優(yōu)先權(quán)聲明本申請(qǐng)要求2014年10月13日提交的題為“copicoatomergammasubunitnucleicacidmoleculesthatconferresistancetocoleopteranandhemipteranpests”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)62/063192的申請(qǐng)日的利益，在此將其公開全體并入本文。公開領(lǐng)域本發(fā)明一般性地涉及由昆蟲害蟲(例如鞘翅目害蟲和半翅目害蟲)引起的植物損害的遺傳控制。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及目標(biāo)編碼和非編碼多核苷酸的鑒定、及其重組dna技術(shù)在昆蟲害蟲細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄后阻遏或抑制目標(biāo)編碼多核苷酸和非編碼多核苷酸表達(dá)從而提供植保作用的用途。背景西方玉米根蟲(wcr)(diabroticavirgiferavirgiferaleconte，玉米根螢葉甲)是北美的一種破壞性最大的玉米根蟲物種，在美國(guó)中西部玉米種植區(qū)受到特別關(guān)注。北方玉米根蟲(ncr)(巴氏根螢葉甲)是與wcr共棲大致相同范圍的近緣物種。有幾種葉甲屬的其他相關(guān)亞種是美洲的嚴(yán)重害蟲：墨西哥玉米根蟲(mcr)[墨西哥玉米根螢葉甲(d.virgiferazeaekrysanandsmith)]；南方玉米根蟲(scr)(十一星根螢葉甲)；黃瓜條根螢葉甲(d.balteataleconte)；d.undecimpunctatatenella；南美葉甲(d.speciosagermar)、和d.u.undecimpunctatamannerheim。美國(guó)農(nóng)業(yè)部估計(jì)玉米根蟲每年造成10億美元收入損失，包括8億美元產(chǎn)量損失和2億美元處理成本。wcr和ncr兩者都以卵的形式在夏季期間潛伏在土壤中。這些昆蟲在整個(gè)冬季都停留在卵階段。卵是橢圓的、白色、且長(zhǎng)度小于0.004英寸。幼蟲在5月下旬或6月上旬孵出，卵孵化的精確時(shí)間由于溫度差異和位置而在各年間有所變化。新孵出的幼蟲是白色的蠕蟲，長(zhǎng)度小于0.125英寸。一旦孵出，幼蟲便開始以玉米根為食。玉米根蟲經(jīng)歷三個(gè)幼蟲齡。在進(jìn)食幾周后，幼蟲蛻皮，進(jìn)入若蟲階段。它們?cè)谕寥乐谢?，然后它們?cè)?月和8月中以成蟲從土壤出現(xiàn)。成體根蟲長(zhǎng)度約0.25英寸。玉米根蟲幼蟲在玉米和幾種其他禾本科物種上完成發(fā)育。在黃色狗尾草上飼養(yǎng)的幼蟲較晚出現(xiàn)，并且作為成蟲比玉米上飼養(yǎng)的幼蟲具有更小的頭殼尺寸。ellsbury等人，(2005)environ.entomol.34:627-634。wcr成蟲以玉米穗絲、花粉、和暴露的穗尖上的籽粒為食。如果wcr成蟲在存在玉米生殖組織之前出現(xiàn)，則它們可以以葉組織為食，由此減緩植物生長(zhǎng)，且偶而殺死宿主植物。然而，當(dāng)優(yōu)選的穗絲和花粉變得可得到時(shí)，成蟲會(huì)快速向其移動(dòng)。ncr成蟲也以玉米植物的生殖組織為食，但相比之下很少以玉米葉為食。玉米中的大部分根蟲損傷由幼蟲進(jìn)食引起。新孵出的根蟲最初以細(xì)的玉米根毛為食，并鉆入根尖中。隨著幼蟲長(zhǎng)得更大，它們以初生根為食并鉆入其中。在有大量玉米根蟲時(shí)，幼蟲嚙食往往導(dǎo)致根部被一直修剪到玉米桿基部。嚴(yán)重的根損傷干擾根將水和養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)到植物中的能力，降低植物生長(zhǎng)，并導(dǎo)致籽粒產(chǎn)生減少，由此經(jīng)常急劇降低總產(chǎn)量。嚴(yán)重的根損傷還經(jīng)常導(dǎo)致玉米植物的倒伏，其使收獲變得更難，并進(jìn)一步降低產(chǎn)量。此外，成蟲以玉米生殖組織為食可以導(dǎo)致穗尖的穗絲修剪。如果這種“穗絲剪切”在花粉脫落期間足夠嚴(yán)重，則傳粉可能受到破壞?？梢酝ㄟ^作物輪作、化學(xué)殺蟲劑、生物殺蟲劑(例如，孢子形成革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌(bt))、表達(dá)bt毒素的轉(zhuǎn)基因植物、或這些手段的組合來(lái)嘗試控制玉米根蟲。作物輪作的重大缺陷是過度限制了農(nóng)田的用途。此外，一些根蟲物種可以在玉米之外的作物田間產(chǎn)卵，或者長(zhǎng)期的滯育(diapause)可導(dǎo)致卵孵化經(jīng)歷多年，因此會(huì)降低用玉米和大豆實(shí)施的作物輪作的效率。化學(xué)殺蟲劑是最為人們所倚重的實(shí)現(xiàn)玉米根蟲控制的手段。然而，使用化學(xué)殺蟲劑并不是完美的玉米根蟲控制策略；如果把化學(xué)殺蟲劑的成本與使用殺蟲劑后仍可能發(fā)生的根蟲害所致的損失相加，則美國(guó)每年由于玉米根蟲可能損失超過10億美元。大的幼蟲群體、大雨、和不適當(dāng)?shù)臍⑾x劑應(yīng)用均可導(dǎo)致玉米根蟲控制不充分。此外，殺蟲劑的連續(xù)使用可能選擇殺蟲劑抗性根蟲品系，并且由于殺蟲劑中許多對(duì)非靶物種有毒性，有嚴(yán)重的影響環(huán)境之虞。椿象和其他半翅目昆蟲(heteroptera)構(gòu)成了另一大類重要的農(nóng)業(yè)害蟲。已知全世界有超過50個(gè)椿象的近緣物種引起作物損害。mcpherson&mcpherson(2000)stinkbugsofeconomicimportanceinamericanorthofmexicocrcpress。這些昆蟲孳生于許多重要作物，包括玉米、大豆、水果、蔬菜、和谷物。椿象在達(dá)到成體期之前要經(jīng)歷多個(gè)蛹期。從卵發(fā)育到成蟲的時(shí)間約為30-40天。若蟲和成體均以來(lái)自軟組織的汁液為食，它們還將消化酶注入到軟組織中，引起口外組織的消化和壞死。然后攝入消化的植物材料和養(yǎng)分。植物維管系統(tǒng)水分和養(yǎng)分的耗竭導(dǎo)致植物組織破壞。對(duì)于籽粒和種子發(fā)育的損害最為顯著，因?yàn)楫a(chǎn)量和萌發(fā)顯著減少。在溫暖的氣候下會(huì)出現(xiàn)多個(gè)世代，導(dǎo)致顯著的蟲害壓力。當(dāng)前的椿象管理依賴于單塊田的殺蟲劑處理。因此，迫切需要替代的管理策略，以將正在發(fā)生的作物損失降低到最低限度。rna干擾(rnai)是一種利用內(nèi)源細(xì)胞途徑的方法，由此對(duì)足夠大小的整個(gè)或任何部分靶基因序列特異性的干擾rna(irna)分子(例如，雙鏈rna(dsrna)分子)導(dǎo)致由其編碼的mrna的降解。在最近幾年，在許多物種和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，例如線蟲秀麗隱桿線蟲、植物、昆蟲胚胎、和組織培養(yǎng)物中的細(xì)胞中，已經(jīng)使用rnai進(jìn)行基因“敲低”。參見，例如fire等人，(1998)nature391:806-811；martinez等人，(2002)cell110:563-574；mcmanus和sharp(2002)naturerev.genetics3:737-747。rnai通過包括切丁酶(dicer)蛋白質(zhì)復(fù)合物的內(nèi)源途徑完成mrna的降解。切丁酶將長(zhǎng)的dsrna分子切割成約20個(gè)核苷酸的短片段，稱作小干擾rna(sirna)。sirna解旋成兩個(gè)單鏈rna：乘客鏈(passengerstrand)和引導(dǎo)鏈(guidestrand)。乘客鏈被降解，引導(dǎo)鏈則被整合到rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(risc)中。美國(guó)專利7,612,194和美國(guó)專利公開文本2007/0050860、2010/0192265、和2011/0154545披露了自玉米根螢葉甲若蟲分離的9112種表達(dá)序列標(biāo)簽(est)序列的文庫(kù)。在美國(guó)專利7,612,194和美國(guó)專利公開號(hào)2007/0050860中提出將與其中披露的玉米根螢葉甲液泡型h+-atp酶(v-atp酶)的幾個(gè)特定部分序列之一互補(bǔ)的核酸分子與啟動(dòng)子可操作連接，以在植物細(xì)胞中表達(dá)反義rna。美國(guó)專利公開文本no.2010/0192265提出將啟動(dòng)子與核酸分子可操作連接以在植物細(xì)胞中表達(dá)反義rna，所述核酸分子與具有未知且未公開的功能的玉米根螢葉甲基因的特定部分序列互補(bǔ)(該部分序列據(jù)稱與秀麗隱桿線蟲中的c56c10.3基因產(chǎn)物58％相同)。美國(guó)專利公開文本no.2011/0154545提出將啟動(dòng)子與核酸分子可操作連接以在植物細(xì)胞中表達(dá)反義rna，所述核酸分子與玉米根螢葉甲外被體(coatomer)gamma亞單位基因的兩個(gè)特定部分序列互補(bǔ)。此外，美國(guó)專利7,943,819公開了自玉米根螢葉甲幼蟲、若蟲、和切開的中腸分離的906種表達(dá)序列標(biāo)簽(est)序列的文庫(kù)，并且提出了將啟動(dòng)子與核酸分子可操作連接以在植物細(xì)胞中表達(dá)雙鏈rna，所述核酸分子與玉米根螢葉帶電的多泡體蛋白4b基因的特定部分序列互補(bǔ)。除了v-atp酶的幾個(gè)特定部分序列和未知功能的基因的特定部分序列之外，在美國(guó)專利7,612,194和美國(guó)專利公開文本2007/0050860、2010/0192265和2011/0154545中沒有進(jìn)一步提出使用其中列出的超過9000個(gè)序列中的任何特定序列進(jìn)行rna干擾。此外，美國(guó)專利7,612,194、以及美國(guó)專利公開文本2007/0050860、2010/0192265、和2011/0154545都沒有教示提供的超過9000個(gè)序列中哪些其他序列在用作dsrna或sirna時(shí)在玉米根蟲物種中會(huì)是致命的、甚至沒有教示其有任何其他方面的用處。除了帶電多泡體蛋白4b基因的特定部分序列之外，美國(guó)專利7,943,819沒有提出使用其文中的超過900個(gè)序列的任何特定序列進(jìn)行rna干擾。此外，美國(guó)專利7,943,819沒有教示其提供的超過900個(gè)序列中哪些其他序列在用作dsrna或sirna時(shí)在玉米根蟲物種中會(huì)是致命的、甚至沒有教示其有任何其他方面的用處。美國(guó)專利申請(qǐng)公開文本u.s.2013/040173和pct申請(qǐng)公開文本wo2013/169923描述了源自玉米根螢葉甲snf7基因的序列在玉米中進(jìn)行rna干擾的用途。(還公開于bolognesi等人，(2012)plosone7(10):e47534.doi:10.1371/journal.pone.0047534)。與玉米根蟲dna互補(bǔ)的絕大多數(shù)序列(如上述)用作dsrna或sirna時(shí)不提供對(duì)玉米根蟲物種的植保作用。例如，baum等人(2007,naturebiotechnology25:1322-1326)描述了rnai對(duì)幾個(gè)wcr基因靶的抑制作用。這些作者報(bào)告，在超過520ng/cm2的極高irna(例如，dsrna)濃度下，他們測(cè)試的26個(gè)靶基因中有8個(gè)不能提供實(shí)驗(yàn)上顯著的鞘翅目害蟲死亡率。美國(guó)專利7,612,194和美國(guó)專利申請(qǐng)公開2007/0050860的作者們首次報(bào)道了在玉米植株中靶向西方玉米根蟲的植物體內(nèi)(inplanta)rnai。baumetal.(2007)nat.biotechnol.25(11):1322-6。這些作者們描述了一種高通量體內(nèi)餌食rnai系統(tǒng)，用來(lái)篩選用于開發(fā)轉(zhuǎn)基因rnai玉米的潛在靶基因。在290種靶物的初始基因池中，只有14種基因展現(xiàn)了幼蟲控制潛力。最有效的雙鏈rna(dsrna)中之一靶向了編碼囊泡性atp酶亞單位a(v-atpase)的基因，導(dǎo)致相應(yīng)的內(nèi)源mrna的迅速阻遏，并以低濃度的dsrna引發(fā)了特異性的rnai應(yīng)答。由此，這些作者首次記錄了植物體內(nèi)rnai作為害蟲管理工具的潛力，同時(shí)證明，有效的靶物是無(wú)法先驗(yàn)地準(zhǔn)確鑒定的，即使從較小的一組候選基因鑒定亦然。公開概要本文中公開了用于控制昆蟲害蟲的核酸分子(例如，靶基因、dna、dsrna、sirna、mirna、shrna、和hprna)及其使用方法，所述昆蟲害蟲包括，例如，鞘翅目害蟲，諸如玉米根螢葉甲(d.virgiferaleconte)(西方玉米根蟲，“wcr”)；巴氏根螢葉甲(d.barberismithandlawrence,北方玉米根蟲，“ncr”)；十一星根螢葉甲(d.u.howardibarber；南方玉米根蟲，“scr”)；墨西哥玉米根螢葉甲(d.v.zeaekrysanandsmith,墨西哥玉米根蟲，“mcr”)；黃瓜條根螢葉甲(d.balteataleconte)；d.u.tenella；南美葉甲(d.speciosagermar)；d.u.undecimpunctatamannerheim；和半翅目害蟲，諸如英雄美洲蝽(euschistusheros(fabr.)(新熱帶棕椿象，“bsb”)、褐椿象(e.servus)(say)(棕椿象)；稻綠蝽(nezaraviridula(l.)(南部綠椿象)、蓋德擬壁蝽(piezodorusguildinii(westwood)(紅帶椿象)、和茶翅蝽(halyomorphahylys(棕翅椿象)、chinaviahilare(say)(綠椿象)；c.marginatum(palisotdebeauvois)；dichelopsmelacanthus(dallas)；d.furcatus(f.)；edessameditabunda(f.)；thyantaperditor(f.)(新熱帶紅肩椿象)；horciasnobilellus(berg)(棉紅蝽)；taediastigmosa(berg)；dysdercusperuvianus(guérin-méneville)；neomegalotomusparvus(westwood)；leptoglossuszonatus(dallas)；niesthreasidae(f.)；lygushesperus(knight)(西方牧草盲蝽)；和牧草盲蝽[l.lineolaris(palisotdebeauvois)]。在具體的實(shí)例中，公開了示例性核酸分子，其與昆蟲害蟲中的一個(gè)或多個(gè)天然核酸序列的至少一部分可以同源。在這些和進(jìn)一步的實(shí)例中，天然核酸可以是靶基因，其產(chǎn)物可以，例如但不限于：涉及代謝過程；或者涉及幼蟲/若蟲發(fā)育。在一些實(shí)例中，借助于包含與靶基因同源的多核苷酸的核酸分子，靶基因表達(dá)的翻譯后抑制在鞘翅目和/或半翅目害蟲中可以是致命的，或?qū)е缕渖L(zhǎng)和/或發(fā)育的降低。在具體的實(shí)例中，可選擇由外殼蛋白復(fù)合物gamma亞單位(本文中稱為copigamma亞單位和copigamma)構(gòu)成的基因作為轉(zhuǎn)錄后沉默的靶基因。在具體實(shí)例中，有用于轉(zhuǎn)錄后抑制的靶基因是本文稱為copigamma的新基因。因此本文中公開了包含：copigamma(seqidno:1和seqidno:87)、copigamma(seqidno:1和seqidno:87)的互補(bǔ)物、以及前述任一者的片段的分離的核酸分子。還公開了包含編碼與靶基因產(chǎn)物內(nèi)的氨基酸序列(例如本文中稱為copigamma的基因的產(chǎn)物)至少約85％相同的多肽的多核苷酸的核酸分子。例如，核酸分子可以包含編碼與seqidno:2或seqidno:88(copigamma蛋白)至少85％相同的多肽的多核苷酸。在具體的實(shí)例中，核酸分子包含的核苷酸序列編碼與copigamma的產(chǎn)物內(nèi)的氨基酸序列至少85％相同的多肽。進(jìn)一步公開了包含編碼這樣的多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸是編碼與靶基因產(chǎn)物內(nèi)的氨基酸序列至少85％相同的多肽的多核苷酸的反向互補(bǔ)物。還公開了用于產(chǎn)生irna(例如，dsrna、sirna、mirna、shrna、和hprna)分子的cdna多核苷酸，所述irna與鞘翅目和/或半翅目害蟲靶基因(例如copigamma)的全部或部分互補(bǔ)。在特定的實(shí)施方案中，dsrna、sirna、mirna、shrna、和/或hprna可以在體外產(chǎn)生，或由遺傳修飾的生物(如植物或細(xì)菌)在體內(nèi)產(chǎn)生。在特定的實(shí)例中，公開了可用于產(chǎn)生與copigamma(seqidno:1和seqidno:87)的全部或部分互補(bǔ)的irna分子。進(jìn)一步公開了用于抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中必需基因的表達(dá)的手段、以及用于給植物提供鞘翅目和/或半翅目害蟲抗性的手段。用于抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中必需基因表達(dá)的手段是由下述至少一者構(gòu)成的單鏈或雙鏈rna分子：seqidno:3(葉甲屬copigamma區(qū)域1，本文中有時(shí)稱作copigammareg1)或seqidno:4(葉甲屬copigamma區(qū)域2，本文中有時(shí)稱作copigammareg2)，或seqidno:5(葉甲屬copigamma區(qū)域3，本文中有時(shí)稱作copigammareg3)，或seqidno:75(葉甲屬copigamma版本1，本文中有時(shí)稱作copigammaver1)，或seqidno:76(葉甲屬copigamma版本2，本文中有時(shí)稱作copigammaver2)，或seqidno:77(葉甲屬copigamma版本3，本文中有時(shí)稱作copigammaver3)，或seqidno:78(葉甲屬copigamma版本4，本文中有時(shí)稱作copigammaver4)，或seqidno:89(英雄美洲蝽copigamma區(qū)域2，本文中有時(shí)稱作bsb_copigamma-2)，或它們的互補(bǔ)物。用于抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中的必需基因表達(dá)的手段的功能等同物包括與包含seqidno:1或seqidno:87的wcr或bsb基因的全部或部分基本上同源的單鏈或雙鏈rna分子。給植物提供鞘翅目和/或半翅目害蟲抗性的手段是這樣的dna分子，其包含與啟動(dòng)子可操作連接的、編碼用于抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中的必需基因的表達(dá)的手段的核苷酸序列，其中所述dna分子能夠整合到玉米或大豆植物的基因組中。公開了控制昆蟲害蟲(例如鞘翅目和/或半翅目害蟲)群體的方法，所述方法包括向昆蟲害蟲(例如鞘翅目和/或半翅目害蟲)提供irna(例如，dsrna、sirna、shrna、mirna、和hprna)分子，所述irna分子在被所述害蟲攝取之后發(fā)揮作用而抑制該害蟲體內(nèi)的生物功能，其中所述irna分子包含選自以下的核苷酸序列的全部或部分：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:75、seqidno:76、seqidno:77、seqidno:78、seqidno:87和seqidno:89；seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:75、seqidno:76、seqidno:77、seqidno:78、seqidno:87和seqidno:89的互補(bǔ)物；葉甲屬生物(例如wsr)或半翅目生物(例如bsb)的包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:75、seqidno:76、seqidno:77、seqidno:78、seqidno:87和seqidno:89中任一者之全部或部分的天然編碼序列；葉甲屬生物或半翅目生物的包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:75、seqidno:76、seqidno:77、seqidno:78、seqidno:87和seqidno:89中任一者之全部或部分的天然編碼序列的互補(bǔ)物；葉甲屬生物或半翅目生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:75、seqidno:76、seqidno:77、seqidno:78、seqidno:87和seqidno:89中任一者之全部或部分的天然rna分子的天然非編碼序列；以及葉甲屬生物或半翅目生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:75、seqidno:76、seqidno:77、seqidno:78、seqidno:87和seqidno:89中任一者之全部或部分的天然rna分子的天然非編碼序列的互補(bǔ)物。本文中還公開了方法，其中可將dsrna、mirna、sirna、shrna、和/或hprna在基于餌食的測(cè)定中(diet-basedassay)提供給鞘翅目和/或半翅目害蟲，或提供在表達(dá)dsrna、mirna、sirna、shrna、和/或hprna的遺傳修飾的植物細(xì)胞中。在這些和另外的實(shí)例中，dsrna、shrna、mirna、sirna、和/或hprna可被鞘翅目幼蟲和/或半翅目害蟲蛹攝入。然后，本發(fā)明的dsrna、sirna、shrna、mirna、和/或hprna的攝入可在該幼蟲/蛹中導(dǎo)致rnai，進(jìn)而可導(dǎo)致對(duì)于該鞘翅目和/或半翅目害蟲的活力必需的基因的沉默，并最終導(dǎo)致幼蟲/蛹死亡。因此，公開了方法，其中給鞘翅目和/或半翅目害蟲提供核酸分子，所述核酸分子包含可用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲的示例性核酸序列。在特定的實(shí)例中，通過使用本發(fā)明的核酸分子控制的鞘翅目和/或半翅目害蟲可以是wcr、ncr、scr,mcr、d.balteata、d.u.tenella、南美葉甲、d.u.undecimpunctata、英雄美洲蝽(euchistusheros)、褐椿象(e.servus)、蓋德擬壁蝽(piezodorusguildinii)、茶翅蝽(halyomorphahalys)、稻綠蝽(nezaraviridula)、綠蝽(chinaviahilare)、c.marginatum,dichelopsmelacanthus,d.furcatus,edessameditabunda,thyantaperditor,horciasnobilellus,taediastigmosa,dysdercusperuvianus,neomegalotomusparvus,leptoglossuszonatus，niesthreasidae，和/或牧草盲蝽(lyguslineolari)。參考下文結(jié)合附圖進(jìn)行的對(duì)若干實(shí)施方案的詳細(xì)說明，前述的特征以及其他特征將會(huì)更加自明。附圖簡(jiǎn)述圖1包括用于使用用單一一對(duì)引物從單個(gè)轉(zhuǎn)錄模板生成dsrna的策略的描述。圖2是用于自兩個(gè)轉(zhuǎn)錄模板的生成dsrna的策略的描述。序列表中的序列的簡(jiǎn)述使用如37c.f.r.§1.822規(guī)定的核苷酸堿基的標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫，示出了所附序列表中列出的核酸序列。所列出的核酸和氨基酸序列定義了具有以所記載的方式排列的核苷酸和氨基酸單體的分子(即分別為多核苷酸和多肽)。每個(gè)列出的核酸和氨基酸序列也定義了包含以所記載的方式排列的核苷酸和氨基酸單體的多核苷酸或多肽的類屬(genus)。鑒于遺傳密碼的冗余，可以理解的是，某個(gè)包含編碼序列的核苷酸序列同樣可還描述一個(gè)多核苷酸類屬，其中的多核苷酸和由參考序列組成的多核苷酸編碼相同的多肽。還應(yīng)當(dāng)理解，某個(gè)氨基酸序列可描述編碼該多肽的多核苷酸orf的類屬。對(duì)于每個(gè)核酸序列僅顯示了一條鏈，僅顯示每個(gè)核酸序列的一條鏈，任何對(duì)所展示的鏈的提述應(yīng)理解為包括對(duì)互補(bǔ)鏈。由于一級(jí)核酸序列的互補(bǔ)序列和反向互補(bǔ)序列必然被該一級(jí)序列所公開，所以對(duì)核酸序列的任何提述也包括核酸序列的互補(bǔ)序列和反向互補(bǔ)序列，但另有明確說明或者從該序列出現(xiàn)的上下文可以明確看出并非如此的除外。此外，如本領(lǐng)域所知，rna鏈的核苷酸序列決定于轉(zhuǎn)錄該rna的dna的序列(除了胸腺嘧啶(t)被尿嘧啶(u)核堿基替換之外)，對(duì)于某個(gè)rna序列而言，任何對(duì)編碼它的dna序列的提述也包括了該序列。在所附序列表中：seqidno:1顯示了來(lái)自玉米根螢葉甲的包含copigamma亞單位的dna。seqidno:2顯示來(lái)自玉米根螢葉甲的copigamma蛋白質(zhì)的氨基酸序列。seqidno:3顯示被用于體外dsrna合成的來(lái)自玉米根螢葉甲的copigammareg1(區(qū)域1)的dna序列(未顯示5’和3’末端的t7啟動(dòng)子序列)。seqidno:4顯示被用于體外dsrna合成的來(lái)自玉米根螢葉甲的copigammareg2(區(qū)域2)的dna序列(未顯示5’和3’末端的t7啟動(dòng)子序列)。seqidno:5顯示被用于體外dsrna合成的來(lái)自玉米根螢葉甲的copigammareg3(區(qū)域3)的dna序列(未顯示5’和3’末端的t7啟動(dòng)子序列)。seqidno:6顯示t7噬菌體啟動(dòng)子的dna序列。seqidno:7顯示被用于體外dsrna合成的yfp編碼區(qū)區(qū)段的dna序列(未顯示5’和3’末端的t7啟動(dòng)子序列)。seqidno:8至13顯示引物，這些引物被用于擴(kuò)增來(lái)自玉米根螢葉甲的copigamma亞單位序列中包含copigammareg1、copigammareg2和copigammareg3的部分。seqidno:14呈現(xiàn)如pdab117221中所見的來(lái)自玉米根螢葉甲的copigamma發(fā)夾v3-rna-形成序列。大寫字母的堿基為copigamma有義鏈，下劃線的小寫字母堿基包含st-ls1內(nèi)含子，無(wú)下劃線的小寫字母堿基為copigamma反義鏈。cgacctcctccggtgtctagagaagaaaacttcgccgaaaaacttagtaacgttccgggtatacaacagttaggacctttgttcaaaacttccgacgtcgttgaactcacgactagtaccggttgggaaaggtatgtttctgcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaaaataaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatccgcggttagtgagttcaacgacgtcggaagttttgaacaaaggtcctaactgttgtatacccggaacgttactaagtttttcggcgaagttttcttctctagacaccggaggaggtcgseqidno:15呈現(xiàn)如pdab117222中所見的來(lái)自玉米根螢葉甲的copigamma發(fā)夾v4-rna-形成序列。大寫字母堿基為copigamma有義鏈，下劃線的小寫字母堿基包含st-ls1內(nèi)含子，無(wú)下劃線的小寫字母堿基為copigamma反義鏈.agttgcactataacgaaaccggtaccacatatgtagtagttaagttgcctgatgatgatctccccaactctgttggtacgtgtggagccgtgttgaagttcttagtgaaagattgtgatccatcaacgggaataccagattctgatgagggttacgatgatgaatatacactggaagacatcgaaataacattaggggacgactagtaccggttgggaaaggtatgtttctgcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaaaataaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatccgcggttagtcccctaatgttatttcgatgtcttccagtgtatattcatcatcgtaaccctcatcagaatctggtattcccgttgatggatcacaatctttcactaagaacttcaacacggctccacacgtaccaacagagttggggagatcatcatcaggcaacttaactactacatatgtggtaccggtttcgttatagtgcaactseqidno:16顯示如pdab110853中所見的yfp發(fā)夾-rna-形成序列v2。大寫字母堿基為yfp有義鏈，下劃線的堿基包含st-ls1內(nèi)含子，小寫字母、無(wú)下劃線的堿基為yfp反義鏈。atgtcatctggagcacttctctttcatgggaagattccttacgttgtggagatggaagggaatgttgatggccacacctttagcatacgtgggaaaggctacggagatgcctcagtgggaaaggactagtaccggttgggaaaggtatgtttctgcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaaaataaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatccgcggttactttcccactgaggcatctccgtagcctttcccacgtatgctaaaggtgtggccatcaacattcccttccatctccacaacgtaaggaatcttcccatgaaagagaagtgctccagatgacatseqidno:17顯示包含st-ls1內(nèi)含子的序列。seqidno:18顯示如pdab101556中所見的yfp蛋白編碼序列。seqidno:19顯示膜聯(lián)蛋白區(qū)域1的dna序列。seqidno:20顯示膜聯(lián)蛋白區(qū)域2的dna序列。seqidno:21顯示β血影蛋白2區(qū)域1的dna序列。seqidno:22顯示β血影蛋白2區(qū)域2的dna序列。seqidno:23顯示mtrp-l4區(qū)域1的dna序列。seqidno:24顯示mtrp-l4區(qū)域2的dna序列。seqidno:25至52顯示被用于擴(kuò)增yfp、膜聯(lián)蛋白、β血影蛋白2及mtrp-l4的基因區(qū)域以供dsrna合成的引物。seqidno:53顯示編碼tip41樣蛋白的玉米dna序列。seqidno:54顯示寡核苷酸t(yī)20nv的dna序列。seqidno:55至59顯示用于測(cè)量玉米轉(zhuǎn)錄物水平的引物和探針的序列。seqidno:60顯示被用于二元載體骨架檢測(cè)的specr編碼區(qū)域的一部分的dna序列。seqidno:61顯示被用于基因組拷貝數(shù)分析的aad1編碼區(qū)域的一部分的dna序列。seqidno:62顯示玉米轉(zhuǎn)化酶基因的dna序列。seqidno:63至71顯示被用于基因拷貝數(shù)分析的引物和探針的序列。seqidno:72至74顯示被用于玉米表達(dá)分析的引物和探針的序列。seqidno:75顯示被用于體外dsrna合成的來(lái)自玉米根螢葉甲的copigammaver1(版本1)的dna序列(未顯示5’和3’末端的t7啟動(dòng)子序列)。seqidno:76顯示被用于體外dsrna合成的來(lái)自玉米根螢葉甲的copigammaver2(版本2)的dna序列(未顯示5’和3’末端的t7啟動(dòng)子序列)。seqidno:77顯示被用于體外dsrna合成的來(lái)自玉米根螢葉甲的copigammaver3(版本3)dna序列(未顯示5’和3’末端的t7啟動(dòng)子序列)。seqidno:78顯示seqidno:77顯示被用于體外dsrna合成的來(lái)自玉米根螢葉甲的copigammaver4(版本4)dna序列(未顯示5’和3’末端的t7啟動(dòng)子序列)。seqidno:79-86顯示引物，所述引物被用于擴(kuò)增來(lái)自玉米根螢葉甲copigamma序列的包含copigammaver1、copigammaver2、gammaver3和copigammaver4的部分。seqidno:87顯示示例性的來(lái)自新熱帶褐椿象(英雄美洲蝽)的bsbcopigamma轉(zhuǎn)錄物的dna序列。seqidno:88顯示來(lái)自英雄美洲蝽copigamma蛋白的氨基酸序列。seqidno:89顯示被用于體外dsrna合成的來(lái)自英雄美洲蝽的bsb_copigamma-2的dna序列(未顯示5’和3’末端的t7啟動(dòng)子序列)。seqidno:90-91顯示引物，所述引物被用于擴(kuò)增來(lái)自英雄美洲蝽copigamma的包含bsb_copigamma-2的序列的部分。seqidno:92是靶定yfp的dsrna:yfpv2的有義鏈。seqidno:93-94顯示被用于擴(kuò)增靶定yfp的dsrna:yfpv2的部分的引物。seqidno:95呈現(xiàn)yfp發(fā)夾序列(yfpv2-1)。大寫字母堿基為yfp有義鏈，下劃線的小寫字母堿基包含rtm1內(nèi)含子，無(wú)下劃線的小寫字母堿基為yfp反義鏈。atgtcatctggagcacttctctttcatgggaagattccttacgttgtggagatggaagggaatgttgatggccacacctttagcatacgtgggaaaggctacggagatgcctcagtgggaaagtccggcaacatgtttgacgtttgtttgacgttgtaagtctgatttttgactcttcttttttctccgtcacaatttctacttccaactaaaatgctaagaacatggttataactttttttttataacttaatatgtgatttggacccagcagatagagctcattactttcccactgaggcatctccgtagcctttcccacgtatgctaaaggtgtggccatcaacattcccttccatctccacaacgtaaggaatcttcccatgaaagagaagtgctccagatgacat詳細(xì)說明i.若干實(shí)施方案的概覽本文中公開了用于遺傳控制昆蟲(例如鞘翅目或半翅目)害蟲侵染的方法和組合物。還提供了用于鑒定對(duì)于昆蟲害蟲的生命周期必需的一個(gè)或多個(gè)基因，作為靶基因用于rnai介導(dǎo)的昆蟲害蟲群體控制的方法?？稍O(shè)計(jì)編碼rna分子的dna質(zhì)粒載體來(lái)抑制生長(zhǎng)、存活、和/或發(fā)育所必需的靶基因。在一些實(shí)施方案中，所述rna分子可能能夠形成dsrna分子。在一些實(shí)施方案中，提供了通過與昆蟲害蟲中靶基因的編碼或非編碼序列互補(bǔ)的核酸分子來(lái)轉(zhuǎn)錄后阻抑靶基因表達(dá)或抑制靶基因的方法。在這些和另外的實(shí)施方案中，昆蟲害蟲可以攝取一種或多種從與靶基因的編碼或非編碼序列互補(bǔ)的核酸分子的全部或部分轉(zhuǎn)錄的dsrna、sirna、shrna、mirna、和/或hprna分子，由此提供植物保護(hù)效果。因此，一些實(shí)施方案涉及使用與靶基因的編碼和/或非編碼序列互補(bǔ)的irna(例如dsrna、sirna、shrna、mirna、和/或hprna)對(duì)靶基因產(chǎn)物的表達(dá)進(jìn)行序列特異性抑制，以實(shí)現(xiàn)對(duì)昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的至少部分控制。公開了一組分離純化的核酸分子，其包含，例如，如seqidno:1,seqidno:3,seqidno:4,seqidno:5,seqidno:75,seqidno:76,seqidno:77,seqidno:78,seqidno:87,seqidno:89任一者中列出的多核苷酸及其片段。在一些實(shí)施方案中，可以從該序列、其片段、或包含這些多核苷酸中一種或多種的基因表達(dá)穩(wěn)定化的dsrna分子，用于靶基因的轉(zhuǎn)錄后沉默或抑制。在某些實(shí)施方案中，分離和純化的核酸分子包含seqidno:1的全部或部分。在其他的實(shí)施方案中，分離和純化的核酸分子包含seqidno:3的全部或部分。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，分離和純化的核酸分子包含seqidno:4的全部或部分。在其他的實(shí)施方案中，分離和純化的核酸分子包含seqidno:5的全部或部分。在另外的實(shí)施方案中，分離和純化的核酸分子包含seqidno:75,seqidno:76,seqidno:77,seqidno:78,seqidno:87或seqidno:89的全部或部分。一些實(shí)施方案涉及在其基因組中具有編碼至少一種irna(例如，dsrna)分子的至少一種重組dna的重組宿主細(xì)胞(例如，植物細(xì)胞)。在特定的實(shí)施方案中，dsrna分子可以在被鞘翅目和/或半翅目害蟲攝取時(shí)產(chǎn)生，使該害蟲中的靶基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄后沉默或抑制其表達(dá)。重組dna可以包含，例如：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:75、seqidno:76、seqidno:77、seqidno:78、seqidno:87或seqidno:89中任一者；seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:75、seqidno:76、seqidno:77、seqidno:78、seqidno:87或seqidno:89中任一者的片段；包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:75、seqidno:76、seqidno:77、seqidno:78、seqidno:87或seqidno:89中一者或更多者的基因的部分序列；或其互補(bǔ)物。一些實(shí)施方案涉及重組宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞在其基因組中具有重組dna，所述重組dna具有編碼至少一種irna(例如，dsrna)分子，所述irna分子包含由seqidno:1和/或seqidno:87編碼的rna的全部或部分；和/或其互補(bǔ)物。當(dāng)被昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲攝入時(shí)，irna分子可以在該鞘翅目和/或半翅目害蟲中沉默或抑制包含seqidno:1和/或seqidno:87的靶基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致害蟲的進(jìn)食、生長(zhǎng)和/或發(fā)育停止。在一些實(shí)施方案中，在其基因組中具有編碼至少一種能夠形成dsrna分子的rna分子的至少一種重組dna的重組宿主細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。一些實(shí)施方案涉及包含這樣的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。除了這樣的轉(zhuǎn)基因植物之外，還提供了任何轉(zhuǎn)基因植物世代的后代植物、轉(zhuǎn)基因種子、和轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品，它們均包含重組dna。在特定的實(shí)施方案中，可以在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中表達(dá)能夠形成dsrna分子的rna分子。因此，在這些和其他實(shí)施方案中，可以從轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞分離dsrna分子。在特定的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物是選自下組的植物，包括：玉米(zeamays)、大豆(glycinemax)、和禾本科(poaceae)的植物。一些實(shí)施方案涉及用于調(diào)控昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲細(xì)胞中靶基因表達(dá)的方法。在這些和其他實(shí)施方案中，可以提供核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼能夠形成dsrna分子的rna分子的多核苷酸。在特定的實(shí)施方案中，編碼能夠形成dsrna分子的rna分子的多核苷酸可與啟動(dòng)子可操作連接，并且還可與轉(zhuǎn)錄終止序列可操作連接。在特定的實(shí)施方案中，用于調(diào)控昆蟲害蟲細(xì)胞中靶基因表達(dá)的方法可包括：(a)用包含編碼能夠形成dsrna分子的rna分子的多核苷酸的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；(b)在足以容許形成包含多個(gè)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的植物細(xì)胞培養(yǎng)物的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；(c)選擇已將載體整合到其基因組中的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；和(d)確定選擇的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞包含由載體的所述多核苷酸序列編碼的、能夠形成dsrna分子的rna分子?？梢詮幕蚪M中整合有載體、且包含由載體的所述多核苷酸編碼的dsrna分子的植物細(xì)胞再生植物。因此，還公開了在其基因組中整合有載體的轉(zhuǎn)基因植物，所述載體具有編碼能夠形成dsrna分子的rna分子的多核苷酸，其中轉(zhuǎn)基因植物包含由所述載體的所述多核苷酸編碼的dsrna分子。在特定的實(shí)施方案中，植物中能夠形成dsrna分子的rna分子的表達(dá)足以調(diào)控接觸所述轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞(例如通過以轉(zhuǎn)化的植物、植物的一部分(例如，根)或植物細(xì)胞為食)的昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲細(xì)胞中靶基因的表達(dá)，使得害蟲的生長(zhǎng)和/或存活被抑制。本文中公開的轉(zhuǎn)基因植物可以展現(xiàn)出對(duì)昆蟲害蟲侵染的抗性和/或增強(qiáng)的耐受性。特定的轉(zhuǎn)基因植物可以展現(xiàn)出對(duì)一種或多種選自下組的鞘翅目和/或半翅目害蟲的抗性和/或增強(qiáng)的保護(hù)：wcr、ncr、scr、mcr、玉米根螢葉甲、d.u.tenella、南美葉甲、d.u.undecimpunctatamannerheim、英雄美洲蝽、蓋德擬壁蝽、茶翅蝽、稻綠蝽、綠蝽、褐椿象、dichelopsmelacanthus；dichelopsfurcatus；edessameditabunda；thyantaperditor；chinaviamarginatum；horciasnobilellus；taediastigmosa；dysdercusperuvianus；neomegalotomusparvus；leptoglossuszonatus；niesthreasidae；lygushesperus；和lyguslineolaris。本文中還公開了用于將控制劑(如irna分子等)投送給昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的方法。這樣的控制劑可以直接或間接地阻礙昆蟲害蟲群體進(jìn)食、生長(zhǎng)或以其他方式致害宿主的能力。在一些實(shí)施方案中，提供了這樣的方法，包括將穩(wěn)定化的dsrna分子遞送至昆蟲害蟲以抑制該害蟲中的至少一種靶基因，從而導(dǎo)致rnai并減少或消除害蟲宿主中的植物損害。在一些實(shí)施方案中，抑制昆蟲害蟲中靶基因表達(dá)的方法可以導(dǎo)致害蟲中生長(zhǎng)、存活、和/或發(fā)育的停止。在一些實(shí)施方案中，提供了包含irna(例如，dsrna)分子的組合物(例如，局部用組合物)，供用于植物、動(dòng)物、和/或植物或動(dòng)物的環(huán)境以消除或降低昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的侵染。在特定的實(shí)施方案中，組合物可以是要喂給昆蟲害蟲的營(yíng)養(yǎng)組合物或食物來(lái)源。一些實(shí)施方案包括使害蟲可得到所述營(yíng)養(yǎng)組合物或食物來(lái)源。包含irna分子的組合物的攝入可導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)害蟲細(xì)胞攝取所述分子，進(jìn)而可導(dǎo)致害蟲細(xì)胞中至少一種靶基因表達(dá)的抑制。通過在害蟲的宿主中提供一種或多種包含irna分子的組合物，可以在任何存在昆蟲害蟲的宿主組織或環(huán)境之中或之上限制或消除該害蟲侵染對(duì)植物或植物細(xì)胞的攝入或損傷。本文中公開的組合物和方法可與針對(duì)其他靶(例如ras相對(duì)物或rop(美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)20150176025)和rnapii(美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)20150176009))的irna分子組合一起使用。這種影響害蟲中(例如幼蟲中)多種靶序列的潛力可以增加功效，并且還可以改善涉及irna技術(shù)的可持續(xù)的昆蟲害蟲管理策略。本文中公開的組合物和方法可與用于控制昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲所致?lián)p害的其他方法和組合物組合一起使用。例如，本文中所描述的用于針對(duì)昆蟲害蟲保護(hù)植物的irna分子可以在這樣的方法中使用，所述方法包括另外使用一種或多種針對(duì)昆蟲害蟲有效的化學(xué)劑、針對(duì)這樣的害蟲有效的生物殺蟲劑、作物輪作、展現(xiàn)出與rnai介導(dǎo)的方法和rnai組合物的特征不同的特征(例如，在植物中重組產(chǎn)生對(duì)于昆蟲害蟲有害的蛋白質(zhì)(例如，bt毒素))的重組遺傳技術(shù)。ii.縮寫bsb新熱帶棕椿象(英雄美洲蝽，euschistusheros)dsrna雙鏈核糖核酸est表達(dá)序列標(biāo)簽gi生長(zhǎng)抑制ncbi美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心gdna基因組dnairna抑制性核糖核酸orf開放閱讀框rnai核糖核酸干擾mirna微小核糖核酸sirna小抑制性核糖核酸shrna短發(fā)夾核糖核酸hprna發(fā)夾核糖核酸utr非翻譯區(qū)wcr西方玉米根蟲(玉米根螢葉甲)ncr北方玉米根蟲(巴氏根螢葉甲)mcr墨西哥玉米根蟲(墨西哥玉米根螢葉甲)pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)qpcr定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)riscrna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物scr南方玉米根蟲(十一星根螢葉甲)sem均值標(biāo)準(zhǔn)誤yfp綠色熒光蛋白iii.術(shù)語(yǔ)在以下描述和表中，使用了許多術(shù)語(yǔ)。為了提供對(duì)說明書和權(quán)利要求書的清楚且一致的理解，包括要賦予此類術(shù)語(yǔ)的范圍，提供了以下定義：鞘翅目害蟲：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“鞘翅目害蟲”指以農(nóng)業(yè)作物和作物產(chǎn)品，包括玉米和其它真正的禾本科為食的、屬于鞘翅目(coleoptera)的昆蟲，包括屬于葉甲屬的害蟲。在具體的例子中，鞘翅目害蟲選自下列清單，包括：玉米根螢葉甲(wcr)；巴氏根螢葉甲(ncr)；十一星根螢葉甲(scr)；墨西哥玉米根螢葉甲(mcr)；黃瓜條根螢葉甲；d.u.tenella；和d.u.undecimpunctatamannerheim。(與生物)接觸：如本文中使用的，與生物(例如，鞘翅目害蟲和/或半翅目害蟲)“接觸”或被生物“攝取”等術(shù)語(yǔ)，就核酸分子而言，包括核酸分子內(nèi)化到生物中，例如但不限于：生物攝取分子(例如，通過進(jìn)食)；使生物與包含核酸分子的組合物接觸；以及用包含核酸分子的溶液浸泡生物。重疊群：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“重疊群”指從一組來(lái)源于單一遺傳來(lái)源的重疊dna區(qū)段重建的dna序列。玉米植物：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“玉米植物”指物種玉蜀黍(玉米)的植物。表達(dá)：如本文中使用的，編碼多核苷酸(例如，基因或轉(zhuǎn)基因)的“表達(dá)”是指這樣的過程，通過該過程，核酸轉(zhuǎn)錄單元(包括，例如gdna或cdna)的編碼信息被轉(zhuǎn)化為細(xì)胞的操作部分、非操作部分、或結(jié)構(gòu)部分(常常包括蛋白質(zhì)的合成)?；虮磉_(dá)可能受到外部信號(hào)的影響，例如細(xì)胞、組織、或生物暴露于增加或降低基因表達(dá)的物質(zhì)?；虮磉_(dá)也可以在從dna到rna再到蛋白質(zhì)的途徑中的任何位置受到調(diào)節(jié)。例如，通過控制對(duì)轉(zhuǎn)錄、翻譯、rna運(yùn)輸和加工、中間分子比如mrna的降解的作用，或通過在特異性蛋白分子已經(jīng)產(chǎn)生之后的活化、失活、區(qū)室化、或降解，或它們的組合，由此發(fā)生基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。通過本領(lǐng)域已知的任何方法，包括但不限于，northern印跡、rt-pcr、western印跡，或體外、原位或體內(nèi)蛋白活性測(cè)定，可以在rna水平或蛋白質(zhì)水平測(cè)量基因表達(dá)。遺傳物質(zhì)：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“遺傳物質(zhì)”包括所有基因和核酸分子，諸如dna和rna。半翅目害蟲：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“半翅目害蟲”指屬于半翅目(hemiptera)的昆蟲，包括但不限于蝽科(pentatomidae),盲蝽科(miridae),紅蝽科(pyrrhocoridae),緣蝽科(coreidae),蛛蝽科(alydidae),和姬緣蝽科(rhopalidae)等科中的昆蟲，其以范圍很廣的宿主植物為食，具有刺吸式口器。在特定的實(shí)例中，半翅目宿主選自下組：英雄美洲蝽[euschistusheros(fabr.)](新熱帶棕椿象),稻綠蝽nezaraviridula(l.)(南方綠椿象),蓋德擬壁蝽[piezodorusguildinii(westwood)](紅帶椿象),茶翅蝽[halyomorphahalys](棕色大理石椿象),綠蝽[chinaviahilare(say)](綠色椿象),褐椿象[euschistusservus(say)](棕色椿象),dichelopsmelacanthus(dallas),dichelopsfurcatus(f.),edessameditabunda(f.),thyantaperditor(f.)(新熱帶紅肩椿象),chinaviamarginatum(palisotdebeauvois),horciasnobilellus(berg)(棉紅蝽),taediastigmosa(berg),dysdercusperuvianus(guérin-méneville),neomegalotomusparvus(westwood),leptoglossuszonatus(dallas),niesthreasidae(f.),lygushesperus(knight)(西方牧草盲蝽),和牧草盲蝽[lyguslineolaris(palisotdebeauvois)]。抑制：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“抑制”在用于描述對(duì)編碼多核苷酸(例如基因)的影響時(shí)是指從編碼多核苷酸轉(zhuǎn)錄的mrna和/或編碼多核苷酸的肽、多肽、或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的細(xì)胞水平的可測(cè)量的降低。在一些實(shí)例中，抑制編碼多核苷酸的表達(dá)可以使得表達(dá)大致消失?！疤禺愋砸种啤笔侵冈趯?shí)現(xiàn)特異性抑制的細(xì)胞中對(duì)靶編碼多核苷酸的抑制不對(duì)其他編碼多核苷酸(例如，基因)的表達(dá)產(chǎn)生影響。昆蟲：如本文用于害蟲的，術(shù)語(yǔ)“害蟲”特別包括鞘翅目昆蟲害蟲和半翅目害蟲。在一些實(shí)施方案中，該術(shù)語(yǔ)還包括某些其它害蟲。分離的：“分離的”生物學(xué)組分(諸如核酸、肽或蛋白質(zhì))是已經(jīng)從該組分所天然存在的生物細(xì)胞中的其他生物學(xué)組分(即，其他染色體和染色體外的dna和rna、和蛋白質(zhì))實(shí)質(zhì)性分開、分開產(chǎn)生、或純化出來(lái)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)組分中的化學(xué)或功能變化(例如，核酸可以通過斷開將核酸連接到染色體中的其余dna的化學(xué)鍵而從染色體分離)。已經(jīng)“分離的”核酸分子和蛋白質(zhì)包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸分子和蛋白質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)還包括通過在宿主細(xì)胞內(nèi)重組表達(dá)制備的核酸分子和蛋白質(zhì)，以及化學(xué)合成的核酸分子、蛋白質(zhì)和肽。核酸分子：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”可以是指核苷酸的聚合物形式，可包括rna、cdna、gdna的有義和反義鏈，以及上述情形的合成形式和混合聚合物。核苷酸或核堿基可以是指核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、或這兩種類型核苷酸的任一者的修飾形式。如本文中使用的“核酸分子”與“核酸”和“多核苷酸”是同義詞。除非另外指明，核酸分子通常在長(zhǎng)度上具有至少10個(gè)堿基。根據(jù)慣例，核酸分子的核苷酸序列從分子的5’至3’端閱讀。核酸分子的“互補(bǔ)物”(即互補(bǔ)序列)是指具有可以與該核酸分子的核堿基形成堿基對(duì)(即，a-t/u，和g-c)的核堿基的多核苷酸。一些實(shí)施方案包括包含轉(zhuǎn)錄為rna分子的模板dna的核酸，所述rna分子是mrna分子的互補(bǔ)序列。在這些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄為mrna分子的核酸的互補(bǔ)物以5'至3'方向存在，使得rna聚合酶(其以5'至3'方向轉(zhuǎn)錄dna)將從互補(bǔ)物轉(zhuǎn)錄出可以與mrna分子雜交的核酸。因此，除非另有明確說明或者從上下文中可以清楚地看出另有所指，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)物”是指具有可以與特定核苷酸序列的核堿基形成堿基對(duì)的從5'至3'的核堿基的多核苷酸。類似地，除非另有明確說明或者從上下文中可以清楚地看出另有所指，核酸的“反向互補(bǔ)物”是指相反取向的互補(bǔ)物。前述內(nèi)容在以下圖示中示出：5’atgatgatg3’多核苷酸5’tactactac3’該多核苷酸的“互補(bǔ)物”5’catcatcat3’該多核苷酸的“反向互補(bǔ)物”本發(fā)明的一些實(shí)施方案包括形成發(fā)夾rna的irna分子。在這些irna分子中，rna干擾的靶核酸的互補(bǔ)物和反向互補(bǔ)物可以出現(xiàn)在同一分子中，使得單鏈rna分子在包含互補(bǔ)和反向互補(bǔ)的多核苷酸的區(qū)域上可以“回折”并與自身雜交，如下面的圖示所示：5’augaugaug–接頭多核苷酸–caucaucau3’,其雜交而形成：“核酸分子”包括所有多核苷酸，例如：dna的單鏈和雙鏈形式；rna的單鏈形式；和rna的雙鏈形式(dsrna)。術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”或“核酸序列”是指作為個(gè)別單鏈或在雙鏈體中的核酸有義和反義鏈兩者。術(shù)語(yǔ)“核糖核酸”(rna)包括irna(抑制性rna)、dsrna(雙鏈rna)、sirna(小干擾rna)、mrna(信使rna)、mirna(微小rna)、shrna(小發(fā)夾rna)、hprna(發(fā)夾rna)、trna(轉(zhuǎn)運(yùn)rna)(無(wú)論是裝載還是卸下相應(yīng)的?；被?、和crna(互補(bǔ)rna)。術(shù)語(yǔ)“脫氧核糖核酸”(dna)包括cdna、gdna、和dna-rna雜交體。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“核酸”、其“區(qū)段”，或其“片段”，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，包括，例如，gdna、核糖體rna、轉(zhuǎn)運(yùn)rna、rna、信使rna、操縱子、和較小的工程化多核苷酸，其編碼或可適用于編碼肽、多肽、或蛋白質(zhì)；以及核酸分子中的功能和/或結(jié)構(gòu)元件，由其相應(yīng)的核苷酸序列界定。寡核苷酸：寡核苷酸是短的核酸聚合物。寡核苷酸可通過切割較長(zhǎng)核酸區(qū)段、或通過使單獨(dú)的核苷酸前體聚合而形成。自動(dòng)合成儀能夠合成長(zhǎng)度多達(dá)幾百個(gè)堿基的寡核苷酸。由于寡核苷酸可與互補(bǔ)的核酸結(jié)合，因此它們可用作檢測(cè)dna或rna的探針。由dna(寡脫氧核糖核苷酸)組成的寡核苷酸可以用于pcr，pcr是一種用于擴(kuò)增dna和rna(逆轉(zhuǎn)錄成cdna)序列的技術(shù)。在pcr中，寡核苷酸一般被稱為“引物”，其允許dna聚合酶延伸寡核苷酸并復(fù)制互補(bǔ)鏈。核酸分子可以包括天然存在的核苷酸和/或修飾核苷酸，它們通過天然存在和/或非天然存在的核苷酸連接而連接在一起。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解，核酸分子可被化學(xué)修飾或生物化學(xué)修飾，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸堿基。這些修飾包括，例如，標(biāo)記物、甲基化、用類似物取代一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾(例如，如不帶電連接(unchargedlinkage)的修飾：例如甲基膦酸鹽、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；帶電連接(chargedlinkage)的修飾：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；懸垂部分的修飾：例如肽類；嵌入劑修飾：例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等；螯合劑修飾；烷化劑(alkylator)修飾；和修飾的連接：例如α異頭核酸等)。術(shù)語(yǔ)“核酸分子”還包括任何拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，包括單鏈的、雙鏈的、部分雙鏈體的、三鏈體的、發(fā)夾形的(hairpinned)、圓形的、掛鎖形的結(jié)構(gòu)。如本文中使用的，就dna而言，術(shù)語(yǔ)“編碼序列”、“結(jié)構(gòu)核苷酸序列”、或“結(jié)構(gòu)核酸分子”是指這樣的核苷酸序列，當(dāng)被置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列控制下時(shí)，其通過轉(zhuǎn)錄和mrna最終翻譯成多肽。就rna而言，術(shù)語(yǔ)“編碼序列”指翻譯成肽、多肽或蛋白質(zhì)的核苷酸序列。編碼序列的邊界由5’端的翻譯起始密碼子和3’端的翻譯終止密碼子所界定。編碼多核苷酸包括但不限于：基因組dna；cdna；est；和重組核苷酸序列?；蚪M：如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“基因組”是指存在于細(xì)胞核內(nèi)的染色體dna，并且也指存在于細(xì)胞的亞細(xì)胞組成部分內(nèi)的細(xì)胞器dna。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可以將dna分子導(dǎo)入植物細(xì)胞中，使得dna分子整合到植物細(xì)胞的基因組中。在這些和另外的實(shí)施方案中，dna分子可以整合到植物細(xì)胞的核dna中，或整合到植物細(xì)胞的葉綠體或線粒體的dna中。術(shù)語(yǔ)“基因組”在其應(yīng)用于細(xì)菌時(shí)，指細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的染色體和質(zhì)粒兩者。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可以將dna分子導(dǎo)入細(xì)菌中，使得dna分子整合到細(xì)菌的基因組中。在這些和另外的實(shí)施方案中，dna分子可以整合于染色體，或者作為穩(wěn)定的質(zhì)粒定位或位于穩(wěn)定的質(zhì)粒中。序列同一性：如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“序列同一性”或“同一性”，在兩個(gè)核酸或多肽序列的情況下，是指在指定比較窗口上以最大對(duì)應(yīng)性比對(duì)時(shí)，這兩個(gè)序列中相同的殘基。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“序列同一性百分比”可以是指通過在比較窗口上比較分子的兩個(gè)最優(yōu)比對(duì)序列(例如，核酸序列或多肽序列)確定的值，其中為了實(shí)現(xiàn)這兩個(gè)序列的最優(yōu)比對(duì)，該比較窗口中的序列部分相比于參考序列(其不包含添加或缺失)可以包含添加或缺失(即，空位)。通過確定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核苷酸或氨基酸殘基的位置的數(shù)目而產(chǎn)生匹配位置數(shù)，用該匹配位置數(shù)除以比較窗口中位置的總數(shù)，將結(jié)果乘以100而產(chǎn)生序列同一性的百分比，從而計(jì)算出該百分比。每個(gè)位置與參考序列相比均相同的序列被認(rèn)為是與參考序列是100％相同的，反之亦然。用于比較的序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。各種程序和比對(duì)算法例如描述于smith和waterman(1981)adv.appl.math.2:482；needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.48:443；pearson和lipman(1988)proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:2444；higgins和sharp(1988)gene73:237-244；higgins和sharp(1989)cabios5:151-153；corpet等人，(1988)nucleicacidsres.16:10881-10890；huang等人，(1992)comp.appl.biosci.8:155-165；pearson等人，(1994)methodsmol.biol.24:307-331；tatiana等人(1999)femsmicrobiol.lett.174:247-250。序列比對(duì)方法和同源性計(jì)算的詳細(xì)考慮事項(xiàng)可見于例如，altschul等人，(1990)j.mol.biol.215:403-410。美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(ncbi)基本局部比對(duì)搜索工具(blasttm；altschul等人(1990))可在幾個(gè)來(lái)源訪問，包括美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(bethesda,md)、以及在互聯(lián)網(wǎng)上，其與幾種序列分析程序結(jié)合使用。怎樣使用該程序確定序列同一性的描述可在互聯(lián)網(wǎng)上blasttm的“幫助”部分獲得。為了比較核酸序列，可以采用利用默認(rèn)參數(shù)的默認(rèn)blosum62矩陣集的blasttm(blastn)程序的“blast2序列”函數(shù)。在用這種方法評(píng)估時(shí)，與參考序列具有較大相似性的核酸序列將顯示出同一性百分比的增加?？商禺愋噪s交/特異性互補(bǔ)：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“可特異性雜交”和“特異性互補(bǔ)”是表明互補(bǔ)性的足夠程度的術(shù)語(yǔ)，該互補(bǔ)性足以使得在核酸分子與靶核酸分子之間發(fā)生穩(wěn)定且特異的結(jié)合。在兩個(gè)核酸分子之間的雜交兩種涉及核酸分子的核酸序列之間的反平行比對(duì)的形成。然后，兩個(gè)分子能夠與相反鏈上的相應(yīng)堿基形成氫鍵以形成雙鏈體分子，如果該雙鏈體分子足夠穩(wěn)定，則可使用本領(lǐng)域中熟知的方法檢出。核酸分子與其可特異性雜交的靶序列不一定是100％互補(bǔ)的。然而，對(duì)于特異性雜交而言必須存在的序列互補(bǔ)性的量依賴所使用的雜交條件而變化。導(dǎo)致特定嚴(yán)格程度的雜交條件會(huì)根據(jù)選擇的雜交方法的性質(zhì)和雜交的核酸序列的組成和長(zhǎng)度而變化。通常，雜交的溫度和雜交的離子強(qiáng)度(尤其是na+和/或mg++濃度)將決定雜交嚴(yán)格性。洗滌緩沖液的離子強(qiáng)度和洗滌溫度也會(huì)影響嚴(yán)格性。關(guān)于獲得特定嚴(yán)格性程度所需要的雜交條件的計(jì)算是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，并且論述于例如sambrook等人(編輯)molecularcloning:alaboratorymanual,2nded.,vol.1-3,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny,1989,chapters9and11和更新；以及hames和higgins(編輯)nucleicacidhybridization,irlpress,oxford,1985。關(guān)于核酸雜交的進(jìn)一步詳細(xì)說明和指導(dǎo)例如可見于tijssen,"overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays,"inlaboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology-hybridizationwithnucleicacidprobes,parti,chapter2,elsevier,ny,1993；以及ausubel等人編輯，currentprotocolsinmolecularbiology,chapter2,greenepublishingandwiley-interscience,ny,1995和更新。如本文中使用的，“嚴(yán)格條件”涵蓋僅在雜交分子與靶核酸分子內(nèi)的同源序列之間存在大于80％的序列匹配時(shí)才發(fā)生雜交的條件。“嚴(yán)格條件”包括另外的特定嚴(yán)格性水平。因此，如本文中使用的，“中等嚴(yán)格性”條件為具有超過80％的以上序列匹配(即具有少于20％錯(cuò)配)的分子將會(huì)雜交的條件；“高嚴(yán)格性”條件為具有超過90％的匹配(即具有少于10％錯(cuò)配)的序列將會(huì)雜交的條件(即，具有小于10％的錯(cuò)配)；并且“極高嚴(yán)格性”條件為具有超過95％的匹配(即具有少于15％錯(cuò)配)的序列將會(huì)雜交的條件。以下是代表性的非限制性雜交條件：高嚴(yán)格性條件(檢測(cè)出共享至少90％序列同一性的序列)：在5xssc緩沖液中在65℃雜交16小時(shí)；在2xssc緩沖液中在室溫下洗滌兩次，每次15分鐘；并且在0.5xssc緩沖液中在65℃洗滌兩次，每次20分鐘。中等嚴(yán)格性條件(檢測(cè)出共享至少80％序列同一性的序列)：在5x到6xssc緩沖液中在65--70℃雜交16-20小時(shí)；在2xssc緩沖液中在室溫下洗滌兩次，每次5-20分鐘；并且在1xssc緩沖液中在55-70℃洗滌兩次，每次30分鐘。非嚴(yán)格對(duì)照條件(共享至少50％序列同一性的序列會(huì)雜交)：在6xssc緩沖液中在室溫到55℃雜交16-20小時(shí)；在2x到3xssc緩沖液中在室溫到55℃洗滌至少兩次，每次20-30分鐘。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“基本上同源”或“實(shí)質(zhì)同源性”就核酸而言是指具有這樣的連續(xù)核堿基的多核苷酸，所述連續(xù)核堿基在嚴(yán)格條件下與參考核酸雜交。例如，與seqidno:1中任一個(gè)的參考核酸序列基本上同源的序列的核酸是在嚴(yán)格條件(例如，上文列出的中等嚴(yán)格性條件)下與seqidno:1中任一個(gè)的參考核酸雜交的那些核酸?；旧贤吹亩嗪塑账峥梢跃哂兄辽?0％序列同一性。例如，基本上同源的多核苷酸可以具有約80％到100％序列同一性，諸如約79％；80％；約81％；約82％；約83％；約84％；約85％；約86％；約87％；約88％；約89％；約90％；約91％；約92％；約93％；約94％；約95％；約96％；約97％；約98％；約98.5％；約99％；約99.5％；和約100％。實(shí)質(zhì)性同源性的特性與特異性雜交緊密相關(guān)。例如，當(dāng)存在足夠的互補(bǔ)程度時(shí)，核酸分子可特異性地雜交，以便避免核酸在特異性結(jié)合是期望的情況下(例如，在嚴(yán)格雜交條件下)與非靶多核苷酸的非特異性結(jié)合。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“直系同源物”是指兩種或更多種物種中已經(jīng)從共同的祖先核酸進(jìn)化并且可以在所述兩種或更多種物種中保留相同功能的基因。如本文中使用的，當(dāng)一個(gè)多核苷酸以5’至3’方向閱讀的每個(gè)核苷酸與另一多核苷酸以3’至5’方向閱讀時(shí)的每個(gè)核苷酸序列互補(bǔ)時(shí)，兩個(gè)核酸分子被認(rèn)為展現(xiàn)出“完全互補(bǔ)性”。與參考多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸將展現(xiàn)出與參考多核苷酸的反向互補(bǔ)物相同的序列。這些術(shù)語(yǔ)和描述是本領(lǐng)域中定義明確的，并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易理解的?？刹僮?地)連接：當(dāng)?shù)谝欢嗪塑账崤c第二多核苷酸處于功能性關(guān)系中時(shí)，則第一多核苷酸與第二多核苷酸是可操作連接的。當(dāng)以重組方式產(chǎn)生時(shí)，可操作連接的多核苷酸通常是連續(xù)的，并且在需要將兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)連接在一起的場(chǎng)合，二者在同一個(gè)閱讀框內(nèi)(例如，在翻譯融合的orf中)。然而，可操作連接的核酸不一定是連續(xù)的。在有關(guān)調(diào)節(jié)性遺傳元件和編碼多核苷酸的語(yǔ)境下使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“可操作連接”意味著該調(diào)節(jié)元件影響該連接的編碼序列的表達(dá)?！罢{(diào)節(jié)元件”或“控制元件”是指影響轉(zhuǎn)錄的周期和水平/量、rna加工或穩(wěn)定性、或相關(guān)編碼多核苷酸的翻譯的多核苷酸。調(diào)節(jié)元件可以包括啟動(dòng)子；翻譯前導(dǎo)；內(nèi)含子；增強(qiáng)子；莖環(huán)結(jié)構(gòu)；阻抑物結(jié)合多核苷酸；具有終止序列的多核苷酸；具有多腺苷酸化識(shí)別序列的多核苷酸等。特定的調(diào)節(jié)元件可位于與其可操作連接的編碼多核苷酸的上游和/或下游。并且，與編碼多核苷酸可操作連接的特定調(diào)節(jié)序列可位于雙鏈核酸分子的相關(guān)互補(bǔ)鏈上。啟動(dòng)子：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指可以在轉(zhuǎn)錄起始上游的、且可能涉及rna聚合酶與其他蛋白質(zhì)的識(shí)別和結(jié)合而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的dna區(qū)域。啟動(dòng)子可與用于在細(xì)胞中表達(dá)的編碼多核苷酸可操作連接，或者啟動(dòng)子可與編碼信號(hào)序列的多核苷酸可操作連接，所述多核苷酸可與用于在細(xì)胞中表達(dá)的編碼多核苷酸可操作連接?！爸参飭?dòng)子”可以是能夠啟動(dòng)植物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。在發(fā)育控制下的啟動(dòng)子的實(shí)例包括優(yōu)先啟動(dòng)某些組織中的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，所述組織例如葉、根、種子、纖維、木質(zhì)部導(dǎo)管、管胞、或厚壁組織。這樣的啟動(dòng)子稱為“組織優(yōu)先”啟動(dòng)子。僅啟動(dòng)某些組織中的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子被稱為“組織特異性”啟動(dòng)子。“細(xì)胞類型特異性”啟動(dòng)子主要驅(qū)動(dòng)一個(gè)或多個(gè)器官中某些細(xì)胞類型(例如，根或葉中的維管細(xì)胞)中的表達(dá)?！罢T導(dǎo)型”啟動(dòng)子可以是可以在環(huán)境控制之下的啟動(dòng)子?？赏ㄟ^誘導(dǎo)型啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實(shí)例包括厭氧條件和光的存在。組織特異性啟動(dòng)子、組織優(yōu)先啟動(dòng)子、細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子、和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子構(gòu)成“非組成型”啟動(dòng)子類別?！敖M成型”啟動(dòng)子是可在大多數(shù)環(huán)境條件下或在大多數(shù)組織或細(xì)胞類型中有活性的啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中可以使用任何誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。參見ward等人，(1993)plantmol.biol.22:361-366。利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄速率響應(yīng)于誘導(dǎo)劑而增加。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于：來(lái)自響應(yīng)于銅的acei系統(tǒng)的啟動(dòng)子；響應(yīng)于苯磺酰胺除草劑安全劑的來(lái)自玉米的in2基因啟動(dòng)子；來(lái)自tn10的tet阻抑物；和來(lái)自類固醇激素基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其轉(zhuǎn)錄活性可通過糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)(schena等人，(1991)proc.natl.acad.sci.usa88:0421)。示例性的組成型啟動(dòng)子包括，但不限于：來(lái)自植物病毒的啟動(dòng)子，例如來(lái)自花椰菜花葉病毒(camv)的35s啟動(dòng)子；來(lái)自水稻肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子；泛素啟動(dòng)子；pemu；mas；玉米h3組蛋白啟動(dòng)子；和als啟動(dòng)子，歐洲油菜als3結(jié)構(gòu)基因5'的xba1/ncoi片段(或與所述xba1/ncoi片段相似的多核苷酸)(國(guó)際pct公布號(hào)美國(guó)專利wo96/30530)。另外，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中可以利用任何組織特異性或組織優(yōu)先啟動(dòng)子。用包含與組織特異性啟動(dòng)子可操作連接的編碼多核苷酸的核酸分子轉(zhuǎn)化的植物可唯一地或優(yōu)先地在特異性組織中產(chǎn)生所述編碼多核苷酸的產(chǎn)物。示例性的組織特異性或組織優(yōu)先啟動(dòng)子包括但不限于：種子特異性啟動(dòng)子，如來(lái)自菜豆蛋白基因的啟動(dòng)子；葉特異性和光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如來(lái)自cab或rubisco的啟動(dòng)子；花藥特異性啟動(dòng)子，如來(lái)自lat52的啟動(dòng)子；花粉特異性啟動(dòng)子，如來(lái)自zm13的啟動(dòng)子；以及小孢子優(yōu)先啟動(dòng)子，如來(lái)自apg的啟動(dòng)子。大豆植物：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“大豆植物”是指屬于大豆屬物種(glycinesp.)的植物，例如大豆(glycinemax)。轉(zhuǎn)化：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”是指將一個(gè)或多個(gè)核酸分子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。當(dāng)核酸分子通過核酸分子并入細(xì)胞基因組中、或通過附加型復(fù)制而由該細(xì)胞穩(wěn)定復(fù)制時(shí)，細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)到該細(xì)胞中的核酸分子“轉(zhuǎn)化”。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”涵蓋可將核酸分子導(dǎo)入這種細(xì)胞中的所有技術(shù)。實(shí)例包括但不限于：用病毒載體轉(zhuǎn)染；用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化；電穿孔(fromm等人，(1986)nature319:791-3)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(felgner等人，(1987)proc.natl.acad.sci.usa84:7413-7)；顯微注射(mueller等人，(1978)cell15:579-85)；土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移(fraley等人，(1983)proc.natl.acad.sci.usa80:4803-7)；直接dna攝取；和微粒轟擊(klein等人，(1987)nature327:70)。轉(zhuǎn)基因：外源核酸。在一些實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因可以是編碼rna的dna，所述rna能夠形成dsrna分子的一條或兩條鏈，包含與存在于鞘翅目和/或半翅目害蟲中的核酸分子互補(bǔ)的多核苷酸。在另外的實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因可以為基因(例如除草劑耐性基因、編碼工業(yè)或藥學(xué)上有用的化合物的基因、或編碼期望的農(nóng)業(yè)性狀的基因)。在這些和其他實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因可以含有與轉(zhuǎn)基因的編碼多核苷酸可操作連接的調(diào)節(jié)元件(例如，啟動(dòng)子)。載體：引入到細(xì)胞中，例如產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的核酸分子。載體可以包含允許其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的遺傳元件，諸如復(fù)制起點(diǎn)。載體的實(shí)例包括但不限于：質(zhì)粒；粘粒；噬菌體；和攜帶外源dna或rna進(jìn)入細(xì)胞中的病毒。載體還可包括一種或多種基因、包括產(chǎn)生反義分子的基因、和/或選擇標(biāo)志物基因和本領(lǐng)域已知的其他遺傳元件。載體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或感染細(xì)胞，由此引起細(xì)胞表達(dá)核酸分子和/或由該載體編碼的蛋白質(zhì)。任選地，載體包括輔助核酸分子實(shí)現(xiàn)進(jìn)入細(xì)胞中的物質(zhì)(例如脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)包衣等)。產(chǎn)量：相對(duì)于在相同生長(zhǎng)位置在相同時(shí)間且在相同條件下生長(zhǎng)的檢驗(yàn)品種的產(chǎn)量，約100％或更大的穩(wěn)定化產(chǎn)量。在特定的實(shí)施方案中，“提高的產(chǎn)量”或“提高產(chǎn)量”意指相對(duì)于在含有相當(dāng)大密度的對(duì)該作物有害的鞘翅目和/或半翅目害蟲(本申請(qǐng)的組合物和方法以所述害蟲為目標(biāo))的相同生長(zhǎng)位置在相同時(shí)間且在相同條件下生長(zhǎng)的檢驗(yàn)品種的產(chǎn)量，具有105％或更大的穩(wěn)定化產(chǎn)量的栽培種。除非特別指明或暗示，如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“一個(gè)”、“一種”和“該”表示“至少一個(gè)/種”。除非另外特別地解釋，本文中使用的全部技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與屬于本公開的領(lǐng)域之內(nèi)的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義?？梢栽谝韵鲁霭嫖镏姓业椒肿由飳W(xué)中常見術(shù)語(yǔ)的定義：例如，lewin’sgenesx,jones&bartlettpublishers,2009(isbn100763766321)；krebs等人(編輯)，theencyclopediaofmolecularbiology,blackwellscienceltd.,1994(isbn0-632-02182-9)；和meyersr.a.(編輯)，molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference,vchpublishers,inc.,1995(isbn1-56081-569-8)。除非另有說明，所有百分比均以重量計(jì)，所有溶劑混合物比例以體積計(jì)。所有溫度以攝氏度計(jì)。iv.包含昆蟲害蟲多核苷酸的核酸分子a.概述本文中描述了可用于控制昆蟲害蟲的核酸分子。在一些實(shí)例中，昆蟲害蟲是鞘翅目和/或半翅目昆蟲害蟲。描述的核酸分子包括靶多核苷酸(例如，天然基因、和非編碼多核苷酸)、dsrna、sirna、shrna、hprna、和mirna。例如，在一些實(shí)施方案中描述了dsrna、mirna、sirna、shrna和/或hprna分子，其可與鞘翅目和/或半翅目害蟲中的一種或多種天然核酸的全部或部分特異性地互補(bǔ)。在這些和另外的實(shí)施方案中，天然核酸可以是一種或多種靶基因，其產(chǎn)物可以例如但不限于：涉及幼蟲/若蟲發(fā)育。本文中描述的核酸分子在導(dǎo)入包含至少一種與該核酸分子特異性互補(bǔ)的天然核酸的細(xì)胞中時(shí)，可以在細(xì)胞中啟動(dòng)rnai，隨后降低或消除該天然核酸的表達(dá)。在一些實(shí)例中，借助于與靶基因特異性互補(bǔ)的核酸分子降低或消除靶基因表達(dá)，可導(dǎo)致害蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和/或進(jìn)食停止。在一些實(shí)施方案中，可以選擇昆蟲害蟲中的至少一種靶基因，其中靶基因包含copigamma(seqidno:1或seqidno:87)。在具體的實(shí)例中，選自鞘翅目和/或半翅目害蟲中的靶基因，其中該靶基因包含新的核苷酸序列，該序列包含copigamma(seqidno:1或seqidno:87)。在一些實(shí)施方案中，靶基因可以是包含這樣的多核苷酸的核酸分子，該多核苷酸能夠在計(jì)算機(jī)上翻譯成包含連續(xù)氨基酸序列的多肽：所述連續(xù)氨基酸序列與copigamma(seqidno:1或seqidno:87)多核苷酸的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列至少約85％相同(例如，至少84％、85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％、或100％相同)。靶基因可以是昆蟲害蟲中的任何核酸，對(duì)該序列的轉(zhuǎn)錄后抑制會(huì)對(duì)該害蟲的生長(zhǎng)和/或存活造成有害影響，從而，例如，給植物提供針對(duì)該害蟲的保護(hù)效益。在具體的實(shí)例中，靶基因是這樣的核酸分子，其包含能夠在計(jì)算機(jī)上反向翻譯為多肽的多核苷酸，所述多肽包含與新核苷酸序列seqidno:1或seqidno:87的蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列至少約85％相同、約90％相同、約95％相同、約96％相同、約97％相同、約98％相同、約99％相同、約100％相同、或100％相同的連續(xù)氨基酸序列。依照一些實(shí)施方案提供了dna，其表達(dá)生成包含這樣的多核苷酸的rna分子，該多核苷酸與由昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲中的編碼多核苷酸編碼的天然rna分子的全部或部分特異性地互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，在昆蟲害蟲攝入表達(dá)的rna分子后，可以獲得害蟲細(xì)胞中編碼多核苷酸的下調(diào)。在特定的實(shí)施方案中，害蟲細(xì)胞中編碼序列的下調(diào)可以對(duì)害蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育、和/或存活產(chǎn)生有害影響。在一些實(shí)施方案中，靶多核苷酸包括轉(zhuǎn)錄的非編碼性rna，諸如5’utr；3’utr；剪接前導(dǎo)；內(nèi)含子；末端內(nèi)含子(outron)(例如，隨后在反式剪接中修飾的5'utrrna)；donatron(例如，提供反式剪接的供體序列需要的非編碼rna)；和昆蟲害蟲靶基因的其他非編碼轉(zhuǎn)錄rna。這樣的多核苷酸可以衍生自單順反子和多順反子基因兩者。因此，本文中結(jié)合一些實(shí)施方案還描述了包含至少一種多核苷酸的irna分子(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna和hprna)，所述多核苷酸與昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲中的靶核酸的全部或部分特異性地互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，irna分子可以包含與多個(gè)靶核酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多個(gè)靶核酸的全部或部分互補(bǔ)的多核苷酸。在特定的實(shí)施方案中，irna分子可以在體外產(chǎn)生，或通過遺傳修飾的生物(如植物或細(xì)菌)在體內(nèi)產(chǎn)生。還公開了cdna，其可以用于產(chǎn)生與昆蟲害蟲中的靶核酸的全部或部分特異性地互補(bǔ)的dsrna分子、sirna分子、mirna分子、shrna分子、和/或hprna分子。進(jìn)一步描述了在實(shí)現(xiàn)特定宿主靶標(biāo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化中使用的重組dna構(gòu)建體。轉(zhuǎn)化的宿主靶標(biāo)可以從重組dna構(gòu)建體表達(dá)有效水平的dsrna、sirna、mirna分子、shrna分子、和/或hprna分子。因此，還描述了植物轉(zhuǎn)化載體，其包含與在植物細(xì)胞中功能性的異源啟動(dòng)子可操作連接的至少一個(gè)多核苷酸，其中多核苷酸的表達(dá)生成包含與昆蟲害蟲中的靶核酸的全部或部分特異性地互補(bǔ)的連續(xù)核堿基串的rna分子。在特定實(shí)例中，可用于控制昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的核酸分子可以包括：從葉甲屬或半翅目生物分離的包含copigamma(seqidno:1或seqidno:87)的天然核酸的全部或部分；核苷酸序列，其在表達(dá)時(shí)生成這樣的rna分子：所述rna分子包含與由copigamma(seqidno:1或seqidno:87)編碼的天然rna分子的全部或部分特異性地互補(bǔ)的多核苷酸；irna分子(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna和hprna)，所述irna分子包含與copigamma(seqidno:1或seqidno:87)的全部或部分特異性地互補(bǔ)的至少一個(gè)多核苷酸；可用于產(chǎn)生dsrna分子、sirna分子、mirna、shrna和/或hprna分子的cdna序列，所述分子與copigamma(seqidno:1或seqidno:87)的全部或部分特異性地互補(bǔ)；以及用于在實(shí)現(xiàn)特定宿主靶標(biāo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化中使用的重組dna構(gòu)建體，其中轉(zhuǎn)化的宿主靶標(biāo)包含一種或多種前述的核酸分子。b.核酸分子本發(fā)明提供了，除其他事項(xiàng)外，抑制昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的細(xì)胞、組織、或器官中的靶基因表達(dá)的irna(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna和hprna)分子；和能夠在細(xì)胞或微生物中表達(dá)為irna分子以抑制昆蟲害蟲的細(xì)胞、組織、或器官中的靶基因表達(dá)的dna分子。本發(fā)明的一些實(shí)施方案提供了分離的核酸分子，其包含至少一個(gè)(例如，一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、或更多個(gè))選自下組的多核苷酸：seqidno:1或seqidno:87中任一者；seqidno:1或seqidno:87中任一者的互補(bǔ)物；seqidno:1或seqidno:87中任一者的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:1或seqidno:87中任一者的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物；葉甲屬生物(例如wcr)的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸；半翅目生物的包含seqidno:87的天然編碼多核苷酸；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸的互補(bǔ)物；半翅目生物的包含seqidno:87的天然編碼多核苷酸的互補(bǔ)物；葉甲屬生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列；半翅目生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:87的天然rna分子的天然非編碼序列；葉甲屬生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的互補(bǔ)物；半翅目生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:87的天然rna分子的天然非編碼序列的互補(bǔ)物；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；半翅目生物的包含seqidno:87的天然編碼多核苷酸的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物；半翅目生物的包含seqidno:87的天然編碼多核苷酸的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物；葉甲屬生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；半翅目生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:87的天然rna分子的天然非編碼序列至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；葉甲屬生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物；以及半翅目生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:87的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物。在特定實(shí)施方案中，所述分離的多核苷酸與鞘翅目和/或半翅目害蟲接觸或被所述昆蟲害蟲攝取抑制該害蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和/或進(jìn)食。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子可以包含至少一個(gè)(例如，一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、或更多個(gè))dna，其能夠在細(xì)胞或微生物中表達(dá)為irna分子以抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲的細(xì)胞、組織、或器官中的靶基因表達(dá)。這樣的dna可以與在包含該dna分子的細(xì)胞中具備功能的啟動(dòng)子可操作連接，以啟動(dòng)或增強(qiáng)編碼的能夠形成dsrna分子的rna的轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)(例如，一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、或更多個(gè))dna可衍生自選自包含seqidno:1或seqidno:87的群組的多核苷酸。seqidno:1或seqidno:87的衍生物包括seqidno:1或seqidno:87的片段。在一些實(shí)施方案中，這樣的片段可包含例如seqidno:1或seqidno:87的至少約15個(gè)連續(xù)核苷酸，或其互補(bǔ)物。因此，這樣的片段可包含，例如，seqidno:1或seqidno:87的15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸，或其互補(bǔ)物。在某些實(shí)例中，這樣的片段可包含，例如，seqidno:1或seqidno:87的至少19個(gè)連續(xù)核苷酸，或其互補(bǔ)物。因此，seqidno:1或seqidno:87的片段可以包含，例如，seqidno:1或seqidno:87的15,16,17,18,19,20,21,約25個(gè)(例如，22,23,24,25,26,27,28，29)，約30,約40,(例如，35,36,37,38,39,40,41,42,43,44和45),約50,約60,約70,約80,約90,約100,約110,約120,約130,約140,約150,約160,約170,約180,約190,約200或更多個(gè)連續(xù)核苷酸，或其互補(bǔ)物。一些實(shí)施方案包括將部分或完全穩(wěn)定化的dsrna分子導(dǎo)入鞘翅目和/或半翅目害蟲中以抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲的細(xì)胞、組織或器官中靶基因的表達(dá)。當(dāng)表達(dá)為irna分子(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)并被鞘翅目和/或半翅目害蟲攝取時(shí)，包含seqidno:1或seqidno:87的一個(gè)或多個(gè)片段的多核苷酸可以引起下列一項(xiàng)或多項(xiàng)：鞘翅目和/或半翅目害蟲的死亡、發(fā)育停止、生長(zhǎng)抑制、性別比變化、產(chǎn)卵量(broodsize)減少、感染停止、和/或進(jìn)食停止。例如，在一些實(shí)施方案中，提供這樣的dsrna分子：該dsrna分子包含與鞘翅目和/或半翅目害蟲靶基因序列基本同源的約15個(gè)至約300個(gè)、或約19個(gè)至約300個(gè)核苷酸的核苷酸序列，并且包含含有seqidno:1或seqidno:87的核苷酸序列的一個(gè)或多個(gè)片段。這種dsrna分子的表達(dá)可能例如導(dǎo)致攝取dsrna分子的鞘翅目和/或半翅目害蟲中的死亡和/或生長(zhǎng)抑制。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的dsrna分子包含與來(lái)自包含seqidno:1或seqidno:87的靶基因的轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)的多核苷酸，和/或與seqidno:1或seqidno:87的片段互補(bǔ)的核苷酸序列，所述靶基因在昆蟲害蟲中的抑制導(dǎo)致對(duì)于害蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育、或其他生物學(xué)功能必需的蛋白質(zhì)或多核苷酸物質(zhì)的減少或消除。選擇的核苷酸序列可以與下列各項(xiàng)展現(xiàn)出約80％到約100％序列同一性：seqidno:1或seqidno:87中任一者；seqidno:1或seqidno:87中所示的核苷酸序列的連續(xù)片段；或前述任一者的互補(bǔ)物。例如，選定的多核苷酸可以與下列任一項(xiàng)展現(xiàn)出79％、80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約98.5％、約99％、約99.5％、或約100％的序列同一性：seqidno:1或seqidno:87；seqidno:1或seqidno:87中所示的核苷酸序列的連續(xù)片段；和前述任一者的互補(bǔ)物。在一些實(shí)施方案中，能夠在細(xì)胞或微生物中表達(dá)為irna分子以抑制靶基因表達(dá)的dna分子可以包含與存在于一個(gè)或多個(gè)靶昆蟲害蟲物種(例如鞘翅目或半翅目害蟲物種)中的天然多核苷酸的全部或部分特異性地互補(bǔ)的單個(gè)多核苷酸，或者dna分子可以是從多個(gè)這樣的特異性互補(bǔ)多核苷酸構(gòu)建而成的嵌合體。在一些實(shí)施方案中，核酸分子可以包含以“間隔物”分開的第一和第二多核苷酸。間隔物可以是任何包含促進(jìn)第一和第二多核苷酸之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)形成(在期望的情況下)的核苷酸序列的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，間隔物是mrna的有義或反義編碼多核苷酸的一部分?；蛘撸g隔物可以包含能夠與核酸分子可操作連接的核苷酸或其同源物的任何組合。在一些實(shí)例中，間隔物可以是內(nèi)含子(例如st-ls1內(nèi)含子或rtm1內(nèi)含子)。例如，在一些實(shí)施方案中，dna分子可以包含編碼一種或多種不同irna分子的多核苷酸，其中每種不同irna分子分別包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中第一和第二多核苷酸彼此互補(bǔ)。第一和第二多核苷酸在rna分子內(nèi)可以通過間隔物連接。間隔物可以構(gòu)成第一多核苷酸或第二多核苷酸的一部分。包含第一和第二多核苷酸的rna分子的表達(dá)可以通過第一和第二多核苷酸的特異性分子內(nèi)堿基配對(duì)而導(dǎo)致dsrna分子的形成。第一多核苷酸或第二多核苷酸可以與對(duì)于昆蟲害蟲(例如鞘翅目和/或半翅目害蟲)而言天然的多核苷酸(例如，靶基因、或轉(zhuǎn)錄的非編碼多核苷酸)、其衍生物、或其互補(bǔ)多核苷酸基本上相同。dsrna核酸分子包含聚合核糖核苷酸的雙鏈，并且可以包含對(duì)磷酸-糖主鏈或核苷的修飾。可以適宜調(diào)整rna結(jié)構(gòu)的修飾以使得特異性抑制能夠發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過普遍存在的酶促過程來(lái)修飾dsrna分子，以便能夠生成sirna分子。此酶促過程可以利用體外或體內(nèi)的rna酶iii酶，如真核生物中的切丁酶。參見elbashir等人，(2001)nature411:494-8；以及hamilton和baulcombe(1999)science286(5441):950-2。切丁酶或功能等效的rna酶iii酶將較大的dsrna鏈和/或hprna分子切割成較小的寡核苷酸(例如，sirna)，每個(gè)所述寡核苷酸長(zhǎng)度為約19-25個(gè)核苷酸。由這些酶生成的sirna分子具有2到3個(gè)核苷酸3’突出物、和5’磷酸和3’羥基末端。由rna酶iii酶生成的sirna分子在細(xì)胞中解旋，并分成單鏈rna。然后，sirna分子與從靶基因轉(zhuǎn)錄的rna特異性地雜交，并且這兩種rna分子隨后通過固有的細(xì)胞rna降解機(jī)制而被降解。這個(gè)過程可以導(dǎo)致由靶生物中的靶基因編碼的rna的有效降解或消除。結(jié)果導(dǎo)致靶向基因的轉(zhuǎn)錄后沉默。在一些實(shí)施方案中，通過內(nèi)源rna酶iii酶從異源核酸分子產(chǎn)生的sirna分子可以有效介導(dǎo)鞘翅目和/或半翅目害蟲中靶基因的下調(diào)。在一些實(shí)施方案中，核酸分子可以包括至少一種可被轉(zhuǎn)錄成單鏈rna分子的非天然存在的多核苷酸，所述單鏈rna分子能夠在體內(nèi)通過分子間雜交形成dsrna分子。這樣的dsrna常常進(jìn)行自組裝，并且可以在昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源中提供，以實(shí)現(xiàn)靶基因的轉(zhuǎn)錄后抑制。在這些和另外的實(shí)施方案中，核酸分子可以包含兩種不同的非天然存在的核苷酸序列，其中每種序列與昆蟲害蟲中的不同靶基因特異性地互補(bǔ)。當(dāng)向例如鞘翅目和/或半翅目害蟲以dsrna分子的形式提供這樣的核酸分子時(shí)，dsrna分子抑制害蟲中至少兩種不同靶基因的表達(dá)。c.獲得核酸分子可以使用昆蟲(例如鞘翅目或半翅目)害蟲中的多種多核苷酸作為靶標(biāo)來(lái)設(shè)計(jì)核酸分子，如irna和編碼irna的dna分子。然而，天然多核苷酸的選擇并非是直截了當(dāng)?shù)倪^程。例如，鞘翅目或半翅目害蟲的天然多核苷酸中僅有少數(shù)會(huì)是有效的靶標(biāo)。特定的天然多核苷酸是否可以被本發(fā)明的核酸分子有效下調(diào)，抑或特定的天然多核苷酸的下調(diào)是否會(huì)對(duì)昆蟲害蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和/或生存具有有害影響，都是無(wú)法肯定地預(yù)測(cè)的。絕大多數(shù)的鞘翅目和半翅目害蟲天然多核苷酸，如自這些害蟲分離的est(例如，如美國(guó)專利7,612,194中所列出的鞘翅目害蟲多核苷酸)，對(duì)害蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和/或存活沒有有害影響。同樣無(wú)法預(yù)測(cè)的是，在可以對(duì)害蟲具有有害影響的天然多核苷酸中哪些能夠在重組技術(shù)中使用，從而在宿主植物中表達(dá)與這樣的天然多核苷酸互補(bǔ)的核酸分子，并且在進(jìn)食后對(duì)害蟲造成有害影響，同時(shí)不對(duì)宿主植物引起損害。在一些實(shí)施方案中，核酸分子(例如，要在昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的宿主植物中提供的dsrna分子)被選擇為靶向這樣的cdna，其編碼對(duì)于害蟲發(fā)育必需的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)部分(如涉及代謝或分解代謝生物化學(xué)途徑、細(xì)胞分裂、能量代謝、消化、宿主植物識(shí)別等的多肽)。如本文中描述的，靶害蟲生物攝入含有一種或多種dsrna——所述dsrna的至少一個(gè)區(qū)段與靶害蟲生物細(xì)胞中產(chǎn)生的rna的至少一個(gè)基本上相同的區(qū)段特異地互補(bǔ)——的組合物，可以導(dǎo)致靶生物的死亡或其他抑制?？梢允褂脧睦ハx害蟲衍生的多核苷酸(dna或rna)來(lái)構(gòu)建對(duì)該害蟲侵染有抗性的植物細(xì)胞。例如，可以轉(zhuǎn)化鞘翅目和/或半翅目害蟲的宿主植物(例如，玉米或大豆)，使其含有從鞘翅目和/或半翅目害蟲衍生的如本文中提供的一種或多種多核苷酸。轉(zhuǎn)化到宿主中的多核苷酸可以編碼一種或多種rna，其在轉(zhuǎn)化的宿主內(nèi)的細(xì)胞或生物學(xué)流體中形成dsrna結(jié)構(gòu)，這樣，如果/當(dāng)害蟲與轉(zhuǎn)基因宿主形成營(yíng)養(yǎng)關(guān)系時(shí)，就有dsrna可用。這可以導(dǎo)致害蟲細(xì)胞中一種或多種基因表達(dá)的阻抑，最終導(dǎo)致死亡或其生長(zhǎng)或發(fā)育的抑制。因此，在一些實(shí)施方案中，靶向?qū)嵸|(zhì)參與昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和生殖的基因。本發(fā)明中使用的其他靶基因可以包括例如那些在害蟲的運(yùn)動(dòng)、遷移、生長(zhǎng)、發(fā)育、感染性、和進(jìn)食位置的建立中發(fā)揮重要作用的靶基因。因此，靶基因可以是管家基因或轉(zhuǎn)錄因子。另外，本發(fā)明中使用的天然昆蟲害蟲多核苷酸也可以從植物、病毒、細(xì)菌或昆蟲基因的同源物(例如，直系同源物)衍生，所述同源物的功能對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，且其多核苷酸與害蟲的基因組中的靶基因可特異性地雜交。通過雜交鑒定已知核苷酸序列的基因同源物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于獲得包含用于產(chǎn)生irna(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)分子的多核苷酸的核酸分子的方法。一種這樣的實(shí)施方案包括：(a)對(duì)一種或多種靶基因分析其在昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲中在dsrna介導(dǎo)的基因阻抑后的表達(dá)、功能和表型；(b)用探針探查cdna或gdna文庫(kù)，所述探針包含來(lái)自靶向的害蟲的多核苷酸的全部或部分或其同源物，所述靶向的害蟲在dsrna介導(dǎo)的阻抑分析中展現(xiàn)出改變的(例如，降低的)生長(zhǎng)或發(fā)育表型；(c)鑒定與探針特異性雜交的dna克??；(d)分離步驟(b)中鑒定的dna克?。?e)對(duì)包含步驟(d)中分離的克隆的cdna或gdna片段測(cè)序，其中測(cè)序的核酸分子包含rna的全部或大部分或其同源物；和(f)化學(xué)合成基因的全部或大部分、mirna、sirna、hprna、mrna、shrna、或dsrna。在另外的實(shí)施方案中，用于獲得包含用于產(chǎn)生大部分的irna(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)分子的多核苷酸的核酸片段的方法包括：(a)合成第一和第二寡核苷酸引物，其與來(lái)自靶向的昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的天然多核苷酸的一部分特異性地互補(bǔ)；和(b)使用步驟(a)的第一和第二寡核苷酸引物擴(kuò)增克隆載體中存在的cdna或gdna插入物，其中擴(kuò)增的核酸分子包含mirna、sirna、mrna、hprna、shrna或dsrna分子的大部分。核酸可以通過多種途徑分離、擴(kuò)增、或產(chǎn)生。例如，可以通過pcr擴(kuò)增從gdna或cdna文庫(kù)衍生的靶多核苷酸(例如，靶基因或靶轉(zhuǎn)錄的非編碼多核苷酸)、或其部分而獲得irna(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)分子。可以從靶生物提取dna或rna，并且可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法從其制備核酸文庫(kù)?？墒褂米园猩锷傻膅dna或cdna文庫(kù)進(jìn)行靶基因的pcr擴(kuò)增和測(cè)序?？梢允褂么_認(rèn)的pcr產(chǎn)物作為體外轉(zhuǎn)錄的模板以在最低限度的啟動(dòng)子的情況下生成有義和反義rna?；蛘撸梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)化學(xué)，如亞磷酰胺化學(xué)，通過許多技術(shù)(參見，例如ozaki等人，(1992)nucleicacidsresearch,20:5205-5214；和agrawal等人，(1990)nucleicacidsresearch,18:5419-5423)，包括使用自動(dòng)化dna合成儀(例如，p.e.biosystems,inc.(fostercity,calif.)392或394型dna/rna合成儀)的任一者來(lái)合成核酸分子。參見，例如，beaucage等人，(1992)tetrahedron,48:2223-2311；美國(guó)專利4,980,460、4,725,677、4,415,732、4,458,066、和4,973,679。也可以采用備選化學(xué)，其生成非天然主鏈基團(tuán)，如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯，等等。本發(fā)明的rna、dsrna、mirna、sirna、shrna、或hprna分子可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過手動(dòng)或自動(dòng)反應(yīng)以化學(xué)或酶促方式產(chǎn)生，或者在包含含有編碼rna、dsrna、mirna、sirna、shrna、或hprna分子的多核苷酸的核酸分子的細(xì)胞中體內(nèi)產(chǎn)生。還可以通過部分或完全有機(jī)合成產(chǎn)生rna，可以通過體外酶促或有機(jī)合成引入任何經(jīng)修飾的核糖核苷酸?？梢酝ㄟ^細(xì)胞rna聚合酶或噬菌體rna聚合酶(例如，t3rna聚合酶、t7rna聚合酶、和sp6rna聚合酶)合成rna分子?？捎糜诳寺『捅磉_(dá)多核苷酸的表達(dá)構(gòu)建體是本領(lǐng)域中已知的。參見，例如，國(guó)際pct公布號(hào)wo97/32016；及美國(guó)專利5,593,874、5,698,425、5,712,135、5,789,214、和5,804,693。可以在導(dǎo)入細(xì)胞中之前純化化學(xué)合成或通過體外酶促合成合成的rna分子。例如，可以通過用溶劑或樹脂提取、沉淀、電泳、色譜法、或其組合從混合物純化rna分子?；蛘?，可以在不純化或最小程度純化的情況下使用化學(xué)合成或通過體外酶促合成而合成的rna分子，例如，以避免由于樣品加工所致的損失?？梢詫na分子干燥貯存或溶解在水溶液中。溶液可以含有緩沖劑或鹽以促進(jìn)dsrna分子雙鏈體鏈的退火和/或穩(wěn)定化。在實(shí)施方案中，可以通過單一自身互補(bǔ)的rna鏈或者從兩條互補(bǔ)rna鏈形成dsrna分子。dsrna分子可以在體內(nèi)或在體外合成。細(xì)胞的內(nèi)源rna聚合酶可以在體內(nèi)介導(dǎo)一條或兩條rna鏈的轉(zhuǎn)錄，或者可以使用克隆的rna聚合酶在體內(nèi)或在體外介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。通過宿主器官、組織、或細(xì)胞類型中的特異性轉(zhuǎn)錄(例如，通過使用組織特異性啟動(dòng)子進(jìn)行)；刺激宿主中的環(huán)境條件(例如，通過使用響應(yīng)于感染、脅迫、溫度、和/或化學(xué)誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)；和/或在宿主的某個(gè)發(fā)育階段或年齡人工造成轉(zhuǎn)錄(例如，通過使用發(fā)育階段特異性啟動(dòng)子)，在昆蟲害蟲中靶基因的轉(zhuǎn)錄后抑制可以是宿主靶向性的。形成dsrna分子的rna鏈(不論是體外還是體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的)可以也可以不是多聚腺苷酸化的，并且可以能夠也可以不能被細(xì)胞翻譯機(jī)制翻譯成多肽。d.重組載體和宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了用于導(dǎo)入細(xì)胞(例如，細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、或植物細(xì)胞)中的dna分子，其中dna分子包含這樣的多核苷酸，該多核苷酸在表達(dá)為rna并被昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲攝取后，可實(shí)現(xiàn)對(duì)害蟲的細(xì)胞、組織或器官中靶基因的阻抑。因此，一些實(shí)施方案提供了重組核酸分子，其包含能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)為irna(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)分子以抑制昆蟲害蟲中靶基因表達(dá)的多核苷酸。為了啟動(dòng)或增強(qiáng)表達(dá)，這樣的重組核酸分子可以包含一種或多種調(diào)節(jié)元件，所述調(diào)節(jié)元件可以與能夠表達(dá)為irna的多核苷酸可操作連接。在植物中表達(dá)基因阻抑分子的方法是已知的，并且可以用于表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。參見，例如，國(guó)際pct公開號(hào)wo06/073727；和美國(guó)專利公開號(hào)2006/0200878a1)。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組dna分子可以包含編碼可形成dsrna分子的rna的多核苷酸。這樣的重組dna分子可以編碼可形成dsrna分子的rna，其被攝取后能夠抑制昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲細(xì)胞中內(nèi)源靶基因的表達(dá)。在許多實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄的rna可以形成dsrna分子，所述dsrna分子可以以穩(wěn)定化形式提供；例如，以發(fā)夾和莖和環(huán)結(jié)構(gòu)的形式提供。在某些實(shí)施方案中，dsrna分子的一條鏈可以通過從與下述任意多核苷酸基本上同源的多核苷酸轉(zhuǎn)錄而形成：seqidno:1；seqidno:1的互補(bǔ)物；seqidno:1的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:1的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物；葉甲屬生物(例如wcr)的包含seqidno:1的天然編碼序列；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼序列的互補(bǔ)物；葉甲屬生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列；葉甲屬生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的互補(bǔ)物；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物；葉甲屬生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；和葉甲屬生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物。在其他實(shí)施方案中，dsrna分子的一條鏈可以通過從與下述選自下組的多核苷酸基本上同源的多核苷酸轉(zhuǎn)錄而形成：seqidno:87；seqidno:87的互補(bǔ)物；seqidno:87的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:87的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物；半翅目生物的包含seqidno:87的天然編碼序列；半翅目生物的包含seqidno:87的天然編碼序列的互補(bǔ)物；半翅目生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:87的天然rna分子的天然非編碼序列；半翅目生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:87的天然rna分子的天然非編碼序列的互補(bǔ)物；半翅目生物的包含seqidno:87的天然編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；半翅目生物的包含seqidno:87的天然編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物；半翅目生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:87的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；和半翅目生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:87的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物。在特定的實(shí)施方案中，編碼可形成dsrna分子的重組dna分子可包含編碼區(qū)，其中至少兩個(gè)多核苷酸如此排列，使得相對(duì)于至少一個(gè)啟動(dòng)子，一個(gè)多核苷酸處于有義取向，另一多核苷酸處于反義取向，其中該有義多核苷酸和該反義多核苷酸通過間隔物連接或聯(lián)接，所述間隔物具有，例如，約5個(gè)(～5)至約一千個(gè)(～1000)核苷酸。間隔物可以在有義和反義多核苷酸之間形成環(huán)。有義多核苷酸或反義多核苷酸可以與靶基因(例如，包含seqidno：1或seqidno:87的基因)或其片段基本上同源。然而，在一些實(shí)施方案中，重組dna分子可以編碼可以形成沒有間隔物的dsrna分子的rna。在實(shí)施方案中，有義編碼多核苷酸和反義編碼多核苷酸可以是不同的長(zhǎng)度。通過在本發(fā)明的重組核酸分子中創(chuàng)建適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)盒，可以容易地將鑒定為對(duì)昆蟲害蟲具有有害影響或者針對(duì)該害蟲的植物保護(hù)效果的多核苷酸摻入表達(dá)的dsrna分子中。例如，可以通過如下步驟將這樣的多核苷酸表達(dá)為具有莖和環(huán)結(jié)構(gòu)的發(fā)夾：采用對(duì)應(yīng)于靶基因多核苷酸(例如，seqidno:1或seqidno:87，或其片段)的第一區(qū)段；將此多核苷酸與第二區(qū)段間隔物區(qū)連接，所述第二區(qū)段間隔物區(qū)與第一區(qū)段不是同源或互補(bǔ)的；并將這與第三區(qū)段連接，其中第三區(qū)段的至少一部分與第一區(qū)段基本上互補(bǔ)。這樣的構(gòu)建體通過第一區(qū)段與第三區(qū)段的分子內(nèi)堿基配對(duì)而形成莖和環(huán)結(jié)構(gòu)，其中環(huán)結(jié)構(gòu)形式包含第二區(qū)段。參見，例如，美國(guó)專利公開文本2002/0048814和2003/0018993；以及國(guó)際pct公開文本wo94/01550和wo98/05770?？梢岳缫噪p鏈結(jié)構(gòu)諸如莖環(huán)結(jié)構(gòu)(例如，發(fā)夾)形式生成dsrna分子，由此通過共表達(dá)靶基因的片段(例如在另外的植物表達(dá)盒上的靶基因的片段)增強(qiáng)靶向天然鞘翅目和/或半翅目害蟲序列的sirna的產(chǎn)生，這可導(dǎo)致sirna產(chǎn)生增強(qiáng)，或者降低甲基化以防止dsrna發(fā)夾啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄基因沉默。本發(fā)明的實(shí)施方案包括將本發(fā)明的重組核酸分子導(dǎo)入植物中(即，轉(zhuǎn)化)以實(shí)現(xiàn)一種或多種irna分子的昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲抑制水平的表達(dá)。重組dna分子可以例如是載體，如線性或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體系統(tǒng)可以是單一載體或質(zhì)粒，或者共同含有要導(dǎo)入宿主基因組中的總dna的兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒。另外，載體可以是表達(dá)載體。可以例如將本發(fā)明的核酸適當(dāng)?shù)夭迦胼d體中，在一種或多種宿主中發(fā)揮功能以驅(qū)動(dòng)連接的編碼多核苷酸或其他dna元件表達(dá)的合適啟動(dòng)子控制下。許多載體可用于此目的，適當(dāng)載體的選擇主要將取決于要插入載體中的核酸的大小和要用載體轉(zhuǎn)化的特定宿主細(xì)胞。每種載體含有不同的組分，根據(jù)其功能(例如，dna擴(kuò)增或dna表達(dá))及與其相容的特定宿主細(xì)胞而定。為了對(duì)轉(zhuǎn)基因植物賦予對(duì)昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的保護(hù)，例如可以在重組植物的組織或流體內(nèi)將重組dna轉(zhuǎn)錄成irna分子(例如，形成dsrna分子的rna分子)。irna分子可包含與可引起宿主植物物種損害的害蟲內(nèi)的相應(yīng)轉(zhuǎn)錄多核苷酸基本上同源且可特異性雜交的多核苷酸。例如，害蟲可以通過攝取包含irna分子的轉(zhuǎn)基因宿主植物的細(xì)胞或流體而接觸在轉(zhuǎn)基因宿主植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的irna分子。因此，在特定實(shí)例中，靶基因的表達(dá)在侵染轉(zhuǎn)基因宿主植物的鞘翅目和/或半翅目害蟲內(nèi)受到irna分子阻抑。在一些實(shí)施方案中，對(duì)靶鞘翅目和/或半翅目害蟲中靶基因表達(dá)的阻抑可以導(dǎo)致植物被保護(hù)免遭害蟲攻擊。為了使irna分子能夠被投送給與已經(jīng)用本發(fā)明的重組核酸分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞存在營(yíng)養(yǎng)關(guān)系的害蟲，需要在植物細(xì)胞中表達(dá)(即，轉(zhuǎn)錄)irna分子。因此，重組核酸分子可以包含與一種或多種調(diào)節(jié)元件(諸如在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的異源啟動(dòng)子元件)可操作連接的本發(fā)明的多核苷酸，所述宿主細(xì)胞諸如其中要擴(kuò)增核酸分子的細(xì)菌細(xì)胞，或其中要表達(dá)核酸分子的植物細(xì)胞。適合于用于本發(fā)明的核酸分子的啟動(dòng)子包括誘導(dǎo)型、病毒的、合成的、或組成型的那些啟動(dòng)子，它們都是本領(lǐng)域中熟知的。描述這樣的啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括美國(guó)專利6,437,217(玉米rs81啟動(dòng)子)；5,641,876(水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)；6,426,446(玉米rs324啟動(dòng)子)；6,429,362(玉米pr-1啟動(dòng)子)；6,232,526(玉米a3啟動(dòng)子)；6,177,611(組成型玉米啟動(dòng)子)；5,322,938、5,352,605、5,359,142、和5,530,196(camv35s啟動(dòng)子)；6,433,252(玉米l3油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子)；6,429,357(水稻肌動(dòng)蛋白2啟動(dòng)子和稻肌動(dòng)蛋白2內(nèi)含子)；6,294,714(光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)；6,140,078(鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)；6,252,138(病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)；6,175,060(磷缺乏誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)；6,388,170(雙向啟動(dòng)子)；6,635,806(γ薏苡辛(coixin)啟動(dòng)子)；及美國(guó)專利公開號(hào)2009/757,089(玉米葉綠體醛縮酶啟動(dòng)子)。其他啟動(dòng)子包括膽脂堿合酶(nos)啟動(dòng)子(ebert等人，(1987)proc.natl.acad.sci.usa84(16):5745-9)和章魚堿合酶(ocs)啟動(dòng)子(兩者都在根癌土壤桿菌的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒上攜帶)；花椰菜花葉病毒組(caulimovirus)啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(camv)19s啟動(dòng)子(lawton等人，(1987)plantmol.biol.9:315-24)；camv35s啟動(dòng)子(odell等人，(1985)nature313:810-2；玄參花葉病毒35s啟動(dòng)子(walker等人，(1987)proc.natl.acad.sci.usa84(19):6624-8)；蔗糖合酶啟動(dòng)子(yang和russell(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:4144-8)；r基因復(fù)合物啟動(dòng)子(chandler等人，(1989)plantcell1:1175-83)；葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子；camv35s(美國(guó)專利5,322,938、5,352,605、5,359,142、和5,530,196)；fmv35s(美國(guó)專利6,051,753和5,378,619)；pclsv啟動(dòng)子(美國(guó)專利5,850,019)；scp1啟動(dòng)子(美國(guó)專利6,677,503)；和agrtu.nos啟動(dòng)子(genbanktm登錄號(hào)v00087；depicker等人，(1982)j.mol.appl.genet.1:561-573；bevan等人，(1983)nature304:184-7)。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含組織特異性啟動(dòng)子，如根特異性啟動(dòng)子。根特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)專門或優(yōu)先在根組織中表達(dá)可操作連接的編碼多核苷酸。根特異性啟動(dòng)子的實(shí)例是本領(lǐng)域中已知的。參見，例如，美國(guó)專利5,110,732；5,459,252和5,837,848；opperman等人，(1994)science263:221-3；和hirel等人，(1992)plantmol.biol.20:207-18。在一些實(shí)施方案中，可以在兩個(gè)根特異性啟動(dòng)子之間克隆依照本發(fā)明的用于鞘翅目和/或半翅目害蟲控制的多核苷酸或片段，所述根特異性啟動(dòng)子相對(duì)于所述多核苷酸或片段以相反的轉(zhuǎn)錄方向排布，在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中可操作，并且在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中表達(dá)以在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中產(chǎn)生rna分子，rna分子隨后可形成dsrna分子，如上文所述。昆蟲害蟲可以攝取植物組織中表達(dá)的irna分子，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的阻抑。其他可任選地與核酸可操作連接的調(diào)節(jié)元件包括5'utr，5'utr作為位于啟動(dòng)子元件和編碼多核苷酸之間的翻譯前導(dǎo)元件發(fā)揮功能。翻譯前導(dǎo)元件存在于完全加工的mrna中，并且其可以影響初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的加工和/或rna的穩(wěn)定性。翻譯前導(dǎo)元件的例子包括玉米和矮牽牛熱休克蛋白前導(dǎo)物(美國(guó)專利no.5,362,865)、植物病毒外殼蛋白前導(dǎo)序列、植物rubisco前導(dǎo)序列等。參見，例如，turner和foster(1995)molecularbiotech.3(3):225-36。5'utr的非限制性實(shí)例包括gmhsp(美國(guó)專利no.5,659,122)；phdnak(美國(guó)專利5,362,865)；atant1；tev(carrington和freed(1990)j.virol.64:1590-7)；和agrtunos(genbanktm登錄號(hào)v00087；和bevan等人，(1983)nature304:184-7)。其他任選地與核酸可操作連接的調(diào)節(jié)元件還包括3'非翻譯元件、3'轉(zhuǎn)錄終止區(qū)、或多腺苷酸化區(qū)。這些是位于多核苷酸下游的遺傳元件，并且包括提供多腺苷酸化信號(hào)的多核苷酸、和/或能夠影響轉(zhuǎn)錄或mrna加工的其他調(diào)節(jié)信號(hào)。多腺苷酸化信號(hào)在植物中發(fā)揮功能，導(dǎo)致多腺苷酸化的核苷酸被添加至mrna前體的3'端。多腺苷酸化元件可以源自多種植物基因或t-dna基因。3'轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的一個(gè)非限制性實(shí)例是膽脂堿合酶3'區(qū)(nos3'；fraley等人，(1983)proc.natl.acad.sci.usa80:4803-7)。在ingelbrecht等人，(1989)plantcell1:671-80中提供了使用不同3'非翻譯區(qū)的實(shí)例。多腺苷酸化信號(hào)的非限制性實(shí)例包括來(lái)自豌豆rbcs2基因的信號(hào)(ps.rbcs2-e9；coruzzi等人，(1984)emboj.3:1671-9)和agrtu.nos(登錄號(hào)e01312)。一些實(shí)施方案可以包括植物轉(zhuǎn)化載體，該植物轉(zhuǎn)化載體包含分離純化的dna分子，該dna分子包含與本發(fā)明的一種或多種多核苷酸可操作連接的至少一種上文描述的調(diào)節(jié)元件。在表達(dá)時(shí)，一種或多種多核苷酸生成一種或多種包含多核苷酸的irna分子，所述多核苷酸與昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲中的天然rna分子的全部或部分特異性地互補(bǔ)。因此，多核苷酸可以包含編碼靶向的鞘翅目和/或半翅目害蟲rna轉(zhuǎn)錄物內(nèi)存在的多核糖核苷酸的全部或部分的區(qū)段，并且可以包含被靶向的害蟲轉(zhuǎn)錄物的全部或部分的反向重復(fù)。植物轉(zhuǎn)化載體可以含有與超過一種靶多核苷酸特異性互補(bǔ)的多核苷酸，由此容許產(chǎn)生超過一種dsrna以抑制靶害蟲的一個(gè)或多個(gè)群體或物種的細(xì)胞中兩種或更多種基因的表達(dá)?？梢詫⑴c不同基因中存在的多核苷酸特異性互補(bǔ)的多核苷酸區(qū)段組合成單一復(fù)合核酸分子，以便在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。這樣的區(qū)段可以是連續(xù)的或者由間隔物分開。在一些實(shí)施方案中，可以通過在同一質(zhì)粒中依次插入另外的多核苷酸來(lái)修飾已經(jīng)含有本發(fā)明的至少一個(gè)多核苷酸的本發(fā)明質(zhì)粒，其中所述另外的多核苷酸與原有的至少一個(gè)多核苷酸可操作連接于相同的調(diào)節(jié)元件。在一些實(shí)施方案中，核酸分子可以設(shè)計(jì)為抑制多種靶基因。在一些實(shí)施方案中，要抑制的多種基因可以獲自相同的昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲物種，這樣做可以增強(qiáng)核酸分子的有效性。在其他實(shí)施方案中，基因可以來(lái)自不同的昆蟲害蟲，這樣可以拓寬藥劑有效的害蟲的范圍。當(dāng)靶向多種基因以實(shí)現(xiàn)阻抑、或表達(dá)和阻抑的組合時(shí)，可以工程化多順反子dna元件。本發(fā)明的重組核酸分子或載體可以包含賦予轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，諸如植物細(xì)胞可選擇表型的選擇標(biāo)志物。也可以使用選擇標(biāo)志物來(lái)選擇包含本發(fā)明的重組核酸分子的植物或植物細(xì)胞。標(biāo)志物可以編碼殺生物劑抗性、抗生素抗性(例如，卡那霉素、遺傳霉素(g418)、博來(lái)霉素、潮霉素，等等)、或除草劑耐性(例如，草甘膦等)。選擇標(biāo)志物的實(shí)例包括但不限于編碼卡那霉素抗性并且可以使用卡那霉素、g418等選擇的neo基因；編碼雙丙氨磷抗性的bar基因；編碼草甘膦耐性的突變體epsp合酶基因；賦予對(duì)溴苯腈的抗性的腈水解酶基因；賦予咪唑啉酮或磺酰脲耐性的突變體乙酰乳酸合酶基因(als)；和甲氨蝶呤抗性dhfr基因?？捎枚喾N選擇標(biāo)志物，其賦予對(duì)氨芐青霉素、博來(lái)霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、膦絲菌素、嘌呤霉素、大觀霉素、利福平、鏈霉素和四環(huán)素等的抗性。這樣的選擇標(biāo)志物的實(shí)例展示于，例如美國(guó)專利5,550,318；5,633,435；5,780,708和6,118,047。本發(fā)明的重組核酸分子或載體還可以包含可篩選標(biāo)志物。可以使用可篩選標(biāo)志物來(lái)監(jiān)測(cè)表達(dá)。示例性篩選標(biāo)志物包括β-葡糖醛酸糖苷酶或uida基因(gus)，其編碼已知的多種生色底物的酶(jefferson等人，(1987)plantmol.biol.rep.5:387-405)；r基因座基因，其編碼調(diào)節(jié)植物組織中花色素苷色素(紅色)產(chǎn)生的產(chǎn)物(dellaporta等人，(1988)"molecularcloningofthemaizer-njallelebytransposontaggingwithac."收錄于18thstadlergeneticssymposium,p.gustafson和r.appels編輯，(newyork:plenum),pp.263-82)；β-內(nèi)酰胺酶基因(sutcliffe等人，(1978)proc.natl.acad.sci.usa75:3737-41)；編碼已知多種生色底物的酶(例如，padac，一種生色頭孢菌素)的基因；螢光素酶基因(ow等人，(1986)science234:856-9)；xyle基因,其編碼能轉(zhuǎn)化生色兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶(zukowski等人，(1983)gene46(2-3):247-55)；淀粉酶基因(ikatu等人，(1990)bio/technol.8:241-2)；酪氨酸酶基因，其編碼能夠?qū)⒗野彼嵫趸癁閐opa和多巴醌(dopaquinone)(其繼而縮合成黑色素)的酶(katz等人，(1983)j.gen.microbiol.129:2703-14))；和α-半乳糖苷酶。在一些實(shí)施方案中，在用于創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因植物和在植物中表達(dá)異源核酸的方法中，可以使用如上文所描述的重組核酸分子來(lái)制備表現(xiàn)出對(duì)昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的易感性降低的轉(zhuǎn)基因植物。例如，可以通過將編碼irna分子的核酸分子插入植物轉(zhuǎn)化載體中，并將這些導(dǎo)入植物中來(lái)制備植物轉(zhuǎn)化載體。用于宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的適合方法包括任何能將dna導(dǎo)入細(xì)胞中的方法，如通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，美國(guó)專利5,508,184)，通過干燥/抑制介導(dǎo)的dna攝取(參見，例如，potrykus等人.(1985)mol.gen.genet.199:183-8)，通過電穿孔(參見，例如，美國(guó)專利5,384,253)，通過用碳化硅纖維攪拌(參見，例如，美國(guó)專利5,302,523和5,464,765)，通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(參見，例如，美國(guó)專利5,563,055；5,591,616；5,693,512；5,824,877；5,981,840；和6,384,301)，以及通過加速dna包被的顆粒(參見，例如，美國(guó)專利5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861、和6,403,865)，等。特別可用于轉(zhuǎn)化玉米的技術(shù)描述于例如美國(guó)專利7,060,876和5,591,616；以及國(guó)際pct公布wo95/06722中。通過應(yīng)用諸如此類的這些技術(shù)，幾乎任何物種的細(xì)胞都可被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化dna被整合到宿主細(xì)胞的基因組中。在多細(xì)胞物種的情況下，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可再生為轉(zhuǎn)基因生物。可以使用任何這些技術(shù)來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，例如在轉(zhuǎn)基因植物的基因組中包含編碼一種或多種irna分子的一種或多種核酸。用于將表達(dá)載體導(dǎo)入植物中的廣泛使用的方法是基于土壤桿菌的天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌是將植物細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化的植物致病性土壤細(xì)菌。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌的ti和ri質(zhì)粒分別攜帶負(fù)責(zé)植物遺傳轉(zhuǎn)化的基因。ti(誘導(dǎo)腫瘤)-質(zhì)粒含有被稱為t-dna的大片段，其被轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化的植物中。ti質(zhì)粒的另一個(gè)片段，vir區(qū)，負(fù)責(zé)t-dna的轉(zhuǎn)移。t-dna區(qū)的邊界為末端重復(fù)序列。在修飾的二元載體中，腫瘤誘導(dǎo)基因已缺失，vir區(qū)的功能用于轉(zhuǎn)移以t-dna邊界元件為界的外來(lái)dna。t區(qū)還可含有用于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和植物有效恢復(fù)的選擇標(biāo)志物、以及插入用于轉(zhuǎn)移諸如編碼核酸的dsrna之類多核苷酸的多克隆位點(diǎn)。因此，在一些實(shí)施方案中，植物轉(zhuǎn)化載體來(lái)源于根癌土壤桿菌的ti質(zhì)粒(參見，例如，美國(guó)專利4,536,475、4,693,977、4,886,937、和5,501,967；以及歐洲專利no.ep0122791)或發(fā)根土壤桿菌的ri質(zhì)粒。其他的植物轉(zhuǎn)化載體包括，例如但不限于，由herrera-estrella等人，(1983)nature303:209-13；bevan等人，(1983)nature304:184-7；klee等人，(1985)bio/technol.3:637-42；以及在歐洲專利no.ep0120516中所描述的那些載體，以及從任何前述文獻(xiàn)來(lái)源的那些載體?？梢孕揎椞烊坏嘏c植物相互作用的其他細(xì)菌，如中華根瘤菌屬、根瘤菌屬、和中慢生根瘤菌屬，以介導(dǎo)到許多各種各樣的植物中的基因轉(zhuǎn)移。通過獲取卸甲ti質(zhì)粒和適合的二元載體，可以使這些植物相關(guān)的共生細(xì)菌能夠勝任基因轉(zhuǎn)移。在提供外源dna到受體細(xì)胞的遞送之后，通常鑒定出轉(zhuǎn)化的細(xì)胞用于進(jìn)一步培養(yǎng)和植物再生。為了提高鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力，人們可能期望采用如前提出的選擇或篩選標(biāo)志物基因，與用來(lái)再生轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)化載體一道使用。在采用選擇標(biāo)志物的情況下，通過使細(xì)胞暴露于選擇劑或藥劑，鑒定出在潛在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在采用篩選標(biāo)志物的情況下，可針對(duì)期望的標(biāo)志物基因性狀來(lái)篩選細(xì)胞。暴露于選擇劑后存活的細(xì)胞、或者在篩選測(cè)定中已被評(píng)分為陽(yáng)性的細(xì)胞，可以在支持植物再生的介質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，可通過包含其他物質(zhì)，如生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑來(lái)改良任何適合的植物組織培養(yǎng)基(例如，ms和n6培養(yǎng)基)?？蓪⒔M織維持在具有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的基本培養(yǎng)基上，直到可得到足夠的組織用于啟動(dòng)植物再生工作時(shí)為止，或者在重復(fù)多輪的手動(dòng)選擇之后，直到組織形態(tài)適合于再生時(shí)為止(例如，至少2周)，然后轉(zhuǎn)移到有助于芽形成的介質(zhì)中。定期轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物，直到已經(jīng)出現(xiàn)充分的芽形成時(shí)為止。一旦形成芽，將它們轉(zhuǎn)移到有助于根形成的介質(zhì)中。一旦形成足夠的根，可將植物轉(zhuǎn)移到土壤中，以便進(jìn)一步生長(zhǎng)和成熟。為了證實(shí)再生植物中感興趣核酸分子(例如，編碼一種或多種irna分子的dna，所述irna分子抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中的靶基因表達(dá))的存在，可以進(jìn)行多種測(cè)定法。這樣的測(cè)定法例如包括：分子生物學(xué)測(cè)定，如southern和northern印跡、pcr、和核酸測(cè)序；生物化學(xué)測(cè)定，如檢測(cè)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的存在，例如通過免疫學(xué)手段(elisa和/或western印跡)或借助于酶功能；植物部分測(cè)定，如葉或根測(cè)定；和再生的全植物的表型分析?？衫缤ㄟ^使用對(duì)感興趣核酸分子特異的寡核苷酸引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增來(lái)分析整合事件。pcr基因分型應(yīng)當(dāng)理解為包括但不限于，來(lái)源于分離的宿主植物愈傷組織的gdna的聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)擴(kuò)增，所述愈傷組織預(yù)期含有整合到基因組中的感興趣核酸分子，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)克隆和pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析。pcr基因分型方法已被很好地描述(例如rios,g等人，(2002)plantj.32:243-53)，并可應(yīng)用于來(lái)源于任何植物物種(例如，玉米或大豆)或組織類型(包括細(xì)胞培養(yǎng)物)的gdna。采用依賴于土壤桿菌的轉(zhuǎn)化方法形成的轉(zhuǎn)基因植物一般含有插入一個(gè)染色體中的單個(gè)重組dna。該單個(gè)重組dna的多核苷酸被稱為“轉(zhuǎn)基因事件”或“整合事件”。這樣的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于插入的外源多核苷酸而言是雜合的。在一些實(shí)施方案中，通過含有單個(gè)外源基因的獨(dú)立分離的轉(zhuǎn)基因植物與自身(例如t0植物)有性交配(自交)以產(chǎn)生tl種子，可獲得相對(duì)于轉(zhuǎn)基因?yàn)榧兒系霓D(zhuǎn)基因植物。所產(chǎn)生的tl種子的四分之一相對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的。萌發(fā)tl種子產(chǎn)生的植物可用于測(cè)試雜合性，所述測(cè)試一般使用snp測(cè)定或熱擴(kuò)增測(cè)定，使得允許在雜合子和純合子之間進(jìn)行區(qū)分(即，接合型測(cè)定)。在特定的實(shí)施方案中，在植物細(xì)胞中產(chǎn)生具有昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲-抑制效果的至少2、3、4、5、6、7、8、9種或10種或更多種不同irna分子?？梢詮囊氩煌D(zhuǎn)化事件中的多種核酸、或從引入單一轉(zhuǎn)化事件中的單一核酸表達(dá)irna分子(例如，dsrna分子)。在一些實(shí)施方案中，在單一啟動(dòng)子的控制下表達(dá)多個(gè)irna分子。在其他實(shí)施方案中，在多個(gè)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)多個(gè)irna分子。可以表達(dá)包含多個(gè)多核苷酸的單一irna分子，所述多核苷酸各自與在相同昆蟲害蟲物種的不同群體中或在不同的昆蟲害蟲物種中的一個(gè)或多個(gè)昆蟲害蟲內(nèi)的不同基因座(例如由seqidno:1或seqidno:87定義的基因座)同源。除了用重組核酸分子直接轉(zhuǎn)化植物之外，可通過使具有至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因事件的第一植物與缺乏這種事件的第二植物雜交來(lái)制造轉(zhuǎn)基因植物。例如，可將包含編碼irna分子的多核苷酸的重組核酸分子導(dǎo)入易于轉(zhuǎn)化的第一植物品系中而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物可與第二植物品系雜交而使編碼irna分子的多核苷酸滲入到第二植物品系中。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的一種或多種序列的商業(yè)產(chǎn)品。具體的實(shí)施方案包括自含有本發(fā)明一種或多種核苷酸序列的重組植物或種子產(chǎn)生的商業(yè)產(chǎn)品。包含本發(fā)明的一種或多種序列的商業(yè)產(chǎn)品意在包括，但不限于：植物的粕、油類、碾碎的或完整的籽?；蚍N子，或包含含有本發(fā)明的一種或多種序列的重組植物或種子的任何粕、油、或碾碎的或完整的籽粒的任何食物產(chǎn)品或動(dòng)物飼料產(chǎn)品。在一種或多種商品或商業(yè)產(chǎn)品中的檢出本發(fā)明的一種或多種序列，事實(shí)上證明該商品或商業(yè)產(chǎn)品是由為了利用dsrna介導(dǎo)的基因阻遏方法來(lái)控制鞘翅目和/或半翅目植物害蟲的目的而設(shè)計(jì)為表達(dá)本發(fā)明的一種或多種序列的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的。在一些方面，包括由自轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞衍生的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子和商業(yè)產(chǎn)品，其中種子或商業(yè)產(chǎn)品包含可檢出量的本發(fā)明的核酸。在一些實(shí)施方案中，例如，可以通過獲得轉(zhuǎn)基因植物并從它們制備食物或飼料來(lái)生產(chǎn)這樣的商業(yè)產(chǎn)品。包含本發(fā)明的一種或多種多核苷酸的商業(yè)產(chǎn)品包括例如但不限于：植物的粕、油類、碾碎的或完整的籽粒或種子，和包含含有本發(fā)明的一種或多種核酸的重組植物或種子的任何粕、油、或碾碎的或完整的籽粒的任何食物產(chǎn)品。在一種或多種商品或商業(yè)產(chǎn)品中的檢出本發(fā)明的一種或多種核酸，事實(shí)上證明該商品或商業(yè)產(chǎn)品是由為了控制昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的目的，設(shè)計(jì)為表達(dá)本發(fā)明的一種或多種irna分子的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的。在一些實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物或種子也可在其基因組中包含至少一個(gè)其他的轉(zhuǎn)基因事件，包括但不限于：自其轉(zhuǎn)錄靶向昆蟲害蟲中與由seqidno:1或seqidno:87定義者不同的基因座的irna分子的轉(zhuǎn)基因事件，所述不同的基因座舉例而言可為選自下組的一個(gè)或多個(gè)基因座：caf1-180(美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2012/0174258)、vatpasec(美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2012/0174259)、rho1(美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2012/0174260)、vatpaseh(美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2012/0198586)、ppi-87b(美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2013/0091600)、rpa70(美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2013/0091601)、和rps6(美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2013/0097730)；自其轉(zhuǎn)錄靶向與鞘翅目和/或半翅目害蟲不同的生物(例如，植物寄生性線蟲)中的基因的irna分子的轉(zhuǎn)基因事件；編碼殺蟲蛋白(例如，蘇云金芽孢桿菌、產(chǎn)堿桿菌屬(例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2014/0033361)、或假單胞菌屬(例如pct申請(qǐng)公開號(hào)wo2015038734)殺蟲蛋白)的基因；除草劑耐性基因(例如提供對(duì)草甘膦耐性的基因)；以及促成轉(zhuǎn)基因植物中的期望表型的基因，所述期望表型例如產(chǎn)量增加、脂肪酸代謝改變、或細(xì)胞質(zhì)雄性不育的恢復(fù)。在特定的實(shí)施方案中，可以在植物中將編碼本發(fā)明irna分子的多核苷酸與其他昆蟲控制和疾病性狀組合以實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的植物疾病和昆蟲損害的期望性狀。例如，由于對(duì)所述性狀的抗性的概率在田間將發(fā)生降低，組合采用獨(dú)特作用模式的昆蟲控制性狀可以對(duì)受保護(hù)的轉(zhuǎn)基因植物提供優(yōu)越的持久性，該持久性優(yōu)于含有單一控制性狀的植物。v.鞘翅目和/或半翅目害蟲中的靶基因阻抑a.概述在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可以對(duì)鞘翅目和/或半翅目害蟲提供至少一種可用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲的核酸分子，其中所述核酸分子在害蟲中導(dǎo)致rnai介導(dǎo)的基因沉默。在特定的實(shí)施方案中，可以對(duì)鞘翅目和/或半翅目宿主提供irna分子(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)。在一些實(shí)施方案中，可以通過使核酸分子與害蟲接觸來(lái)對(duì)害蟲提供可用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲的核酸分子。在這些和另外的實(shí)施方案中，可以在害蟲的進(jìn)食基質(zhì)，例如營(yíng)養(yǎng)組合物中提供可用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲的核酸分子。在這些和另外的實(shí)施方案中，可以通過攝取被害蟲攝取的包含核酸分子的植物材料來(lái)提供可用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲的核酸分子。在某些實(shí)施方案中，核酸分子通過表達(dá)導(dǎo)入植物材料中的重組核酸而存在于植物材料中，所述導(dǎo)入例如通過用包含重組核酸的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物材料或全植物來(lái)進(jìn)行。b.rna介導(dǎo)的靶基因阻抑在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了irna分子(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)，可以設(shè)計(jì)此類分子使之靶向昆蟲害蟲(例如，鞘翅目(例如wcr或ncr)或半翅目(例如bsb)害蟲)的轉(zhuǎn)錄組中的必需天然多核苷酸(例如，必需基因)，例如設(shè)計(jì)有至少一條鏈包含與靶多核苷酸特異性互補(bǔ)的多核苷酸的irna分子。如此設(shè)計(jì)的irna分子的序列可以與靶多核苷酸相同，或者可以含有不會(huì)阻止irna分子與其靶多核苷酸之間的特異性雜交的錯(cuò)配。本發(fā)明的irna分子可以在用于昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲中基因阻抑的方法中使用，由此降低由害蟲對(duì)植物(例如，包含irna分子的受保護(hù)的轉(zhuǎn)化植物)引起的損害水平或發(fā)生率。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“基因阻抑”是指用于降低由于基因轉(zhuǎn)錄成mrna及隨后mrna翻譯而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水平，包括降低基因或編碼多核苷酸的蛋白質(zhì)表達(dá)，包括任何公知的轉(zhuǎn)錄后抑制表達(dá)和轉(zhuǎn)錄阻抑表達(dá)的方法。通過從靶向阻抑的基因轉(zhuǎn)錄的mrna的全部或部分與用于阻抑的相應(yīng)irna分子之間的特異性同源性而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后抑制。另外，轉(zhuǎn)錄后抑制是指通過核糖體結(jié)合的細(xì)胞中可用的mrna量的實(shí)質(zhì)性且可測(cè)量的降低。在其中rnai分子是dsrna分子的實(shí)施方案中，切丁酶這種酶可以將dsrna分子切割成短sirna分子(大約20個(gè)核苷酸長(zhǎng))。借助于切丁酶對(duì)dsrna分子的活性而生成的雙鏈sirna分子可以分成兩個(gè)單鏈sirna：“乘客鏈”和“引導(dǎo)鏈”。乘客鏈可以被降解，而引導(dǎo)鏈可以摻入risc中。通過引導(dǎo)鏈與mrna分子的特異性互補(bǔ)多核苷酸的特異性雜交，隨后通過酶argonaute(risc復(fù)合物的催化組分)切割而發(fā)生轉(zhuǎn)錄后抑制。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以使用任何形式的irna分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解的是，在制備過程中及在對(duì)細(xì)胞提供irna分子的步驟過程中，dsrna分子一般比單鏈rna分子更穩(wěn)定，并且一般在細(xì)胞中也是更穩(wěn)定的。因此，例如，雖然在一些實(shí)施方案中sirna和mirna分子可能是同等有效的，但是dsrna分子可以由于其穩(wěn)定性而被選用。在特定的實(shí)施方案中，提供了包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸可以在體外表達(dá)以產(chǎn)生irna分子，所述irna分子與由昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲基因組內(nèi)的多核苷酸編碼的核酸分子基本上同源。在某些實(shí)施方案中，體外轉(zhuǎn)錄的irna分子可以是包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定化的dsrna分子。在昆蟲害蟲接觸體外轉(zhuǎn)錄的irna分子后，可以發(fā)生對(duì)該昆蟲害蟲中靶基因(例如，必需基因)的轉(zhuǎn)錄后抑制。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在用于對(duì)昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲中靶基因的轉(zhuǎn)錄后抑制的方法中利用包含多核苷酸的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸(例如至少19個(gè)連續(xù)核苷酸)的核酸分子的表達(dá)，其中所述多核苷酸選自下組：seqidno:1；seqidno:1的互補(bǔ)物；seqidno:1的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:1的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸；自葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸表達(dá)的rna的互補(bǔ)物；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸；自葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸表達(dá)的rna的互補(bǔ)物；自葉甲屬生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列表達(dá)的rna的互補(bǔ)物；葉甲屬生物(例如wcr)的包含seqidno:1的天然編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物；葉甲屬生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；和葉甲屬生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物。在某些實(shí)施方案中，可以使用與前述任一項(xiàng)至少約80％相同(例如，79％，約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％、和100％)的核酸分子的表達(dá)。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，在用于轉(zhuǎn)錄后抑制半翅目害蟲中的靶基因的方法中利用包含核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸分子的表達(dá)，其中所述核苷酸序列選自下組：seqidno:87；seqidno:87的互補(bǔ)物；seqidno:87的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:87的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物；半翅目生物的包含seqidno:87的天然編碼序列；半翅目生物的包含seqidno:87的天然編碼序列的互補(bǔ)物；半翅目生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:87的天然rna分子的天然非編碼序列；半翅目生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:87的天然rna分子的天然非編碼序列的互補(bǔ)物；半翅目生物的包含seqidno:87的天然編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；半翅目生物的包含seqidno:87的天然編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物；半翅目生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:87的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；和半翅目生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:87的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物。在某些實(shí)施方案中，可以使用與前述任一項(xiàng)至少約80％相同(例如，80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％、和100％)的核酸分子的表達(dá)。在這些實(shí)施方案和進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以表達(dá)這樣的核酸分子，其與昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的至少一個(gè)細(xì)胞中存在的rna分子特異性雜交。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，在用于轉(zhuǎn)錄后抑制鞘翅目害蟲中的靶基因的方法中可以利用包含核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸分子的表達(dá)，其中所述核苷酸序列選自下組：seqidno:1；seqidno:1的互補(bǔ)物；seqidno:1的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:1的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物；葉甲屬生物(例如wcr)的包含seqidno:1的天然編碼序列；葉甲屬生物(例如wcr)的包含seqidno:1的天然編碼序列的互補(bǔ)物；葉甲屬生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列；葉甲屬生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的互補(bǔ)物；葉甲屬生物(例如wcr)的包含seqidno:1的天然編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物；葉甲屬生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；和葉甲屬生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物。在某些實(shí)施方案中，可以使用與前述任一項(xiàng)至少約80％相同(例如，80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％、和100％)的核酸分子的表達(dá)。在這些實(shí)施方案和進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以表達(dá)這樣的核酸分子，其與鞘翅目害蟲的至少一個(gè)細(xì)胞中存在的rna分子特異性雜交。在具體的實(shí)例中，這樣的核酸分子可包含包含seqidno:1的核苷酸序列。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，在用于轉(zhuǎn)錄后抑制半翅目害蟲中的靶基因的方法中利用包含核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸分子的表達(dá)，其中所述核苷酸序列選自下組：seqidno:87；seqidno:87的互補(bǔ)物；seqidno:87的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:87的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物；半翅目生物的包含seqidno:87的天然編碼序列；半翅目生物的包含seqidno:87的天然編碼序列的互補(bǔ)物；半翅目生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:87的天然rna分子的天然非編碼序列；半翅目生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:87的天然rna分子的天然非編碼序列的互補(bǔ)物；半翅目生物的包含seqidno:87的天然編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；半翅目生物的包含seqidno:87的天然編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物；半翅目生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:87的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；和半翅目生物的轉(zhuǎn)錄為包含seqidno:87的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物。在某些實(shí)施方案中，可以使用與前述任一項(xiàng)至少約80％相同(例如，80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％、和100％)的核酸分子的表達(dá)。在這些實(shí)施方案和進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以表達(dá)這樣的核酸分子，其與半翅目害蟲的至少一個(gè)細(xì)胞中存在的rna分子特異性雜交。在具體的實(shí)例中，這樣的核酸分子可包含包含seqidno:87的核苷酸序列。本發(fā)明的一些實(shí)施方案的重要特征在于，rnai轉(zhuǎn)錄后抑制系統(tǒng)能夠容忍靶基因中預(yù)期由于遺傳突變、株系多態(tài)性、或進(jìn)化趨異而可能發(fā)生的序列變異。導(dǎo)入的核酸分子可以不必與靶基因的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或完全加工的mrna絕對(duì)同源，只要導(dǎo)入的核酸分子與靶基因的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或完全加工的mrna可特異性雜交即可。而且，相對(duì)于靶基因的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或完全加工的mrna，導(dǎo)入的核酸分子可以不必是全長(zhǎng)的。使用本文的irna技術(shù)抑制靶基因是序列特異性的；即，靶向與irna分子基本上同源的多核苷酸進(jìn)行遺傳抑制。在一些實(shí)施方案中，可以使用包含具有與靶基因的一部分相同的核苷酸序列的多核苷酸的rna分子進(jìn)行抑制。在這些和另外的實(shí)施方案中，可以使用包含相對(duì)于靶多核苷酸具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失和/或點(diǎn)突變的多核苷酸的rna分子。在特定的實(shí)施方案中，irna分子和靶基因的一部分可以共享例如至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％、至少約100％、和100％的序列同一性。或者，dsrna分子的雙鏈體區(qū)可以與靶基因轉(zhuǎn)錄物的一部分可特異性地雜交。在可特異性雜交的分子中，展現(xiàn)出較大同源性的小于全長(zhǎng)的多核苷酸可補(bǔ)償較長(zhǎng)的、同源性較低的多核苷酸。dsrna分子的雙鏈體區(qū)中與靶基因轉(zhuǎn)錄物的一部分相同的多核苷酸的長(zhǎng)度可以是至少約15、25、50、100、200、300、400、500個(gè)、或至少約1000個(gè)堿基。在一些實(shí)施方案中，可以使用大于20個(gè)到100個(gè)核苷酸的多核苷酸。在特定的實(shí)施方案中，可以使用大于約200個(gè)到300個(gè)核苷酸的多核苷酸。在特定的實(shí)施方案中，根據(jù)靶基因的大小，可以使用大于約500個(gè)到1000個(gè)核苷酸的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，可以將害蟲(例如鞘翅目或半翅目害蟲)中靶基因的表達(dá)在害蟲細(xì)胞內(nèi)抑制至少10％；至少33％；至少50％；或至少80％，使得發(fā)生顯著抑制。顯著抑制是指高于閾值的抑制，所述抑制導(dǎo)致可檢出的表型(例如，生長(zhǎng)停止、進(jìn)食停止、發(fā)育停止、和誘導(dǎo)性死亡，等等)，或與所抑制的靶基因?qū)?yīng)的rna和/或基因產(chǎn)物的可檢出降低。雖然在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在害蟲的基本上所有細(xì)胞中均發(fā)生抑制，但在其他實(shí)施方案中，僅在表達(dá)靶基因的細(xì)胞的一個(gè)子集中發(fā)生抑制。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄阻抑由細(xì)胞中展現(xiàn)出與啟動(dòng)子dna或其互補(bǔ)物的實(shí)質(zhì)性序列同一性的dsrna分子的存在所介導(dǎo)，從而產(chǎn)生所謂的“啟動(dòng)子反式阻抑”?；蜃枰挚梢栽诳梢詳z取或接觸此類dsrna分子的昆蟲害蟲中針對(duì)靶基因發(fā)揮效果，例如通過害蟲攝取或接觸含有dsrna分子的植物材料。在啟動(dòng)子反式阻抑中使用的dsrna分子可以特異性地設(shè)計(jì)為抑制或阻抑昆蟲害蟲細(xì)胞中一種或多種同源或互補(bǔ)多核苷酸的表達(dá)。美國(guó)專利5,107,065；5,759,829；5,283,184；和5,231,020中公開了通過反義或有義取向的rna進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因阻抑以調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中的基因表達(dá)。c.對(duì)昆蟲害蟲提供的irna分子的表達(dá)可以許多體外或體內(nèi)形式的任一種進(jìn)行表達(dá)用于在昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲中rnai介導(dǎo)的基因抑制的irna分子。然后，可以對(duì)害蟲提供irna分子，例如通過使irna分子與害蟲接觸，或通過引起害蟲攝取或以別的方式內(nèi)在化irna分子。一些實(shí)施方案包括鞘翅目和/或半翅目害蟲的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主植物、經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、和經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物的后代。經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物可以工程化改造為，例如，在異源啟動(dòng)子控制下表達(dá)一種或多種irna分子，以提供害蟲保護(hù)效果。因此，當(dāng)在昆蟲害蟲在進(jìn)食期間食用轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞時(shí)，害蟲可以攝取轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞中表達(dá)的irna分子。也可以將本發(fā)明的多核苷酸導(dǎo)入廣泛而多樣的原核和真核微生物宿主中以產(chǎn)生irna分子。術(shù)語(yǔ)“微生物”包括原核和真核物種，如細(xì)菌和真菌?；虮磉_(dá)的調(diào)變可以包括對(duì)此類表達(dá)的部分或完全阻抑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于阻抑昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲中基因表達(dá)的方法包括在害蟲宿主的組織中提供基因阻抑量的至少一種如本文中所描述的多核苷酸在轉(zhuǎn)錄后形成的dsrna分子，其至少一個(gè)區(qū)段與害蟲細(xì)胞內(nèi)的mrna互補(bǔ)。昆蟲害蟲所攝取的dsrna分子，包括其修飾的形式，如mirna、sirna、shrna、或hprna分子，可以與包含含有seqidno:1或seqidno:87的核苷酸序列的分子轉(zhuǎn)錄的rna分子至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或約100％相同。因此，提供了用于制備dsrna分子的分離的且基本上純化的核酸分子，包括但不限于非天然存在的多核苷酸和重組dna構(gòu)建體，其在導(dǎo)入昆蟲害蟲時(shí)阻抑或抑制其中的內(nèi)源編碼多核苷酸或靶編碼多核苷酸的表達(dá)。特定的實(shí)施方案提供了用于遞送irna分子以轉(zhuǎn)錄后抑制昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)植物害蟲中的一種或多種靶基因并控制該植物害蟲群體的遞送系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，所述遞送系統(tǒng)涉及包括對(duì)宿主轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或包含在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的rna分子的宿主細(xì)胞內(nèi)容物的攝取。在這些和另外的實(shí)施方案中，創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物，其含有可提供本發(fā)明的穩(wěn)定化dsrna分子的重組dna構(gòu)建體。包含編碼特定irna分子的核酸的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物可以如下產(chǎn)生：采用重組dna技術(shù)(這些基礎(chǔ)技術(shù)是本領(lǐng)域中熟知的)構(gòu)建包含編碼本發(fā)明的irna分子(例如，穩(wěn)定化的dsrna分子)的多核苷酸的植物轉(zhuǎn)化載體；以此轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物；并以此生成含有轉(zhuǎn)錄的irna分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物。為了對(duì)轉(zhuǎn)基因植物賦予針對(duì)昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的保護(hù)，可以例如將重組dna分子轉(zhuǎn)錄成irna分子，如dsrna分子、sirna分子、shrna分子、mirna分子、或hprna分子。在一些實(shí)施方案中，從重組dna分子轉(zhuǎn)錄的rna分子可以在重組植物的組織或流體內(nèi)形成dsrna分子。這樣的dsrna分子可以包含在多核苷酸的一部分中，所述多核苷酸與可侵染宿主植物的類型的昆蟲害蟲內(nèi)的dna轉(zhuǎn)錄的相應(yīng)多核苷酸相同。害蟲內(nèi)靶基因的表達(dá)被所述dsrna分子所阻抑，并且該害蟲中靶基因表達(dá)的阻抑導(dǎo)致該轉(zhuǎn)基因植物對(duì)該害蟲有抗性。已經(jīng)顯示dsrna分子的調(diào)控作用可適用于害蟲中表達(dá)的多種基因，包括例如負(fù)責(zé)細(xì)胞代謝或細(xì)胞轉(zhuǎn)化的內(nèi)源基因，包括管家基因；轉(zhuǎn)錄因子；蛻皮相關(guān)基因；和編碼涉及細(xì)胞代謝或正常生長(zhǎng)和發(fā)育的多肽的其他基因。為了從體內(nèi)轉(zhuǎn)基因或表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，可以在一些實(shí)施方案中使用調(diào)節(jié)區(qū)(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、和多聚腺苷酸化信號(hào))以轉(zhuǎn)錄一條或多條rna鏈。因此，在一些實(shí)施方案中，如上文提出的，在產(chǎn)生irna分子中使用的多核苷酸可以與在植物宿主細(xì)胞中有功能的一種或多種啟動(dòng)子元件可操作連接。啟動(dòng)子可以是通常駐留于宿主基因組中的內(nèi)源啟動(dòng)子。在可操作連接的啟動(dòng)子元件控制下的本發(fā)明的多核苷酸可以進(jìn)一步被其他有利地影響其轉(zhuǎn)錄和/或所得轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性的元件所側(cè)翼。這樣的元件可以位于可操作連接啟動(dòng)子的上游、表達(dá)構(gòu)建體3'端的下游、并且可以同時(shí)存在于啟動(dòng)子的上游和表達(dá)構(gòu)建體3'端的下游。一些實(shí)施方案提供了用于降低由以植物為食的昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲引起的對(duì)宿主植物(例如，玉米植物)的損害的方法，其中所述方法包括在宿主植物中提供表達(dá)本發(fā)明的至少一種核酸分子的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述核酸分子在被害蟲攝取后發(fā)揮功能以抑制該害蟲內(nèi)靶多核苷酸的表達(dá)，該表達(dá)抑制導(dǎo)致該害蟲的死亡和/或生長(zhǎng)降低，由此降低由該害蟲引起的對(duì)宿主植物的損害。在一些實(shí)施方案中，核酸分子包含dsrna分子。在這些和另外的實(shí)施方案中，核酸分子包含dsrna分子，所述dsrna分子各自包含超過一種與鞘翅目和/或半翅目害蟲細(xì)胞中表達(dá)的核酸分子可特異性地雜交的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，核酸分子由一種多核苷酸組成，所述多核苷酸與昆蟲害蟲細(xì)胞中表達(dá)的核酸分子可特異性地雜交。在一些實(shí)施方案中，提供了用于提高玉米作物產(chǎn)量的方法，其中所述方法包括將本發(fā)明的至少一種核酸分子導(dǎo)入玉米植物中；栽培玉米植物以容許表達(dá)包含核酸的irna分子，其中包含所述核酸的irna分子的表達(dá)可抑制昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲損害和/或生長(zhǎng)，由此降低或消除由于害蟲侵染所致的產(chǎn)量損失。在一些實(shí)施方案中，irna分子是dsrna分子。在這些和另外的實(shí)施方案中，核酸分子包含dsrna分子，所述dsrna分子各自包含超過一種與昆蟲害蟲細(xì)胞中表達(dá)的核酸分子特異性可雜交的多核苷酸。在一些實(shí)例中，所述核酸分子包含與鞘翅目和/或半翅目害蟲細(xì)胞中表達(dá)的核酸分子可特異性地雜交的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，提供了用于調(diào)變昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲中靶基因表達(dá)的方法，所述方法包括：用包含編碼本發(fā)明的至少一種irna分子的多核苷酸的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述多核苷酸與啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止元件可操作連接；在足以容許形成包含多個(gè)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的植物細(xì)胞培養(yǎng)物的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；選擇已經(jīng)將核酸分子整合到其基因組中的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；對(duì)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞篩選由整合的核酸分子編碼的irna分子的表達(dá)；選擇表達(dá)irna分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞；并且用選擇的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞喂養(yǎng)昆蟲害蟲。也可以從表達(dá)由整合的核酸分子編碼的irna分子的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生植物。在一些實(shí)施方案中，irna分子是dsrna分子。在這些和另外的實(shí)施方案中，核酸分子包含dsrna分子，所述dsrna分子各自包含超過一種與昆蟲害蟲細(xì)胞中表達(dá)的核酸分子可特異性地雜交的多核苷酸。在一些實(shí)例中，核酸分子包含與鞘翅目和/或半翅目害蟲細(xì)胞中表達(dá)的核酸分子可特異性地雜交的多核苷酸。可以將本發(fā)明的irna分子作為來(lái)自摻入植物細(xì)胞基因組中的重組基因的表達(dá)產(chǎn)物、或者摻入應(yīng)用于種植前種子的包衣或種子處理中而摻入植物物種(例如，玉米)的種子之內(nèi)。包含重組基因的植物細(xì)胞被視為轉(zhuǎn)基因事件。本發(fā)明的實(shí)施方案中還包括用于將irna分子投送給昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的遞送系統(tǒng)。例如，可以將本發(fā)明的irna分子直接導(dǎo)入害蟲的細(xì)胞中。用于導(dǎo)入的方法可以包括將irna與來(lái)自害蟲的宿主的植物組織直接混合，以及對(duì)宿主植物組織應(yīng)用包含本發(fā)明的irna分子的組合物。例如，可將irna分子噴霧到植物表面上?；蛘撸梢酝ㄟ^微生物表達(dá)irna分子，并且可以將微生物施加到植物表面上，或通過物理手段諸如注射導(dǎo)入根或莖中。如上文論述的，也可以對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行遺傳工程改造，使其以足以殺死已知侵染植物的昆蟲害蟲的量表達(dá)至少一種irna分子。通過化學(xué)或酶促合成產(chǎn)生的irna分子也可以以符合常見農(nóng)業(yè)實(shí)踐的方式配制，并且作為噴霧產(chǎn)品使用以控制昆蟲害蟲所致的植物損害。配制劑可以包含有效的葉覆蓋需要的適當(dāng)輔料(例如粘著劑(sticker)和濕潤(rùn)劑)，以及保護(hù)irna分子(例如，dsrna分子)免于uv損傷的uv保護(hù)劑。這樣的添加劑通常在生物殺蟲劑產(chǎn)業(yè)中使用，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這樣的應(yīng)用可以與其他噴霧殺蟲劑應(yīng)用(基于生物學(xué)的或其他方面)組合以增強(qiáng)針對(duì)害蟲的植物保護(hù)。本文中所討論的所有參考文獻(xiàn)，包括本文引用的出版物，專利和專利申請(qǐng)，均通過引用并入本文，只要與本公開的明確細(xì)節(jié)不沖突，如同單獨(dú)地和具體地明示將每篇參考文獻(xiàn)通過引用并入本文一樣。本文所討論的參考文獻(xiàn)僅為其在本申請(qǐng)的申請(qǐng)日之前的公開內(nèi)容而提供。本文中任何內(nèi)容不應(yīng)被解釋為承認(rèn)發(fā)明人無(wú)權(quán)憑借在先發(fā)明而先于這些公開。提供以下實(shí)施例以展示某些具體特征和/或方面。這些實(shí)施例不應(yīng)被理解為將本公開限于本文中描述的具體特征或方面。實(shí)施例實(shí)施例1昆蟲餌食生物測(cè)定樣品制備和生物測(cè)定使用rnai試劑盒合成并純化了若干dsrna分子(包括對(duì)應(yīng)于copigammareg1(seqidno:3),copigammareg2(seqidno:4),copigammareg3(seqidno:5),copigammaver1(seqidno:75),copigammaver2(seqidno:76),copigammaver3(seqidno:77),和copigammaver4(seqidno:78)的那些)。將純化的dsrna分子準(zhǔn)備在te緩沖液中，并且所有生物測(cè)定均包含由該緩沖液組成的對(duì)照處理，用作wcr(玉米根螢葉甲)的死亡率或生長(zhǎng)抑制的背景檢查。使用nanodroptm8000分光光度計(jì)(thermoscientific，wilmington，de)測(cè)量生物測(cè)定緩沖液中dsrna分子的濃度。在使用飼喂人工昆蟲餌食的新生昆蟲幼蟲的生物測(cè)定中測(cè)試樣品的昆蟲活性。wcr卵獲自cropcharacteristics，inc(farmington，mn)。生物測(cè)定在特別為昆蟲生物測(cè)定設(shè)計(jì)的128孔塑料托盤(c-dinternational，pitman，nj)中進(jìn)行。每個(gè)孔含有約1.0ml設(shè)計(jì)用于鞘翅目昆蟲生長(zhǎng)的人工餌食。通過移液管將60μl等份的dsrna樣品遞送到每個(gè)孔的餌食的表面(40μl/cm2)。dsrna樣品濃度作為孔中每平方厘米(ng/cm2)表面積(1.5cm2)的dsrna量來(lái)計(jì)算。將處理的托盤保持在通風(fēng)櫥中，直到餌食表面上的液體蒸發(fā)或吸收到餌食中。在破殼后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，用濕潤(rùn)的駱駝毛刷拾取幼蟲個(gè)體，并且將其放置在處理的餌食(每孔一個(gè)或兩個(gè)幼蟲)上。然后用透明塑料粘合片密封128孔塑料托盤上帶蟲的孔，并通氣以允許氣體交換。將生物測(cè)定盤在受控環(huán)境條件(28℃，～40％相對(duì)濕度，16:8(光照:黑暗))下保持9天，而后記錄暴露于每個(gè)樣品的昆蟲總數(shù)、死亡的昆蟲數(shù)、和存活昆蟲的重量。計(jì)算每個(gè)處理的平均百分比死亡率和平均生長(zhǎng)抑制。生長(zhǎng)抑制(gi)計(jì)算如下:gi＝[1-(twit/tnit)/(twibc/tnibc)]，其中twit是處理中活昆蟲的總重量；tnit是處理中的昆蟲總數(shù)；twibc是背景檢查中的活昆蟲的總重量(緩沖液對(duì)照)；和tnibc是背景檢查中的昆蟲總數(shù)(緩沖液對(duì)照)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用jmptm軟件sas,cary,nc)進(jìn)行。lc50(致死濃度)定義為50％的測(cè)試?yán)ハx被殺死時(shí)的劑量。gi50(生長(zhǎng)抑制)定義為試驗(yàn)昆蟲的平均生長(zhǎng)(例如活體重)為在背景檢查樣品中觀察到的平均值的50％時(shí)的劑量。重復(fù)進(jìn)行的生物測(cè)定證明，特定樣品被攝取后導(dǎo)致了玉米根蟲幼蟲的令人驚訝且意想不到的死亡率和生長(zhǎng)抑制。實(shí)施例2候選靶基因的鑒定選擇多個(gè)wcr(玉米根螢葉甲)發(fā)育期進(jìn)行匯集的轉(zhuǎn)錄組分析，以提供通過rnai轉(zhuǎn)基因植物抗性技術(shù)控制的候選靶基因序列。在一個(gè)范例中，從約0.9gm的完整第一齡wcr幼蟲(孵化后4到5天；保持在16℃)分離總rna，并使用下述基于苯酚/tri-的方法(molecularresearchcenter,cincinnati,oh)進(jìn)行純化：將幼蟲于室溫在具有10mltri的15ml勻漿器中均質(zhì)化，直到獲得均勻的懸浮液時(shí)為止。在室溫溫育5分鐘后，將勻漿分配到1.5ml微量離心管中(每管1ml)，添加200μl氯仿，并將混合物強(qiáng)力振搖15秒。在室溫提取10分鐘之后，通過在4℃以12,000xg離心分離各個(gè)相。將上層相(包含約0.6ml)小心轉(zhuǎn)移到另一個(gè)無(wú)菌的1.5ml管中，并添加等體積的室溫異丙醇。在室溫溫育5到10分鐘之后，將混合物在12,000xg(4℃或25℃)離心8分鐘。將上清液小心取出并棄去，并將rna離心沉淀通過用75％乙醇渦旋振蕩洗滌兩次，在每次洗滌后通過在7,500xg(4℃或25℃)離心5分鐘回收。小心去除乙醇，讓離心沉淀風(fēng)干3至5分鐘，然后溶解在無(wú)核酸酶的無(wú)菌水中。通過在260nm和280nm測(cè)量吸光度(a)測(cè)定rna濃度。從約0.9gm幼蟲的典型提取產(chǎn)生超過1mg的總rna，其中a260/a280比為1.9。如此提取的rna在80℃貯存，直到進(jìn)一步處理。通過使等份跑1％瓊脂糖凝膠確定rna質(zhì)量。在經(jīng)高溫滅菌的容器中，使用經(jīng)depc(焦碳酸二乙酯)處理的水稀釋的高溫滅菌的10xtae緩沖液(tris乙酸鹽edta；1x濃度為0.04mtris乙酸鹽，1mmedta(乙二胺四乙酸鈉鹽，ph8.0)制成瓊脂糖凝膠溶液。使用1xtae作為運(yùn)行緩沖液。在使用前，用rnaseawaytm(invitrogeninc.,carlsbad,ca)清潔電泳槽和造孔梳。將2μlrna樣品與8μlte緩沖液(10mmtrishclph7.0；1mmedta)和10μlrna樣品緩沖液(目錄號(hào)70606；emd4bioscience,gibbstown,nj)混合。將樣品于70℃加熱3分鐘，冷卻至室溫，每孔上樣5μl(含有1μg到2μgrna)。將市售的rna分子量標(biāo)記物在分離的孔中同時(shí)運(yùn)行以進(jìn)行分子大小比較。在60伏特下跑膠2小時(shí)。由服務(wù)提供商(eurofinsmwgoperon,huntsville,al)利用隨機(jī)引發(fā)從幼蟲總rna制備標(biāo)準(zhǔn)化的cdna文庫(kù)。在eurofinsmwgoperon通過gsflx454titaniumtm系列化學(xué)以1/2板的規(guī)模對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化的幼蟲cdna文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，其產(chǎn)生具有平均讀段長(zhǎng)度348bp的超過600,000個(gè)讀段。將350,000個(gè)讀段裝配成超過50,000個(gè)重疊群。使用公眾可訪問的程序f0rmatdb(可在ncbi訪問)將未裝配的讀段和重疊群兩者都轉(zhuǎn)換成可blast的數(shù)據(jù)庫(kù)。類似地從其他wcr發(fā)育期收獲的材料制備了總rna和標(biāo)準(zhǔn)化的cdna文庫(kù)。合并代表各個(gè)發(fā)育期的cdna文庫(kù)成員，構(gòu)建了用于靶基因篩選的匯集的轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)。利用關(guān)于其他昆蟲如果蠅屬(drosophila)和擬谷盜屬(tribolium)中的致死性rnai效應(yīng)的信息選擇了用于rnai靶向的候選基因。這些基因被假設(shè)為對(duì)于鞘翅目昆蟲的存活和生長(zhǎng)是必需的。對(duì)于選定的靶基因，在轉(zhuǎn)錄物組序列數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定其同源物，如下文所述。通過pcr擴(kuò)增靶基因的全長(zhǎng)或部分序列來(lái)制備用于產(chǎn)生雙鏈rna(dsrna)的模板。使用候選蛋白質(zhì)編碼多核苷酸針對(duì)含有未裝配的葉甲屬序列讀段或已裝配的重疊群的可blast數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行tblastn搜索。對(duì)于與葉甲屬序列的顯著命中(定義為：對(duì)于重疊群同源性，好于e-20；對(duì)于未裝配的序列讀段同源性，好于e-10)，使用blastx針對(duì)ncbi非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)加以確認(rèn)。此blastx搜索的結(jié)果確認(rèn)，在tblastn搜索中鑒定的葉甲屬同源物候選基因序列確實(shí)包含葉甲屬基因，或者是針對(duì)葉甲屬序列中存在的非葉甲屬候選基因序列的最佳命中。在大多數(shù)情況下，被注釋為編碼蛋白質(zhì)的擬谷盜屬候選基因呈現(xiàn)出明確的與葉甲屬轉(zhuǎn)錄物組序列中的一種或多種序列的序列同源性。在少數(shù)情況下可明顯看出，某些基于與非葉甲屬候選基因的同源性選擇的葉甲屬重疊群或未裝配的序列讀段有重疊，而且重疊群的裝配未能連接起這些重疊。在這些情況下，使用sequenchertmv4.9(genecodescorporation,annarbor,mi)將序列裝配成更長(zhǎng)的重疊群。一種編碼葉甲屬copigamma(seqidno:1)的候選靶基因被鑒定為可能導(dǎo)致鞘翅目害蟲死亡、生長(zhǎng)抑制、發(fā)育抑制、或wcr中的生殖抑制的候選靶基因。與wcrcopigamma有同源性的基因copi指的是抑制順式高爾基體膜上出芽過程的特異性外殼蛋白復(fù)合物(nickel,etal.2002.journalofcellscience115,3235-3240)。copi外被體復(fù)合物由七個(gè)亞單位組成。copi外被體γ是這些亞單位之一。該復(fù)合物的功能是將囊泡從高爾基復(fù)合體的順式末端轉(zhuǎn)移回到粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)——這些囊泡原來(lái)被合成之處。其它同樣含有該結(jié)構(gòu)域的玉米根螢葉甲蛋白可能有共同的結(jié)構(gòu)和/或功能性質(zhì)，因此編碼這些蛋白質(zhì)之一的基因可能包括了可能導(dǎo)致鞘翅目害蟲死亡、生長(zhǎng)抑制、發(fā)育抑制、或抑制wcr中的繁殖的候選靶基因。seqidno:1的序列是新的。該序列未提供在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中，并且沒有在wo/2011/025860；美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0070124836；美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0090306189；美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)杣s20070050860；美國(guó)專利申請(qǐng)no.20100192265；或美國(guó)專利no.7,612,194中公開。葉甲屬copigamma序列(seqidno:1)與來(lái)自一種線蟲，旋毛蟲(trichinellaspiralis)的一個(gè)序列(genbank登錄號(hào)xm_003381124.1)的某個(gè)片段有一定相關(guān)。葉甲屬copigamma氨基酸序列(seqidno:2)的最接近的同系物是具有g(shù)enbank登錄號(hào)xp_973414.1的金龜子(triboliumcasetanum)蛋白(90％相似；在同源區(qū)域上81％相同)。copigammadsrna轉(zhuǎn)基因可與其他dsrna分子組合以提供冗余的rnai靶向和協(xié)同的rnai效應(yīng)。表達(dá)靶向copigamma的dsrna的轉(zhuǎn)基因玉米事件用于防止玉米根蟲引起的噬根性損害(rootfeedingdamage)。copigammadsrna轉(zhuǎn)基因提供了新的作用模式，可以用來(lái)與蘇云金芽孢桿菌、產(chǎn)堿桿菌屬、或假單胞菌屬殺蟲蛋白技術(shù)在昆蟲抗性管理基因疊加(insectresistancemanagementgenepyramid)中組合，以減緩根蟲群體對(duì)這兩種根蟲控制技術(shù)中的任一者發(fā)展抗性。利用該葉甲屬候選基因，本文中稱為copigamma，的序列的全長(zhǎng)或部分克隆來(lái)生成用于dsrna合成的pcr擴(kuò)增子。seqidno:1顯示葉甲屬copigamma的2840bpdna序列。seqidno:3顯示copigammareg1的303bpdna序列。seqidno:4顯示copigammareg2的332bpdna序列。seqidno:5顯示copigammareg3的350bpdna序列。seqidno:75顯示copigammaver1的108bpdna序列。seqidno:76顯示copigammaver2的140bpdna序列。seqidno:77顯示copigammaver3的110bpdna序列。seqidno:78顯示copigammaver4的200bpdna序列。實(shí)施例3擴(kuò)增靶基因以產(chǎn)生dsrna設(shè)計(jì)引物來(lái)通過pcr擴(kuò)增每個(gè)靶基因的編碼區(qū)部分。參見表1。在適當(dāng)?shù)那闆r下，將t7噬菌體啟動(dòng)子元件(ttaatacgactcactatagggaga；seqidno:6)引入擴(kuò)增的有義或反義鏈的5'端。參見表1。從wcr提取總dna，并使用相反向的引物，使用第一鏈cdna作為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)，引物的位置可擴(kuò)增天然靶基因序列的全部或部分。還從包含黃色熒光蛋白(yfp)(seqidno:7；shagin等人，(2004)mol.biol.evol.21(5):841-50)編碼區(qū)的dna克隆擴(kuò)增了dsrna。表1.用于擴(kuò)增示例性copigamma靶基因和yfp陰性對(duì)照基因的編碼區(qū)部分的引物和引物對(duì)實(shí)施例4rnai構(gòu)建體通過pcr制備模板和dsrna合成。圖1中顯示了一種提供特異性模板用于產(chǎn)生copigamma和yfpdsrna的策略。使用表1中的引物對(duì)、以及從分離自wcr第一齡幼蟲的總rna制備的第一鏈cdna(作為pcr模板)，制備了準(zhǔn)備在copigammadsrna合成中使用的模板dna。對(duì)于每個(gè)選定的copigamma和yfp靶基因區(qū)，pcr擴(kuò)增在擴(kuò)增的有義和反義鏈的5'端導(dǎo)入了一個(gè)t7啟動(dòng)子元件(yfp區(qū)段擴(kuò)增自yfp編碼區(qū)的dna克隆)。將在有義鏈和反義鏈5’末端均具有t7啟動(dòng)子序列的pcr產(chǎn)物用作模板來(lái)產(chǎn)生dsrna。見圖1。被特定引物對(duì)擴(kuò)增的dsrna模板序列是:seqidno:3(copigammareg1)、seqidno:4(copigammareg2)、seqidno:5(copigammareg3)、seqidno:75(copigammaver1)、seqidno:76(copigammaver2),seqidno:77(copigammaver3),seqidno:78(copigammaver4)、和yfp(seqidno:7)。合成用于昆蟲生物測(cè)定的雙鏈rna，并使用rnai試劑盒遵循制造商的說明書(invitrogen)進(jìn)行純化。使用nanodroptm8000分光光度計(jì)(thermoscientific,wilmington,de)測(cè)量dsrna的濃度。植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建.使用化學(xué)合成的片段(dna2.0,menlopark,ca)的組合以及標(biāo)準(zhǔn)分子克隆方法，組裝包含具有copigamma(seqidno:1)的區(qū)段的用于發(fā)夾形成的靶基因構(gòu)建體的入門載體(pdab117215和pdab117216)。通過(在單一轉(zhuǎn)錄單位內(nèi))安排兩個(gè)拷貝的copigamma靶基因序列的區(qū)段彼此相反取向來(lái)易化rna初級(jí)轉(zhuǎn)錄物形成分子內(nèi)發(fā)夾，其中兩個(gè)區(qū)段相隔一個(gè)st-ls1內(nèi)含子序列(seqidno:17，vancanneyt等人，(1990)mol.gen.genet.220(2):245-50)。因此，初級(jí)mrna轉(zhuǎn)錄物含有被內(nèi)含子序列分開的兩個(gè)copigamma基因區(qū)段，其中兩個(gè)區(qū)段互為大的反向重復(fù)序列。用一個(gè)拷貝玉米泛素1啟動(dòng)子(美國(guó)專利5,510,474)來(lái)驅(qū)動(dòng)初級(jí)mrna發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生，并用包含玉米過氧化物酶5基因的(zmper53'utrv2；美國(guó)專利號(hào)6,699,984)的3'非翻譯區(qū)的片段來(lái)終止表達(dá)發(fā)夾rna的基因的轉(zhuǎn)錄。入門載體pdab117215包含copigamma發(fā)夾v3rna構(gòu)建體(seqidno:14)，其含有copigamma(seqidno:1)的一個(gè)區(qū)段。入門載體pdab117216包含copigamma發(fā)夾v4-rna構(gòu)建體(seqidno:15)，其含有不同于pdab117215中所見的copigamma(seqidno:1)區(qū)段。使用上述入門載體pdab117215和pdab117216與典型的二元目標(biāo)載體(pdab109805)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)重組反應(yīng)，分別產(chǎn)生了用于土壤桿菌介導(dǎo)的玉米胚轉(zhuǎn)化的copigamma發(fā)夾rna表達(dá)轉(zhuǎn)化載體(分別為pdab117221和pdab117222)。通過典型的二元目標(biāo)載體(pdab109805)與入門載體pdab101670的標(biāo)準(zhǔn)重組反應(yīng)，構(gòu)建包含表達(dá)yfp發(fā)夾dsrna的基因的陰性對(duì)照二元載體pdab110853。入門載體pdab101670包含處于玉米泛素1啟動(dòng)子(如上文)的表達(dá)控制之下的yfp發(fā)夾序列(seqidno:16)和包含來(lái)自玉米過氧化物酶5基因(如上文)的3'非翻譯區(qū)的片段。二元目標(biāo)載體pdab109805包含處于甘蔗桿狀dna病毒(scbv)啟動(dòng)子(schenk等人，(1999)plantmolec.biol.39:1221-30)的調(diào)節(jié)之下的除草劑抗性基因(芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶；aad-1v3)(美國(guó)專利7838733(b2)和wrightetal.(2010)proc.natl.acad.sci.u.s.a.107:20240-5)。一段人造5’utr序列，其由來(lái)自玉米條紋病毒(msv)外殼蛋白基因5’utr以及來(lái)自玉米醇脫氫酶1(adh1)基因的內(nèi)含子6組成，定位在上述scbv啟動(dòng)子區(qū)段的3’末端和aad-1編碼區(qū)的起始密碼子之間。利用一個(gè)包含玉米脂肪酶基因的3'非翻譯區(qū)(zmlip3'utr；美國(guó)專利號(hào)7,179,902)的片段來(lái)終止aad-1mrna的轉(zhuǎn)錄。通過典型的二元目標(biāo)載體(pdab9989)與入門載體pdab100287的標(biāo)準(zhǔn)重組反應(yīng)，構(gòu)建了另一個(gè)包含表達(dá)yfp蛋白的基因的陰性對(duì)照二元載體pdab101556。二元目標(biāo)載體pdab9989包含處于玉米泛素1啟動(dòng)子(如上文)的表達(dá)調(diào)節(jié)之下的除草劑抗性基因(芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶；aad-1v3)(如上文)和一個(gè)包含來(lái)自玉米脂肪酶基因的3'非翻譯區(qū)(zmlip3'utr；如上文)的片段。入門載體pdab100287包含處于玉米泛素1啟動(dòng)子(如上文)的表達(dá)控制之下的yfp編碼區(qū)(seqidno:18)和一個(gè)包含來(lái)自玉米過氧化物酶5基因(如上文)的3'非翻譯區(qū)的片段。seqidno:14呈現(xiàn)如pdab117221中所見的copigamma發(fā)夾v3形成序列。seqidno:14呈現(xiàn)如pdab117222中所見的copigamma發(fā)夾v4形成序列。實(shí)施例5候選靶基因的篩選在基于餌食的測(cè)定中，當(dāng)將設(shè)計(jì)為抑制實(shí)施例2中鑒定的靶基因序列的合成dsrna給予至wcr時(shí)，引起了死亡和生長(zhǎng)抑制。觀察到copigammareg1,copigammareg2,copigammareg3,copigammaver1,copigammaver2,copigammaver3和copigammaver4在此測(cè)定中相比于其他被篩選的dsrna顯示出大大增加的功效。重復(fù)的生物測(cè)定證明，對(duì)分別來(lái)源于copigammareg1,copigammareg2,copigammareg3,opigammaver1,copigammaver2,copigammaver3和copigammaver4的dsrna制備物的攝取導(dǎo)致西方玉米根蟲幼蟲的死亡和/或生長(zhǎng)抑制。表2和表3顯示了在wcr幼蟲暴露于這些dsrna9天之后的基于餌食的飼喂生物測(cè)定的結(jié)果，以及從黃色熒光蛋白(yfp)編碼區(qū)(seqidno:7)制備的dsrna的陰性對(duì)照樣品獲得的結(jié)果。表2.利用西方玉米根蟲幼蟲進(jìn)食9天之后獲得的copigammadsrna餌食進(jìn)食測(cè)定的結(jié)果。anova分析發(fā)現(xiàn)在平均百分比死亡率和平均生長(zhǎng)抑制(gi)上的顯著差異。使用tukey--kramer檢驗(yàn)分離平均值。*sem＝均值標(biāo)準(zhǔn)誤。刮弧中的字母指明統(tǒng)計(jì)水平。不是由相同字母連接的水平是顯著不同的(p<0.05)。**te＝trishcl(1mm)加edta(1mm)緩沖液，ph7.2。***yfp＝黃色熒光蛋白表3.copigammadsrna對(duì)wcr幼蟲的口服效力(ng/cm2)的總結(jié)。以前有人提出，某些葉甲屬物種基因可以用于rnai介導(dǎo)的昆蟲控制。參見美國(guó)專利公開號(hào)2007/0124836，其公開了906個(gè)序列，以及美國(guó)專利7,612,194，其公開了9,112個(gè)序列。然而確定了，許多被提示對(duì)rnai介導(dǎo)的昆蟲控制基因?qū)刂迫~甲屬無(wú)效。還確定了，與表明其他對(duì)于rnai介導(dǎo)的昆蟲控制有用的基因相比，序列copigammareg1,copigammareg2,copigammareg3,opigammaver1,copigammaver2,copigammaver3和copigammaver4各自提供了令人驚奇和出乎意料的優(yōu)越的葉甲屬控制。例如，美國(guó)專利7,612,194提出，膜聯(lián)蛋白、β血影蛋白2和mtrp-l4都在rnai介導(dǎo)的昆蟲控制中有效。seqidno:19為膜聯(lián)蛋白區(qū)1(reg1)的dna序列，seqidno:20為膜聯(lián)蛋白區(qū)2(reg2)的dna序列。seqidno:21為β血影蛋白2區(qū)1(reg1)的dna序列，seqidno:22為β血影蛋白2區(qū)2(reg2)的dna序列。seqidno:23為mtrp-l4區(qū)1(reg1)的dna序列，并且seqidno:24為mtrp-l4區(qū)2(reg2)的dna序列。還使用了yfp序列(seqidno:7)產(chǎn)生用作陰性對(duì)照的dsrna。分別利用上述序列通過實(shí)施例3中的方法來(lái)產(chǎn)生dsrna。提供用于產(chǎn)生dsrna的特異性模板的策略顯示在圖2中。使用表4中的引物對(duì)和從分離自wcr第一齡幼蟲的總rna制備的第一鏈cdna(作為pcr模板)，制備了準(zhǔn)備了在dsrna合成中使用的模板dna。(yfp從dna克隆擴(kuò)增。)對(duì)于每個(gè)選擇的靶基因區(qū)，進(jìn)行兩個(gè)單獨(dú)的pcr擴(kuò)增。第一個(gè)pcr擴(kuò)增在擴(kuò)增的有義鏈的5'端引入t7啟動(dòng)子元件。第二個(gè)反應(yīng)在反義鏈的5'端引入t7啟動(dòng)子元件。然后將每個(gè)靶基因區(qū)的兩個(gè)pcr擴(kuò)增片段以大致相等的量混合，并將混合物用作dsrna產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄模板。參見圖2。合成雙鏈rna，并使用rnai試劑盒遵循制造商的說明書(invitrogen)進(jìn)行純化。使用nanodroptm8000分光光度計(jì)(thermoscientific,wilmington,de)測(cè)量dsrna的濃度。并通過上述相同的基于餌食的生物測(cè)定方法測(cè)試每一種dsrna。表4列出了用來(lái)產(chǎn)生yfp、膜聯(lián)蛋白reg1、膜聯(lián)蛋白reg2、β血影蛋白2reg1、β血影蛋白2reg2、mtrp-l4reg1、和mtrp-l4reg2dsrna分子的引物的序列。用于圖2顯示的方法的yfp引物序列也在表4中列出。表5呈現(xiàn)了wcr幼蟲在暴露于這些dsrna分子9天之后的基于餌食的飼喂生物測(cè)定的結(jié)果。重復(fù)的生物測(cè)定證明，在以上西方玉米根蟲幼蟲中，攝取這些dsrna沒有導(dǎo)致超過te緩沖液、水、或yfp蛋白等對(duì)照樣品中所見的死亡或生長(zhǎng)抑制。表4.用來(lái)擴(kuò)增基因的編碼區(qū)的多個(gè)部分的引物和引物對(duì)。表5.利用西方玉米根蟲幼蟲9天之后獲得的餌食進(jìn)食測(cè)定的結(jié)果。*te＝trishcl(10mm)加edta(1mm)緩沖液，ph8。**yfp＝黃色熒光蛋白實(shí)施例6包含殺蟲發(fā)夾dsrna的轉(zhuǎn)基因玉米組織的產(chǎn)生土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化.在土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化之后，制成了通過表達(dá)穩(wěn)定地整合到植物基因組中的嵌合基因而產(chǎn)生一種或多種殺蟲dsrna分子(例如，至少一種dsrna分子，其包含靶向包含copigamma，seqidno:1)的基因的dsrna分子)的轉(zhuǎn)基因玉米細(xì)胞、組織、和植物。采用超二元或二元轉(zhuǎn)化載體的玉米轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域中已知的，正如例如美國(guó)專利號(hào)8,304,604中(在此通過提述并入其全部?jī)?nèi)容)所描述。通過轉(zhuǎn)化的組織在含吡氟氯禾靈的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力選擇它們，并視情況適宜篩選其dsrna產(chǎn)生?？梢詫⒁徊糠诌@樣的轉(zhuǎn)化的組織培養(yǎng)物提供給新生玉米根蟲幼蟲以進(jìn)行生物測(cè)定，基本上如實(shí)施例1中所描述。土壤桿菌培養(yǎng)啟動(dòng).將包含上述(實(shí)施例4)二元轉(zhuǎn)化載體pdab114515、pdab115770、pdab110853或pdab101556的土壤桿菌菌株dat13192細(xì)胞(wo2012/016222a2)的甘油儲(chǔ)劃線接種在含有適當(dāng)抗生素的ab基本培養(yǎng)基平板(watson等人，(1975)j.bacteriol.123:255-264)上，并在20℃培養(yǎng)3天。然后將培養(yǎng)物劃線接種在含有相同抗生素的yep平板(g/l:酵母提取物10；蛋白胨10；nacl,5)上，并在20℃溫育1天。土壤桿菌培養(yǎng).在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，以適合于實(shí)驗(yàn)中的構(gòu)建體數(shù)目的體積制備接種培養(yǎng)基和乙酰丁香酮的儲(chǔ)液，并將其移液到無(wú)菌的一次性250ml燒瓶中。接種培養(yǎng)基(frame等人，(2011)genetictransformationusingmaizeimmaturezygoticembryos.收錄于plantembryoculturemethodsandprotocols:methodsinmolecularbiology.t.a.thorpeande.c.yeung,(eds),springerscienceandbusinessmedia,llc.pp327-341)含有:2.2gm/lms鹽；1xisu改良的ms維生素(frame等人，同上)；68.4gm/l蔗糖；36gm/l葡萄糖；115mg/l脯氨酸；和100mg/l肌醇；ph為5.4)。將乙酰丁香酮以200μm的終濃度(從100％二甲亞砜中的1m儲(chǔ)液)添加到含有接種培養(yǎng)基的燒瓶中，并充分混合溶液。對(duì)于每種構(gòu)建體，來(lái)自yep平板的1或2個(gè)滿接種環(huán)的土壤桿菌懸浮在一次性50ml無(wú)菌離心管內(nèi)15ml的接種培養(yǎng)基/乙酰丁香酮儲(chǔ)液中，在分光光度計(jì)中在550nm(od550)處測(cè)量溶液的光密度。然后使用另外的接種培養(yǎng)基/乙酰丁香酮混合物將懸液稀釋到0.3到0.4的od550。然后將土壤桿菌懸液的管水平放置在設(shè)置為在室溫下約75rpm的平臺(tái)搖床上，并在進(jìn)行胚切開的同時(shí)振搖1到4小時(shí)。玉米棒消毒和胚分離.未成熟玉米胚從玉米近交系b104(hallauer等人，(1997)cropscience37:1405-1406)植物獲得，所述植物在溫室中培養(yǎng)，并進(jìn)行自花授粉或近親授粉以產(chǎn)生玉米棒。在授粉后大約10到12天收獲玉米棒。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將玉米棒脫殼，并通過浸沒在20％市售漂白劑(ultragermicidalbleach，6.15％次氯酸鈉；加兩滴吐溫tm20)的溶液中并振搖20到30分鐘進(jìn)行表面消毒，隨后在層流罩內(nèi)在無(wú)菌去離子水中沖洗三次。從每個(gè)玉米棒無(wú)菌切下未成熟合子胚(1.8到2.2mm長(zhǎng))并隨機(jī)分配到微量離心管中，每根微量離心管含有2.0ml的液體接種培養(yǎng)基中的適當(dāng)土壤桿菌細(xì)胞的懸液，其中含200μm乙酰丁香酮，并添加了2μl的10％s233表面活性劑(evonikindustries；essen,germany)。對(duì)于一套給定的實(shí)驗(yàn)，每次轉(zhuǎn)化均使用來(lái)自匯集的玉米棒的胚。土壤桿菌共培養(yǎng).在分離之后，將胚在搖動(dòng)平臺(tái)上放置5分鐘。然后將管的內(nèi)容物傾倒到共培養(yǎng)基的平板上，所述培養(yǎng)基含有4.33gm/lms鹽；1xisu改良的ms維生素；30gm/l蔗糖；700mg/ll-脯氨酸；在koh中的3.3mg/l的麥草畏(3,6-二氯-o-茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)；100mg/l肌醇(myo-inositol)；100mg/l酪蛋白酶水解物；15mg/lagno3；200μm溶于dmso中的乙酰丁香酮；和3gm/lgelzantm，ph為5.8。用無(wú)菌一次性移液管移除液態(tài)土壤桿菌懸液。然后借助于顯微鏡，使用無(wú)菌鑷子使胚定向?yàn)槎芷嫦虺?。蓋上平板，用3mtmmicroporetm醫(yī)用膠帶密封，并放置在具有大約60μmolm-2s-1的光合有效輻射(par)的連續(xù)光照的25℃培養(yǎng)箱中。愈傷組織選擇和轉(zhuǎn)基因事件的再生.在共培養(yǎng)期之后，將胚轉(zhuǎn)移到靜息培養(yǎng)基上，靜息培養(yǎng)基的組成為：4.33gm/lms鹽；1xisu改良的ms維生素；30gm/l蔗糖；700mg/ll-脯氨酸；溶于koh中的3.3mg/l的麥草畏；100mg/l肌醇；100mg/l酪蛋白酶水解物；15mg/lagno3；0.5g/lmes(2-(n-嗎啉代)乙磺酸一水合物；phytotechnologieslabr.；lenexa,ks)；250mg/l羧芐青霉素；和2.3gm/lgelzantm；ph為5.8。將不超過36個(gè)胚移到每個(gè)平板上。將平板放置在透明的塑料盒中，在27℃下在大約50μmolm-2s-1par的連續(xù)光照下溫育7到10天。然后將愈傷的胚轉(zhuǎn)移(<18個(gè)/板)到選擇培養(yǎng)基i上，所述培養(yǎng)基由具有100nm吡氟氯禾靈酸(r-haloxyfopacid)(0.0362mg/l；用于選擇包含aad-1基因的愈傷組織)的靜息培養(yǎng)基(上文)構(gòu)成。將平板返回到透明盒中，在27℃下在大約50μmolm-2s-1par的連續(xù)光照下溫育7天。然后將愈傷的胚轉(zhuǎn)移(<12個(gè)/板)到選擇培養(yǎng)基ii上，所述培養(yǎng)基由具有500nm吡氟氯禾靈酸(0.181mg/l)的靜息培養(yǎng)基組成。將平板返回到透明盒中，在27℃下在大約50μmolm-2s-1par的連續(xù)光照下溫育14天。這一選擇步驟允許轉(zhuǎn)基因愈傷組織進(jìn)一步增殖和分化。將增殖中的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到(<9個(gè)/板)預(yù)再生培養(yǎng)基上。預(yù)再生培養(yǎng)基含有4.33g/lms鹽；1xisu改良的ms維生素；45gm/l蔗糖；350mg/ll-脯氨酸；100mg/l肌醇；50mg/l酪蛋白酶水解物；1.0mg/lagno3；0.25gm/lmes；溶于naoh中的0.5mg/l萘乙酸；溶于乙醇中的2.5mg/l脫落酸；1mg/l6-芐氨基嘌呤；250mg/l羧芐青霉素；2.5gm/lgelzantm；和0.181mg/l吡氟氯禾靈酸；ph為5.8。將平板保存在透明盒中，在27℃下在大約50μmolm-2s-1par的連續(xù)光照下溫育7天。然后將再生中的愈傷組織轉(zhuǎn)移到(<6個(gè)/板)phytatraystm(sigma-aldrich)中的再生培養(yǎng)基上，在28℃以每天16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗(以大約160μmolm-2s-1par)溫育14天，直到發(fā)出芽和根為止。再生培養(yǎng)基含有4.33gm/lms鹽；1xisu改良的ms維生素；60gm/l蔗糖；100mg/l肌醇；125mg/l羧芐青霉素；3gm/lgellantm膠；和0.181mg/l吡氟氯禾靈酸；ph為5.8。然后分離具有主根的小芽，并不經(jīng)選擇直接轉(zhuǎn)移到伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上。伸長(zhǎng)培養(yǎng)基含有4.33gm/lms鹽；1xisu改良的ms維生素；30gm/l蔗糖；和3.5gm/lgelritetm:ph為5.8。通過它們?cè)诤羞练群天`的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力而選擇出轉(zhuǎn)化植物芽，將所述芽從phytatraystm移栽到填充有生長(zhǎng)培養(yǎng)基(promixbx；premiertechhorticulture)的小盆中，小盆用杯子或humi-domes(arcoplastics)覆蓋，然后在conviron生長(zhǎng)室中煉苗(27℃晝/24℃夜，16小時(shí)光周期，50-70％rh，200μmolm-2s-1par)。在一些情況下，分析推定的轉(zhuǎn)基因小植物的轉(zhuǎn)基因相對(duì)拷貝數(shù)，這使用設(shè)計(jì)用于檢測(cè)整合到玉米基因組中的aad1除草劑耐受基因的引物通過定量實(shí)時(shí)pcr測(cè)定來(lái)完成。此外，利用rnaqpcr測(cè)定來(lái)檢測(cè)在推定的轉(zhuǎn)化體表達(dá)的dsrna中st-ls1內(nèi)含子序列的存在。然后將選定的轉(zhuǎn)化小植物移動(dòng)到溫室中，以便進(jìn)一步生長(zhǎng)和測(cè)試。轉(zhuǎn)移t0植物和在溫室中定植以進(jìn)行生物測(cè)定和產(chǎn)生種子.當(dāng)植物達(dá)到v3-v4期時(shí)，將其移栽到iecustomblend(profile/metromix160)土壤混合物中，在溫室中(光曝露類型：光或同化作用；高光限值：1200par；16-小時(shí)晝長(zhǎng)；27℃晝/24℃夜)培植至開花。將要用于昆蟲生物測(cè)定的植物從小盆移栽到tinustm350-4(spencer-lemaireindustries,acheson,alberta,canada)(每每事件一個(gè)植物)。在移栽到約四天后，侵染植物以進(jìn)行生物測(cè)定。通過對(duì)t0轉(zhuǎn)基因植物的穗絲授粉，其中花粉從非轉(zhuǎn)基因良種近交系b104或其他適當(dāng)?shù)幕ǚ酃w采集而來(lái)，并種植所得的種子而獲得t1代植物。在可能時(shí)進(jìn)行互交。實(shí)施例7轉(zhuǎn)基因玉米組織的分子分析對(duì)在評(píng)估噬根損害的同日從溫室培植的植物采集的葉和根的樣品進(jìn)行了玉米組織的分子分析(例如，rnaqpcr)。用對(duì)per53'utr的rnaqpcr測(cè)定結(jié)果來(lái)驗(yàn)證發(fā)夾轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。(在非轉(zhuǎn)化的玉米植物中預(yù)期會(huì)檢出低水平的per53'utr，因?yàn)樵谟衩捉M織中通常存在內(nèi)源per5基因表達(dá))。用針對(duì)表達(dá)的rna中的st-ls1內(nèi)含子序列(為形成dsrna發(fā)夾分子所必需)的rnaqpcr測(cè)定結(jié)果來(lái)驗(yàn)證發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物的存在。測(cè)量了相對(duì)于內(nèi)源玉米基因的rna水平的轉(zhuǎn)基因rna表達(dá)水平。通過dnaqpcr分析檢測(cè)基因組dna中aad1編碼區(qū)的一部分，用來(lái)估計(jì)轉(zhuǎn)基因插入拷貝數(shù)。從培植在環(huán)境室中的植物采集樣品用于這些分析。將結(jié)果與旨在檢測(cè)單拷貝天然基因的一部分的測(cè)定法的dnaqpcr結(jié)果進(jìn)行比較，并將簡(jiǎn)單事件(具有一個(gè)或兩個(gè)copigamma轉(zhuǎn)基因拷貝)推進(jìn)到溫室中的進(jìn)一步研究。另外，用旨在檢測(cè)大觀霉素抗性基因(specr；包含在t-dna外部的二元載體質(zhì)粒上)的一部分的qpcr測(cè)定法來(lái)確定轉(zhuǎn)基因植物是否含有無(wú)關(guān)的整合的質(zhì)粒骨架序列。發(fā)夾rna轉(zhuǎn)錄物表達(dá)水平:per53'utrqpcr.通過per53'utr序列的實(shí)時(shí)定量pcr(qpcr)來(lái)分析愈傷組織細(xì)胞事件或轉(zhuǎn)基因植物，以確定全長(zhǎng)發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)表達(dá)水平，與內(nèi)部玉米基因(seqidno:53；genbank登錄號(hào)bt069734)的轉(zhuǎn)錄物水平比較，所述內(nèi)部玉米基因編碼tip41-樣蛋白(即，genbank登錄號(hào)at4g34270的玉米同源物；具有74％同一性的tblastx得分)。使用rnaeasytm96試劑盒(qiagen,valencia,ca)分離rna。洗脫后，根據(jù)試劑盒建議的方案進(jìn)行總rna的dnase1處理。然后在nanodroptm8000分光光度計(jì)(thermoscientific)上將rna定量，并將濃度歸一化為25ng/μl。大體上按照制造商推薦的方案，使用高容量cdna合成試劑盒(invitrogen)制備第一鏈cdna，反應(yīng)體積10μl，含有5μl變性rna。略微改變?cè)摲桨敢园▽?0μl的100μmt20vn寡核苷酸(idt)(seqidno:54；ttttttttttttttttttttvn，其中v是a、c、或g，n是a、c、g、或t/u)添加到隨機(jī)引物儲(chǔ)備預(yù)混物的1ml管中，以制備隨機(jī)引物和寡dt混合的工作儲(chǔ)備液。在cdna合成后，以無(wú)核酸酶的水將樣品以1:3稀釋，并儲(chǔ)存在-20℃直到用于測(cè)定時(shí)為止。在lightcyclertm480(rochediagnostics,indianapolis,in)上以10μl的反應(yīng)體積分別進(jìn)行per53'utr和tip41樣轉(zhuǎn)錄物的實(shí)時(shí)pcr測(cè)定。對(duì)于per53'utr測(cè)定，利用引物p5u76s(f)(seqidno:55)和p5u76a(r)(seqidno:56)，以及rocheuniversalprobetm(upl76；目錄號(hào)4889960001；用fam標(biāo)記)運(yùn)行反應(yīng)。對(duì)于tip41-樣參考基因測(cè)定，使用引物tipmxf(seqidno:57)和tipmxr(seqidno:58)、以及標(biāo)記有hex(六氯熒光素)的探針hxtip(seqidno:59)。所有測(cè)定都包括沒有模板的陰性對(duì)照(僅有預(yù)混物)。為制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，在源板中還包括空白(源孔中加水)，以檢查樣品交叉污染。在表6中列出了引物和探針序列。用于檢測(cè)各種轉(zhuǎn)錄物的反應(yīng)成分配方在表7中公開，pcr反應(yīng)條件概述于表8中。在465nm處激發(fā)fam(6-羧基熒光素亞磷酰胺)熒光部分，并測(cè)量在510nm處的熒光；hex(六氯熒光素)熒光部分的對(duì)應(yīng)值為533nm和580nm。表6.被用于轉(zhuǎn)基因玉米中轉(zhuǎn)錄物水平的分子分析的多多核苷酸。*tip41樣蛋白**nav序列無(wú)法從供應(yīng)商獲得表7.用于轉(zhuǎn)錄物檢測(cè)的pcr反應(yīng)配方。表8.用于rnaqpcr的熱循環(huán)儀條件。使用lightcyclertm軟件v1.5，根據(jù)供應(yīng)商的推薦利用二階導(dǎo)數(shù)最大算法計(jì)算cq值，通過相對(duì)定量分析數(shù)據(jù)。對(duì)于表達(dá)分析，使用δδct方法(即，2-(cqtarget–cqref))計(jì)算表達(dá)值，所述方法依賴于比較兩個(gè)靶之間的cq值的差異，其中假定對(duì)于優(yōu)化的pcr反應(yīng)條件，每個(gè)循環(huán)產(chǎn)物都加倍，基值選擇為2。發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物大小和完整性:northern印跡測(cè)定.在一些情況下，利用northern印跡(rna印跡)分析來(lái)確定在表達(dá)copigamma發(fā)夾dsrna的轉(zhuǎn)基因植物中copigamma發(fā)夾rna的分子大小，從而獲得轉(zhuǎn)基因植物的另外的分子表征。所有的材料和設(shè)備在使用之前用rnazap(ambion/invitrogen)處理。將組織樣品(100mg到500mg)采集到2mlsafelockeppendorf管中，用配備三個(gè)鎢珠的kleckotm組織粉碎器(garciamanufacturing,visalia,ca)在1mltrizol(invitrogen)中破碎5分鐘，然后在室溫(rt)下溫育10分鐘。任選地，將樣品在4℃在11,000rpm下離心10分鐘，并將上清液轉(zhuǎn)移到新鮮的2mlsafelockeppendorf管中。在將200μl的氯仿添加到勻漿中之后，通過翻轉(zhuǎn)該管2到5分鐘進(jìn)行混合，然后在rt下溫育10分鐘，并在4℃在12,000xg下離心15分鐘。將上層相轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的1.5mleppendorf管中，添加600μl的100％異丙醇，在rt溫育10分鐘到2小時(shí)之后，然后在4°到25℃在12,000xg下離心10分鐘。棄去上清液，用1ml的70％乙醇將rna離心沉淀物洗滌兩次，在兩次洗滌之間，在4°到25℃在7,500xg下離心10分鐘。棄去乙醇，將離心沉淀物快速風(fēng)干3到5分鐘，然后重懸在50μl無(wú)核酸酶的水中。使用(thermo-fisher)對(duì)總rna定量，并將樣品歸一化為5μg/10μl。然后向每個(gè)樣品中加入10μl的乙二醛(ambion/invitrogen)。將5到14ng的digrna標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志物預(yù)混物(rocheappliedscience,indianapolis,in)分配并添加到等體積的乙二醛中。在50℃使樣品和標(biāo)志物rna變性45分鐘，并保存在冰上，直到上樣到在northernmaxtm10x乙二醛運(yùn)行緩沖液(ambion/invitrogen)中的1.25％seakemgoldtm瓊脂糖(lonza,allendale,nj)凝膠上為止，通過在65伏特/30ma下電泳2小時(shí)15分鐘分離rna。電泳之后，在2xssc沖洗凝膠5分鐘，在凝膠doc工作站(biorad,hercules,ca)上成像，然后在rt過夜使rna被動(dòng)轉(zhuǎn)移到尼龍膜(millipore)上，其中使用10xssc作為轉(zhuǎn)移緩沖液(由3m氯化鈉和300mm檸檬酸三鈉組成的20xssc，ph7.0)。轉(zhuǎn)膜后，在2xssc中沖洗膜5分鐘，通過uv使rna與該膜交聯(lián)(agilent/stratagene)，并使該膜在室溫下干燥2天。使膜在緩沖液(ambion/invitrogen)中預(yù)雜交1到2小時(shí)。探針由含有感興趣序列(例如，seqidno:14或seqidno:15的反義序列部分，視情況適宜)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物組成，其通過rocheappliedsciencedig程序用地高辛配基標(biāo)記。在雜交管中推薦的緩沖液中60℃的溫度下雜交過夜。雜交后，對(duì)印跡進(jìn)行dig洗滌，包裝，暴露于膠片1到30分鐘，然后將膠片顯影，所有這些都通過dig試劑盒的供應(yīng)商推薦的方法來(lái)進(jìn)行。轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)確定.將大約等同于2個(gè)葉沖孔塊的玉米葉片收集在96孔的收集平板(qiagen)中。用配備一個(gè)不銹鋼珠的kleckotm組織粉碎器(garciamanufacturing,visalia,ca)在biosprint96ap1溶解緩沖液(與biosprint96plantkit一起提供；qiagen)中進(jìn)行組織破碎。組織浸軟之后，使用biosprint96plantkit和biosprint96提取機(jī)器人以高通量形式分離基因組dna(gdna)。在設(shè)立qpcr反應(yīng)之前，以2:3的dna:水稀釋基因組dna。qpcr分析.通過使用480系統(tǒng)的實(shí)時(shí)pcr，借助水解探針測(cè)定來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)。使用probedesignsoftware2.0設(shè)計(jì)了要在水解探針測(cè)定中用于檢測(cè)st-ls1內(nèi)含子序列(seqidno:17)、或檢測(cè)specr基因(即，負(fù)載在二元載體質(zhì)粒上的大觀霉素抗性基因；seqidno:71；在表9中的spc1寡核苷酸)的一部分的寡核苷酸。此外，使用primerexpress軟件(appliedbiosystems)設(shè)計(jì)了要在水解探針測(cè)定中用于檢測(cè)aad-1耐除草劑基因(seqidno:65；在表9中的gaad1寡核苷酸)的區(qū)段的寡核苷酸。表9顯示了引物和探針序列。測(cè)定用內(nèi)源玉米染色體基因(轉(zhuǎn)化酶(seqidno:62；genbank登錄號(hào)u16123；在本文中稱為ivr1)的試劑多重化，所述基因用作內(nèi)部參考序列以確保在每個(gè)測(cè)定中都存在gdna。為了擴(kuò)增，制備了在10μl體積的多重反應(yīng)物中的1x終濃度的480probes母液混合物(rocheappliedscience)，其含有每種引物各0.4μm，以及每種探針各0.2μm(表10)。如表11中概述進(jìn)行兩步擴(kuò)增反應(yīng)。fam-和hex-標(biāo)記探針的熒光團(tuán)活化和發(fā)射如上文所述；cy5偶聯(lián)物在650nm處最大激發(fā)，并且在670nm處發(fā)最大熒光。使用擬合點(diǎn)算法(軟件發(fā)行版本1.5)和相對(duì)定量模塊(基于δδct方法)，根據(jù)實(shí)時(shí)pcr數(shù)據(jù)確定cp得分(熒光信號(hào)與背景閾值雜交的點(diǎn))。如前所述處理數(shù)據(jù)(上文；rnaqpcr)。表9.用于基因拷貝數(shù)確定和二元載體質(zhì)粒骨架檢測(cè)的引物和探針(具有熒光偶聯(lián)物)的序列。cy5＝花青-5表10.用于基因拷貝數(shù)分析和質(zhì)粒骨架檢測(cè)的反應(yīng)成分成分量(μl)儲(chǔ)液終濃度2x緩沖液5.02x1x適當(dāng)?shù)恼蛞?.410μm0.4適當(dāng)?shù)姆聪蛞?.410μm0.4適當(dāng)?shù)奶结?.45μm0.2ivr1-正向引物0.410μm0.4ivr1-反向引物0.410μm0.4ivr1-探針0.45μm0.2h2o0.6na*nagdna2.0nd**nd總計(jì)10.0*na＝不適用**nd＝未確定表11.用于dnaqpcr的熱循環(huán)儀條件實(shí)施例8轉(zhuǎn)基因玉米的生物測(cè)定體外昆蟲生物測(cè)定.通過生物測(cè)定方法來(lái)證實(shí)在植物細(xì)胞中產(chǎn)生的本主題發(fā)明的dsrna的生物活性。參見，例如，baum等人，(2007)nat.biotechnol.25(11):1322-1326。人們能夠例如通過在受控的飼喂環(huán)境下給靶昆蟲喂食來(lái)源于產(chǎn)生殺蟲dsrna的植物的各種植物組織或組織片來(lái)證實(shí)效力?；蛘撸瑥膩?lái)源于產(chǎn)生殺蟲dsrna的植物的各種植物組織制備提取物，并將提取的核酸分配在用于如以前在本文中描述的生物測(cè)定的人工餌食上面。將這樣的飼喂測(cè)定的結(jié)果與類似方式進(jìn)行的采用來(lái)自不產(chǎn)生殺蟲dsrna的宿主植物的適當(dāng)對(duì)照組織、或其他對(duì)照樣品的生物測(cè)定進(jìn)行比較。關(guān)于轉(zhuǎn)基因玉米事件的昆蟲生物測(cè)定.選擇從經(jīng)洗滌的卵孵化的兩條西方玉米根蟲幼蟲(1到3日齡)并將其置于生物測(cè)定托盤的每個(gè)孔中。然后將這些孔用“拉-揭”(pulln’peel)護(hù)蓋(bio-cv-16,bio-serv)覆蓋，并置于具有18小時(shí)/6小時(shí)光照/黑暗周期的28℃培養(yǎng)箱中。在初始侵染9日之后，評(píng)估幼蟲死亡率，其按照死亡昆蟲占的每次處理中昆蟲總數(shù)的百分比來(lái)計(jì)算。將昆蟲樣品在-20℃冷凍兩天，然后匯集來(lái)自每個(gè)處理的昆蟲幼蟲并稱重。生長(zhǎng)抑制百分比按照實(shí)驗(yàn)處理的平均重量除以兩個(gè)對(duì)照孔處理的平均重量的均值來(lái)計(jì)算。數(shù)據(jù)表示為(陰性對(duì)照的)生長(zhǎng)抑制百分比。將超過對(duì)照平均重量的平均重量歸一化為零。溫室中的昆蟲生物測(cè)定.從cropcharacteristics(farmington,mn)收到帶有西方玉米根蟲(wcr，玉米根螢葉甲)卵的土壤。在28℃溫育wcr卵10到11天。洗掉卵上的土壤，將卵置于0.15％瓊脂溶液中，濃度調(diào)節(jié)至每0.25ml等份大約75個(gè)到100個(gè)卵。將一份卵懸浮液加入培養(yǎng)皿中以設(shè)置孵化平板，用于監(jiān)測(cè)孵化速率。用150到200個(gè)wcr卵侵染中生長(zhǎng)的玉米植物周圍的土壤。允許昆蟲攝食2周，在這段時(shí)間之后，對(duì)每個(gè)植物給出“根評(píng)級(jí)”。利用一個(gè)節(jié)損傷量表進(jìn)行分級(jí)，大體上如oleson等人，(2005,j.econ.entomol.98:1-8)所述。將通過了這個(gè)生物測(cè)定的植物移栽到5加侖的盆中供產(chǎn)生種子。用殺蟲劑處理移植物以防止進(jìn)一步根蟲損害和昆蟲釋放到溫室中。將植物人工授粉以產(chǎn)生種子。保存由這些植物產(chǎn)生的種子以評(píng)估植物的t1和后續(xù)世代。溫室生物測(cè)定包括兩種陰性對(duì)照植物。轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照植物通過用包含設(shè)計(jì)為產(chǎn)生黃色熒光蛋白(yfp)的基因或yfp發(fā)夾dsrna的載體轉(zhuǎn)化而生成(參見實(shí)施例4)。非轉(zhuǎn)化的陰性對(duì)照植物從品系7sh382或b104的種子培植而來(lái)。在兩個(gè)不同的日期進(jìn)行生物測(cè)定，其中每一組植物材料中均包括陰性對(duì)照。表12顯示了copigamma發(fā)夾植物的分子分析和生物測(cè)定的結(jié)果匯總?？疾炜偨Y(jié)在表12中的生物測(cè)定結(jié)果揭示了一項(xiàng)令人驚奇和出乎意料的觀察結(jié)果，即，大多數(shù)包含表達(dá)含有seqidno:1區(qū)段(例如，如seqidno:14和seqidno:15所例示)的copigamma發(fā)夾dsrna的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因玉米植物受到保護(hù)而免于通過喂養(yǎng)西方玉米根蟲幼蟲招致的根損害。37個(gè)被分級(jí)的事件中的二十二個(gè)具有0.5或更低的根評(píng)級(jí)。表13顯示了陰性對(duì)照植物的分子分析和生物測(cè)定的合并結(jié)果。大多數(shù)植物不具有針對(duì)wcr幼蟲喂養(yǎng)的保護(hù)，雖然34株被評(píng)級(jí)的植物中有5株具有0.75或更低的根評(píng)級(jí)。有時(shí)觀察到陰性對(duì)照植物組中存在一些具有根評(píng)級(jí)分?jǐn)?shù)低的植物，這反映了在溫室環(huán)境中進(jìn)行這種類型生物測(cè)定的易變性和困難性。表12.表達(dá)copigamma發(fā)夾v3和copigamma發(fā)夾v4的玉米植物的溫室生物測(cè)定和分子分析結(jié)果。*rtl＝針對(duì)tip4-樣基因轉(zhuǎn)錄物水平測(cè)量的相對(duì)轉(zhuǎn)錄物水平。**ng＝由于植物尺寸小而未評(píng)級(jí)。表13.包含轉(zhuǎn)基因的陰性對(duì)照植物和非轉(zhuǎn)化玉米植物的溫室生物測(cè)定和分子分析結(jié)果。*rtl＝針對(duì)tip4樣基因轉(zhuǎn)錄物水平測(cè)量的相對(duì)轉(zhuǎn)錄物水平。**ng＝由于植物尺寸小未予分級(jí)***nd＝未進(jìn)行。實(shí)施例9包含鞘翅目害蟲序列的轉(zhuǎn)基因玉米如實(shí)施例6中所述生成10個(gè)到20個(gè)轉(zhuǎn)基因t0玉米植物。獲得另外的10--20個(gè)表達(dá)針對(duì)rnai構(gòu)建體的發(fā)夾dsrna的t1玉米獨(dú)立品系用于玉米根蟲攻擊。發(fā)夾dsrna可按照seqidno:14、seqidno:15中所列出而衍生，或者進(jìn)一步包含seqidno:1。更多的發(fā)夾dsrna衍生自例如鞘翅目害蟲序列，例如像caf1-180(美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2012/0174258)、vatpasec(美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2012/0174259)、rho1(美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2012/0174260)、vatpaseh(美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2012/0198586)、ppi-87b(美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2013/0091600)、rpa70(美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2013/0091601)、或rps6(美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2013/0097730)。這些通過rt-pcr或其他分子分析方法得以證實(shí)。來(lái)自選定的獨(dú)立t1系的總rna制備物在某些情況下用于rt-pcr，其中引物被設(shè)計(jì)為在每個(gè)rnai構(gòu)建體中的發(fā)夾表達(dá)盒的st-ls1內(nèi)含子中結(jié)合。另外，用于rnai構(gòu)建體中每個(gè)靶基因的特異性引物在某些情況下用于擴(kuò)增在植物內(nèi)sirna產(chǎn)生所需要的預(yù)加工mrna，并用于確認(rèn)所述預(yù)加工mrna的產(chǎn)生。對(duì)于每個(gè)靶基因的期望條帶的擴(kuò)增可確認(rèn)每個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米植物中發(fā)夾rna的表達(dá)。隨后在某些情況下利用rna印跡雜交在獨(dú)立轉(zhuǎn)基因系中確認(rèn)靶基因的dsrna發(fā)夾加工成sirna。而且，與靶基因具有80％以上序列同一性、具有錯(cuò)配序列的rnai分子對(duì)玉米根蟲的影響類似于與靶基因具有100％序列同一性的rnai分子。錯(cuò)配序列與天然序列的配對(duì)在同一個(gè)rnai構(gòu)建體中形成發(fā)夾dsrna，由此產(chǎn)生出能夠影響攝食中的鞘翅目害蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和生存力的植物加工的sirna。對(duì)應(yīng)于靶基因的dsrna、sirna、或mirna的植物體內(nèi)遞送以及被鞘翅目害蟲進(jìn)食后的攝取，導(dǎo)致鞘翅目害蟲中的靶基因由于rna介導(dǎo)的基因沉默而下調(diào)。當(dāng)靶基因在發(fā)育的一個(gè)或多個(gè)階段發(fā)揮重要作用的時(shí)候，鞘翅目害蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和生殖受到影響，而且在wcr、ncr、scr、mcr、玉米根螢葉甲、d.u.tenella、和d.u.undecimpunctatamannerheim的至少一者的情況下，會(huì)導(dǎo)致鞘翅目害蟲無(wú)法成功侵染、攝食、發(fā)育、和/或生殖，或?qū)е缕渌劳?。然后通過靶基因的選擇和rnai的成功應(yīng)用來(lái)控制鞘翅目害蟲。轉(zhuǎn)基因rnai品系和非轉(zhuǎn)化玉米的表型比較.選用于創(chuàng)建發(fā)夾dsrna的靶鞘翅目害蟲基因或序列與任何已知的植物基因bn序列都沒有相似性。因此不期望靶向這些鞘翅目害蟲基因或序列的構(gòu)建體的(系統(tǒng)性)rnai的產(chǎn)生或活化對(duì)轉(zhuǎn)基因植物會(huì)有任何有害影響。然而，將轉(zhuǎn)基因系的發(fā)育和形態(tài)特征與非轉(zhuǎn)化植物、以及用沒有發(fā)夾表達(dá)基因的“無(wú)效”(null)載體轉(zhuǎn)化的那些轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行比較。比較了植物根、芽、葉和生殖特征。轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)化植物在根長(zhǎng)和生長(zhǎng)模式上沒有可觀察到的差異。植物地上部特征，諸如高度、葉數(shù)和大小、開花時(shí)間、花大小和外觀之類，是相似的?？偟膩?lái)說，在體外以及在溫室土壤中培養(yǎng)時(shí)，在轉(zhuǎn)基因系和沒有表達(dá)靶irna分子的那些品系之間沒有可觀察的形態(tài)差異。實(shí)施例10包含鞘翅目害蟲序列和另外的rnai構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)基因玉米植物在其基因組中包含異源編碼多核苷酸，所述異源編碼多核苷酸被轉(zhuǎn)錄成靶向鞘翅目害蟲之外的生物的irna分子，對(duì)這樣的轉(zhuǎn)基因植物通過土壤桿菌或whiskerstm方法(參見petolino和arnold(2009)methodsmol.biol.526:59-67)進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生一種或多種殺蟲dsrna分子(例如，至少一種dsrna分子，包括靶向包含seqidno:1的基因的dsrna分子)?；旧先鐚?shí)施例4中所述制備植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒載體，經(jīng)由土壤桿菌或whiskerstm-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法遞送到獲自轉(zhuǎn)基因hiii或b104玉米植物的玉米懸浮細(xì)胞或未成熟玉米胚中，所述玉米植物在其基因組中包含異源編碼多核苷酸，所述異源編碼多核苷酸被轉(zhuǎn)錄成靶向鞘翅目害蟲之外的生物的irna分子。實(shí)施例11包含rnai構(gòu)建體和另外的鞘翅目害蟲控制序列的轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)基因玉米植物在其基因組中包含被轉(zhuǎn)錄成靶向鞘翅目害蟲生物的irna分子的異源編碼多核苷酸(例如，至少一種dsrna分子，包括靶向包含seqidno:1的基因的dsrna分子)，對(duì)于這樣的轉(zhuǎn)基因玉米植物，通過土壤桿菌或whiskerstm方法(參見petolino和arnold(2009)methodsmol.biol.526:59-67)進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生一種或多種殺蟲蛋白分子，例如，cry1b、cry1i、cry2a、cry3、cry7a、cry8、cry9d、cry14、cry18、cry22、cry23、cry34、cry35、cry36、cry37、cry43、cry55、cyt1a和cyt2c殺蟲蛋白。基本上如實(shí)施例4中所述制備植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒載體，經(jīng)由土壤桿菌或whiskerstm-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法遞送到獲自轉(zhuǎn)基因b104玉米植物的玉米懸浮細(xì)胞或未成熟玉米胚中，所述玉米植物在其基因組中包含被轉(zhuǎn)錄成靶向鞘翅目害蟲生物的irna分子的異源編碼多核苷酸。獲得產(chǎn)生用于控制鞘翅目害蟲的irna分子和殺蟲蛋白的雙重轉(zhuǎn)化植物。實(shí)施例12新熱帶棕椿象(英雄美洲蝽)在copigammarnai注射后的死亡新熱帶棕椿象(bsb；英雄美洲蝽)群落.將bsb飼養(yǎng)在27℃、相對(duì)濕度65％、16:8小時(shí)的光照:黑暗循環(huán)的培養(yǎng)箱中。將經(jīng)2-3天收集的1克卵接種在5l容器中，容器底部有濾紙盤，并用#18目篩蓋住容器以便通風(fēng)。每個(gè)飼養(yǎng)容器產(chǎn)生約300-400只成蟲bsb。在所有階段，昆蟲均每周三次喂養(yǎng)新鮮青豆，每周更換一小袋含有向日葵種子，大豆和花生(3:1:1重量比)的種子混合物。水在帶有棉塞作為捻子的小瓶中補(bǔ)充。經(jīng)最初兩周后，每周一次將昆蟲轉(zhuǎn)移到新的容器上。bsb人工餌食.用如下制備的bsb人工餌食(在制備兩周內(nèi)使用)。在magic混合器中將凍干綠豆混合成細(xì)粉，同時(shí)在另一臺(tái)magic混合器中將生(有機(jī))花生混合。在大的magic混合器中合并混合的干成分(重量百分比:綠豆35％；花生35％；蔗糖5％；維生素復(fù)合物(例如用于昆蟲的vanderzant維生素混合物，sigma-aldrich,目錄號(hào)v1007)0.9％)，加蓋并充分振搖以將這些成分混合。然后將混合的干成分添加到混合碗。在另一容器中，將水和苯菌靈抗真菌劑(50ppm；25μl20,000ppm溶液/50ml餌食液)充分混合，然后添加到干成分混合物中。人工混合所有成分，直到溶液完全混合時(shí)為止。將餌食成形為期望的大小，松散地包裝在鋁箔中，在60℃加熱4小時(shí)，然后冷卻，在4℃儲(chǔ)存。bsb轉(zhuǎn)錄組組裝.選擇六個(gè)bsb發(fā)育期用于mrna文庫(kù)制備。從冷凍在-70℃的昆蟲提取總rna，并將其在-24設(shè)備(mpbiomedicals)上的lysingmatrixa2ml管(mpbiomedicals,santaana,ca)中的10倍體積的溶解/結(jié)合緩沖液中均質(zhì)化。使用mirvanatmmirna分離試劑盒(ambion；invitrogen)根據(jù)制造商的方案提取總mrna。使用hiseqtm系統(tǒng)(sandiego,ca)的rna測(cè)序提供了用于在rnai昆蟲控制技術(shù)中使用的候選靶基因序列。hiseqtm為六個(gè)樣品生成了總共約3.78億個(gè)讀段。使用trinity匯編程序軟件(grabherr等人，(2011)naturebiotech.29:644-652)針對(duì)每個(gè)樣品將讀段逐一匯編。合并匯編的轉(zhuǎn)錄物以生成匯集的轉(zhuǎn)錄組。這個(gè)bsb匯集的轉(zhuǎn)錄組含有378,457個(gè)序列。bsbcopigamma直系同源物鑒定.使用果蠅屬copigamma蛋白序列γcop-pa、γcop-pb及γcop-pc：genbank登錄號(hào)np_524608、np_733432和np_001163784，分別作為查詢進(jìn)行bsb匯集的轉(zhuǎn)錄組的tblastn搜索。bsbcopigamma(seqidno:87)被鑒定為英雄美洲蝽候選靶基因產(chǎn)物，其預(yù)測(cè)的肽序列為seqidno:88。模板制備和dsrna合成.使用試劑(lifetechnologies)，從提取自單一年輕成蟲(約90mg)的總bsbrna制備cdna。使用微量管研磨棒(pelletpestle)(fisherbrand目錄號(hào)12-141-363)和研磨棒混合器(pestlemotormixer)(cole-parmer,vernonhills,il)，在裝有200μl的的1.5ml微量離心管中將昆蟲均質(zhì)化。均質(zhì)化之后，再添加800μl的使勻漿渦旋，然后在室溫下溫育五分鐘。通過離心去除細(xì)胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移到新的管中。按照制造商推薦的提取方案，將rna離心沉淀在室溫下干燥，并重懸于來(lái)自gfxpcrdnaandgelextractionkit(illustratm；gehealthcarelifesciences)的200μltris緩沖液中，使用洗脫緩沖液類型4(即10mmtris-hcl，ph8.0)。使用nanodroptm8000分光光度計(jì)(thermoscientific，wilmington，de)測(cè)定rna濃度。cdna擴(kuò)增.使用針對(duì)rt-pcr的superscriptiiifirst-strandsynthesissystemtm(invitrogen)，根據(jù)供應(yīng)商的推薦方案，從5μg的bsb總rna模板和寡dt引物反向轉(zhuǎn)錄而成cdna。用無(wú)核酸酶的水將轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的終體積調(diào)節(jié)為100μl。使用引物bsb_γcop-2-for(seqidno:90)和bsb_γcop-2-rev(seqidno:91)來(lái)擴(kuò)增bsb_copigamma區(qū)域2，又稱bsb_copigamma-2模板。用1μl的cdna(上文)進(jìn)行觸地(touch-down)pcr(退火溫度從60℃降至50℃，以10℃/循環(huán)降低)來(lái)擴(kuò)增該dna模板。在35個(gè)循環(huán)的pcr中產(chǎn)生了包含bsb_copigamma-2(seqidno:89)的495bp區(qū)段的片段。上述程序也被用于使用yfpv2-f(seqidno:93)和yfpv2-r(seqidno:94)引物擴(kuò)增301bp陰性對(duì)照模板yfpv2(seqidno:92)。bsb_copigamma和yfpv2引物在其5'端含有t7噬菌體啟動(dòng)子元件(seqidno:6)，因此使得yfpv2和bsb_copigammadna片段能夠用于dsrna轉(zhuǎn)錄。dsrna合成.利用megascripttmrnai試劑盒(ambion)，根據(jù)制造商的說明，使用2μl的pcr產(chǎn)物(上文)作為模板合成dsrna。(參見圖1)。在nanodroptm8000分光光度計(jì)上將dsrna定量并在無(wú)核酸酶的0.1xte緩沖液(1mmtrishcl，0.1mmedta，ph7.4)中稀釋到500ng/μl。dsrna注射到bsb血腔中.在27℃培養(yǎng)箱中，在65％相對(duì)濕度和16:8小時(shí)的光:暗光周期下，用綠豆和種子餌食喂養(yǎng)作為群落的bsb。用小刷子輕輕操作第二齡若蟲(每只重1到1.5mg)以防損傷，并將它們置于冰上培養(yǎng)皿中，以使昆蟲預(yù)冷和固定。給每只昆蟲注射55.2nl的500ng/μldsrna溶液(即，27.6ngdsrna；18.4到27.6μg/g體重的劑量)。注射使用配備有從drummond3.5英寸#3-000＝203-g/x玻璃毛細(xì)管拉制而成的注射針的nanojecttmii注入器(drummondscientific,broomhall,pa)。將針尖打破，用輕礦油裝填毛細(xì)管，然后充填2到3μl的dsrna。將dsrna注射到若蟲的腹部(每次試驗(yàn)每dsrna注射10個(gè)昆蟲)，在不同的三天重復(fù)試驗(yàn)。經(jīng)過注射的昆蟲(每孔5個(gè))被轉(zhuǎn)移到含有一團(tuán)人工bsb餌食并覆蓋有pull-n-peeltm蓋片(bio-cv-4；bio-serv)的32孔托盤(bio-rt-32rearingtray；bio-serv,frenchtown,nj)中。借助于帶有棉花芯的裝有1.25ml水的1.5ml微量離心管提供水分。將這些托盤在26.5℃、60％濕度和16:8小時(shí)光:暗光周期下溫育。在注射之后7天，獲取生存力計(jì)數(shù)和重量。注射鑒定了bsbcopidelta是致死性dsrna靶.在bsb注射實(shí)驗(yàn)中使用靶向yfp編碼區(qū)的區(qū)段yfpv2的dsrna作為陰性對(duì)照。如表14中總結(jié)的，將27.6ng的bsb_copigamma-2dsrna注射到第二齡bsb若蟲的血腔中，在七天內(nèi)產(chǎn)生了高死亡率。bsb_copigamma-2dsrna導(dǎo)致的死亡率均與相同量注射的yfpv2dsrna(陰性對(duì)照)所見到的顯著不同，其p＝0.001935(student'st-檢驗(yàn))。表14.bsb_copigamma-2dsrna注射到第二齡棕椿象若蟲的血腔中注射七天之后的結(jié)果。*每種dsrna每次試驗(yàn)注射10只昆蟲實(shí)施例13包含半翅目害蟲序列的轉(zhuǎn)基因玉米如實(shí)施例7中所述，生成10到20個(gè)包含表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因t0玉米植物，所述表達(dá)載體含有seqidno:87和/或seqidno89的核酸。獲得另外的10-20個(gè)t1玉米獨(dú)立系，其表達(dá)針對(duì)rnai構(gòu)建體的發(fā)夾dsrna，用于bsb攻擊。可以獲得包含如seqidno:89中所示，或進(jìn)一步包含seqidno:87的發(fā)夾dsrna。這些通過rt-pcr或其他分子分析方法得以證實(shí)。任選地用選定的獨(dú)立t1系的總rna制備物進(jìn)行rt-pcr，其中引物設(shè)計(jì)為結(jié)合每個(gè)rnai構(gòu)建體中的發(fā)夾表達(dá)盒的st-ls1內(nèi)含子中。另外，任選地用針對(duì)rnai構(gòu)建體中每個(gè)靶基因的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，并且在植物體內(nèi)確認(rèn)產(chǎn)生sirna所需要的預(yù)加工mrna的產(chǎn)生。每個(gè)靶基因的各期望條帶的擴(kuò)增可確認(rèn)每個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米植物中發(fā)夾rna的表達(dá)。任選地隨后在獨(dú)立轉(zhuǎn)基因系中利用rna印跡雜交來(lái)確認(rèn)靶基因的dsrna發(fā)夾加工成sirna。而且，與靶基因具有80％以上序列同一性的具有錯(cuò)配序列的rnai分子以類似于與靶基因具有100％序列同一性的rnai分子所見的方式影響玉米根蟲。錯(cuò)配序列與天然序列的配對(duì)在同一個(gè)rnai構(gòu)建體中形成發(fā)夾dsrna，從而投放出能夠影響攝食的半翅目害蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和生存力的植物加工的sirna。在植物體內(nèi)投予對(duì)應(yīng)于靶基因的dsrna、sirna、shrna、或mirna，隨后被半翅目害蟲通過攝食而攝取，結(jié)果導(dǎo)致半翅目害蟲中的靶基因由于rna介導(dǎo)的基因沉默作用而下調(diào)。當(dāng)靶基因在所影響的半翅目害蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和生殖的一個(gè)或多個(gè)階段中發(fā)揮重要功能時(shí)，并且在英雄美洲蝽、蓋德擬壁蝽、茶翅蝽、稻綠蝽、擬綠蝽、和褐椿象中至少一者的情況下，可導(dǎo)致半翅目害蟲無(wú)法成功侵染、進(jìn)食、發(fā)育、和/或生殖，或?qū)е缕渌劳觥Ｈ缓筮x定的靶基因的和rnai的成功應(yīng)用用來(lái)控制半翅目害蟲。轉(zhuǎn)基因rnai系和非轉(zhuǎn)化玉米的表型比較.選用于創(chuàng)建發(fā)夾dsrna的靶半翅目害蟲基因或序列與任何已知的植物基因序列都沒有相似性。因此可以預(yù)期，靶向這些半翅目害蟲基因或序列的構(gòu)建體的(系統(tǒng)性)rnai的產(chǎn)生或者激活不會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生任何有害影響。盡管如此，將轉(zhuǎn)基因系的發(fā)育和形態(tài)特征與非轉(zhuǎn)化植物、以及用沒有發(fā)夾表達(dá)基因的“空”載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行比較。比較植物根、芽、葉和生殖特征。轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)化植物在根長(zhǎng)和生長(zhǎng)模式上沒有可觀察到的差異。諸如高度、葉數(shù)和大小、開花時(shí)間、花大小和外觀之類的植物地上部特征是相似的。總的來(lái)說，在體外以及在溫室土壤中培養(yǎng)時(shí)，在轉(zhuǎn)基因品系和沒有表達(dá)靶irna分子的品系之間沒有可觀察到的形態(tài)差異。實(shí)施例14包含半翅目害蟲序列的轉(zhuǎn)基因大豆生成10到20個(gè)包含下述核酸的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因t0大豆植物，所述核酸含有seqidno:87和/或89，所述植物按照本領(lǐng)域已知的方式生成，包括例如通過如下所述的土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。用氯氣將成熟大豆(glycinemax)種子消毒十六小時(shí)過夜。用氯氣消毒之后，將種子置于laminartm層流罩內(nèi)的開放容器中以驅(qū)散氯氣。接著，使用黑盒，在黑暗中24℃下使消毒過的種子吸收無(wú)菌h2o十六小時(shí)。分割種子大豆的制備.包含部分胚軸的大豆種子分割方案需要制備縱向切開的大豆種子材料，縱向切開使用固定在解剖刀上的10號(hào)刀片，沿著種子的種臍分離并去除種皮，并將種子分開為兩個(gè)子葉部分。小心地部分移除胚軸，其中約1/2-1/3的胚軸仍然附著在子葉的節(jié)端。接種.然后將包含部分胚軸的分割大豆種子在根癌土壤桿菌(例如，菌株eha101或eha105)溶液中浸沒約30分鐘，根癌土壤桿菌攜帶包含seqidno:87和/或seqidno:89的二元質(zhì)粒。在浸入帶胚軸的子葉之前，將根癌土壤桿菌溶液稀釋到λ＝0.6od650的終濃度。共培養(yǎng).接種后，將分割的大豆種子與根癌土壤桿菌菌株在共培養(yǎng)基(wang,kan.agrobacteriumprotocols.2.1.newjersey:humanapress,2006.print.)上共培養(yǎng)5天，共培養(yǎng)基置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿用一片濾紙覆蓋。芽誘導(dǎo).在共培養(yǎng)5天之后，將分割的大豆種子在含有b5鹽、b5維生素、28mg/l二價(jià)鐵、38mg/lna2edta、30g/l蔗糖、0.6g/lmes、1.11mg/lbap、100mg/ltimentintm、200mg/l頭孢噻肟、和50mg/l萬(wàn)古霉素的液體芽誘導(dǎo)(si)(ph5.7)培養(yǎng)基中洗滌。然后將分割的大豆種子在含有b5鹽、b5維生素、7g/lnoble瓊脂、28mg/l二價(jià)鐵、38mg/lna2edta、30g/l蔗糖、0.6g/lmes、1.11mg/lbap、50mg/ltimentintm、200mg/l頭孢噻肟、50mg/l萬(wàn)古霉素的芽誘導(dǎo)i(sii)培養(yǎng)基(ph5.7)上培養(yǎng)，其中子葉的平坦一側(cè)向上，而子葉的節(jié)端埋入培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)2周之后，將來(lái)自轉(zhuǎn)化的分割大豆種子的外植體轉(zhuǎn)移到芽誘導(dǎo)ii(siii)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有補(bǔ)充了6mg/l草丁膦的sii培養(yǎng)基。芽伸長(zhǎng).在siii培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周之后，將子葉從外植體移除，通過在子葉的基部做切口切下含有胚軸的齊平的(flush)芽墊。將分離自子葉的芽墊轉(zhuǎn)移到芽伸長(zhǎng)(se)培養(yǎng)基上。該se培養(yǎng)基含有ms鹽、28mg/l二價(jià)鐵、38mg/lna2edta、30g/l蔗糖和0.6g/lmes、50mg/l天冬酰胺、100mg/ll--焦谷氨酸、0.1mg/liaa、0.5mg/lga3、1mg/l玉米素核苷、50mg/ltimentintm、200mg/l頭孢噻肟、50mg/l萬(wàn)古霉素、6mg/l草丁膦、7g/lnoble瓊脂，(ph5.7)。每2周將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮的se培養(yǎng)基上。培養(yǎng)物在生長(zhǎng)室中在24℃下培養(yǎng)，使用18h光周期，光強(qiáng)為80-90μmol/m2sec。生根.對(duì)于從子葉芽墊發(fā)出的伸長(zhǎng)芽，通過在子葉芽墊基部切割伸長(zhǎng)芽加以分離，并將伸長(zhǎng)芽浸入1mg/liba(吲哚-3-丁酸)中1-3分鐘促進(jìn)生根。接著，將伸長(zhǎng)芽轉(zhuǎn)移到phyta托盤中的生根培養(yǎng)基(ms鹽、b5維生素、28mg/l二價(jià)鐵、38mg/lna2edta、20g/l蔗糖和0.59g/lmes、50mg/l天冬酰胺、100mg/ll-焦谷氨酸、7g/lnoble瓊脂，ph5.6)中。栽培.在convirontm生長(zhǎng)室24℃、18h光周期培養(yǎng)1-2周之后，將已經(jīng)生根的芽轉(zhuǎn)移到帶蓋的圣代杯內(nèi)的土壤混合物中，放到convirontm生長(zhǎng)室(型號(hào)cmp4030和cmp3244,controlledenvironmentslimited,winnipeg,manitoba,canada)內(nèi)，置于長(zhǎng)的白晝條件下(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)，光強(qiáng)度為120-150μmol/m2sec，溫度(22℃)和濕度(40-50％)恒定，以馴化小植物。生根的小植物在圣代杯中馴化數(shù)周之后，轉(zhuǎn)移到溫室中進(jìn)行進(jìn)一步的馴化并定植強(qiáng)健的轉(zhuǎn)基因大豆植物。獲得另外的10-20個(gè)表達(dá)針對(duì)rnai構(gòu)建體的發(fā)夾dsrna的t1大豆獨(dú)立系用于bsb攻擊?？梢垣@得如seqidno:89中所示，或進(jìn)一步包含seqidno:87的發(fā)夾dsrna。這些通過rt-pcr或其他分子分析方法加以確認(rèn)。任選用來(lái)自選擇的獨(dú)立t1系的總rna制備物進(jìn)行rt-pcr，其中引物設(shè)計(jì)為結(jié)合每個(gè)rnai構(gòu)建體中的發(fā)夾表達(dá)盒中的st-ls1內(nèi)含子。另外，任選用針對(duì)rnai構(gòu)建體中每個(gè)靶基因的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，并且在植物體內(nèi)確認(rèn)產(chǎn)生sirna所需要的預(yù)加工mrna的產(chǎn)生。每個(gè)靶基因的期望條帶的擴(kuò)增可確認(rèn)每個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米植物中發(fā)夾rna的表達(dá)。任選地隨后在獨(dú)立轉(zhuǎn)基因系中利用rna印跡雜交來(lái)確認(rèn)靶基因的dsrna發(fā)夾加工成sirna。此外，與靶基因具有80％以上序列同一性且具有錯(cuò)配序列的rnai分子影響玉米根蟲的方式類似于與靶基因具有100％序列同一性的rnai分子。錯(cuò)配序列與天然序列的配對(duì)在同一個(gè)rnai構(gòu)建體中形成發(fā)夾dsrna，從而投放出能夠影響攝食的半翅目害蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和生存力的植物加工的sirna。在植物內(nèi)投放對(duì)應(yīng)于靶基因的dsrna、sirna、shrna、或mirna，隨后被半翅目害蟲通過攝食而攝取，結(jié)果導(dǎo)致半翅目害蟲中的靶基因由于rna介導(dǎo)基因沉默作用而下調(diào)。當(dāng)靶基因在發(fā)育的一個(gè)或多個(gè)階段中重要時(shí)，半翅目害蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和/或存活受影響，并且在英雄美洲蝽、蓋德擬壁蝽、茶翅蝽、稻綠蝽、綠蝽(acrosternumhilare)、褐椿象中至少一者的情況下，可導(dǎo)致半翅目害蟲無(wú)法成功侵染、進(jìn)食、發(fā)育和/或生殖，或?qū)е缕渌劳觥Ｈ缓筮x定的靶基因的和rnai的成功應(yīng)用可用來(lái)控制半翅目害蟲。轉(zhuǎn)基因rnai系和非轉(zhuǎn)化玉米的表型比較.選用于創(chuàng)建發(fā)夾dsrna的靶半翅目害蟲基因或序列與任何已知的植物基因序列都沒有相似性。因此可以預(yù)期，靶向這些半翅目害蟲基因或序列的構(gòu)建體的(系統(tǒng)性)rnai的產(chǎn)生或者激活不會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生任何有害影響。盡管如此，將轉(zhuǎn)基因系的發(fā)育和形態(tài)特征與非轉(zhuǎn)化植物、以及用沒有發(fā)夾表達(dá)基因的“空”載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行比較。比較植物根、芽、葉和生殖特征。轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)化植物在根長(zhǎng)和生長(zhǎng)模式上沒有可觀察到的差異。諸如高度、葉數(shù)和大小、開花時(shí)間、花大小和外觀之類的植物地上部特征是相似的?？偟膩?lái)說，在體外以及在溫室土壤中培養(yǎng)時(shí)，在轉(zhuǎn)基因品系和沒有表達(dá)靶irna分子的品系之間沒有可觀察到的形態(tài)差異。實(shí)施例15人工飲食的英雄美洲蝽生物測(cè)定在使用人工餌食的dsrna飼喂測(cè)定中，與注射實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例12)相同，設(shè)置具有一顆約18mg的人工飼料小丸和水的32孔托盤。將濃度為200ng/μl的dsrna加入到食物小丸和水樣品中，向兩個(gè)孔中的每一個(gè)加入100μl。向每個(gè)孔中加入5只第2齡的英雄美洲蝽若蟲。以水樣品和靶向yfp轉(zhuǎn)錄物的dsrna作為陰性對(duì)照。在三個(gè)不同的日期重復(fù)實(shí)驗(yàn)。稱重存活的昆蟲，并在處理8天后測(cè)定死亡率。實(shí)施例16包含半翅目害蟲序列的轉(zhuǎn)基因擬南芥使用與實(shí)施例4相似的標(biāo)準(zhǔn)分子方法產(chǎn)生包含用于發(fā)夾形成的靶基因構(gòu)建體的擬南芥轉(zhuǎn)化載體，所述構(gòu)建體包含copigamma(seqidno:87)的區(qū)段。使用標(biāo)準(zhǔn)的基于土壤桿菌的方法進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化。用草銨膦耐受性選擇標(biāo)志物選擇t1種子。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因t1擬南芥植物，并產(chǎn)生純合的單拷貝t2轉(zhuǎn)基因植物用于昆蟲研究。對(duì)具有花序的生長(zhǎng)中的擬南芥植物進(jìn)行生物測(cè)定。將五至十只昆蟲放置在每株植物上，并在14天內(nèi)監(jiān)測(cè)存活。擬南芥轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建.使用化學(xué)合成的片段(dna2.0，menlopark，ca)的組合，以及標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆方法，組裝基于入門載體pdab3916的入門克隆，這些入門克隆包含用于發(fā)夾形成的靶基因構(gòu)建體，靶基因構(gòu)建體包含copigamma(seqidno:87)。通過將靶基因區(qū)段的兩個(gè)拷貝以相反方向排列(在單個(gè)轉(zhuǎn)錄單元內(nèi))，兩個(gè)區(qū)段被st-ls1內(nèi)含子序列(seqidno:17)(vancanneytetal.(1990)mol.gen.genet.220(2)：245-50)所分隔，可以易化rna初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的分子內(nèi)發(fā)夾形成。因此，初級(jí)mrna轉(zhuǎn)錄物包含兩個(gè)copigamma基因區(qū)段序列，它們彼此作為對(duì)方的大反向重復(fù)序列，由內(nèi)含子序列分隔開。使用一個(gè)擬南芥泛素10啟動(dòng)子(callisetal.(1990)j.biologicalchem.265：12486-12493))的拷貝來(lái)驅(qū)動(dòng)初級(jí)mrna發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生，并且使用包含來(lái)自根癌土壤桿菌的開放閱讀框23(atuorf233'utrv1；美國(guó)專利號(hào)5,428,147)的3'非翻譯區(qū)的片段來(lái)終止表達(dá)發(fā)夾rna的基因的轉(zhuǎn)錄。將上述pdab3916載體內(nèi)的發(fā)夾克隆用于標(biāo)準(zhǔn)重組反應(yīng)，使用典型的二元目的載體pdab101836，以產(chǎn)生用于土壤桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化的發(fā)夾rna表達(dá)轉(zhuǎn)化載體。二元目的載體pdab101836包含在木薯葉脈花葉病毒啟動(dòng)子(csvmv啟動(dòng)子v2，美國(guó)專利號(hào)us7601885；verdaguer等人(1996)plantmol.biol.31:1129-1139))控制下的除草劑耐受基因dsm-2v2(美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?011/0107455)。使用包含來(lái)自根癌土壤桿菌開放閱讀框1的3'非翻譯區(qū)(atuorf13'utrv6；huang等人(1990)j.bacteriol，172：1814-1822)的片段來(lái)終止dsm2v2mrna的轉(zhuǎn)錄。通過標(biāo)準(zhǔn)重組反應(yīng)用典型的二元目的載體(pdab101836)和入門載體pdab3916構(gòu)建包含表達(dá)yfp發(fā)夾rna的基因的陰性對(duì)照二元構(gòu)建體pdab114507。入門構(gòu)建體pdab112644包含在擬南芥泛素10啟動(dòng)子(如上)的表達(dá)控制下的yfp發(fā)夾序列(hpyfpv2-1，seqidno:95)和包含來(lái)自根癌土壤桿菌的orf233'非翻譯區(qū)的片段(如上所述)。包含殺蟲發(fā)夾rna的轉(zhuǎn)基因擬南芥的產(chǎn)生：土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化.將含有發(fā)夾序列的二元質(zhì)粒電穿孔到土壤桿菌菌株gv3101(pmp90rk)中。通過重組土壤桿菌菌落的質(zhì)粒制備物的限制性分析確認(rèn)重組土壤桿菌克隆。使用qiagenplasmidmaxkit(qiagen，cat#12162)根據(jù)制造商推薦的方案從土壤桿菌培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒。擬南芥轉(zhuǎn)化和t1選擇.將12至15株擬南芥植物(columbia栽培種)在溫室中的4”盆中生長(zhǎng)，光強(qiáng)度為250μmol/m2，25℃和18:6小時(shí)光照:黑暗條件。轉(zhuǎn)化前一周修剪主花莖。通過將10μl的重組土壤桿菌甘油儲(chǔ)在28℃、225rpm振蕩下在100mllb肉湯(sigmal3022)+100mg/l壯觀霉素+50mg/l卡那霉素中溫育72小時(shí)來(lái)制備土壤桿菌接種物。收獲土壤桿菌細(xì)胞，并將其懸浮于5％蔗糖+0.04％silwet-l77(lehleseedscat#vis-02)+10μg/l苯甲氨基嘌呤(ba)溶液中至od6000.8～1.0，然后浸花。將植株的地上部分浸入土壤桿菌溶液5-10分鐘，輕柔攪動(dòng)，然后將植株轉(zhuǎn)移到溫室中進(jìn)行正常生長(zhǎng)，并定期澆水和施肥，直到種子定植。實(shí)施例17轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)和生物測(cè)定選擇用發(fā)夾rnai構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的t1擬南芥.將來(lái)自每次轉(zhuǎn)化的至多達(dá)200mg的t1種子在0.1％瓊脂糖溶液中分層。將種子種植在裝有5號(hào)陽(yáng)光培養(yǎng)基(sunshinemedia)的發(fā)芽盤(10.5”×21”×1”；t.o.plasticsinc.，clearwater，mn)中。在種植后6天和9天，選擇對(duì)280g/ha的(草銨膦)具有耐受性的轉(zhuǎn)化體。將選出的事件移植到4”直徑的盆中。在移植的一周內(nèi)進(jìn)行插入拷貝分析，插入拷貝分析使用rochelightcycler480的水解定量實(shí)時(shí)pcr(qpcr)。使用lightcyclerprobedesignsoftware2.0(roche)，針對(duì)dsm2v2選擇標(biāo)記設(shè)計(jì)pcr引物和水解探針。將植物維持在24℃，在強(qiáng)度為100-150me/m2×s的熒光和白熾燈下以16:8小時(shí)光:暗光周期。英雄美洲蝽植物飼養(yǎng)生物測(cè)定.為每個(gè)構(gòu)建體選擇至少四個(gè)低拷貝事件(1-2個(gè)插入)、四個(gè)中拷貝事件(2-3個(gè)插入)和四個(gè)高拷貝(≥4個(gè)插入)事件。使植物生長(zhǎng)至開花期(植物有花和長(zhǎng)角果)。土壤表面覆蓋有～50ml體積的白色沙子，便于鑒別昆蟲。將五到十二齡的英雄美洲蝽若蟲引入每株植物。植物用直徑3”，高16”，壁厚0.03”的塑料管(產(chǎn)品號(hào)484485，visipackfentonmo)覆蓋；用尼龍網(wǎng)蓋住管子以隔離昆蟲。在conviron培養(yǎng)箱中將植物保持在正常溫度、光照和澆水條件下。在14天中，收集昆蟲并稱重，計(jì)算死亡率百分比以及生長(zhǎng)抑制(1-處理重量/對(duì)照重量)。用表達(dá)yfp發(fā)夾的植物作為對(duì)照。t2擬南芥種子生成和t2生物測(cè)定.對(duì)于每個(gè)構(gòu)建體，從選定的低拷貝(1-2個(gè)插入)事件產(chǎn)生t2種子。如上所述，對(duì)植物(純合的和/或雜合的)進(jìn)行英雄美洲蝽飼養(yǎng)生物測(cè)定。從純合子收獲t3種子并儲(chǔ)存用于將來(lái)分析。上文已經(jīng)通過實(shí)施例詳細(xì)描述了具體實(shí)施方案，但本公開可能容許各種修改和替代形式。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本公開不旨在限于所公開的特定形式。相反，本公開應(yīng)覆蓋落入由附隨的權(quán)利要求及其法律上等同物限定的本公開的范圍內(nèi)的所有修改、等同物和替代物。序列表<110>美國(guó)陶氏益農(nóng)公司k·納瓦h(yuǎn)·李c·耿n·埃蘭戈m·j·亨利m·蘭加薩米a·t·伍斯利k·阿羅拉p·甘德拉s·e·沃登e·菲什里維奇<120>賦予鞘翅目和半翅目害蟲抗性的copi外被體gamma亞單位核酸分子<130>74227<150>62/063192<151>2014-10-13<160>95<170>patentinversion3.5<210>1<211>2840<212>dna<213>玉米根螢葉甲(diabroticavirgifera)<400>1tggtttttttttatcaaagttttatatggaaacttataaattggttttttgcttaaaatt60tgttttcagttttgacgtttattttggtcgtcggctgatgtgacgtgtaaagaaattaaa120tcaaattattttaaagtttttaaattaaaatgggtacttttaaaagagatactcatgatg180aggacgggggatcaagtgcttttcaaaatctggagaaaactactgttttgcaggaagcta240gagtttttaatgaaactagtgtaaatccaagaaaatgtacaccgatactaacaaaactgt300tgtacttattgaaccagggtgaaactttaagtgccaaagaggccacagatgttttctttg360ccatgaccaaactgttccaatcaaaagatgtaatattgagaaggatggtttatttgggaa420ttaaagaactcagttctgttgctgatgatgtcattattgtaacatccagtcttacaaaag480atatgactggtaaagaagacatgtacagagcagctgctataagagcattatgcagtatta540ctgatgctactatgcttcaagctatagaacgttatatgaagcaagctattgtagatagaa600acgcagctgtcagttcagcagcactaattagttcattacatatgagcaaattagctccag660atgtagtaaaaagatgggtaaatgaagctcaggaagcagtaaatagtgataatgcaatgg720tacagtatcacgcattaggtcttctataccatattaggaagactgataagctagcagtga780caaaattgatttccaagctgaattcaatgggtttaaagagcccttatgctttgtgtatgt840tgataagaatcactgcaaaacttttagaagaagaggaccaagagtcactcctcaactccc900catatacaataatatttacaatgggcttaaggaacaaatctgaaatggtggtgtatgaag960ctgcacatgccatggttaacctgaagttcacgagtagtaatgtgctagcacccgctataa1020gtgttctacaactattttgtggatctcctaaagccacactcagatttgctgctgttagaa1080ctttaaatcaagtggccaccacccaccctgcgtcagtgacagcttgtaatttggatctag1140aaaatttgattactgatcctaataggtcaattgctacactggccattactactcttttga1200aaacaggtgccgaatcttctgttgacagactaatgaaacaaatcgctacttttgtatctg1260aaatcagtgatgaatttaaagtggttgtcattcaggcaattaaggtattagctttgaaat1320ttccaaggaaacatagcacgcttatgaatttcctatccgccatgttaagagatgagggag1380gtttagaatataaagcatccatagcagataccattataaccctaatcgaagataatcccg1440aagctaaagaatctggtttggcgcatctttgcgagttcattgaagactgtgaacatgttt1500ctttggctgtgagaatcttgcatttgttaggaaaggaaggacccaagaccaaacaaccat1560cgagatacatccgttttatctacaatcgcgtcatattggaatgtccttctgtaagagctg1620ctgcagtctccgccatggcacaattcggagcctcttgtcccgatttgttagaaaatatcc1680aaatattactttcgaggtgtcagatggattcagacgatgaagttagggacagagctacat1740attatagtaatatacttaacaaaaatgataaaagtttatacaacaattacattttggatt1800ctttgcaggtttcaattccttcactagaaagatcgcttagagaatacattcaaaatccaa1860ctgacgaaccatttgacattaagtccgtacctgtagcagcagtgccaacagcagaagaac1920gagaagttaaaaacaaatctgaaggactgctagtctctcaaggtccagtccgacctcctc1980cggtgtctagagaagaaaacttcgccgaaaaacttagtaacgttccgggtatacaacagt2040taggacctttgttcaaaacttccgacgtcgttgaactcactgaatctgaaacagagtatt2100ttgtccgctgtatcaagcactgtttcaaacatcacatcgtcctccaattcgattgtctga2160ataccttgccagaccagcttttagaaaacgttagagtggagatagacgccggtgaaacct2220tcgaaattttggcagaaataccttgtgaaaagttgcactataacgaaaccggtaccacat2280atgtagtagttaagttgcctgatgatgatctccccaactctgttggtacgtgtggagccg2340tgttgaagttcttagtgaaagattgtgatccatcaacgggaataccagattctgatgagg2400gttacgatgatgaatatacactggaagacatcgaaataacattaggggaccaaattcaaa2460aagtaagcaaagtaaattgggctgcagcctgggaagaagctgcagctacttatgtagaaa2520aagaggatacatactccttgaccatcaatacgctaagtggc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