狀dna被稀釋至1.5分子的反應(yīng)液中，對(duì)于每各反應(yīng)樣品，僅任何一方的克隆被擴(kuò)增。這表明，即使模板dna是混合物，通過將其在反應(yīng)液中稀釋至1分子水平，能進(jìn)行單一的環(huán)狀dna克隆的擴(kuò)增?！緦?shí)施例4：傳代擴(kuò)增】使用lacz環(huán)狀dna，對(duì)于環(huán)狀dna的傳代擴(kuò)增進(jìn)行試驗(yàn)。lacz環(huán)狀dna(9.0kb)通過將含oric的雙鏈dna片段(1.0kb)、含卡那霉素抗性基因(km)的雙鏈dna片段(4.6kb)及含lacz(β-半乳糖苷酶)基因的雙鏈dna片段(3.4kb)連接而調(diào)制。通過向擴(kuò)增反應(yīng)液(實(shí)施例1、表2)10μl加lacz環(huán)狀dna至含1,000分子，于30℃保溫3小時(shí)而進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以其作為第1次傳代。將在前述的傳代數(shù)的擴(kuò)增反應(yīng)物稀釋105倍，將1μl其添加到新的擴(kuò)增反應(yīng)液，同樣地反應(yīng)而作為下一傳代擴(kuò)增。將此傳代擴(kuò)增重復(fù)至10次。對(duì)于每次傳代的擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行0.5％瓊脂糖凝膠電泳，用sybrgreen(寶生物株式會(huì)社)染色，檢測(cè)(圖9)。另外，將其擴(kuò)增產(chǎn)物的一部分轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，由卡那霉素抗性集落數(shù)定量dna擴(kuò)增程度，由此值算出是否重復(fù)幾個(gè)世代指數(shù)擴(kuò)增作為總世代數(shù)顯示。結(jié)果得知，在10次傳代后仍有效進(jìn)行環(huán)狀dna的擴(kuò)增。如實(shí)施例2(圖7)的結(jié)果所示，如果環(huán)狀dna以某種程度擴(kuò)增，則隨著底物或酶的枯渴，擴(kuò)增速度達(dá)到頂點(diǎn)。一方面，本實(shí)施例的結(jié)果表示，通過將擴(kuò)增反應(yīng)物的一部分用新的反應(yīng)液傳代，能半永久地重復(fù)環(huán)狀dna的指數(shù)擴(kuò)增。即，本發(fā)明的方法是能如細(xì)胞的傳代增殖一樣進(jìn)行環(huán)狀dna的擴(kuò)增的方法?！緦?shí)施例5：在擴(kuò)增反應(yīng)中的復(fù)制錯(cuò)誤發(fā)生率】由于在實(shí)施例4中的模板的環(huán)狀dna中含lacz基因，如果在x-gal板上培養(yǎng)用此環(huán)狀基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，則正常表達(dá)lacz基因的集落(lacz+)由于可分解x-gal而呈藍(lán)色，由復(fù)制錯(cuò)誤的變異導(dǎo)入而lacz基因變得無法正常發(fā)揮功能的集落(lacz-)由于無法分解x-gal而呈白色。即，可由用此環(huán)狀基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在x-gal板上呈的色判斷擴(kuò)增的環(huán)狀dna中的復(fù)制錯(cuò)誤。將各傳代樣品的擴(kuò)增反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到直接大腸桿菌，在x-gal板上培養(yǎng)，求出lacz-出現(xiàn)率。從此lacz-出現(xiàn)率和在實(shí)施例4中求出的總世代數(shù)，根據(jù)barnes的方法(barneswmgene.1992,112,29-35)，算出復(fù)制循環(huán)每1世代的錯(cuò)誤發(fā)生率。結(jié)果示于以下的表5?！颈?】傳代數(shù)總世代數(shù)lacz-集落出現(xiàn)率(％)錯(cuò)誤發(fā)生率(每個(gè)堿基)125<0.045<3.7×10-8244<0.074<3.4×10-851060.11.9×10-8102010.0930.93×10-8上述的結(jié)果表示，復(fù)制錯(cuò)誤是每1億堿基1個(gè)位置左右(每個(gè)堿基平均1.4x10-8個(gè)錯(cuò)誤)。這與細(xì)胞內(nèi)(不具有錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的株)的變異率同程度，是taq聚合酶的約1萬倍的正確性。當(dāng)前第1頁12