本申請(qǐng)要求2014年6月4日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)順序號(hào)62/007,908的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益。前述申請(qǐng)的說明書以其整體結(jié)合到本文中。

發(fā)明背景

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)超家族含有多種具有共同的序列元件和結(jié)構(gòu)基序的生長(zhǎng)因子。已知這些蛋白質(zhì)對(duì)脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物兩者中的多種細(xì)胞類型發(fā)揮生物作用。超家族的成員在胚胎發(fā)育期間在圖式形成和組織特化中執(zhí)行重要功能，并可影響多種分化過程，包括脂肪形成、肌生成、軟骨發(fā)生、心臟發(fā)生、血細(xì)胞生成、神經(jīng)發(fā)生和上皮細(xì)胞分化。該家族被分成2個(gè)總分支：BMP/GDF和TGF-β/激活素/BMP10分支，其成員具有不同的、通?；パa(bǔ)的作用。通過操控TGF-β家族成員的活性，常常可在生物體中引起重要的生理變化。例如，皮埃蒙特牛和比利時(shí)藍(lán)牛品種在GDF8 (亦稱肌生成抑制蛋白(myostatin))基因中攜帶功能失去突變，引起肌肉質(zhì)量顯著增加。Grobet等, Nat. Genet. 1997, 17(1):71-4。此外，在人類中，無(wú)活性的GDF8等位基因與肌肉質(zhì)量增加有關(guān)，并且據(jù)報(bào)告與異常強(qiáng)度有關(guān)。Schuelke等, N Engl J Med 2004, 350:2682-8。

肌肉、骨、軟骨和其它組織的改變可通過激發(fā)(agonizing)或拮抗由適合的TGF-β家族成員介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)。然而，由于該家族的成員可影響一種以上的組織，因此在一些患者護(hù)理情況下，需要以局部而非全身的方式實(shí)現(xiàn)該家族成員的治療性抑制。因此，存在對(duì)起TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的強(qiáng)效調(diào)節(jié)劑的作用并且適于局部給藥的藥劑的需要。

發(fā)明概述

某些方面，本公開內(nèi)容提供促濾泡素抑制素多肽，其經(jīng)設(shè)計(jì)在其中給予所述促濾泡素抑制素多肽的組織的附近抑制促濾泡素抑制素配體(例如激活素A、激活素B、GDF8和GDF11)，同時(shí)對(duì)患者幾乎沒有或沒有全身作用。

本文所述促濾泡素抑制素多肽包括包含是SEQ ID NO: 1-4、7-16和26-43任一個(gè)的至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列的多肽。任選促濾泡素抑制素多肽經(jīng)設(shè)計(jì)以二聚化或形成更高級(jí)次的多聚體。這可通過使促濾泡素抑制素多肽的促濾泡素抑制素序列與賦予二聚化或多聚化的結(jié)構(gòu)域融合來實(shí)現(xiàn)。這類結(jié)構(gòu)域的實(shí)例是免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域，包括例如免疫球蛋白的Fc部分。任選促濾泡素抑制素部分與異源部分直接連接，或可使用間插序列，例如接頭。接頭的實(shí)例是序列TGGG。任選促濾泡素抑制素多肽可按人促濾泡素抑制素-288具有肝素結(jié)合活性的方式，顯示肝素結(jié)合活性?；蛘?，促濾泡素抑制素可按人促濾泡素抑制素-315的方式，具有被掩蔽的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。某些方面，本公開內(nèi)容提供治療上優(yōu)化的促濾泡素抑制素多肽，其包含來自與天然人IgG1相比ADCC或CDC活性降低的人IgG的免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的一部分。實(shí)例包括IgG2、IgG3、IgG4、雜合IgG2/4和IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的變體。某些方面，本公開內(nèi)容提供促濾泡素抑制素的最佳活性形式，其包含SEQ ID NO:15或16的氨基酸序列或基本由其組成或由其組成，特別在二聚融合蛋白(例如促濾泡素抑制素-Fc蛋白)的情況下，提供比天然FST(288)和FST(315)形式優(yōu)越的蛋白質(zhì)品質(zhì)和活性。

在某些方面，本公開內(nèi)容提供包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的多肽，其中第一氨基酸序列由選自SEQ ID NO：15和16的氨基酸序列組成，且其中第二氨基酸序列包含免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域。任選存在位于第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之間的接頭多肽。任選接頭多肽包含序列TGGG或基本由其組成或由其組成。任選第二氨基酸序列包含IgG免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域、基本由其組成或由其組成。任選第二氨基酸序列包含與人IgG1相比ADCC活性降低的IgG免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域、基本由其組成或由其組成。任選第二氨基酸序列包含與人IgG1相比CDC活性降低的IgG免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域、基本由其組成或由其組成。任選第二氨基酸序列包含選自IgG1、IgG2和IgG4的IgG免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域、基本由其組成或由其組成。任選第二氨基酸序列包含免疫球蛋白(例如IgG免疫球蛋白)的Fc部分或由其組成，所述免疫球蛋白可為與人IgG1相比ADCC、CDC或兩者降低的免疫球蛋白，其實(shí)例包括IgG2、IgG4和IgG2/4雜合體或IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任一個(gè)的各種突變。在某些方面，本公開內(nèi)容提供促濾泡素抑制素多肽，其包含與選自SEQ ID NO: 38-43的序列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列、基本由其組成或由其組成。在某些方面，本公開內(nèi)容提供促濾泡素抑制素多肽，其包含與選自SEQ ID NO: 26-28和32-34的序列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列、基本由其組成或由其組成。在某些方面，本公開內(nèi)容提供促濾泡素抑制素多肽，其包含與選自SEQ ID NO: 29-31和35-37的序列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列、基本由其組成或由其組成。合乎需要的促濾泡素抑制素多肽可以小于1nM、100pM、50pM或10pM的KD與選自以下的一種或多種配體結(jié)合：肌生成抑制蛋白、GDF-11、激活素A和激活素B。在某些方面，上述多肽的任一個(gè)可以是二聚體，包括異二聚體或同二聚體，或更高級(jí)次多聚體。上述多肽的任一個(gè)可摻入藥物制劑中。

在某些方面，本公開內(nèi)容提供編碼本文所述任何促濾泡素抑制素多肽的核酸和包含所述核酸的細(xì)胞，所述細(xì)胞可用來產(chǎn)生促濾泡素抑制素多肽。

在某些方面，本公開內(nèi)容提供通過將促濾泡素抑制素多肽直接給予組織以治療所述組織或器官的方法。例如，本公開內(nèi)容提供增加患者的肌肉大小或強(qiáng)度的方法，所述方法包括通過肌內(nèi)給藥途徑將有效量的促濾泡素抑制素多肽給予有需要的患者的目標(biāo)肌肉，其中肌肉大小或強(qiáng)度的增加發(fā)生在目標(biāo)肌肉中，且其中促濾泡素抑制素多肽對(duì)肌肉大小或強(qiáng)度不具有實(shí)質(zhì)性的全身作用。目標(biāo)肌肉可能受損、衰弱或有缺陷，正如在包括以下的多種肌肉病癥中的情況：肌營(yíng)養(yǎng)不良(例如杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy)、貝克爾肌營(yíng)養(yǎng)不良(Becker’s muscular dystrophy)和面肩肱型肌營(yíng)養(yǎng)不良(fascioscapulohumeral muscular dystrophy))、炎癥性肌肉病癥(例如包涵體肌炎)、肌肉損傷或創(chuàng)傷、肌肉廢用(如在長(zhǎng)期臥床休息或肢體制動(dòng)之后會(huì)發(fā)生的一樣)和由于衰老、癌癥或不同類型的慢性疾病的結(jié)果肌肉萎縮或弱化。所述方法還可適用于健康的但需要增加目標(biāo)肌肉的肌肉大小或強(qiáng)度的肌肉。另外，將促濾泡素抑制素多肽給予肌肉可引起體脂肪的總體降低，因此可用于治療肥胖癥或其它與過量體脂肪有關(guān)的疾病，任選可將促濾泡素抑制素直接給予脂肪組織?？蓪⒋贋V泡素抑制素多肽給予唯一一個(gè)目標(biāo)肌肉或給予一個(gè)以上目標(biāo)肌肉。所述方法和促濾泡素抑制素多肽可用來實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)組織(例如肌肉)的作用，而對(duì)其它組織(例如非目標(biāo)肌肉或其它器官)無(wú)實(shí)質(zhì)性作用。因此，未觀察到促濾泡素抑制素的全身作用。例如，目標(biāo)肌肉對(duì)側(cè)的肌肉大小或強(qiáng)度不會(huì)被實(shí)質(zhì)性地增加，或者對(duì)患者中選自以下的度量沒有實(shí)質(zhì)性作用：血清FSH水平、肝大小、血細(xì)胞比容、血紅蛋白和網(wǎng)織紅細(xì)胞水平。

附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示人促濾泡素抑制素315的完整、未加工的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)。前導(dǎo)序列用粗體的斜體字表示，促濾泡素抑制素N-端區(qū)(FSN)用單下劃線表示，3個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域(FSD)用雙下劃線表示。具體地說，促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I (FSDI)用紅色字體表示，促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域II (FSDII)用藍(lán)色字體表示，促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域III (FSDIII)用綠色字體表示。

圖2顯示通過用FST(288)-Fc、FST(315)-Fc或ActRIIB-Fc皮下注射的4周治療對(duì)小鼠的無(wú)脂肪組織質(zhì)量的作用。溶媒是Tris緩沖鹽水。數(shù)據(jù)為均值± SEM。*，通過非配對(duì)t檢驗(yàn)相對(duì)于TBS的P ＜ 0.05。#，通過非配對(duì)t檢驗(yàn)相對(duì)于FST組的P ＜ 0.05。與溶媒對(duì)照小鼠相比，F(xiàn)ST(288)-Fc、FST(315)-Fc和ActRIIB-Fc治療導(dǎo)致無(wú)脂肪組織質(zhì)量顯著增加。ActRIIB-Fc治療小鼠無(wú)脂肪組織質(zhì)量的增加顯著大于FST(288)-Fc或FST(315)-Fc治療小鼠中觀察到無(wú)脂肪組織質(zhì)量的增加。

圖3顯示用FST(288)-Fc、FST(315)-Fc或ActRIIB-Fc皮下注射每周兩次的4周治療對(duì)小鼠握力的作用。溶媒是Tris緩沖鹽水。數(shù)據(jù)為均值± SEM。*，通過非配對(duì)t檢驗(yàn)相對(duì)于TBS的P ＜ 0.05。#，通過非配對(duì)t檢驗(yàn)相對(duì)于FST組的P ＜ 0.05。ActRIIB-Fc治療提高小鼠握力。在FST(288)-Fc或FST(315)-Fc治療小鼠中未觀察到握力提高。

圖4顯示用FST(288)-IgG1、FST(315)-IgG1或ActRIIB-Fc皮下注射每周兩次的4周治療對(duì)小鼠胸肌(Pecs)、脛骨前肌(TA)、腓腸肌(Gastroc)和骨股肌質(zhì)量的作用。溶媒是Tris緩沖鹽水。數(shù)據(jù)為均值± SEM。*，通過非配對(duì)t檢驗(yàn)相對(duì)于TBS的P ＜ 0.05。#，通過非配對(duì)t檢驗(yàn)相對(duì)于FST組的P ＜ 0.05。ActRIIB-Fc治療顯著增加小鼠的胸肌、脛骨前肌、腓腸肌和骨股肌質(zhì)量，但在FST(288)-IgG1或FST(315)-IgG1治療小鼠中幾乎沒有或沒有觀察到肌肉質(zhì)量增加。

圖5顯示通過用FST(288)-IgG1或FST(315)-IgG1皮下注射的4周治療對(duì)促卵泡激素(FSH)的血清水平的作用。溶媒是Tris緩沖鹽水。數(shù)據(jù)為均值± SEM。*，通過非配對(duì)t檢驗(yàn)相對(duì)于TBS的P ＜ 0.05。與溶媒對(duì)照小鼠相比，F(xiàn)ST(315)-IgG1治療導(dǎo)致血清FSH水平顯著降低。相比之下，F(xiàn)ST(288)-IgG1治療對(duì)血清FSH水平?jīng)]有作用。

圖6顯示通過用FST(288)-IgG1、FST(315)-IgG1或ActRIIB-mFc皮下注射每周兩次的4周治療對(duì)小鼠的無(wú)脂肪組織質(zhì)量的作用。溶媒是Tris緩沖鹽水。數(shù)據(jù)為均值± SEM。*，通過非配對(duì)t檢驗(yàn)相對(duì)于TBS的P ＜ 0.05。與溶媒對(duì)照小鼠相比，ActRIIB-mFc治療導(dǎo)致無(wú)脂肪組織質(zhì)量顯著增加。在FST(288)-IgG1或FST(315)-IgG1治療小鼠中沒有觀察到無(wú)脂肪組織質(zhì)量增加。

圖7顯示通過用FST(288)-IgG1、FST(315)-IgG1或ActRIIB-mFc肌內(nèi)注射入右腓腸肌每周兩次的4周治療對(duì)小鼠腓腸肌質(zhì)量的作用。溶媒是Tris緩沖鹽水。數(shù)據(jù)為均值± SEM。*，通過非配對(duì)t檢驗(yàn)相對(duì)于TBS的P ＜ 0.05。#，通過非配對(duì)t檢驗(yàn)注射右腓腸肌相對(duì)于未注射左腓腸肌的P ＜ 0.05。FST(288)-IgG1、FST(315)-IgG1和ActRIIB-mFc治療顯著增加注射的右腓腸肌的肌肉質(zhì)量。ActRIIB-mFc治療還顯著增加未注射的左腓腸肌的肌肉質(zhì)量。相比之下，在FST(288)-IgG1或FST(315)-IgG1治療小鼠中在未注射左腓腸肌中未觀察到增加。

圖8顯示通過用不同劑量的FST(288)-IgG1肌內(nèi)注射入右腓腸肌每周兩次的3周治療對(duì)小鼠的腓腸肌質(zhì)量的作用，表示為相對(duì)于未注射左腓腸肌的比率。溶媒為磷酸鹽緩沖鹽水。數(shù)據(jù)為均值± SEM。*，通過非配對(duì)t檢驗(yàn)相對(duì)于PBS的P ＜ 0.05。相對(duì)于未注射肌肉，遞增劑量的FST(288)-IgG1引起經(jīng)注射腓腸肌肥大增加。

圖9顯示通過用FST(291)-IgG1肌內(nèi)注射入左腓腸肌每周兩次的4周治療的作用。溶媒為磷酸鹽緩沖鹽水。數(shù)據(jù)為均值± SEM。*，通過非配對(duì)t檢驗(yàn)相對(duì)于PBS的P ＜ 0.05。相對(duì)于未注射肌肉和相對(duì)于對(duì)照，肌內(nèi)給予FST(291)-IgG2在注射的腓腸肌中引起肌肉質(zhì)量顯著增加。

發(fā)明詳述

1. 概述

在某些方面，本公開內(nèi)容涉及促濾泡素抑制素多肽。本文所用術(shù)語(yǔ)“促濾泡素抑制素”是指來源于任何物種的促濾泡素抑制素(FST)蛋白和促濾泡素抑制素相關(guān)蛋白的家族。促濾泡素抑制素是一種在高級(jí)動(dòng)物的幾乎所有組織中表達(dá)的自分泌糖蛋白。它最初從濾泡液中分離，并鑒定為抑制促卵泡激素(FSH)從垂體前葉中分泌的蛋白質(zhì)部分，因此命名為FSH抑制蛋白(FSP)。隨后，確定其主要功能為結(jié)合并中和TGF-β超家族成員，包括例如激活素，一種提高垂體前葉中FSH分泌的旁分泌激素。

術(shù)語(yǔ)“促濾泡素抑制素多肽”用來指包含保持有用活性包括例如配體結(jié)合(例如肌生成抑制蛋白、GDF-11、激活素A、激活素B)或肝素結(jié)合的促濾泡素抑制素家族的任何天然存在的多肽以及其任何變體(包括突變體、片段、融合物和肽模擬物形式)的多肽。例如，促濾泡素抑制素多肽包括這樣的多肽，其包含來源于與促濾泡素抑制素多肽的序列具有至少約80%同一性、優(yōu)選至少85%、90%、95%、97%、99%或更大同一性的序列的任何已知促濾泡素抑制素序列的氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)“促濾泡素抑制素多肽”可指包含上述多肽的任一個(gè)以及異源(非促濾泡素抑制素)部分的融合蛋白。如果不是唯一存在于SEQ ID NO: 3所示的長(zhǎng)(315個(gè)氨基酸)形式的人促濾泡素抑制素，則氨基酸序列被視為對(duì)促濾泡素抑制素是異源的。本文提供異源部分的許多實(shí)例，所述異源部分可通過氨基酸序列緊接融合蛋白的促濾泡素抑制素多肽部分，或被間插氨基酸序列(例如接頭或其它序列)分隔開來。

根據(jù)可變mRNA剪接和蛋白質(zhì)的可變糖基化，促濾泡素抑制素是分子量范圍為31-49 kDa的單鏈多肽?？勺兗艚拥膍RNA編碼315個(gè)氨基酸(即FST315)和288個(gè)氨基酸(即FST288)的2種蛋白質(zhì)；促濾泡素抑制素315可被進(jìn)一步蛋白水解性降解為促濾泡素抑制素303 (FST303)。氨基酸序列分析顯示，天然人促濾泡素抑制素多肽包含5個(gè)結(jié)構(gòu)域(自N端側(cè)起)：信號(hào)序列肽(SEQ ID NO: 1的氨基酸1-29)、N端結(jié)構(gòu)域(FSN) (SEQ ID NO: 1的氨基酸30-94)、促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I (FSDI) (SEQ ID NO: 1的氨基酸95-164)、促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域II (FSDII) (SEQ ID NO: 1的氨基酸168-239)和促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域III (FSDIII) (SEQ ID NO: 1的氨基酸245-316)。參見PNAS, U.S.A., 1988, 第85卷, 第12期, 第4218-4222頁(yè)。

人促濾泡素抑制素-288 (FST288)前體具有下列氨基酸序列，其中用黑體字表示的信號(hào)肽、用單下劃線表示的N端結(jié)構(gòu)域(FSN)和用雙下劃線表示的促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I-III (FSI、FSII、FSIII)。

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQAGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCN (SEQ ID NO: 1)

加工的(成熟的)人促濾泡素抑制素變體FST(288)具有下列氨基酸序列，其中有用單下劃線表示的N端結(jié)構(gòu)域和用雙下劃線表示的促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I-III。此外，應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可通過加工或有意去除第一半胱氨酸之前的起始氨基酸G或N的任一個(gè)而無(wú)任何后果，并且進(jìn)一步包括包含所述略較小多肽的多肽。

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCN (SEQ ID NO: 2)

人促濾泡素抑制素-315 (FST315)前體具有下列氨基酸序列，其中有用黑體字表示的信號(hào)肽、用單下劃線表示的N端結(jié)構(gòu)域(FSN)和用雙下劃線表示的促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I-III (FSI、FSII、FSIII) (NCBI登記號(hào)AAH04107.1；344個(gè)氨基酸)。

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQAGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW (SEQ ID NO: 3)

加工的(成熟的)人FST(315)具有下列氨基酸序列，其中有用單下劃線表示的N端結(jié)構(gòu)域和用雙下劃線表示的促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I-III。此外，應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可通過加工或有意去除第一半胱氨酸之前的起始氨基酸G或N的任一個(gè)而無(wú)任何后果，并且進(jìn)一步包括包含所述略較小多肽的多肽。

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW (SEQ ID NO: 4)

本公開內(nèi)容的促濾泡素抑制素多肽可包括任何天然存在的促濾泡素抑制素蛋白的結(jié)構(gòu)域及其保持有用活性的變體(例如突變體、片段和肽模擬物形式)。例如，眾所周知，F(xiàn)ST(315)和FST(288)對(duì)激活素(激活素A和激活素B)和肌生成抑制蛋白(和密切相關(guān)的GDF11)兩者具有高親和力，并且促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域(例如FSN和FSD I-III)被視為參與所述TGF-β配體的結(jié)合。然而，據(jù)信，這3個(gè)結(jié)構(gòu)域各自針對(duì)這些TGF-β配體可具有不同的親和力。例如，最新研究表明，只包含N端結(jié)構(gòu)域(FSN)和串聯(lián)的2個(gè)FSDI結(jié)構(gòu)域的多肽構(gòu)建體保持對(duì)肌生成抑制蛋白的高親和力，當(dāng)通過基因表達(dá)引入小鼠中時(shí)顯示對(duì)激活素幾乎沒有或沒有親和力，并促進(jìn)全身肌肉生長(zhǎng)(Nakatani等，The FASEB Journal，第22477-487卷(2008))。

另外，F(xiàn)SDI結(jié)構(gòu)域含有人促濾泡素抑制素的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其具有KKCRMNKKNKPR (SEQ ID NO: 5)的氨基酸序列。該肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域可表示為BBXBXXBBXBXB (SEQ ID NO: 6)，其中“B”意指堿性氨基酸，具體為賴氨酸(K)或精氨酸(R)。因此，某些方面，本公開內(nèi)容包括相對(duì)于天然存在的FST蛋白顯示對(duì)指定TGF-β配體的選擇性結(jié)合和/或抑制(例如保持對(duì)肌生成抑制蛋白的高親和力同時(shí)對(duì)激活素的親和力顯著降低)的變體促濾泡素抑制素蛋白。

在某些方面，本公開內(nèi)容包括包含下文列出的FSN結(jié)構(gòu)域和例如一個(gè)或多個(gè)異源多肽的多肽，此外，應(yīng)認(rèn)識(shí)到，第一半胱氨酸之前的起始氨基酸G或N的任一個(gè)可缺失，如下文所述實(shí)例(SEQ ID NO: 8)。

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKET (SEQ ID NO: 7)

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKET (SEQ ID NO: 8)

在某些方面，本公開內(nèi)容包括這樣的多肽，其包含含有下文所示肌生成抑制蛋白(和/或GDF11)結(jié)合連同肝素結(jié)合的最小核心活性的FSDI結(jié)構(gòu)域和例如一個(gè)或多個(gè)異源多肽。

CENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRC(SEQ ID NO: 9)

FSDI序列可通過表達(dá)為另包含F(xiàn)SN結(jié)構(gòu)域的多肽有利地保持在結(jié)構(gòu)環(huán)境中。因此，本公開內(nèi)容包括包含以下列出的FSN-FSDI序列(SEQ ID NO: 10)和例如一個(gè)或多個(gè)異源多肽的多肽，此外，應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可通過加工或有意去除第一半胱氨酸之前的起始氨基酸G或N的任一個(gè)而無(wú)任何后果，并且進(jìn)一步包括包含所述略較小多肽的多肽。

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRC (SEQ ID NO: 10)

Nakani等人表明，當(dāng)在小鼠中遺傳表達(dá)時(shí)，F(xiàn)SN-FSDI-FSDI構(gòu)建體足以賦予全身肌肉生長(zhǎng)，因此本公開內(nèi)容包括包含以下氨基酸序列和例如一個(gè)或多個(gè)異源多肽的多肽。

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRC (SEQ ID NO: 11)

雖然FSDI序列賦予肌生成抑制蛋白和GDF11結(jié)合，但已證實(shí)激活素，特別是激活素A和激活素B，還是肌肉的負(fù)調(diào)節(jié)劑，因此抑制肌生成抑制蛋白/GDF11組和激活素A/激活素B組兩者的促濾泡素抑制素多肽可提供更強(qiáng)的肌肉作用。此外，鑒于表明的某些促濾泡素抑制素多肽、特別是包含肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、更特別是呈同二聚體形式的多肽(例如Fc融合物)的全身可獲得性低的本文研究結(jié)果，減輕了激活素抑制對(duì)生殖軸和其它組織的已知作用有關(guān)的安全顧慮?？紤]到FSDII賦予激活素A和B結(jié)合，本公開內(nèi)容提供包含F(xiàn)SDI和FSDII (SEQ ID NO: 12)以及FSN-FSDI-FSDII構(gòu)建體(SEQ ID NO: 13)和例如一個(gè)或多個(gè)異源多肽的多肽。

CENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKC (SEQ ID NO: 12)

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKC (SEQ ID NO: 13)

如實(shí)施例中所述，291個(gè)氨基酸(表示天然存在的FST-315的截短)的促濾泡素抑制素多肽具有有利性質(zhì)。因此，未加工的(SEQ ID NO: 14)和成熟的FST(291) (SEQ ID NO: 15)多肽包括在本公開內(nèi)容中，并可與異源蛋白結(jié)合。此外，應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可通過加工或有意去除第一半胱氨酸之前的起始氨基酸G或N的任一個(gè)而無(wú)任何后果，并且進(jìn)一步包括包含所述略較小多肽的多肽，例如下文所示實(shí)例(SEQ ID NO: 16)。

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQAGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSIS (SEQ ID NO: 14)

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSIS (SEQ ID NO: 15)

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSIS (SEQ ID NO: 16)

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用主題促濾泡素抑制素多肽(例如FST-IgG融合多肽)拮抗促濾泡素抑制素的配體(亦稱為促濾泡素抑制素配體)。因此，本公開內(nèi)容的組合物和方法可用于治療與促濾泡素抑制素的一種或多種配體的異?；钚杂嘘P(guān)的病癥。促濾泡素抑制素的示例性配體包括一些TGF-β家族成員，例如激活素A、激活素B、肌生成抑制蛋白(GDF8)和GDF11。

促濾泡素抑制素蛋白在本文可稱為FST。如果后面是數(shù)字，例如FST(288)，則這表明蛋白質(zhì)是促濾泡素抑制素的288形式。如果作為FST(288)-Fc存在，則這表明FST(288)的C端Fc融合物，這可包括或不包括間插接頭。在這種情況下，F(xiàn)c可以是任何免疫球蛋白Fc部分，正如本文定義的該術(shù)語(yǔ)。如果作為FST(288)-IgG2存在，則這表明人IgG2的Fc部分與FST(288)的C端Fc融合物。

激活素是二聚體多肽生長(zhǎng)因子，屬于TGF-β超家族。有3種激活素(A、B和AB)，其是2個(gè)密切相關(guān)的β亞基的同/異二聚體(β_Aβ_A、β_Bβ_B和β_Aβ_B)。已鑒定出另外的激活素C和E，雖然不了解這些蛋白質(zhì)的功能。在TGF-β超家族中，激活素是獨(dú)特的多功能因子，可刺激卵巢和胎盤細(xì)胞中的激素產(chǎn)生、支持神經(jīng)元細(xì)胞存活、根據(jù)細(xì)胞類型積極或消極影響細(xì)胞周期進(jìn)程，并且至少在兩棲動(dòng)物胚胎中誘導(dǎo)中胚層分化(DePaolo等, 1991, Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512；Dyson等, 1997, Curr Biol. 7:81-84；Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol. 55:953-963)。此外，發(fā)現(xiàn)自經(jīng)刺激的人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞分離的紅細(xì)胞分化因子(EDF)與激活素A相同(Murata等，1988，PNAS，85:2434)。已經(jīng)表明，激活素A在骨髓中起紅細(xì)胞生成的天然調(diào)節(jié)劑的作用。在幾種組織中，激活素信號(hào)傳導(dǎo)被其相關(guān)的異二聚體(抑制素)拮抗。例如在從垂體釋放促卵泡激素(FSH)期間，激活素促進(jìn)FSH分泌和合成，而抑制素阻止FSH分泌和合成。激活素還涉及作為肌肉質(zhì)量和功能的負(fù)調(diào)節(jié)劑，且激活素拮抗劑可促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)或?qū)贵w內(nèi)肌肉喪失。Link和Nishi, Exp Cell Res. 1997年6月15日;233(2):350-62；He等, Anat Embryol (Berl). 2005年6月;209(5):401-7；Souza等, Mol Endocrinol. 2008年12月;22(12):2689-702；Am J Physiol Endocrinol Metab. 2009年7月;297(1):E157-64；Gilson等, Zhou等, Cell. 2010年8月20;142(4):531-43。

生長(zhǎng)和分化因子-8 (GDF8)亦稱為肌生成抑制蛋白。GDF8是骨骼肌質(zhì)量的負(fù)調(diào)節(jié)劑。GDF8在發(fā)育的和成熟的骨骼肌中高表達(dá)。轉(zhuǎn)基因小鼠中的GDF8無(wú)效突變的特征在于明顯的骨骼肌肥大和增生(McPherron等，Nature，1997，387:83-90)。在牛中(Ashmore等, 1974, Growth, 38:501-507；Swatland和Kieffer, J. Anim. Sci., 1994, 38:752-757；McPherron和Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:12457-12461；以及Kambadur等, Genome Res., 1997, 7:910-915)和引人側(cè)目地在人類中(Schuelke等，N Engl J Med 2004;350:2682-8)，骨骼肌質(zhì)量的類似增加在天然存在的GDF8突變中是明顯的。研究還顯示與人類HIV感染有關(guān)的肌肉消耗伴有GDF8蛋白質(zhì)表達(dá)的增加(Gonzalez-Cadavid等，PNAS，1998，95:14938-43)。另外，GDF8可調(diào)節(jié)肌肉特異性酶(例如肌酸激酶)的產(chǎn)生，并調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞增殖(WO 00/43781)。GDF8前肽可與成熟的GDF8結(jié)構(gòu)域二聚體非共價(jià)結(jié)合，使其失去生物活性(Miyazono等, (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415；Wakefield等, (1988) J. Biol. Chem., 263；7646-7654；以及Brown等, (1990) Growth Factors, 3: 35-43)。與GDF8或結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)合并抑制其生物活性的其它蛋白質(zhì)包括促濾泡素抑制素，并可能包括促濾泡素抑制素相關(guān)蛋白(Gamer等, (1999) Dev. Biol., 208: 222-232)。

本說明書所用術(shù)語(yǔ)通常具有其在本領(lǐng)域、在本發(fā)明的情況下和在使用各個(gè)術(shù)語(yǔ)的具體情況下的普通含義。下文或本說明書其它部分論述了某些術(shù)語(yǔ)以提供，為從業(yè)人員在描述本發(fā)明的組合物和方法及如何制備和使用它們時(shí)提供額外的指導(dǎo)。從術(shù)語(yǔ)使用的具體情況看，術(shù)語(yǔ)的任何應(yīng)用范圍或含義都將是顯而易見的。

“約”和“大約”總的來講可意指鑒于測(cè)量的性質(zhì)或精確度，對(duì)所測(cè)定的量的可接受的誤差度。通常，示例性誤差度通常在給定值或值的范圍的百分之20 (20%)、優(yōu)選10%、更優(yōu)選5%內(nèi)。

或者，特別是在生物系統(tǒng)中，術(shù)語(yǔ)“約”和“大約”可意指在給定值的數(shù)量級(jí)以內(nèi)、優(yōu)選5倍以內(nèi)、更優(yōu)選2倍以內(nèi)的值。本文給出的數(shù)值的量是近似值，除非另有說明，意指在未明確表示時(shí)，可被推測(cè)為術(shù)語(yǔ)“約”或“大約”。

本發(fā)明的方法可包括將序列彼此進(jìn)行比較的步驟，包括野生型序列與一個(gè)或多個(gè)突變型(序列變體)比較。這類比較通常包括多聚體序列的比對(duì)，例如應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的序列比對(duì)程序和/或算法(例如BLAST、FASTA和MEGALIGN等)。技術(shù)人員可容易理解的是，在其中突變含有殘基插入或缺失的所述比對(duì)中，序列比對(duì)可在不含插入殘基或缺失殘基的多聚體序列中引入“空位” (通常用破折號(hào)或“A”表示)。

在所有其語(yǔ)法形式和拼法變化中，“同源的”是指具有“共同進(jìn)化起源”的兩種蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，包括來源于同一生物物種超家族的蛋白質(zhì)以及來源于不同生物物種的同源蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)(及其編碼核酸)具有序列同源性，正如其序列相似性所反映的一樣，不論就百分比同一性而言，還是就特定殘基或基序和保守位置的存在情況而論。然而，在普通用法中以及在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“同源的”當(dāng)用副詞(例如“高度地”)修飾時(shí)，可以是指序列相似性，并且可能與共同進(jìn)化起源有關(guān)或無(wú)關(guān)。

在所有其全部語(yǔ)法形式中，術(shù)語(yǔ)“序列相似性”是指可能有或沒有共同進(jìn)化起源的核酸或氨基酸序列之間的同一性或一致性程度。

2. 促濾泡素抑制素多肽

在某些方面，本公開內(nèi)容涉及促濾泡素抑制素多肽(例如FST-Fc多肽)，和特別是通過包含SEQ ID NO: 2、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16的多肽例示的截短形式及其變體。任選片段、功能變體和修飾形式具有其相應(yīng)野生型促濾泡素抑制素多肽相似、相同或改進(jìn)的生物活性。例如，本公開內(nèi)容的促濾泡素抑制素變體可與促濾泡素抑制素配體(例如激活素A、激活素AB、激活素B和GDF8)結(jié)合并抑制其功能。任選促濾泡素抑制素多肽調(diào)節(jié)組織(特別是肌肉)的生長(zhǎng)。促濾泡素抑制素多肽的實(shí)例包括包含SEQ ID No: 1-16和26-43任一個(gè)的氨基酸序列、基本由其組成或由其組成的多肽，以及包含與SEQ ID No: 1-16和26-43任一個(gè)的氨基酸序列有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列、基本由其組成或由其組成的多肽?？砂凑障旅娴闹笇?dǎo)制備這些多肽的變化。促濾泡素抑制素多肽的氨基酸的編號(hào)以SEQ ID NO: 1的序列為基礎(chǔ)，不論是否使用天然前導(dǎo)序列。

如上所述，促濾泡素抑制素的特征在于3個(gè)富含半胱氨酸的區(qū)域(即FS結(jié)構(gòu)域I-III)，其被認(rèn)為介導(dǎo)促濾泡素抑制素配體結(jié)合。此外，研究人員證實(shí)，僅包含3個(gè)FS-結(jié)合結(jié)構(gòu)域之一(例如FSDI)的多肽構(gòu)建體保持對(duì)某些促濾泡素抑制素配體(例如肌生成抑制蛋白)的強(qiáng)親和力，并且體內(nèi)是有活性的。參見Nakatani等，F(xiàn)ASEB Journal，第22477-487卷(2008)。因此，本公開內(nèi)容的變體促濾泡素抑制素多肽可包含促濾泡素抑制素蛋白的一個(gè)或多個(gè)活性部分。例如，本公開內(nèi)容的構(gòu)建體可始于相當(dāng)于SEQ ID NO: 1的氨基酸30-95的殘基并終于相當(dāng)于SEQ ID NO: 1的氨基酸316-344的位置。其它實(shí)例包括始于SEQ ID NO: 1的30-95位置并終于相當(dāng)于氨基酸164-167或238-244的位置的構(gòu)建體。其它實(shí)例可包括SEQ ID No: 7-16的任一個(gè)。

本文所述促濾泡素抑制素變化可以不同方式彼此或與異源氨基酸序列結(jié)合。例如，本公開內(nèi)容的變體促濾泡素抑制素蛋白包括包含選自FSDI (SEQ ID NO: 1的氨基酸95-164 (即SEQ ID NO: 2)、FSDII (SEQ ID NO: 1的氨基酸168-239)或FSDIII (SEQ ID NO: 1的氨基酸245-316)的一個(gè)或多個(gè)FS結(jié)構(gòu)域的多肽以及包含選自與FSDI (SEQ ID NO: 1的氨基酸95-164 (即SEQ ID NO: 2)、FSDII (SEQ ID NO: 1的氨基酸168-239)或FSDIII (SEQ ID NO: 1的氨基酸245-316)有至少80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列的一個(gè)或多個(gè)FS結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。這些FS結(jié)構(gòu)域可以任何順序在本公開內(nèi)容的變體促濾泡素抑制素多肽內(nèi)結(jié)合，條件是所述重組蛋白保持所需活性，包括例如促濾泡素抑制素配體結(jié)合活性(例如肌生成抑制蛋白)和生物活性(例如誘導(dǎo)肌肉質(zhì)量和/或強(qiáng)度)。所述促濾泡素抑制素變體多肽的實(shí)例包括例如具有例如FSDI-FSDII-FSDIII、FSDI-FSDIII、FSDI-FSDI-FSDIII、FSDI-FSDII、FSDI-FSDI、FSN-FSDI-FSDII-FSDIII、FSN-FSDI-FSDII、FSN-FSDI-FSDI、FSN-FSDI-FSDIII、FSN-FSDI-FSDI-FSDIII等結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的多肽和使其它異源多肽與這些多肽的N端或C端融合所得到的多肽。這些結(jié)構(gòu)域可直接連接或通過接頭多肽連接。任選多肽接頭可為任何序列，并可包含1-50、優(yōu)選1-10、更優(yōu)選1-5個(gè)氨基酸。在某些方面，優(yōu)選的接頭不含半胱氨酸氨基酸。

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的促濾泡素抑制素變體對(duì)一種或多種促濾泡素抑制素配體的結(jié)合親和力降低或消除。在某些方面，本公開內(nèi)容提供對(duì)激活素的結(jié)合親和力降低或消除的促濾泡素抑制素變體。在某些方面，本公開內(nèi)容提供對(duì)激活素結(jié)合親和力降低或消除但保持對(duì)肌生成抑制蛋白的高親和力的促濾泡素抑制素變體。

在某些方面，本公開內(nèi)容提供不包含相當(dāng)于FSDII結(jié)構(gòu)域或功能活性FSDII結(jié)構(gòu)域的序列的促濾泡素抑制素變體。例如，本公開內(nèi)容的促濾泡素抑制素多肽可包括通過FSDII結(jié)構(gòu)域的部分或完全缺失獲得的部分或完全缺失的變體。在某些方面，所述促濾泡素抑制素變體包括FSDII區(qū)內(nèi)一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基的缺失或用非半胱氨酸氨基酸的取代。

本公開內(nèi)容的促濾泡素抑制素蛋白可包含信號(hào)序列。信號(hào)序列可以是促濾泡素抑制素蛋白的天然信號(hào)序列(例如SEQ ID NO: 1的氨基酸1-29)或來自其它蛋白質(zhì)的信號(hào)序列，例如組織纖溶酶原激活物(TPA)信號(hào)序列或蜂毒肽(honey bee melatin, HBM)信號(hào)序列。

此外可將N聯(lián)糖基化位點(diǎn)(N-X-S/T)加至促濾泡素抑制素多肽上，并且可延長(zhǎng)FST-Fc融合蛋白的血清半壽期。一般可在配體結(jié)合袋外的位置上引入N-X-S/T序列。可在促濾泡素抑制素序列和Fc或其它融合物組分之間的接頭中引入N-X-S/T序列?？赏ㄟ^在相對(duì)于先存在的S或T的正確位置中引入N，或通過相當(dāng)于先存在的N的位置上引入S或T，以最小的努力引入所述位點(diǎn)?？蓪㈩A(yù)測(cè)待被糖基化的任何S變成T而不產(chǎn)生免疫原性位點(diǎn)，這是因?yàn)樘腔峁┑谋Ｗo(hù)。同樣，可將預(yù)測(cè)待被糖基化的任何T變成S。因此，促濾泡素抑制素變體可包括一個(gè)或多個(gè)額外的非內(nèi)源N聯(lián)糖基化共有序列。

在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容考慮了通過修飾促濾泡素抑制素多肽的結(jié)構(gòu)制備功能變體用于提高治療功效或穩(wěn)定性(例如離體保存限期和對(duì)體內(nèi)蛋白水解性降解的抗性)的目的。還可例如通過氨基酸取代、缺失或添加，產(chǎn)生修飾的促濾泡素抑制素多肽。例如，有理由預(yù)期，亮氨酸被異亮氨酸或纈氨酸單獨(dú)置換、天冬氨酸被谷氨酸單獨(dú)置換、蘇氨酸被絲氨酸單獨(dú)置換，或者氨基酸被結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸進(jìn)行類似置換(例如保守突變)將不會(huì)對(duì)所得分子的生物活性產(chǎn)生重大影響。保守置換是發(fā)生在其側(cè)鏈上是相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)的置換。通過評(píng)價(jià)變體促濾泡素抑制素多肽以類似于野生型促濾泡素抑制素多肽的方式在細(xì)胞中產(chǎn)生反應(yīng)，或以類似于野生型促濾泡素抑制素的方式與一種或多種配體(例如激活素或肌生成抑制蛋白)結(jié)合的能力，可容易地確定促濾泡素抑制素多肽的氨基酸序列的變化是否產(chǎn)生功能同系物。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮了促濾泡素抑制素多肽的特異性突變以改變多肽的糖基化?？蛇x擇所述突變以引入或消除一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)，例如O聯(lián)或N聯(lián)糖基化位點(diǎn)。天冬酰胺聯(lián)糖基化識(shí)別位點(diǎn)一般包含三肽序列天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中“X”是任何氨基酸)，其被合適的細(xì)胞糖基化酶特異性識(shí)別。還可通過將一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基序列添加至野生型促濾泡素抑制素多肽的序列中(對(duì)于O聯(lián)糖基化位點(diǎn))或用一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基置換，來進(jìn)行改變。在糖基化識(shí)別位點(diǎn)的第一或第三氨基酸位置的一個(gè)或兩個(gè)處的各種氨基酸取代或缺失(和/或第二位置的氨基酸缺失)在修飾的三肽序列上導(dǎo)致非糖基化。在促濾泡素抑制素多肽中增加糖部分的數(shù)目的另一種方法是通過糖苷與促濾泡素抑制素多肽的化學(xué)或酶促偶聯(lián)。根據(jù)所采用的偶聯(lián)方式，可將糖連接至：(a)精氨酸和組氨酸；(b)游離羧基；(c)游離巰基，例如半胱氨酸的巰基；(d)游離羥基，例如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的羥基；(e)芳族殘基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族殘基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基。這些方法描述于1987年9月11日公布的WO 87/05330以及Aplin和Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 第259-306頁(yè)，通過引用結(jié)合到本文中。可用化學(xué)方法和/或酶方法實(shí)現(xiàn)ActRIIB多肽上存在的一個(gè)或多個(gè)糖部分的脫去?；瘜W(xué)去糖基化可包括例如將促濾泡素抑制素多肽暴露于化合物三氟甲烷磺酸或等同化合物中。這種處理導(dǎo)致除連接糖(N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰半乳糖胺)以外的大部分或所有糖被切割，同時(shí)保持氨基酸序列完整?；瘜W(xué)去糖基化另描述于Hakimuddin等(1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52和Edge等(1981) Anal. Biochem. 118:131?？砂碩hotakura等(1987) Meth. Enzymol. 138:350所述，通過使用各種內(nèi)切糖苷酶和外切糖苷酶完成促濾泡素抑制素多肽上的糖部分的酶促切割。適當(dāng)時(shí)，可根據(jù)所采用的表達(dá)系統(tǒng)類型，調(diào)整促濾泡素抑制素多肽的序列，因?yàn)椴溉閯?dòng)物、酵母、昆蟲和植物細(xì)胞均可引入可受所述肽的氨基酸序列影響的不同糖基化模式。一般而言，用于人的促濾泡素抑制素蛋白可在提供適當(dāng)糖基化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(例如HEK293或CHO細(xì)胞系)中表達(dá)，雖然預(yù)期其它哺乳動(dòng)物表達(dá)細(xì)胞系、具有工程改造的糖基化酶的酵母細(xì)胞系以及昆蟲細(xì)胞也是有用的。

本公開內(nèi)容還考慮產(chǎn)生變體、特別是數(shù)套促濾泡素抑制素多肽的組合變體(任選包括截短變體)的方法；組合突變型庫(kù)尤其可用于鑒定功能變體序列。篩選所述組合文庫(kù)的目的可以是產(chǎn)生例如具有改變的性質(zhì)(例如具有改變的藥代動(dòng)力學(xué)或改變的配體結(jié)合)的促濾泡素抑制素多肽變體。下面提供各種篩選測(cè)定法，所述測(cè)定法可用來評(píng)價(jià)變體。例如，可針對(duì)與促濾泡素抑制素多肽結(jié)合的能力篩選促濾泡素抑制素多肽變體，以防止促濾泡素抑制素配體與促濾泡素抑制素多肽結(jié)合。

還可以在基于細(xì)胞的測(cè)定法或體內(nèi)測(cè)定法中測(cè)試促濾泡素抑制素多肽或其變體的活性。例如，可評(píng)價(jià)促濾泡素抑制素多肽變體對(duì)參與肌肉產(chǎn)生的基因表達(dá)的作用。這可根據(jù)需要在一種或多種重組促濾泡素抑制素配體蛋白(例如激活素A)存在下進(jìn)行，可以轉(zhuǎn)染細(xì)胞以產(chǎn)生促濾泡素抑制素多肽和/或其變體，任選促濾泡素抑制素配體。同樣，可將促濾泡素抑制素多肽給予小鼠或其它動(dòng)物，并可評(píng)價(jià)一個(gè)或多個(gè)肌肉性質(zhì)，例如肌肉質(zhì)量或強(qiáng)度。所述測(cè)定法是本領(lǐng)域眾所周知的和常規(guī)的。易起反應(yīng)的報(bào)道基因可用于所述細(xì)胞系以監(jiān)測(cè)對(duì)下游信號(hào)傳導(dǎo)的作用。

可以制備具有相對(duì)于天然存在的促濾泡素抑制素多肽選擇性功效普遍提高的組合衍生的變體。所述變體蛋白，當(dāng)自重組DNA構(gòu)建體表達(dá)時(shí)，可用于基因治療方案。同樣，誘變可產(chǎn)生與相應(yīng)的野生型促濾泡素抑制素多肽相比胞內(nèi)半壽期十分不同的變體。例如，對(duì)于蛋白水解性降解或者導(dǎo)致天然促濾泡素抑制素多肽破壞或以其它方式失活的其它細(xì)胞過程，可使經(jīng)改變的蛋白質(zhì)更穩(wěn)定或更不穩(wěn)定?？衫盟鲎凅w和編碼所述變體的基因，以通過調(diào)節(jié)促濾泡素抑制素多肽的半壽期，改變促濾泡素抑制素多肽水平。例如，短的半壽期可產(chǎn)生更短暫的生物作用，并且當(dāng)為誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)的一部分時(shí)，可允許更密切地控制細(xì)胞內(nèi)的重組促濾泡素抑制素多肽水平。

在某些實(shí)施方案中，除天然存在于促濾泡素抑制素多肽中的任何修飾以外，本公開內(nèi)容的促濾泡素抑制素多肽還可包含翻譯后修飾。所述修飾包括但不限于乙?；Ⅳ然?、糖基化、磷酸化、脂化和?；Ｒ虼?，修飾的促濾泡素抑制素多肽可含有非氨基酸成分，例如聚乙二醇、脂質(zhì)、多糖或單糖和磷酸酯。可按照本文有關(guān)其它促濾泡素抑制素多肽變體方面所述，測(cè)試所述非氨基酸成分對(duì)促濾泡素抑制素多肽的功能性的作用。如果促濾泡素抑制素多肽在細(xì)胞中通過切割促濾泡素抑制素多肽的新生形式產(chǎn)生，則翻譯后加工對(duì)于蛋白質(zhì)的正確折疊和/或功能也可能是重要的。對(duì)于所述翻譯后活性，不同的細(xì)胞(例如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293)具有特定的細(xì)胞機(jī)器和特有機(jī)制，可選擇不同的細(xì)胞以確保促濾泡素抑制素多肽的正確修飾和加工。

在某些方面，促濾泡素抑制素多肽的功能變體或修飾形式包括具有促濾泡素抑制素多肽的至少一部分和一個(gè)或多個(gè)融合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。所述融合結(jié)構(gòu)域的眾所周知的實(shí)例包括但不限于聚組氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、硫氧還蛋白、A蛋白、G蛋白、免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(Fc)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)或人血清白蛋白?？蛇x擇融合結(jié)構(gòu)域以提供所需要的性質(zhì)。例如，一些融合結(jié)構(gòu)域特別可用于通過親和層析法分離融合蛋白。為了親和純化的目的，使用用于親和層析法的相關(guān)基質(zhì)，例如谷胱甘肽綴合樹脂、淀粉酶綴合樹脂和鎳綴合樹脂或鈷綴合樹脂。所述基質(zhì)的許多種可以“試劑盒”形式獲得，例如Pharmacia GST純化系統(tǒng)和可與(HIS₆)融合配偶體一起使用的QIAexpress^TM系統(tǒng)(Qiagen)。作為另一個(gè)實(shí)例，可選擇融合結(jié)構(gòu)域以促進(jìn)促濾泡素抑制素多肽的檢測(cè)。所述檢測(cè)結(jié)構(gòu)域的實(shí)例包括各種熒光蛋白(例如GFP)以及“表位標(biāo)簽”，其通常是短肽序列，可獲得其特異性抗體。易獲得其特異性單克隆抗體的眾所周知的表位標(biāo)簽包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)和c-myc標(biāo)簽。在一些情況下，融合結(jié)構(gòu)域具有蛋白酶切割位點(diǎn)(例如因子Xa或凝血酶的切割位點(diǎn))，其允許相關(guān)蛋白酶部分消化融合蛋白，從而從中釋放重組蛋白。然后，可通過隨后的層析分離，從融合結(jié)構(gòu)域分離出釋放的蛋白質(zhì)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，促濾泡素抑制素多肽與體內(nèi)穩(wěn)定促濾泡素抑制素多肽的結(jié)構(gòu)域(“穩(wěn)定劑”結(jié)構(gòu)域)融合。所謂“穩(wěn)定”意指延長(zhǎng)血清半壽期的任何事物，不論這是否是因?yàn)槠茐臏p少、腎清除率降低還是其它藥代動(dòng)力學(xué)的作用。已知與免疫球蛋白的Fc部分的融合物賦予多種蛋白質(zhì)所需要的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。同樣，與人血清白蛋白的融合物可賦予所需要的性質(zhì)?？蛇x擇的融合結(jié)構(gòu)域的其它類型包括多聚化(例如二聚化、四聚化)結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域(其提供額外的生物功能，例如肌肉生長(zhǎng)的進(jìn)一步刺激)。

作為具體實(shí)例，本公開內(nèi)容提供含有包含與免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域(例如免疫球蛋白的CH1、CH2或CH3結(jié)構(gòu)域)的多肽或Fc融合的促濾泡素抑制素多肽的融合蛋白。下面提供來源于人IgG1和IgG2的Fc結(jié)構(gòu)域(分別為SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18)。如本文所述，IgG2、IgG4或IgG2/4 Fc結(jié)構(gòu)域?qū)εc保持肝素結(jié)合活性的促濾泡素抑制素多肽融合是特別有利的，因?yàn)檫@些Fc物類的CDC和/或ADCC活性(這對(duì)這些肝素結(jié)合多肽可與之附著的細(xì)胞是有害的)降低。已知降低CDC或ADCC活性的其它突變，總的來說，這些變體的任一種都包括在本公開內(nèi)容中，并可用作促濾泡素抑制素融合蛋白的有利組分。任選SEQ ID NO: 17的Fc結(jié)構(gòu)域在例如Asp-265、Lys-322和Asn-434 (按照相應(yīng)的全長(zhǎng)IgG1編號(hào))等殘基處具有一個(gè)或多個(gè)突變。在某些情況下，相對(duì)于野生型Fc結(jié)構(gòu)域，具有這些突變的一個(gè)或多個(gè)(例如Asp-265突變)的突變體Fc結(jié)構(gòu)域與Fcγ受體結(jié)合的能力降低。在其它情況下，相對(duì)于野生型Fc結(jié)構(gòu)域，這些突變的一個(gè)或多個(gè)(例如Asn-434突變)的突變體Fc結(jié)構(gòu)域與MHC I類相關(guān)Fc受體(FcRN)結(jié)合的能力提高。

可使用的人IgG1和IgG2氨基酸序列的實(shí)例見下：

IgG1

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 17)

IgG2

VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 18)

要了解，融合蛋白的不同成分可以與所需功能性一致的任何方式排列。例如，可將促濾泡素抑制素多肽置于異源結(jié)構(gòu)域的C端，或者，可將異源結(jié)構(gòu)域置于促濾泡素抑制素多肽的C端。促濾泡素抑制素多肽結(jié)構(gòu)域和異源結(jié)構(gòu)域在融合蛋白中不必鄰接，并且任一結(jié)構(gòu)域的C端或N端或在結(jié)構(gòu)域之間可包括其它結(jié)構(gòu)域或氨基酸序列。

本文所用術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域”或簡(jiǎn)稱“Fc”要理解為是指免疫球蛋白鏈恒定區(qū)、優(yōu)選免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的羧基端部分或其部分。例如，免疫球蛋白Fc區(qū)可包含1) CH1結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，2) CH1結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域，3) CH1結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，4) CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，或5)兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫球蛋白Fc區(qū)包含至少免疫球蛋白鉸鏈區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，并優(yōu)選缺乏CH1結(jié)構(gòu)域。還要了解，促濾泡素抑制素多肽可只包含免疫球蛋白的一個(gè)結(jié)構(gòu)域，例如CH1結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域的多個(gè)提供所需藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)以及二聚化或高級(jí)次多聚化。

在一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈恒定區(qū)來源于其中的免疫球蛋白類別為IgG (Igγ) (γ亞類1、2、3或4)?？墒褂妹庖咔虻鞍椎钠渌悇eIgA (Igα)、IgD (Igδ)、IgE (Igε)和IgM (Igμ)。合適免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的選擇詳細(xì)論述于美國(guó)專利號(hào)5,541,087和5,726,044。為獲得特定結(jié)果的來自某些免疫球蛋白類別和亞類的具體免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列的選擇被視為在本領(lǐng)域的技術(shù)水平內(nèi)。編碼免疫球蛋白Fc區(qū)的DNA構(gòu)建體的部分優(yōu)選包含鉸鏈結(jié)構(gòu)域的至少一部分，優(yōu)選Fc γ的CH₃結(jié)構(gòu)域或IgA、IgD、IgE或IgM任一種的同源結(jié)構(gòu)域的至少一部分。

此外，預(yù)期免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)內(nèi)氨基酸的取代或缺失可用于實(shí)施本文公開的方法和組合物。一個(gè)實(shí)例可為將氨基酸取代引入上部CH2區(qū)以產(chǎn)生對(duì)Fc受體的親和力降低的Fc變體(Cole等(1997) J. Immunol. 159:3613)。另外，在許多情況下，可脫去C端賴氨酸或K，因此本文所述任何多肽可省略存在于Fc結(jié)構(gòu)域中的C端K，例如SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18所示那些。

在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的促濾泡素抑制素多肽含有能夠穩(wěn)定促濾泡素抑制素多肽的一個(gè)或多個(gè)修飾。例如，所述修飾延長(zhǎng)促濾泡素抑制素多肽的體外半壽期、延長(zhǎng)促濾泡素抑制素多肽的循環(huán)半壽期或降低促濾泡素抑制素多肽的蛋白水解性降解。所述穩(wěn)定修飾包括但不限于融合蛋白(包括例如包含促濾泡素抑制素多肽和穩(wěn)定劑結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)、糖基化位點(diǎn)的修飾(包括例如糖基化位點(diǎn)加至促濾泡素抑制素多肽上)和糖部分的修飾(包括例如從促濾泡素抑制素多肽中脫去糖部分)。在融合蛋白的情況下，促濾泡素抑制素多肽與穩(wěn)定劑結(jié)構(gòu)域(例如IgG分子(例如Fc結(jié)構(gòu)域))融合。本文使用的術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定劑結(jié)構(gòu)域”不僅僅是指融合蛋白的情況下的融合結(jié)構(gòu)域(例如Fc)，而且還包括非蛋白質(zhì)修飾(例如糖部分)或非蛋白質(zhì)聚合物(例如聚乙二醇)。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明可獲得促濾泡素抑制素多肽的分離和/或純化形式，其分離自其它蛋白質(zhì)或以別的方式基本不含其它蛋白質(zhì)。

在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的促濾泡素抑制素多肽(未修飾的或修飾的)可通過多種本領(lǐng)域已知技術(shù)產(chǎn)生。例如，所述促濾泡素抑制素多肽可采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)例如描述于以下文獻(xiàn)的技術(shù)合成：Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993)和Grant G. A. (編輯), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992)。另外，自動(dòng)化肽合成儀是市購(gòu)可獲得的(例如Advanced ChemTech Model 396；Milligen/Biosearch 9600)?；蛘撸贋V泡素抑制素多肽、其片段或變體可采用本領(lǐng)域眾所周知的各種表達(dá)系統(tǒng)(例如大腸桿菌(E. coli)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、COS細(xì)胞、桿狀病毒)重組產(chǎn)生(另見下文)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，可通過使用例如蛋白酶(例如胰蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶或成對(duì)堿性氨基酸轉(zhuǎn)化酶(PACE))消化天然存在的或重組產(chǎn)生的全長(zhǎng)促濾泡素抑制素多肽，來產(chǎn)生修飾或未修飾的促濾泡素抑制素多肽?？蓱?yīng)用計(jì)算機(jī)分析(應(yīng)用市購(gòu)可獲得的軟件，例如MacVector，Omega，PCGene，Molecular Simulation，Inc.)鑒定蛋白酶水解性切割位點(diǎn)?；蛘?，可通過例如本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如通過化學(xué)切割(例如溴化氰、羥胺)從天然存在的或重組產(chǎn)生的全長(zhǎng)促濾泡素抑制素多肽產(chǎn)生所述促濾泡素抑制素多肽。

3. 核酸編碼促濾泡素抑制素多肽

在某些方面，本發(fā)明提供編碼本文公開的任何促濾泡素抑制素多肽的分離核酸和/或重組核酸。主題核酸可為單鏈的或雙鏈的。所述核酸可為DNA或RNA分子。這些核酸可用于例如制備促濾泡素抑制素多肽的方法。

例如，下列序列編碼天然存在的人促濾泡素抑制素前體多肽(SEQ ID NO: 19) (NCBI登記號(hào)BC004107.2，1032 bp)：

atggtccgcgcgaggcaccagccgggtgggctttgcctcctgctgctgctgctctgccagttcatggaggaccgcagtgcccaggctgggaactgctggctccgtcaagcgaagaacggccgctgccaggtcctgtacaagaccgaactgagcaaggaggagtgctgcagcaccggccggctgagcacctcgtggaccgaggaggacgtgaatgacaacacactcttcaagtggatgattttcaacgggggcgcccccaactgcatcccctgtaaagaaacgtgtgagaacgtggactgtggacctgggaaaaaatgccgaatgaacaagaagaacaaaccccgctgcgtctgcgccccggattgttccaacatcacctggaagggtccagtctgcgggctggatgggaaaacctaccgcaatgaatgtgcactcctaaaggcaagatgtaaagagcagccagaactggaagtccagtaccaaggcagatgtaaaaagacttgtcgggatgttttctgtccaggcagctccacatgtgtggtggaccagaccaataatgcctactgtgtgacctgtaatcggatttgcccagagcctgcttcctctgagcaatatctctgtgggaatgatggagtcacctactccagtgcctgccacctgagaaaggctacctgcctgctgggcagatctattggattagcctatgagggaaagtgtatcaaagcaaagtcctgtgaagatatccagtgcactggtgggaaaaaatgtttatgggatttcaaggttgggagaggccggtgttccctctgtgatgagctgtgccctgacagtaagtcggatgagcctgtctgtgccagtgacaatgccacttatgccagcgagtgtgccatgaaggaagctgcctgctcctcaggtgtgctactggaagtaaagcactccggatcttgcaactccatttcggaagacaccgaggaagaggaggaagatgaagaccaggactacagctttcctatatcttctattctagagtgg

下列序列編碼成熟的FST(315)多肽(SEQ ID NO: 20)。

gggaactgctggctccgtcaagcgaagaacggccgctgccaggtcctgtacaagaccgaactgagcaaggaggagtgctgcagcaccggccggctgagcacctcgtggaccgaggaggacgtgaatgacaacacactcttcaagtggatgattttcaacgggggcgcccccaactgcatcccctgtaaagaaacgtgtgagaacgtggactgtggacctgggaaaaaatgccgaatgaacaagaagaacaaaccccgctgcgtctgcgccccggattgttccaacatcacctggaagggtccagtctgcgggctggatgggaaaacctaccgcaatgaatgtgcactcctaaaggcaagatgtaaagagcagccagaactggaagtccagtaccaaggcagatgtaaaaagacttgtcgggatgttttctgtccaggcagctccacatgtgtggtggaccagaccaataatgcctactgtgtgacctgtaatcggatttgcccagagcctgcttcctctgagcaatatctctgtgggaatgatggagtcacctactccagtgcctgccacctgagaaaggctacctgcctgctgggcagatctattggattagcctatgagggaaagtgtatcaaagcaaagtcctgtgaagatatccagtgcactggtgggaaaaaatgtttatgggatttcaaggttgggagaggccggtgttccctctgtgatgagctgtgccctgacagtaagtcggatgagcctgtctgtgccagtgacaatgccacttatgccagcgagtgtgccatgaaggaagctgcctgctcctcaggtgtgctactggaagtaaagcactccggatcttgcaactccatttcggaagacaccgaggaagaggaggaagatgaagaccaggactacagctttcctatatcttctattctagagtgg

下列序列編碼FST(288)多肽(SEQ ID NO: 21)。

gggaactgctggctccgtcaagcgaagaacggccgctgccaggtcctgtacaagaccgaactgagcaaggaggagtgctgcagcaccggccggctgagcacctcgtggaccgaggaggacgtgaatgacaacacactcttcaagtggatgattttcaacgggggcgcccccaactgcatcccctgtaaagaaacgtgtgagaacgtggactgtggacctgggaaaaaatgccgaatgaacaagaagaacaaaccccgctgcgtctgcgccccggattgttccaacatcacctggaagggtccagtctgcgggctggatgggaaaacctaccgcaatgaatgtgcactcctaaaggcaagatgtaaagagcagccagaactggaagtccagtaccaaggcagatgtaaaaagacttgtcgggatgttttctgtccaggcagctccacatgtgtggtggaccagaccaataatgcctactgtgtgacctgtaatcggatttgcccagagcctgcttcctctgagcaatatctctgtgggaatgatggagtcacctactccagtgcctgccacctgagaaaggctacctgcctgctgggcagatctattggattagcctatgagggaaagtgtatcaaagcaaagtcctgtgaagatatccagtgcactggtgggaaaaaatgtttatgggatttcaaggttgggagaggccggtgttccctctgtgatgagctgtgccctgacagtaagtcggatgagcctgtctgtgccagtgacaatgccacttatgccagcgagtgtgccatgaaggaagctgcctgctcctcaggtgtgctactggaagtaaagcactccggatcttgcaac

下列序列編碼成熟的FST(291)多肽(SEQ ID NO: 22)。

gggaactgctggctccgtcaagcgaagaacggccgctgccaggtcctgtacaagaccgaactgagcaaggaggagtgctgcagcaccggccggctgagcacctcgtggaccgaggaggacgtgaatgacaacacactcttcaagtggatgattttcaacgggggcgcccccaactgcatcccctgtaaagaaacgtgtgagaacgtggactgtggacctgggaaaaaatgccgaatgaacaagaagaacaaaccccgctgcgtctgcgccccggattgttccaacatcacctggaagggtccagtctgcgggctggatgggaaaacctaccgcaatgaatgtgcactcctaaaggcaagatgtaaagagcagccagaactggaagtccagtaccaaggcagatgtaaaaagacttgtcgggatgttttctgtccaggcagctccacatgtgtggtggaccagaccaataatgcctactgtgtgacctgtaatcggatttgcccagagcctgcttcctctgagcaatatctctgtgggaatgatggagtcacctactccagtgcctgccacctgagaaaggctacctgcctgctgggcagatctattggattagcctatgagggaaagtgtatcaaagcaaagtcctgtgaagatatccagtgcactggtgggaaaaaatgtttatgggatttcaaggttgggagaggccggtgttccctctgtgatgagctgtgccctgacagtaagtcggatgagcctgtctgtgccagtgacaatgccacttatgccagcgagtgtgccatgaaggaagctgcctgctcctcaggtgtgctactggaagtaaagcactccggatcttgcaactccatttcgtgg

在某些方面，要進(jìn)一步了解，編碼促濾泡素抑制素多肽的主題核酸包括是SEQ ID NO: 19-22的變體的核酸。變體核苷酸序列包括因一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、添加或缺失而不同的序列，例如等位基因變體；因此，可包括不同于SEQ ID NO: 19-22指定的編碼序列的核苷酸序列的編碼序列。

在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供與SEQ ID NO: 19-22有至少80%、85%、90%、95%、96% 97%、98%、99%或100%同一性的分離核酸序列或重組核酸序列和特別其來源于促濾泡素抑制素的那些部分(相當(dāng)于SEQ ID NO: 1的氨基酸95-164的核苷酸)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，與SEQ ID NO: 19-22互補(bǔ)的核酸序列和SEQ ID NO: 19-22的變體也在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的核酸序列可以是分離的、重組的和/或與異源核苷酸序列融合，或在DNA文庫(kù)中。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸還包括在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: 19-22指定的核苷酸序列、SEQ ID NO: 19-22的互補(bǔ)序列或其片段(例如核苷酸19-22)雜交的核苷酸序列。

本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)容易地了解，可以改變促進(jìn)DNA雜交的合適的嚴(yán)格性條件。例如，可在6.0 x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中于約45℃進(jìn)行雜交，接著2.0 x SSC于50℃洗滌。例如，可從約2.0 x SSC于50℃的低嚴(yán)格性到約0.2 x SSC于50℃的高嚴(yán)格性，選擇洗滌步驟的鹽濃度。另外，可從室溫(約22℃)下的低嚴(yán)格性條件提高洗滌步驟的溫度到約65℃下的高嚴(yán)格性條件。溫度和鹽兩者均可改變，或者可保持溫度或鹽濃度恒定，而改變另一個(gè)變量。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在6 x SSC于室溫的低嚴(yán)格性條件下雜交接著2 x SSC于室溫洗滌的核酸。

由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性所致不同于SEQ ID NO: 19-22所示核酸的分離核酸也在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。例如，多種氨基酸用不只一個(gè)三聯(lián)體指定。指定同一氨基酸的密碼子或同義密碼子(例如CAU和CAC是組氨酸的同義密碼子)，可導(dǎo)致不影響蛋白質(zhì)的氨基酸序列的“沉默”突變。然而，預(yù)期在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可存在確實(shí)引起主題蛋白質(zhì)氨基酸序列改變的DNA序列多態(tài)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，由于天然等位基因變化所致，在給定物種的個(gè)體之間，這些變化可存在編碼特定蛋白質(zhì)的核酸的一個(gè)或多個(gè)核苷酸(多至約3-5%的核苷酸)中。任何和所有所述核苷酸變化和所得氨基酸多態(tài)性也在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。

在某些實(shí)施方案中，在表達(dá)構(gòu)建體中，本公開內(nèi)容的重組核酸可與一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)核苷酸序列有效連接。調(diào)節(jié)核苷酸序列一般可適于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域已知用于各種宿主細(xì)胞的合適表達(dá)載體和合適調(diào)節(jié)序列的許多類型。通常，所述一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)核苷酸序列可包括但不限于啟動(dòng)子序列、前導(dǎo)序列或信號(hào)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始序列和終止序列、翻譯起始序列和終止序列及增強(qiáng)子或激活物序列。本公開內(nèi)容考慮本領(lǐng)域已知的組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是天然存在的啟動(dòng)子或?qū)⒉恢挂环N啟動(dòng)子的元件組合的雜合啟動(dòng)子。表達(dá)構(gòu)建體可存在于細(xì)胞的附加體(例如質(zhì)粒)上，或者表達(dá)構(gòu)建體可插入染色體中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)載體含有選擇標(biāo)記基因以供轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇。選擇標(biāo)記基因是本領(lǐng)域眾所周知的，并可隨所采用的宿主細(xì)胞而改變。

在某些方面，在包含編碼促濾泡素抑制素多肽并與至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列有效連接的核苷酸序列的表達(dá)載體中提供主題核酸。調(diào)節(jié)序列是本領(lǐng)域公認(rèn)的，并被選擇來指導(dǎo)表達(dá)促濾泡素抑制素多肽。因此，術(shù)語(yǔ)調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)調(diào)控元件。示例性的調(diào)節(jié)序列描述于Goeddel；Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)。例如，當(dāng)與DNA序列有效連接時(shí)控制DNA序列表達(dá)的各種表達(dá)調(diào)控序列的任一種，可被用于這些載體以表達(dá)編碼促濾泡素抑制素多肽的DNA序列。這類有用的表達(dá)調(diào)控序列包括例如SV40的早期啟動(dòng)子和晚期啟動(dòng)子、tet啟動(dòng)子、腺病毒或巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子、RSV啟動(dòng)子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC或TRC系統(tǒng)、其表達(dá)受T7 RNA聚合酶指導(dǎo)的T7啟動(dòng)子、噬菌體λ的主要操縱基因和啟動(dòng)子區(qū)、fd外殼蛋白的調(diào)控區(qū)、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動(dòng)子、酸性磷酸酶啟動(dòng)子(例如Pho5)、酵母α-交配因子啟動(dòng)子、桿狀病毒系統(tǒng)的多角體啟動(dòng)子和已知控制原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒的基因表達(dá)的其它序列及其各種組合。應(yīng)當(dāng)了解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可取決于以下這類因素，例如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇和/或欲表達(dá)的蛋白質(zhì)類型。此外，還應(yīng)考慮載體拷貝數(shù)、控制該拷貝數(shù)的能力和由該載體編碼的任何其它蛋白質(zhì)(例如抗生素標(biāo)記)的表達(dá)。

可通過將克隆的基因或其部分連接至適于在原核細(xì)胞、真核細(xì)胞(酵母、禽、昆蟲或哺乳動(dòng)物)或兩者中表達(dá)的載體中來產(chǎn)生本公開內(nèi)容的重組核酸。用于產(chǎn)生重組促濾泡素抑制素多肽的表達(dá)載體包括質(zhì)粒和其它載體。例如，合適的載體包括用于在原核細(xì)胞(例如大腸桿菌)中表達(dá)的以下類型的質(zhì)粒：pBR322衍生質(zhì)粒、pEMBL衍生質(zhì)粒、pEX衍生質(zhì)粒、pBTac衍生質(zhì)粒和pUC衍生質(zhì)粒。

一些哺乳動(dòng)物表達(dá)載體既含有利于載體在細(xì)菌中增殖的原核序列，又含有在真核細(xì)胞中表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)真核轉(zhuǎn)錄單位。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生載體是適于轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的實(shí)例。這些載體的一些用來源于細(xì)菌質(zhì)粒(例如pBR322)的序列修飾，以利于在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞兩者中復(fù)制和進(jìn)行藥物抗性選擇?；蛘?，可使用諸如牛乳頭瘤病毒(BPV-1)或埃巴病毒(pHEBo、pREP衍生物和p205)等病毒衍生物在真核細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)蛋白質(zhì)。其它病毒(包括反轉(zhuǎn)錄病毒)表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例可參見下面基因療法遞送系統(tǒng)的描述。用于質(zhì)粒制備和宿主生物轉(zhuǎn)化中的各種方法是本領(lǐng)域眾所周知的。對(duì)于原核和真核細(xì)胞兩者的其它合適的表達(dá)系統(tǒng)以及通用重組方法，參見MolecularCloning A Laboratory Manual, 第2版, 編輯Sambrook, Fritsch和Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)第16和17章。在某些情況下，可能需要通過利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)重組多肽。這類桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括pVL衍生載體(例如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生載體(例如pAcUW1)和pBlueBac衍生載體(例如含β-gal的pBlueBac III)。

在某些實(shí)施方案中，可設(shè)計(jì)在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生主題促濾泡素抑制素多肽的載體，例如Pcmv-Script載體(Stratagene，La Jolla，Calif.)、pcDNA4載體(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)和pCI-neo載體(Promega，Madison，Wisc.)。顯然，可使用主題基因構(gòu)建體于在培養(yǎng)基中繁殖的細(xì)胞中使主題促濾泡素抑制素多肽表達(dá)，例如產(chǎn)生蛋白質(zhì)(包括融合蛋白或變體蛋白)以便純化。

本公開內(nèi)容另涉及包括主題促濾泡素抑制素多肽的一個(gè)或多個(gè)的編碼序列(例如SEQ ID NO: 19-22)的重組基因轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是任何原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。例如，本公開內(nèi)容的促濾泡素抑制素多肽可在細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌)、昆蟲細(xì)胞(例如使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng))、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。其它合適的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

因此，本公開內(nèi)容進(jìn)一步涉及產(chǎn)生主題促濾泡素抑制素多肽的方法。例如，可將用編碼促濾泡素抑制素多肽的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞在允許促濾泡素抑制素多肽表達(dá)發(fā)生的合適條件下培養(yǎng)?？墒勾贋V泡素抑制素多肽分泌并從細(xì)胞和含有促濾泡素抑制素多肽的培養(yǎng)基的混合物中分離出來?；蛘?，可使促濾泡素抑制素多肽保持在胞質(zhì)或在膜部分中，然后收獲、裂解細(xì)胞并分離蛋白質(zhì)。細(xì)胞培養(yǎng)物包括宿主細(xì)胞、培養(yǎng)基和其它副產(chǎn)物。用于細(xì)胞培養(yǎng)的合適培養(yǎng)基是本領(lǐng)域眾所周知的。可采用本領(lǐng)域已知的用于純化蛋白質(zhì)的技術(shù)，包括離子交換層析法、凝膠過濾層析法、超濾法、電泳、使用對(duì)促濾泡素抑制素多肽的特定表位有特異性的抗體進(jìn)行的免疫親和純化，將主題促濾泡素抑制素多肽從細(xì)胞培養(yǎng)基、宿主細(xì)胞或兩者中分離出來。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，促濾泡素抑制素多肽是含有促進(jìn)其純化的結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼純化前導(dǎo)序列(例如重組促濾泡素抑制素多肽的所需部分的N端上的聚-(His)/腸激酶切割位點(diǎn)序列)的融合基因，可允許使用Ni²⁺金屬樹脂通過親和層析法對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行純化。然后，純化前導(dǎo)序列隨后可通過用腸激酶處理除去，得到純化的促濾泡素抑制素多肽(例如參見Hochuli等(1987) J. Chromatography411:177；以及Janknecht等，PNAS USA 88:8972)。

制備融合基因的技術(shù)是眾所周知的?；旧希幋a不同多肽序列的各種DNA片段的連接按照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，采用用于連接的平端或交錯(cuò)端，限制性內(nèi)切酶消化以提供合適末端，適當(dāng)時(shí)補(bǔ)平黏性末端，堿性磷酸酶處理以避免不需要的連接，并進(jìn)行酶促連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，融合基因可通過常規(guī)技術(shù)合成，包括自動(dòng)DNA合成儀?；蛘?，可使用在兩個(gè)連續(xù)基因片段之間產(chǎn)生互補(bǔ)突出端的錨定引物進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增，所述基因片段隨后可退火得到嵌合基因序列(參見例如Current Protocols in Molecular Biology，編輯Ausubel等，John Wiley & Sons：1992)。

4. 示例性治療應(yīng)用

在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的組合物，包括例如FST(288)-IgG1、FST(288)-IgG2、FST(291)-IgG1、FST(291)-IgG2、FST(315)-IgG1、FST(315)-IgG2和本文公開的其它促濾泡素抑制素多肽的任一種可用于治療或預(yù)防本節(jié)描述的疾病或病況，包括與促濾泡素抑制素多肽和/或促濾泡素抑制素配體(例如GDF8)的異?；钚杂嘘P(guān)的疾病或病癥。這些疾病、病癥或病況在本文一般稱為“促濾泡素抑制素相關(guān)病況”。在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供通過給予個(gè)體治療有效量的上述促濾泡素抑制素多肽來治療或預(yù)防有需要的個(gè)體的方法。這些方法的目的特別在于動(dòng)物、更特別是人的治療性和預(yù)防性治療。

本文使用的“預(yù)防”病癥或病況的治療藥是指以下化合物，其在統(tǒng)計(jì)樣本中，與未治療對(duì)照樣品相比，減少治療樣品中的病癥或病況的發(fā)生，或者與未治療對(duì)照樣品相比，延緩病癥或病況的一個(gè)或多個(gè)癥狀發(fā)作或者降低病癥或病況的一個(gè)或多個(gè)癥狀的嚴(yán)重程度。本文使用的術(shù)語(yǔ)“治療”包括病況一旦確立便改善或根除病況。

促濾泡素抑制素配體復(fù)合物在組織生長(zhǎng)以及早期發(fā)育過程(例如不同結(jié)構(gòu)的正確形成)中或在一個(gè)或多個(gè)發(fā)育后能力(包括性發(fā)育、垂體激素產(chǎn)生和肌肉產(chǎn)生)中起重要作用。因此，促濾泡素抑制素相關(guān)病況包括異常組織生長(zhǎng)和發(fā)育缺陷。

治療的示例性病況包括神經(jīng)肌肉病癥(例如肌營(yíng)養(yǎng)不良和肌肉萎縮)、充血性阻塞性肺病(和與COPD相關(guān)的肌肉消耗)、肌肉消耗綜合征、肌肉衰減綜合征(sarcopenia)和惡病質(zhì)。其它示例性病況包括肌肉變性病癥和神經(jīng)肌肉病癥、組織修復(fù)(例如傷口愈合)和神經(jīng)變性性疾病(例如肌萎縮性側(cè)索硬化)。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物(例如FST-Fc多肽)用作肌營(yíng)養(yǎng)不良治療的組成部分。術(shù)語(yǔ)“肌營(yíng)養(yǎng)不良”是指一類變性性肌肉疾病，其特征在于骨骼肌以及有時(shí)為心肌和呼吸肌逐漸弱化和衰退。肌營(yíng)養(yǎng)不良是遺傳病癥，其特征在于以微觀肌肉變化開始的進(jìn)行性肌肉消耗和衰弱。當(dāng)肌肉隨時(shí)間退化時(shí)，人的肌肉強(qiáng)度下降?？捎冒ㄖ黝}促濾泡素抑制素多肽的方案治療的示例性肌營(yíng)養(yǎng)不良包括：杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)、貝克爾肌營(yíng)養(yǎng)不良(BMD)、埃-德肌營(yíng)養(yǎng)不良(EDMD)、肢帶肌營(yíng)養(yǎng)不良(LGMD)、面肩胛肱骨肌營(yíng)養(yǎng)不良(FSH或FSHD) (亦稱為L(zhǎng)andouzy-Dejerine)、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良(MMD) (亦稱為斯坦內(nèi)特病(Steinert's Disease))、眼咽肌營(yíng)養(yǎng)不良(OPMD)、遠(yuǎn)端肌營(yíng)養(yǎng)不良(DD)、先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良(CMD)。

法國(guó)神經(jīng)學(xué)家Guillaume Benjamin Amand Duchenne最早在1860年代描述了杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)。貝克爾肌營(yíng)養(yǎng)不良(BMD)以德國(guó)醫(yī)生Peter Emil Becker命名，他最早在1950年代描述了這種DMD的變體。DMD是男性中最常見的遺傳疾病之一，累及1/3,500的男孩。當(dāng)位于X染色體短臂的肌養(yǎng)蛋白基因斷裂時(shí)，即發(fā)生DMD。由于男性只攜帶一個(gè)拷貝的X染色體，因此只有一個(gè)拷貝的肌養(yǎng)蛋白基因。在無(wú)肌養(yǎng)蛋白的情況下，在收縮和松弛循環(huán)期間，肌肉容易受損。雖然在疾病早期肌肉被再生補(bǔ)償，但以后肌肉祖細(xì)胞無(wú)法跟上不斷進(jìn)行的損害，而且健康肌肉被無(wú)功能的纖維脂肪組織代替。

BMD由肌養(yǎng)蛋白基因的不同突變引起。BMD患者具有一些肌養(yǎng)蛋白，但或是量不足夠，或是品質(zhì)低下。具有一些肌養(yǎng)蛋白保護(hù)BMD患者的肌肉不像患有DMD的人的肌肉那些嚴(yán)重或快速地變性。

例如，最新研究表明，體內(nèi)阻斷或消除GDF8 (一種促濾泡素抑制素配體)的功能可有效治療DMD和BMD患者中的至少某些癥狀。因此，主題促濾泡素抑制素拮抗劑可用作GDF8抑制劑(拮抗劑)，并在DMD和BMD患者中構(gòu)成體內(nèi)阻斷GDF8的功能的備選方法。

類似地，在需要肌肉生長(zhǎng)的其它疾病狀況中，主題促濾泡素抑制素多肽提供增加肌肉質(zhì)量的有效方法。例如ALS，亦稱Lou Gehrig病(運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病)是一種慢性的無(wú)法治愈和無(wú)法停止的攻擊運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(連接腦與骨骼肌的CNS組分)的CNS病癥。在ALS中，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元惡化，最終死亡，盡管人腦正常地保持完整功能和警覺，但運(yùn)動(dòng)指令從不達(dá)到肌肉。患上ALS的大多數(shù)人年齡介于40和70歲。最早弱化的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元是通向臂或腿的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。ALS患者可能行走困難，他們可能掉東西，摔倒，言語(yǔ)含糊，并且控制不住地笑或哭。最終四肢肌肉因廢用而萎縮。這種肌肉衰弱會(huì)使人變得衰弱，將需要輪椅或變得不能下床行動(dòng)。大多數(shù)ALS患者從發(fā)病起3-5年內(nèi)死于呼吸衰竭或死于呼吸機(jī)輔助并發(fā)癥如肺炎。

通過局部給予本文所述促濾泡素抑制素多肽，可治療進(jìn)行性神經(jīng)病性腓骨肌萎縮(Charcot-Marie-Tooth Disease, CMT)。CMT是一類累及外周神經(jīng)并導(dǎo)致進(jìn)行性且常常局部肌肉衰弱和變性的遺傳病癥?？芍委煹募膊〉姆矫姘ㄗ慊?極高弓足)；足下垂(無(wú)法保持足與地面平行)；“拍擊(Slapping)”步態(tài)(由于足下垂，在步行時(shí)足部拍打地面)；小腿肌肉丟失；足麻木；平衡困難或臂和手衰弱。

可用本文公開的促濾泡素抑制素多肽治療患有包括以下多種全身肌肉病癥的患者的肌肉：Lambert-Eaton肌無(wú)力綜合征(LEMS)；代謝營(yíng)養(yǎng)不良；脊髓性肌萎縮(SMA)；皮肌炎(DM)；遠(yuǎn)端肌營(yíng)養(yǎng)不良(DD)；埃-德肌營(yíng)養(yǎng)不良(EDMD)；內(nèi)分泌肌病；弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)(Friedreich’s Ataxia，F(xiàn)A)；遺傳性肌??；線粒體肌??；重癥肌無(wú)力(MG)；多肌炎(PM)。

可用本文公開的促濾泡素抑制素多肽治療患有一個(gè)或多個(gè)肌肉的手術(shù)后或失用性萎縮(包括以下情況之后)的患者的肌肉：髖骨折；全髖關(guān)節(jié)成形術(shù)(THA)；全膝關(guān)節(jié)成形術(shù)(TKA)或肌腱套手術(shù)。

可用本文公開的促濾泡素抑制素多肽治療患有引起肌肉丟失或弱化的多種其它疾病的患者的肌肉，包括患有下列疾病的患者的肌肉：肌肉衰減綜合征、惡病質(zhì)、不同類型的癌癥包括肺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌、依賴長(zhǎng)期通氣輔助的患者、糖尿病、慢性阻塞性肺病、腎衰竭、心力衰竭、外周神經(jīng)的創(chuàng)傷和病癥。

促濾泡素抑制素多肽誘導(dǎo)的肌肉質(zhì)量增加也可有益于患有肌肉消耗疾病的人。GDF8表達(dá)與人的無(wú)脂質(zhì)量負(fù)相關(guān)，且GDF8基因的表達(dá)增加與患有AIDS消耗綜合征的男性的體重減輕有關(guān)。通過抑制GDF8在AIDS患者中的功能，即使不完全消除，也可緩解AIDS的至少某些癥狀，因此明顯改善AIDS患者的生命質(zhì)量。

5. 藥物組合物

在某些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的化合物(例如促濾泡素抑制素多肽)與藥學(xué)上可接受的載體一起配制。例如，促濾泡素抑制素多肽可單獨(dú)給予或作為藥物制劑(治療組合物)的組分給予。可以用于人或獸藥的任何適宜的方式配制主題化合物用于給藥。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療方法包括局部、全身或者以植入物或裝置局部給予組合物。當(dāng)給藥時(shí)，用于本發(fā)明的治療組合物當(dāng)然呈無(wú)致熱原的生理學(xué)上可接受的形式。此外，組合物可適宜地以粘性形式包封或注射以遞送至靶組織部位(例如骨、軟骨、肌肉、脂肪或神經(jīng)元)，例如具有組織損害的部位。局部給藥可適于傷口愈合和組織修復(fù)。也可任選包含在上述組合物中的促濾泡素抑制素多肽以外的治療有用物質(zhì)，在本發(fā)明的方法中可備選或另外與主題化合物(例如促濾泡素抑制素多肽)同時(shí)或序貫給予。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可包含基質(zhì)，其能夠?qū)⒁环N或多種治療化合物(例如促濾泡素抑制素多肽)遞送到靶組織部位，為發(fā)育組織提供結(jié)構(gòu)，并且最好能夠被吸收進(jìn)體內(nèi)。例如，基質(zhì)可提供慢釋的促濾泡素抑制素多肽。所述基質(zhì)可由目前用于其它植入醫(yī)學(xué)應(yīng)用的材料形成。

基質(zhì)材料的選擇取決于生物相容性、生物降解能力、機(jī)械性能、美容外觀和界面性質(zhì)。主題組合物的具體應(yīng)用將界定適當(dāng)?shù)闹苿?。用于組合物的可能基質(zhì)可以是生物可降解的和化學(xué)成分確定的硫酸鈣、磷酸三鈣、羥磷灰石、聚乳酸和聚酐。其它可能的材料是生物可降解的和生物學(xué)成分充分確定的，例如骨或真皮膠原。其它基質(zhì)由純的蛋白質(zhì)或胞外基質(zhì)組分組成。其它可能的基質(zhì)是非生物可降解的和化學(xué)成分確定的，例如燒結(jié)羥磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽或其它陶瓷?；|(zhì)可由任何上述類型的材料的組合組成，例如聚乳酸和羥磷灰石或膠原和磷酸三鈣。生物陶瓷可在組成方面改變，例如呈鈣-鋁酸鹽-磷酸鹽，并進(jìn)行加工以改變孔徑、顆粒大小、顆粒形狀和生物降解能力。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以例如以下形式口服給予：膠囊劑、扁囊劑、丸劑、片劑、錠劑(使用調(diào)味基料，一般為蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠)、散劑、顆粒劑，或者作為水性液體或非水性液體中的溶液劑或混懸劑、或作為水包油或油包水液體乳劑、或作為酏劑或糖漿劑、或作為軟錠劑(使用惰性基料，例如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠)和/或作為漱口劑等，各自含有預(yù)定量的物質(zhì)作為活性成分。藥劑還可作為大丸劑、藥糖劑或糊劑給予。

在口服給藥的固體劑型(膠囊劑、片劑、丸劑、糖衣丸、散劑、顆粒劑等)中，可將一種或多種本發(fā)明的治療化合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣和/或以下的任一種混合：(1)填充劑或增充劑，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合劑，例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯膠；(3)濕潤(rùn)劑，例如甘油；(4)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；(5)溶液阻滯劑，例如石蠟；(6)吸收促進(jìn)劑，例如季銨化合物；(7)潤(rùn)濕劑，例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(8)吸收劑，例如高嶺土和膨潤(rùn)土；(9)潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固態(tài)聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉及其混合物；和(10)著色劑。在膠囊劑、片劑和丸劑的情況下，藥物組合物還可包含緩沖劑。在使用諸如乳糖以及高分子量聚乙二醇等賦形劑的軟充填和硬充填明膠膠囊劑中，相似類型的固體組合物也可用作填充劑。

用于口服給藥的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳劑、微乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和酏劑。除活性成分以外，液體劑型可含有常用于本領(lǐng)域的惰性稀釋劑，例如水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(具體地說為棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和失水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀釋劑以外，口服組合物還可包含輔料，例如潤(rùn)濕劑、乳化劑和助懸劑、甜味劑、矯味劑、著色劑、芳香劑和防腐劑。

除活性化合物以外，混懸劑可含有助懸劑，例如乙氧基化異十八醇、聚氧乙烯山梨糖醇和失水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁(aluminum metahydroxide)、膨潤(rùn)土、瓊脂和西黃蓍膠及其混合物。

本文公開的某些組合物可局部給予皮膚或粘膜。局部制劑可另包括已知作為皮膚或角質(zhì)層滲透促進(jìn)劑是有效的各種作用劑的一種或多種。這些的實(shí)例為2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇、甲醇或異丙醇、二甲亞砜和氮酮?？闪戆ㄆ渌饔脛┮灾苽涿廊萆峡山邮艿闹苿＿@些的實(shí)例為脂肪、蠟、油、染料、香料、防腐劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑。還包括角質(zhì)層分離劑例如本領(lǐng)域已知的那些。實(shí)例為水楊酸和硫。

用于局部或經(jīng)皮給藥的劑型包括散劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、溶液劑、貼劑和吸入劑。可在無(wú)菌條件下將活性化合物與藥學(xué)上可接受的載體和可能需要的任何防腐劑、緩沖劑或拋射劑一起混合。除本發(fā)明的主題化合物(例如促濾泡素抑制素多肽)以外，軟膏劑、糊劑、乳膏劑和凝膠劑可含有賦形劑，例如動(dòng)物脂和植物脂、油、蠟、石蠟、淀粉、西黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤(rùn)土、硅酸、滑石粉和氧化鋅或其混合物。

除主題化合物以外，散劑和噴霧劑可含有賦形劑，例如乳糖、滑石粉、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣和聚酰胺粉或這些物質(zhì)的混合物。噴霧劑可另含有常規(guī)拋射劑，例如氯氟烴和揮發(fā)性未取代的烴，例如丁烷和丙烷。

在某些實(shí)施方案中，適于胃腸外給藥的藥物組合物可包含一種或多種促濾泡素抑制素多肽以及一種或多種藥學(xué)上可接受的無(wú)菌等滲水性溶液或非水性溶液、分散體、混懸液或乳液或者無(wú)菌粉劑(所述粉劑可在臨用前重構(gòu)成無(wú)菌注射溶液劑或分散劑)，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、使制劑與預(yù)期接受者血液等滲的溶質(zhì)或者助懸劑或增稠劑。可用于本發(fā)明藥物組合物的合適水性載體和非水性載體的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物、植物油(例如橄欖油)和注射用有機(jī)酯(例如油酸乙酯)?？赏ㄟ^例如使用包衣材料(例如卵磷脂)，在分散劑的情況下通過保持所需要的粒徑，以及通過使用表面活性劑，來保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。

本發(fā)明的組合物還可含有輔料，例如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑?？赏ㄟ^加入多種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，來確保防止微生物的作用。組合物中還可能需要包含等滲劑(例如糖、氯化鈉等)。另外，可通過加入延遲吸收的物質(zhì)(例如單硬脂酸鋁和明膠)，使可注射藥物形式的吸收延長(zhǎng)。

要了解，主治醫(yī)師可在考慮修正本發(fā)明的主題化合物(例如促濾泡素抑制素多肽)的作用的各種因素后，確定劑量方案。各種因素將取決于待治療的疾病。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供用于體內(nèi)產(chǎn)生促濾泡素抑制素多肽或本文公開的其它化合物的基因療法。這類療法可通過將促濾泡素抑制素多核苷酸序列引入受累于上文所列病癥的細(xì)胞或組織中，來達(dá)到其治療效果。可使用重組表達(dá)載體(例如嵌合病毒或膠體分散系統(tǒng))實(shí)現(xiàn)促濾泡素抑制素多核苷酸序列的遞送。優(yōu)選的促濾泡素抑制素多核苷酸序列的治療遞送是使用靶向脂質(zhì)體。

可用于本文教導(dǎo)的基因療法的各種病毒載體包括腺病毒、皰疹病毒、痘苗病毒或優(yōu)選RNA病毒(例如反轉(zhuǎn)錄病毒)。優(yōu)選反轉(zhuǎn)錄病毒載體是鼠或禽反轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物。其中可插入單一外源基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體的實(shí)例包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV)和勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus, RSV)。許多其它的反轉(zhuǎn)錄病毒載體可摻入多個(gè)基因。所有的這些載體可轉(zhuǎn)移或整合選擇標(biāo)記的基因，使得可鑒定和產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞?？赏ㄟ^連接例如糖、糖脂或蛋白質(zhì)，使反轉(zhuǎn)錄病毒載體具有靶標(biāo)特異性。通過使用抗體來完成優(yōu)選的打靶。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可將特異性多核苷酸序列插入反轉(zhuǎn)錄病毒基因組或與病毒包膜連接，以供含有促濾泡素抑制素多核苷酸的反轉(zhuǎn)錄病毒載體的靶標(biāo)特異性遞送。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體靶向骨、軟骨、肌肉或神經(jīng)元細(xì)胞/組織。

或者，可通過常規(guī)磷酸鈣轉(zhuǎn)染，將組織培養(yǎng)細(xì)胞用編碼反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、pol和env的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染。然后將這些細(xì)胞用含有目標(biāo)基因的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。所得細(xì)胞釋放反轉(zhuǎn)錄病毒載體到培養(yǎng)基中。

促濾泡素抑制素多核苷酸的另一種靶定遞送系統(tǒng)是膠體分散系統(tǒng)。膠體分散系統(tǒng)包括大分子復(fù)合體、納米囊、微球、珠粒和脂質(zhì)型系統(tǒng)，其包括水包油乳液、微團(tuán)、混合微團(tuán)和脂質(zhì)體。優(yōu)選的本發(fā)明的膠體系統(tǒng)是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是可體外和體內(nèi)用作遞送載體的人工膜囊泡。RNA、DNA和完整病毒體可包封在水性內(nèi)部，并以生物活性形式遞送至細(xì)胞(參見例如Fraley等, Trends Biochem. Sci., 6:77，1981)。使用脂質(zhì)體載體的有效基因轉(zhuǎn)移方法是本領(lǐng)域已知的，參見例如Mannino等, Biotechniques, 6:682, 1988。脂質(zhì)體的組成一般是磷脂的組合，一般與類固醇(尤其是膽固醇)組合。也可以使用其它磷脂或其它脂質(zhì)。脂質(zhì)體的物理特性取決于pH、離子強(qiáng)度和二價(jià)陽(yáng)離子的存在情況。

可用于產(chǎn)生脂質(zhì)體的脂質(zhì)的實(shí)例包括磷脂酰化合物，例如磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂。說明性的磷脂包括蛋黃磷脂酰膽堿(egg phosphatidylcholine)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿。根據(jù)例如器官特異性、細(xì)胞特異性和細(xì)胞器特異性靶定脂質(zhì)體也是可行的，并且是本領(lǐng)域已知的。

實(shí)例

現(xiàn)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了大致描述，通過參照下列實(shí)施例可更容易地理解本發(fā)明，包括所述實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的某些實(shí)施方案和實(shí)施方案的目的，并無(wú)意限制本發(fā)明。

實(shí)施例1：促濾泡素抑制素-Fc蛋白的產(chǎn)生

已知促濾泡素抑制素(FST)具有復(fù)雜的藥代動(dòng)力學(xué)特性。據(jù)報(bào)道，縮短形式FST(288)在阻斷配體時(shí)更有效，并且部分由于其未掩蔽的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域所致與細(xì)胞表面結(jié)合。由于富含酸性的C端氨基酸序列(其中和肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域)所致，F(xiàn)ST(315)被視為除較少被細(xì)胞表面吸引以外，也不太有效。在文獻(xiàn)中，促濾泡素抑制素一般被報(bào)道為具有全身作用。申請(qǐng)人尋求確定是否可設(shè)計(jì)可趨于在給藥組織(例如注射肌肉)中具有作用的促濾泡素抑制素構(gòu)建體，以及促濾泡素抑制素的二聚化是否可提供升高的組織滯留。已知免疫球蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域形成二聚體。為了研究促濾泡素抑制素-Fc融合蛋白對(duì)肌肉和其它組織的作用，且為了評(píng)價(jià)Fc介導(dǎo)的二聚化對(duì)促濾泡素抑制素多肽的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的作用，申請(qǐng)人生產(chǎn)了含有與IgG1的Fc部分融合的FST(288)或FST(315)的融合蛋白。選擇TGGG接頭序列以使各促濾泡素抑制素多肽與Fc部分連接。

對(duì)于各FST-IgG1構(gòu)建體，考慮下列3個(gè)前導(dǎo)序列：

(1) 促濾泡素抑制素前導(dǎo)序列：mvrarhqpgglcllllllcqfmedrsaqa (SEQ ID NO: 23)

(2) 組織纖溶酶原激活物(TPA)：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 24)

(3) 蜜蜂蜂毒肽(HBML)：MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 25)

所選擇的FST-Fc蛋白并入促濾泡素抑制素前導(dǎo)序列。FST(288)-IgG1融合物具有下文所示未加工的氨基酸序列和成熟的氨基酸序列。

未加工的FST(288)-IgG1 (SEQ ID NO: 26)

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQAGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

成熟的FST(288)-IgG1 (SEQ ID NO: 27)

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

可脫去起始的“GN”序列，得到下列多肽。(SEQ ID NO: 28)

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

FST(315)-IgG1融合物具有下文所示未加工的氨基酸序列和成熟的氨基酸序列。

未加工的FST(315)-IgG1 (SEQ ID NO: 29)

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQAGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEWTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

成熟的FST(315)-IgG1 (SEQ ID NO: 30)

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEWTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

可脫去起始的“GN”序列，得到下列多肽。(SEQ ID NO: 31)

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEWTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

使蛋白質(zhì)在HEK-293細(xì)胞或CHO細(xì)胞中表達(dá)，并且通過過濾和A蛋白層析法從條件培養(yǎng)基中純化。在某些情況下，還采用陰離子交換和疏水性相互作用層析法和/或凝膠過濾。

通過與激活素A或GDF11結(jié)合，來評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)活性。在各種情況下，蛋白質(zhì)以小于10 pM的K_D結(jié)合。

實(shí)施例2：促濾泡素抑制素-Fc蛋白的全身給藥對(duì)小鼠的肌肉質(zhì)量和強(qiáng)度的作用

申請(qǐng)人測(cè)定了在全身給藥后野生型小鼠中促濾泡素抑制素-Fc蛋白增加肌肉質(zhì)量和強(qiáng)度的能力。眾所周知的刺激無(wú)脂肪肌肉質(zhì)量的基本上全身增加的ActRIIB-Fc融合蛋白用作陽(yáng)性對(duì)照。

用FST(288)-IgG1蛋白、人FST(315)-IgG1蛋白或人ActRIIB-Fc蛋白給予C57BL/6小鼠(10 mg/kg；皮下(s.c.))兩次/周持續(xù)4周。對(duì)小鼠進(jìn)行全身核磁共振(NMR)掃描以測(cè)定全身無(wú)脂肪組織質(zhì)量的百分比變化。當(dāng)與溶媒對(duì)照組相比時(shí)，ActRIIB-Fc治療小鼠顯示無(wú)脂肪組織顯著(約35%)增加。與對(duì)照組相比，用FST(288)-IgG1或FST(315)-IgG1蛋白的小鼠顯示無(wú)脂肪組織質(zhì)量幾乎沒有增加。參見圖2。在研究結(jié)束時(shí)，切下胸肌、脛骨前肌(TA)、腓腸肌和骨股肌并稱重。如圖4所示，ActRIIB-Fc治療顯示增加這些肌群每個(gè)中的肌肉質(zhì)量。相比之下，在FST(288)-IgG1或FST(315)-IgG1治療組中觀察到肌肉質(zhì)量幾乎沒有增加或未增加。參見圖2。

在該研究過程中，還查檢了小鼠肌肉強(qiáng)度的變化。測(cè)量當(dāng)牽拉測(cè)力傳感器時(shí)小鼠發(fā)揮的力來確定前肢握力。申請(qǐng)人觀察到用ActRIIB-Fc蛋白治療的小鼠顯示肌肉強(qiáng)度提高。相比之下，在FST(288)-IgG1或FST(315)-IgG1治療組中未觀察到握力提升。參見圖3。

總起來，結(jié)果證實(shí)當(dāng)與溶媒對(duì)照動(dòng)物相比時(shí)，全身給予ActRIIB-Fc顯著增加小鼠的肌肉質(zhì)量和強(qiáng)度兩者。相比之下，在用促濾泡素抑制素-Fc融合蛋白FST(288)-IgG1或FST(315)-IgG1任一種治療的小鼠中幾乎沒有或沒有觀察到肌肉質(zhì)量或強(qiáng)度的增加。因此，看來當(dāng)全身給予時(shí)，促濾泡素抑制素-Fc融合蛋白體內(nèi)對(duì)肌肉質(zhì)量或強(qiáng)度幾乎沒作用或沒有作用。

實(shí)施例3：全身給予促濾泡素抑制素-Fc蛋白對(duì)FSH水平的作用。

促濾泡素抑制素的主要特征在于其結(jié)合并抑制信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)的TGF-β超家族成員的能力。具體地說，已知促濾泡素抑制素是激活素活性的有效抑制劑。激活素是促卵泡激素(FSH)產(chǎn)生的有效誘導(dǎo)物。FSH由垂體前葉腺的促性腺激素細(xì)胞合成和分泌，并在機(jī)體青春期成熟和不同生殖過程期間調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和發(fā)育。為了評(píng)價(jià)促濾泡素抑制素-Fc多肽的全身作用，評(píng)價(jià)了對(duì)FSH水平的作用。

用FST(288)-IgG1治療(10 mg/kg；皮下(s.c.)兩次/周)導(dǎo)致3.836 (± 5.22) μg/mL的藥物循環(huán)水平。用FST(315)-IgG1的類似治療導(dǎo)致19.31 (± 1.85) μg/mL的顯著較高的藥物血清水平。如圖5所示，F(xiàn)ST(288)-IgG1對(duì)FSH對(duì)血清水平?jīng)]有任何顯著作用，表明了這種FST(288)-IgG1治療方案不顯著影響全身激活素活性。相比之下，F(xiàn)ST(315)-IgG1治療導(dǎo)致FSH的循環(huán)水平降低，表明了全身給予FST(315)-IgG1對(duì)全身激活素信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生作用?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明使用具有介導(dǎo)二聚化的Fc結(jié)構(gòu)域融合的未掩蔽的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的促濾泡素抑制素多肽(例如FST(288)-IgG1)，產(chǎn)生幾乎沒有或沒有全身活性的蛋白質(zhì)，而具有掩蔽的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的FST(315)-IgG1可用來獲得全身作用。

實(shí)施例4：局部給予促濾泡素抑制素-Fc蛋白對(duì)小鼠的肌肉質(zhì)量和強(qiáng)度的作用

雖然在全身給藥后沒有顯著作用，申請(qǐng)人采用類似的實(shí)驗(yàn)方法以測(cè)定在肌內(nèi)(i.m.)給予后，促濾泡素抑制素是否可用來局部增加野生型小鼠的肌肉質(zhì)量和強(qiáng)度。

用FST(288)-Fc蛋白、FST(315)-Fc蛋白或人ActRIIB-Fc蛋白給予C57BL/6小鼠(50微克；i.m.進(jìn)入右腓腸肌)兩次/周持續(xù)4周。在初治后不同的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)小鼠進(jìn)行全身核磁共振(NMR)掃描以測(cè)定全身無(wú)脂肪組織質(zhì)量的百分比變化。當(dāng)與溶媒對(duì)照組相比時(shí)，ActRIIB-Fc治療小鼠顯示無(wú)脂肪組織顯著增加。相比之下，與對(duì)照組相比，用FST(288)-Fc或FST(315)-Fc蛋白治療的小鼠都不顯示無(wú)脂肪組織質(zhì)量顯著增加。在研究結(jié)束時(shí)，切離注射的右腓腸肌和對(duì)側(cè)的左腓腸肌，并稱重。如圖6所示，與溶媒治療小鼠相比，ActRIIB-Fc治療顯示右和左腓腸肌兩者肌肉質(zhì)量顯著增加。因此，甚至當(dāng)局限于單塊肌肉的局部給藥時(shí)，ActRIIB-Fc對(duì)增加肌肉質(zhì)量產(chǎn)生全身作用。相比之下，F(xiàn)ST(288)-Fc和FST(315)-Fc兩者導(dǎo)致右腓腸肌的肌肉質(zhì)量顯示增加，但對(duì)對(duì)側(cè)肌肉的質(zhì)量沒有作用。因此，與在全身給藥后觀察到的作用相反，看來當(dāng)直接給予肌肉時(shí)，促濾泡素抑制素蛋白是肌肉質(zhì)量的有效刺激物。此外，促濾泡素抑制素顯得具有相對(duì)于像ActRIIB-Fc等其它作用劑的明顯優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槠鋵?duì)肌肉質(zhì)量的作用限于給藥部位，表明了促濾泡素抑制素可用于選擇肌肉或肌群的靶定療法，而不影響周圍的非目標(biāo)肌肉的正常生長(zhǎng)/活性。

申請(qǐng)人還嚴(yán)密監(jiān)測(cè)了在i.m.給予后促濾泡素抑制素-Fc融合蛋白的血清水平。用FST(288)-IgG1治療導(dǎo)致0.156 (± 0.245) μg/mL的藥物循環(huán)水平。用FST(315)-IgG1的類似治療導(dǎo)致3.58 (± 1.73) μg/mL的略微較高的藥物血清水平，但這些水平顯著低于在全身給予FST(315)-IgG1后觀察到的水平。由于FST(288)-IgG1和FST(315)-IgG1兩者在i.m.注射后以比在全身給予FST(288)-IgG1 (即3.836 (± 5.22) μg/mL)后觀察到低的水平在患者血清中循環(huán)，因此可預(yù)期FST(288)-IgG1或FST(315)-IgG1對(duì)FSH的血清水平都沒有顯著作用，正如FST(288)-IgG1在s.c.給予后沒有這類作用一樣。參見圖5。因此，這些數(shù)據(jù)表明FST(288)-IgG1和FST(315)-IgG1兩者將特別適于促進(jìn)在生殖上活躍的或希望使對(duì)生殖系統(tǒng)的作用降到最小的患者的目標(biāo)肌肉生長(zhǎng)。

進(jìn)行了類似實(shí)驗(yàn)以建立FST(288)-IgG1對(duì)肌肉質(zhì)量和品質(zhì)的作用的劑量反應(yīng)曲線。用不同的量(1-100微克) i.m.給予C57BL/6小鼠的右腓腸肌兩次/周持續(xù)4周。如圖8所示，用較大劑量的FST(288)-IgG1，注射肌肉相對(duì)于對(duì)側(cè)肌肉的肌肉質(zhì)量的選擇性增加較大。切斷面的肌肉顯示肌肉質(zhì)量增加是肌纖維肥大而非發(fā)育不全(hypoplasia)的結(jié)果。

實(shí)施例5：局部起作用的促濾泡素抑制素-Fc融合蛋白的Fc最優(yōu)化

如前述實(shí)施例中所述，促濾泡素抑制素-Fc融合蛋白例如FST(288)-IgG1和FST(315)-IgG1在肌肉和其它組織中具有微不足道的全身作用，特別是蛋白質(zhì)的FST(288)形式在注射部位有活性。申請(qǐng)人和其他人證實(shí)了FST(288)通過肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞結(jié)合，這種結(jié)合可通過外源肝素消除。因此，申請(qǐng)人確定了已知介導(dǎo)對(duì)靶定細(xì)胞的CDC和ADCC作用的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域可引起對(duì)用結(jié)合肝素的促濾泡素抑制素構(gòu)建體處理的細(xì)胞的損害。所述損害可表現(xiàn)為目標(biāo)組織中或目標(biāo)組織生長(zhǎng)減慢中的免疫反應(yīng)。因此申請(qǐng)人使用人IgG2的Fc部分(其是已知消除刺激CDC和ADCC活性的能力的IgG恒定結(jié)構(gòu)域的實(shí)例)產(chǎn)生不同形式的促濾泡素抑制素多肽。進(jìn)行了該實(shí)驗(yàn)以確定使用備選Fc結(jié)構(gòu)域的促濾泡素抑制素-Fc融合蛋白是否可保留活性。

申請(qǐng)人制備了含有與IgG2的Fc部分融合的FST(288)或FST(315)的融合蛋白。選擇TGGG接頭序列使各促濾泡素抑制素多肽與Fc部分連接。

對(duì)于各FST-IgG2構(gòu)建體，使用促濾泡素抑制素前導(dǎo)序列。

FST(288)-IgG2融合物具有下文所示未加工的氨基酸序列和成熟的氨基酸序列。

未加工的FST(288)-IgG2 (SEQ ID NO: 32)

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQAGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNTGGGVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

其由下列核酸序列(SEQ ID NO: 44)編碼

atggtccgcgcgaggcaccagccgggtgggctttgcctcctgctgctgctgctctgccagttcatggaggaccgcagtgcccaggctgggaactgctggctccgtcaagcgaagaacggccgctgccaggtcctgtacaagaccgaactgagcaaggaggagtgctgcagcaccggccggctgagcacctcgtggaccgaggaggacgtgaatgacaacacactcttcaagtggatgattttcaacgggggcgcccccaactgcatcccctgtaaagaaacgtgtgagaacgtggactgtggacctgggaaaaaatgccgaatgaacaagaagaacaaaccccgctgcgtctgcgccccggattgttccaacatcacctggaagggtccagtctgcgggctggatgggaaaacctaccgcaatgaatgtgcactcctaaaggcaagatgtaaagagcagccagaactggaagtccagtaccaaggcagatgtaaaaagacttgtcgggatgttttctgtccaggcagctccacatgtgtggtggaccagaccaataatgcctactgtgtgacctgtaatcggatttgcccagagcctgcttcctctgagcaatatctctgtgggaatgatggagtcacctactccagtgcctgccacctgagaaaggctacctgcctgctgggcagatctattggattagcctatgagggaaagtgtatcaaagcaaagtcctgtgaagatatccagtgcactggtgggaaaaaatgtttatgggatttcaaggttgggagaggccggtgttccctctgtgatgagctgtgccctgacagtaagtcggatgagcctgtctgtgccagtgacaatgccacttatgccagcgagtgtgccatgaaggaagctgcctgctcctcaggtgtgctactggaagtaaagcactccggatcttgcaacaccggtggtggagtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagaattc

成熟的FST(288)-IgG2 (SEQ ID NO: 33)

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNTGGGVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

可脫去起始的“GN”序列，得到下列多肽。(SEQ ID NO: 34)

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNTGGGVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

FST(315)-IgG2融合物具有下文所示未加工的氨基酸序列和成熟的氨基酸序列。

未加工的FST(315)-IgG2 (SEQ ID NO: 35)

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQAGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEWTGGGVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

其由下列核酸序列(SEQ ID NO: 45)編碼

atggtccgcgcgaggcaccagccgggtgggctttgcctcctgctgctgctgctctgccagttcatggaggaccgcagtgcccaggctgggaactgctggctccgtcaagcgaagaacggccgctgccaggtcctgtacaagaccgaactgagcaaggaggagtgctgcagcaccggccggctgagcacctcgtggaccgaggaggacgtgaatgacaacacactcttcaagtggatgattttcaacgggggtgcccccaactgcatcccctgtaaagaaacgtgtgagaacgtggactgtggacctgggaaaaaatgccgaatgaacaagaagaacaaaccccgctgcgtctgcgccccggattgttccaacatcacctggaagggtccagtctgcgggctggatgggaaaacctaccgcaatgaatgtgcactcctaaaggcaagatgtaaagagcagccagaactggaagtccagtaccaaggcagatgtaaaaagacttgtcgggatgttttctgtccaggcagctccacatgtgtggtggaccagaccaataatgcctactgtgtgacctgtaatcggatttgcccagagcctgcttcctctgagcaatatctctgtgggaatgatggagtcacctactccagtgcctgccacctgagaaaggctacctgcctgctgggcagatctattggattagcctatgagggaaagtgtatcaaagcaaagtcctgtgaagatatccagtgcactggtgggaaaaaatgtttatgggatttcaaggttgggagaggccggtgttccctctgtgatgagctgtgccctgacagtaagtcggatgagcctgtctgtgccagtgacaatgccacttatgccagcgagtgtgccatgaaggaagctgcctgctcctcaggtgtgctactggaagtaaagcactccggatcttgcaactccatttcggaagacaccgaggaagaggaggaagatgaagaccaggactacagctttcctatatcttctattctagagtggaccggtggtggagtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagaattc

成熟的FST(315)-IgG2 (SEQ ID NO: 36)

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEWTGGGVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

可脫去起始的“GN”序列，得到下列多肽。(SEQ ID NO: 37)

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEWTGGGVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

使蛋白質(zhì)在HEK-293細(xì)胞或CHO細(xì)胞中表達(dá)，并且通過過濾和A蛋白層析法從條件培養(yǎng)基中純化。在某些情況下，還采用陰離子交換和疏水性相互作用層析法和/或凝膠過濾。

通過與激活素A或GDF11結(jié)合，來評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)活性。在各種情況下，蛋白質(zhì)以小于10 pM的K_D結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明，可制備和表達(dá)促濾泡素抑制素-IgG2融合蛋白，并保留微微摩爾配體結(jié)合活性。

實(shí)施例6：優(yōu)化的局部起作用的促濾泡素抑制素-Fc融合蛋白

為了評(píng)價(jià)是否可制備最優(yōu)的促濾泡素抑制素-Fc融合蛋白，產(chǎn)生了FST(288)和FST(315)的C端間的多種截短。與其它形式相比，這些截短之一，以氨基酸291結(jié)束并稱為FST(291)，顯示優(yōu)良的表達(dá)性質(zhì)，并保留所需肝素結(jié)合活性，盡管含有FST(315)的小部分掩蔽結(jié)構(gòu)域。使這種形式與人IgG1和IgG2的Fc部分融合，得到FST(291)-IgG1和FST(291)-IgG2。

選擇TGGG接頭序列使各促濾泡素抑制素多肽與Fc部分連接。

對(duì)于各個(gè)FST-IgG1構(gòu)建體，使用促濾泡素抑制素前導(dǎo)序列。

FST(291)-IgG1融合物具有下文所示未加工的氨基酸序列和成熟的氨基酸序列。

未加工的FST(291)-IgG1 (SEQ ID NO: 38)

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQAGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

成熟的FST(291)-IgG1 (SEQ ID NO: 39)

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

可脫去起始的“GN”序列，得到下列多肽。(SEQ ID NO: 40)

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

FST(291)-IgG2融合物具有下文所示未加工的氨基酸序列和成熟的氨基酸序列。

未加工的FST(291)-IgG2 (SEQ ID NO: 41)

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQAGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISTGGGVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

成熟的FST(291)-IgG2 (SEQ ID NO: 42)

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISTGGGVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

可脫去起始的“GN”序列，得到下列多肽。(SEQ ID NO: 43)

CWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISTGGGVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

使蛋白質(zhì)在HEK-293細(xì)胞或CHO細(xì)胞中表達(dá)，并且通過過濾和A蛋白層析法從條件培養(yǎng)基中純化。在某些情況下，還采用陰離子交換和疏水性相互作用層析法和/或凝膠過濾。

通過與激活素A或GDF11結(jié)合，來評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)活性。在各種情況下，蛋白質(zhì)以小于10 pM的K_D結(jié)合。

進(jìn)行了其它的截短實(shí)驗(yàn)以鑒定促濾泡素抑制素-IgG2構(gòu)建體，在TGGG接頭的情況下，顯示了最優(yōu)配體和肝素結(jié)合活性，以得到具有高效能、有助于在受治療組織中滯留的強(qiáng)大趨勢(shì)和在受治療組織中產(chǎn)生炎性反應(yīng)或免疫反應(yīng)的低趨勢(shì)的多肽。為此，制備一系列構(gòu)建體，稱為FST(278)-IgG2、FST(284)-IgG2，F(xiàn)ST(291)-IgG2和FST(303)-IgG2，并彼此比較且與FST(288)-IgG2和FST-(315)-IgG2比較。如下評(píng)價(jià)肝素結(jié)合，通過測(cè)量在肝素存在或不存在時(shí)從細(xì)胞回收的蛋白質(zhì)，通過ELISA量化，并表示為在肝素存在時(shí)回收的蛋白質(zhì)與在肝素不存在時(shí)回收的蛋白質(zhì)的比率。如下表所示，F(xiàn)ST(278)-IgG2、FST(284)-IgG2、FST(288)-IgG2和FST(291)-IgG2均顯示3.00-4.00的相似比率，而FST(303)-IgG2和FST(315)-IgG2分別顯示1.50和0.97的比率。這表明由于在291和303位之間包括較多氨基酸，因此肝素結(jié)合活性急劇降低。

進(jìn)行了基于細(xì)胞的報(bào)道基因測(cè)定法(A-204報(bào)道基因測(cè)定法，描述于WO/2006/012627)，以評(píng)價(jià)激活素和GDF11的抑制。如下表所示，延伸至288位以外的構(gòu)建體提供提高的配體抑制。

將肝素結(jié)合和配體抑制數(shù)據(jù)合起來看，顯然在本文所用TGGG接頭或類似大小的接頭(例如接頭大小為1-10個(gè)氨基酸，任選3-8個(gè)氨基酸)的情況下，以291-302位結(jié)束的FST-IgG2構(gòu)建體，相對(duì)于FST(288)-IgG2配體抑制增強(qiáng)，且相對(duì)于FST(315)-IgG2肝素結(jié)合增加，而且FST(291)-IgG2表示局部給藥和作用的最優(yōu)蛋白質(zhì)。

實(shí)施例7：局部給予FST(291)-IgG2蛋白質(zhì)對(duì)小鼠的肌肉質(zhì)量和強(qiáng)度的作用

申請(qǐng)人評(píng)價(jià)了在肌內(nèi)(i.m.)給予后野生型小鼠中優(yōu)化的FST(291)-IgG2蛋白用來局部增加肌肉質(zhì)量和強(qiáng)度的活性。

用溶媒(PBS)、FST(291)-IgG2或來自IgG1的對(duì)照Fc給予C57BL/6小鼠(100微克在50微升中；i.m.進(jìn)入左腓腸肌)兩次/周持續(xù)4周。在研究結(jié)束時(shí)，切離注射的左腓腸肌和對(duì)側(cè)右腓腸肌兩者，并稱重。如圖9所示，與溶媒治療小鼠相比，F(xiàn)ST(291)-IgG2治療顯示在注射左腓腸肌中增加肌肉質(zhì)量到實(shí)質(zhì)的程度，未觀察到對(duì)對(duì)側(cè)肌肉的作用。另外，對(duì)胸肌和骨股肌稱重，由于給予溶媒或FST(291)-IgG2的結(jié)果顯示無(wú)變化。因此，F(xiàn)ST(291)-IgG2對(duì)注射肌群具有有限的作用，幾乎沒有或沒有全身作用。進(jìn)行了類似實(shí)驗(yàn)，但注射不同的肌群，包括三頭肌和脛骨前肌。在各種情況下，觀察到注射肌肉的選擇性肥大。

進(jìn)行了其它實(shí)驗(yàn)以直接比較FST(288)-IgG1和FST(291)-IgG2對(duì)肌肉生長(zhǎng)的作用。雖然兩個(gè)構(gòu)建體促進(jìn)注射肌肉(腓腸肌)中肌肉質(zhì)量顯著增加，但FST(291)-IgG2引起注射肌肉相對(duì)于對(duì)側(cè)肌肉約42%增加，而FST(288)-IgG1引起注射肌肉相對(duì)于對(duì)側(cè)肌肉約22%增加。

因此，這些數(shù)據(jù)表明FST(291)-IgG2是在有需要的患者中促進(jìn)目標(biāo)肌肉生長(zhǎng)的最佳化合物。

實(shí)施例8：杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良小鼠模型中局部給予FST(291)-IgG2蛋白對(duì)肌肉的作用

在杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良小鼠模型中評(píng)價(jià)了FST(291)-IgG2對(duì)肌肉質(zhì)量的作用。小鼠C57BL/10ScCN-Dmd^mdx/J (mdx)品系是充分確立的人杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良的模型(Bulfield，Siller等, 1984；Partridge 2013)。

用mdx小鼠和野生型背景品系C57BL/10SnJ (WT)進(jìn)行了兩個(gè)獨(dú)立研究。在第一個(gè)研究中，當(dāng)小鼠達(dá)到6周齡進(jìn)開始治療(FST(291)-IgG2或溶媒對(duì)照)。在第二個(gè)研究中，當(dāng)小鼠達(dá)到4周齡時(shí)開始治療。在兩項(xiàng)研究中，小鼠在左腓腸肌中肌內(nèi)接受100 μg FST(291)-IgG2，每周兩次，每次注射50 μL的固定體積。治療4周齡小鼠持續(xù)4周，治療6周齡小鼠持續(xù)6周。

在尸體剖檢時(shí)，切離來自注射(左)和對(duì)側(cè)未注射(右)腿的腓腸肌并稱重。在兩個(gè)研究中，與對(duì)側(cè)腿以及溶媒對(duì)照相比，來自用FST(291)-IgG2治療的WT動(dòng)物的注射腓腸肌的大小顯著較大(P<0.001)。在兩個(gè)研究中，在WT和mdx小鼠兩者中，與對(duì)側(cè)肌肉和與溶媒治療動(dòng)物相比，用FST(291)-IgG2治療的歸一化至體重的腓腸肌的大小顯著較大。肌肉質(zhì)量的增加在較年輕的動(dòng)物中比在較年老的動(dòng)物中稍稍更顯著。就相對(duì)于對(duì)側(cè)肌肉的百分比增加而言，在6周齡WT和mdx小鼠中，F(xiàn)ST(291)-IgG2增加肌肉質(zhì)量分別達(dá)34.2%和16.4%。在4周齡WT和mdx小鼠中分別觀察到62.8%和41.8%的肌肉質(zhì)量增加。

這些數(shù)據(jù)表明，使用每周兩次肌內(nèi)給予FST(291)-IgG2阻斷激活素/肌生成抑制蛋白信號(hào)傳導(dǎo)增加肌營(yíng)養(yǎng)不良小鼠模型的肌肉質(zhì)量。肌肉質(zhì)量的增加僅局部出現(xiàn)在注射肌肉中。

通過引用予以結(jié)合

本文提及的所有出版物和專利均通過引用以其整體結(jié)合到本文中，就像每個(gè)獨(dú)立出版物或?qū)＠唧w而單獨(dú)指明通過引用結(jié)合一樣。

雖然論述了主題的具體實(shí)施方案，但上述說明書是說明性的而非限制性的。當(dāng)回顧本說明書和隨附權(quán)利要求書時(shí)，許多變動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將變得顯而易見。應(yīng)參照權(quán)利要求書及其等同內(nèi)容的整個(gè)范圍和說明書及這類變化來確定本發(fā)明的整個(gè)范圍。