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用于增加植物生長和產(chǎn)量的方法和組合物與流程

文檔序號:11109518閱讀:563來源:國知局
本發(fā)明涉及用于控制參與植物生長和發(fā)育的基因表達(dá)的方法和組合物。發(fā)明背景持續(xù)增加的世界人口和日漸減少的農(nóng)業(yè)可耕種土地供應(yīng)推動開發(fā)具有增加的生物質(zhì)和產(chǎn)量的植物。常規(guī)農(nóng)作物和園藝改進(jìn)手段采用選擇性育種技術(shù)來鑒定具有所需特性的植物。然而,這種選擇性育種技術(shù)具有幾個缺陷,即,這些技術(shù)一般是費(fèi)力的并且產(chǎn)生通常含有異源遺傳組件的植物,其可能并不總是導(dǎo)致所需的性狀從親本植物傳遞下去。分子生物學(xué)的進(jìn)展提供了調(diào)節(jié)植物種質(zhì)的手段。植物遺傳改造要求分離和操作遺傳物質(zhì)(一般是DNA或RNA的形式)并且隨后向植物導(dǎo)入該遺傳物質(zhì)。這種技術(shù)具有向作物或植物遞送各種改善的經(jīng)濟(jì)、農(nóng)業(yè)或園藝性狀的能力。感興趣性狀包括植物生物質(zhì)和產(chǎn)量以及對非生物脅迫條件的耐受性。產(chǎn)量通常定義為可測量的來自作物的有經(jīng)濟(jì)價值的產(chǎn)物。這可以量和/或質(zhì)來定義。產(chǎn)量直接取決于幾個因素,例如,器官的數(shù)量和尺寸、植物結(jié)構(gòu)(例如,分枝數(shù)量)、種子產(chǎn)生、葉衰老等。根發(fā)育、營養(yǎng)攝入、脅迫耐受性和早期活力也可能是決定產(chǎn)量的重要因素。因此,優(yōu)化上述因素可產(chǎn)生增加的植物產(chǎn)量。植物遇到的非生物脅迫可包括高或低溫度脅迫、干旱或澆水過度和鹽脅迫。植物對于這些和其他非生物脅迫的響應(yīng)可能對產(chǎn)量有重要影響,因?yàn)檫@些脅迫可導(dǎo)致產(chǎn)量顯著降低。因此需要產(chǎn)生面對非生物脅迫時保持其生長以最大化其在非優(yōu)化生長條件下的產(chǎn)量的植物和植物變體。種子產(chǎn)量的增加是特別重要的性狀,因?yàn)樵S多植物的種子對于人和動物消耗而言是重要的。作物例如玉米、水稻、小麥、油菜和大豆占總?cè)藷崃繑z入的超過一般,無論是通過直接消耗其種子或通過消耗在經(jīng)加工的種子上產(chǎn)生的肉制品。它們也是工業(yè)過程中使用的糖類、油脂和許多類型礦物質(zhì)的來源。種子含有胚(新芽和根的來源)和胚乳(在萌發(fā)期間和幼苗的早期生長期間胚生長的營養(yǎng)源)。種子的發(fā)育涉及許多基因,并且需要將代謝物從根、葉和莖轉(zhuǎn)移到生長的種子中。尤其是胚乳,其吸收了糖類、油脂和蛋白質(zhì)的代謝前體并將它們合成儲存大分子以填充谷粒。植物生物質(zhì)的增加對于飼料作物如苜蓿、青貯玉米和干草而言重要。許多基因參與植物生長和發(fā)育。因此,需要調(diào)節(jié)這些基因的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:提供了用于獲得更高的作物產(chǎn)量而增加植物生長的方法和組合物。組合物包含轉(zhuǎn)錄因子,包含轉(zhuǎn)錄因子的構(gòu)建體,和含有轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因植物、種子和植物部分。可使用轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)感興趣植物中一種或多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平和/或表達(dá)模式來改變植物生長和/或脅迫耐受性。可調(diào)節(jié)調(diào)控參與植物生長、光合作用的基因或其他基因的轉(zhuǎn)錄因子來增加植物生長、增加植物質(zhì)量、改善植物脅迫耐受性、并且增加植物產(chǎn)量。本發(fā)明的實(shí)施方式包括:1.一種通過改變或調(diào)節(jié)編碼選自下組的多肽或其片段或變體的至少一種核苷酸序列的表達(dá)來改善感興趣植物中的植物生長的方法:SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、21、23、27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、或51。2.如實(shí)施方式1所述的方法,其中所述核苷酸序列編碼選自下組的多肽或其片段或變體:SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、或16。3.如實(shí)施方式1所述的方法,其中至少一種核苷酸序列上調(diào),使得TF的表達(dá)相對于對照植物細(xì)胞增加。4.如實(shí)施方式1所述的方法,其中至少一種核苷酸序列下調(diào),使得TF的表達(dá)相對于對照植物細(xì)胞減少。5.如實(shí)施方式1、2、3或4所述的方法,其中所述調(diào)節(jié)通過穩(wěn)定插入至少一種表達(dá)構(gòu)建體來實(shí)現(xiàn),所述表達(dá)構(gòu)建體包含驅(qū)動在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動子,所述啟動子可操作地連接至編碼至少一種轉(zhuǎn)錄因子的至少一種核苷酸序列,其中所述轉(zhuǎn)錄因子包含選自下組的多肽:SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、21、23、27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、或51。6.如實(shí)施方式1或2中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述片段或變體與所述核苷酸序列或所述多肽序列具有至少80%的序列相同性。7.如實(shí)施方式1或2中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述片段或變體與所述核苷酸序列或所述多肽序列具有至少90%的序列相同性。8.如實(shí)施方式1或2中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述片段或變體與所述核苷酸序列或所述多肽序列具有至少95%的序列相同性。9.如實(shí)施方式1-4中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述調(diào)節(jié)通過穩(wěn)定插入DNA構(gòu)建體來實(shí)現(xiàn),所述DNA構(gòu)建體包含驅(qū)動在植物細(xì)胞中表達(dá)的至少一個啟動子,所述啟動子可操作地連接至針對編碼選自下組的轉(zhuǎn)錄因子多肽的至少一種核苷酸設(shè)計的一個或多個amiRNA盒:SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、21、23、27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、或51。10.如實(shí)施方式1-4中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述調(diào)節(jié)是通過穩(wěn)定插入轉(zhuǎn)化構(gòu)建體來實(shí)現(xiàn),所述轉(zhuǎn)化構(gòu)建體包含一個或多個在植物細(xì)胞中可操作的啟動子,所述啟動子可操作地連接至針對至少一種感興趣轉(zhuǎn)錄因子設(shè)計的一個或多個RNAi盒。11.如實(shí)施方式1-4中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述調(diào)節(jié)通過用衍生自植物病毒并包含在植物細(xì)胞中可操作的至少一個啟動子的自復(fù)制轉(zhuǎn)化構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化感興趣植物物種來實(shí)現(xiàn),所述啟動子可操作地連接至編碼至少一種轉(zhuǎn)錄因子的至少一個開放閱讀框。12.如實(shí)施方式1-4中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述調(diào)節(jié)通過用衍生自植物病毒并包含在植物細(xì)胞中可操作的至少一個啟動子的自復(fù)制轉(zhuǎn)化構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化感興趣植物物種來實(shí)現(xiàn),所述啟動子可操作地連接至針對至少一種感興趣轉(zhuǎn)錄因子設(shè)計的至少一個amiRNA盒。13.如實(shí)施方式1-4中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述調(diào)節(jié)通過用衍生自植物病毒并包含在植物細(xì)胞中可操作的至少一個啟動子的自復(fù)制轉(zhuǎn)化構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化感興趣植物物種來實(shí)現(xiàn),所述啟動子可操作地連接至針對至少一種感興趣轉(zhuǎn)錄因子設(shè)計的至少一個RNAi盒。14.如實(shí)施方式1-4中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述調(diào)節(jié)通過將至少一個順式調(diào)節(jié)元件在一定位置插入植物細(xì)胞的基因組來實(shí)現(xiàn),使得所述順式調(diào)節(jié)元件可改變至少一種感興趣轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平和/或表達(dá)概況。15.如實(shí)施方式9-13中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述至少一個啟動子是組成型啟動子。16.如實(shí)施方式9-13中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述至少一個啟動子是非組成型啟動子。17.如實(shí)施方式16所述的方法,其中所述至少一個啟動子是發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動子。18.如實(shí)施方式16所述的方法,其中所述至少一個啟動子是晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)或晝調(diào)節(jié)的啟動子。19.如實(shí)施方式16所述的方法,其中所述至少一個啟動子是組織特異性啟動子。20.如實(shí)施方式16所述的方法,其中所述至少一個啟動子是誘導(dǎo)型啟動子。21.如實(shí)施方式16所述的方法,其中所述至少一個啟動子是光調(diào)節(jié)的啟動子。22.如實(shí)施方式16所述的方法,其中所述至少一個啟動子包含SEQIDNO:17所示的序列。23.如實(shí)施方式16所述的方法,其中所述至少一個啟動子包含SEQIDNO:18所示的序列。24.如實(shí)施方式16所述的方法,其中所述至少一個啟動子包含SEQIDNO:19所示的序列。25.如實(shí)施方式1-24中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述感興趣植物是單子葉植物。26.如實(shí)施方式1-24中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述感興趣植物是雙子葉植物。27.一種分離的多核苷酸,所述多核苷酸包含編碼轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸序列,與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、21、23、27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、或51所示的氨基酸序列有至少90%序列相同性。28.如實(shí)施方式27所述的分離的多核苷酸,其中所述多肽與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、21、23、27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、或51所示的氨基酸序列有至少95%序列相同性。29.如實(shí)施方式1所述的方法,其特征在于,所述改善植物生長包括向所述感興趣植物提供對高pH條件的耐受性。30.如實(shí)施方式29所述的方法,其特征在于,所述植物可耐受超過8的pH。31.如實(shí)施方式29所述的方法,其特征在于,所述植物可耐受超過8.5的pH。32.如實(shí)施方式29所述的方法,其特征在于,所述植物可耐受超過9的pH。33.如實(shí)施方式29所述的方法,其特征在于,所述植物可耐受超過9.5的pH。34.如實(shí)施方式1所述的方法,其特征在于,所述改善植物生長包括向所述感興趣植物提供對高鹽條件的耐受性。35.如實(shí)施方式34所述的方法,其特征在于,所述高鹽條件包括超過50ppm的Na+濃度。36.如實(shí)施方式34所述的方法,其特征在于,所述高鹽條件包括超過55ppm的Na+濃度。37.如實(shí)施方式34所述的方法,其特征在于,所述高鹽條件包括超過60ppm的Na+濃度。38.如實(shí)施方式34所述的方法,其特征在于,所述高鹽條件包括超過90ppm的SO42-濃度。39.如實(shí)施方式34所述的方法,其特征在于,所述高鹽條件包括超過100ppm的SO42-濃度。40.如實(shí)施方式34所述的方法,其特征在于,所述高鹽條件包括超過110ppm的SO42-濃度。41.如實(shí)施方式34所述的方法,其特征在于,所述高鹽條件包括超過120ppm的SO42-濃度。42.如實(shí)施方式34所述的方法,其特征在于,所述高鹽條件包括超過130ppm的SO42-濃度。43.如實(shí)施方式34所述的方法,其特征在于,所述高鹽條件包括超過140ppm的SO42-濃度。44.如實(shí)施方式34所述的方法,其特征在于,所述高鹽條件包括超過150ppm的SO42-濃度。45.如實(shí)施方式34所述的方法,其特征在于,所述高鹽條件包括超過20ppm的Cl-濃度。46.如實(shí)施方式34所述的方法,其特征在于,所述高鹽條件包括超過50ppm的Na+濃度、超過90ppm的SO42-濃度、和超過20ppm的Cl-濃度。發(fā)明詳述增加作物植物生長以獲得更高產(chǎn)量是植物育種和植物生物技術(shù)的主要目標(biāo)。作為一種極復(fù)雜的性狀,產(chǎn)量潛力通過正反饋和負(fù)反饋同時控制,并且通過多個代謝通路中的許多不同基因調(diào)節(jié)。因此,這種性狀的成功操作需要同時操作許多不同基因的表達(dá)。同時操作許多基因的表達(dá)的理想方法是改變調(diào)節(jié)與感興趣性狀(即,升高的作物生長和產(chǎn)量)相關(guān)的多個基因的表達(dá)的一個或多個轉(zhuǎn)錄因子(TF)的表達(dá)。本發(fā)明描述了改變植物中TF表達(dá)的方法,其導(dǎo)致改善的植物生長和產(chǎn)量。提供了編碼TF的重組核苷酸序列。描述了改變所述TF的表達(dá)水平和/或概況以改善植物生長的方法。另外,提供了已經(jīng)修飾以調(diào)節(jié)至少一種本發(fā)明的TF的表達(dá)的植物、種子和植物部分?!爱a(chǎn)量”或“作物產(chǎn)量”是每單位耕地面積收獲的作物的量的量度。作物產(chǎn)量是通常用于谷物或谷類的量度,并且通常測量為給定時間內(nèi)單位面積收獲的植物的量,即噸/公頃或千克/公頃的度量。作物產(chǎn)量也指由植物產(chǎn)生或生成的實(shí)際種子或生物質(zhì)。“耐受”或“耐受性”是指植物在特定組的環(huán)境條件下生長的能力,該環(huán)境條件一般被視為不利于植物生長,并且對照植物在該環(huán)境條件下無法正常生長。當(dāng)在這類環(huán)境條件下生長時,耐受植物可相對于對照植物顯示出改善的產(chǎn)量。“重組多核苷酸”包含兩個或更多個化學(xué)連接的核酸區(qū)段的組合,未發(fā)現(xiàn)這些區(qū)段在自然中直接接合?!爸苯咏雍稀敝?個核酸區(qū)段緊鄰并且通過化學(xué)鍵互相連接。在具體實(shí)施方式中,重組多核苷酸包含感興趣多核苷酸或其活性變體或片段,使得其他化學(xué)連接的核酸區(qū)段位于感興趣多核苷酸的5’、3’或內(nèi)部?;蛘撸赏ㄟ^刪除序列來形成重組多核苷酸的化學(xué)連接的核酸區(qū)段。其他化學(xué)連接的核酸區(qū)段或刪除以接合連接的核酸區(qū)段的序列可以是任意長度,包括,例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多核苷酸。本文公開了用于制備這種重組多核苷酸的各種方法,例如,通過化學(xué)合成或通過遺傳工程技術(shù)對多核苷酸的分離區(qū)段進(jìn)行操作。在具體實(shí)施方式中,重組多核苷酸可包含重組DNA序列或重組RNA序列?!爸亟M多核苷酸的片段”包含兩個或更多個化學(xué)連接的氨基酸區(qū)段的組合中的至少一個,未發(fā)現(xiàn)這些區(qū)段在自然中直接接合?!爸亟M多核苷酸構(gòu)建體”包含兩個或更多個可操作連接的核酸區(qū)段,未發(fā)現(xiàn)這些區(qū)段在自然中可操作連接。重組多核苷酸構(gòu)建體的非限制性示例包括可操作連接至異源序列的感興趣多核苷酸或其活性變體或片段,該異源序列輔助感興趣序列的表達(dá)、自體復(fù)制和/或基因組插入。這類異源且可操作連接的序列包括,例如,啟動子、終止序列、增強(qiáng)子等,或表達(dá)盒的任意組分;質(zhì)粒、粘粒、病毒、自體復(fù)制序列、噬菌體、或者線性或環(huán)狀單鏈或雙鏈DNA或RNA核苷酸序列;和/或編碼異源多肽的序列?!爸亟M多肽”包含兩個或更多個化學(xué)連接的氨基酸區(qū)段的組合,未發(fā)現(xiàn)這些區(qū)段在自然中直接接合。在具體實(shí)施方式中,重組多肽包含額外的化學(xué)連接的氨基酸區(qū)段,其位于重組多肽的N-端、C-端或內(nèi)部。或者,可通過刪除至少一個氨基酸來形成重組多肽的化學(xué)連接的氨基酸區(qū)段。其他化學(xué)連接的氨基酸區(qū)段或刪除的化學(xué)連接的氨基酸區(qū)段的序列可以是任意長度,包括,例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多氨基酸。本發(fā)明包括合成寡核苷酸或核苷酸序列。合成序列是在實(shí)驗(yàn)室條件中產(chǎn)生或再生成的序列。雖然,核苷酸序列可具有相對于母序列改變的核苷酸序列,合成序列可與天然產(chǎn)生的序列相同。然而,在兩種情況中,合成序列的結(jié)構(gòu)改變或者與從其自然條件中直接分離的序列中所見的不同。“改變”或“調(diào)節(jié)”TF的表達(dá)是指表達(dá)相對于野生型或?qū)φ罩参镏兴鯰F的表達(dá)水平上調(diào)或下調(diào)。認(rèn)識到在一些情況中,通過增加一種或多種本發(fā)明的TF的表達(dá)水平(即上調(diào)表達(dá))來增加植物生長和產(chǎn)量。類似地,在一些情況中,通過降低一種或多種本發(fā)明的TF的表達(dá)水平,即下調(diào)表達(dá)來增加植物生長和產(chǎn)量。因此,本發(fā)明包括上調(diào)或下調(diào)一種或多種本發(fā)明的TF。另外,該方法包括在感興趣植物中上調(diào)至少一種TF并下調(diào)至少一種TF。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因植物中本發(fā)明的TF中的至少一種的濃度和/或活性是指相對于天然對照植物、植物部分或沒有導(dǎo)入本發(fā)明序列的細(xì)胞,濃度和/或活性增加或降低至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%。認(rèn)識到可通過選擇本發(fā)明的啟動子或使用本發(fā)明的增強(qiáng)子來控制TF的表達(dá)水平。例如,如果需要30%增加,可選擇啟動子來提供合適的表達(dá)水平。例如,可通過測定植物中TF的水平來直接測量TF的表達(dá)水平。使用本發(fā)明的組合物來改變植物中感興趣基因,尤其是參與光合作用的基因的表達(dá)。因此,可與對照植物相比調(diào)節(jié)TF的表達(dá)?!皩ο笾参锘蛑参锛?xì)胞”是其中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)感興趣基因的遺傳改變?nèi)甾D(zhuǎn)化,或者是源自如此改變的植物或細(xì)胞并包含改變的植物或植物細(xì)胞?!皩φ铡被颉皩φ罩参铩被颉皩φ罩参锛?xì)胞”提供了測量對象植物或植物細(xì)胞的表型變化的參照點(diǎn)。因此,根據(jù)本發(fā)明的方法,表達(dá)水平高于或低于對照植物中的表達(dá)水平。一種對照植物或植物細(xì)胞可包含,例如:(a)野生型植物或細(xì)胞,即具有與用于產(chǎn)生對象植物或細(xì)胞的遺傳改變的起始材料相同的基因型;(b)與起始材料有相同基因型的植物或植物細(xì)胞,但其已經(jīng)用無效構(gòu)建體(即,用對感興趣性狀沒有已知影響的構(gòu)建體,如包含標(biāo)記基因的構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化;(c)植物或植物細(xì)胞,其是對象植物或植物細(xì)胞的后代中的非轉(zhuǎn)化分離體;(d)與對象植物或植物細(xì)胞在遺傳上相同但沒有接觸會誘導(dǎo)感興趣基因表達(dá)的條件或刺激的植物或植物細(xì)胞;或(e)在不表達(dá)感興趣基因的條件下的對象植物或植物細(xì)胞本身。雖然本發(fā)明以轉(zhuǎn)化的植物描述,應(yīng)認(rèn)識到本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的生物體可包括植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、植物可再生的植物組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物塊、和在植物或植物部分中完整的植物細(xì)胞如胚胎、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝條、果實(shí)、仁、谷穗、穗軸、外殼、柄、根、根尖、花粉囊、種子等。谷粒是指由種植戶處于生長或繁殖物種以外的目的產(chǎn)生的成熟種子。再生植物的后代、變體和突變體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi),只要這些部分包含導(dǎo)入的多核苷酸。本發(fā)明包括分離的或基本純化的轉(zhuǎn)錄因子或增強(qiáng)子多核苷酸或氨基酸組合物?!胺蛛x的”或“純化的”多核苷酸或蛋白或其生物活性部分基本或本質(zhì)上不含其天然產(chǎn)生環(huán)境中通常伴隨多核苷酸或蛋白或與之相互作用的組分。因此,通過重組技術(shù)產(chǎn)生時,分離或純化的多核苷酸或蛋白基本不含其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基,或者通過化學(xué)方法合成時基本不含化學(xué)物質(zhì)前體或其他化學(xué)物質(zhì)。任選地,“分離的”多核苷酸不含該多核苷酸源自的生物體基因組DNA中天然側(cè)接所述多核苷酸(即位于多核苷酸5′和3′末端處的序列)的序列(任選蛋白編碼序列)。本發(fā)明也包括本文公開的多核苷酸和由其編碼的氨基酸序列的片段和變體?!捌巍笔侵付嗪塑账岬牟糠只虬被嵝蛄械牟糠??!白凅w”是指基本相似的序列。對于多核苷酸,變體包括具有以下的多核苷酸:在5′和/或3′端處的刪除(即,截短);在天然多核苷酸中一個或多個內(nèi)部位點(diǎn)處的刪除和/或添加;和/或在天然多核苷酸中一個或多個位點(diǎn)處一個或多個核苷酸的取代。本文所用的“天然”多核苷酸或多肽分別包含天然產(chǎn)生的核苷酸序列或氨基酸序列。一般而言,本發(fā)明的特定多核苷酸的變體將與由本文他處所述的序列比對程序和參數(shù)確定的特定核苷酸有至少約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列相同性。“變體”氨基酸或蛋白是指通過在天然蛋白質(zhì)的N-末端和/或C-末端處刪除(也稱為截短)一個或多個氨基酸;在天然蛋白質(zhì)的一個或多個內(nèi)部位點(diǎn)處刪除和/或添加一個或多個氨基酸;或在天然蛋白質(zhì)的一個或多個位點(diǎn)處取代一個或多個氨基酸衍生的氨基酸或蛋白質(zhì)。本發(fā)明包括的變體蛋白質(zhì)有生物活性,即它們繼續(xù)具有天然TF或增強(qiáng)子的所需生物活性。本發(fā)明的天然TF或增強(qiáng)子序列的生物活性變體將與由本文所述的序列比對程序和參數(shù)確定的天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列相同性。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物活性變體與該蛋白質(zhì)可相差少至1-15個氨基酸殘基,少至1-10個,如6-10個,少至4、3、2或甚至1個氨基酸殘基。如圖所示,本發(fā)明的TF因子在感興趣植物中調(diào)整,即上調(diào)或下調(diào)??赡苄枰险{(diào)至少一種TF,同時下調(diào)至少一種不同的TF。增加表達(dá)或上調(diào)TF的方法是本領(lǐng)域已知的并且可用于本發(fā)明的方法中。在一個實(shí)施方式中,可通過用包含可操作地連接至至少一種本發(fā)明的TF的在植物中驅(qū)動表達(dá)的啟動子的表達(dá)盒來穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)上調(diào)。可通過使用精確基因組編輯技術(shù)來實(shí)現(xiàn)一種或多種本發(fā)明的TF的表達(dá)以調(diào)節(jié)內(nèi)源性TF序列的表達(dá)。通過這種方式,通過使用本領(lǐng)域已知的方法將核酸插入編碼感興趣TF的天然植物序列附近。這類方法包括但不限于針對感興趣植物基因組序列設(shè)計的大范圍核酸酶(D’Halluin等,(2013)PlantBiotechnolJ11:933-941);CRISPR-Cas9,TALEN,和其他精確編輯基因組的技術(shù)(Feng等,(2013)CellResearch23:1229-1232,Podevin等,(2013)TrendsBiotechnology31:375-383,Wei等,(2013)JGenGenomics40:281-289,Zhang等,(2013)WO2013/026740);Cre-lox位點(diǎn)-特異性重組(Dale等,(1995)PlantJ7:649-659;Lyznik等,(2007)TransgenicPlantJ1:1-9;FLP-FRT重組(Li等,(2009)PlantPhysiol151:1087-1095);Bxb1-介導(dǎo)的整合(Yau等,PlantJ(2011)701:147-166);鋅指介導(dǎo)的整合(Wright等,(2005)PlantJ44:693-705);Cai等,(2009)PlantMolBiol69:699-709);和同源重組(Lieberman-Lazarovich和Levy(2011)MethodsMolBiol701:51-65);Puchta,H.(2002)PlantMolBiol48:173-182)。使用所述核酸序列的插入來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的一種或多種TF的過表達(dá)的所需結(jié)果。增強(qiáng)子包括能夠在插入植物的基因組時增強(qiáng)基因表達(dá)的任何分子。因此,可將增強(qiáng)子插入至少一個感興趣TF序列的上游或下游基因組區(qū)中以增強(qiáng)表達(dá)。相對于將增強(qiáng)表達(dá)的基因,增強(qiáng)子可以起順式作用,并且可位于基因組內(nèi)的任何位置。例如,增強(qiáng)子可位于增強(qiáng)表達(dá)的編碼序列的約1Mbp以內(nèi)、約100kbp以內(nèi)、約50kbp、約30kbp、約20kbp、約10kbp、約5kbp、約3kbp、或約1kbp以內(nèi)。增強(qiáng)子也可位于其增強(qiáng)表達(dá)的基因的約1500bp以內(nèi),或者可緊鄰或位于其增強(qiáng)表達(dá)的基因的內(nèi)含子以內(nèi)。本發(fā)明的用于調(diào)節(jié)內(nèi)源性TF或同源物表達(dá)的增強(qiáng)子包括經(jīng)典增強(qiáng)子元件,如CaMV35S增強(qiáng)子元件、巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動子增強(qiáng)子元件、和SV40增強(qiáng)子元件,還包括增強(qiáng)基因表達(dá)的內(nèi)含子-介導(dǎo)的增強(qiáng)子元件如玉米shrunken-1增強(qiáng)子元件(Clancy,M.和Hannah,L.C.(2002)PlantPhysiol.130(2):918-29)??蓪?dǎo)入植物基因組以調(diào)節(jié)表達(dá)的增強(qiáng)子的其他示例包括PetE增強(qiáng)子(Chua等,(2003)PlantCell15:11468-1479),或水稻α-淀粉酶增強(qiáng)子(Chen等,(2002)J.Biol.Chem.277:13641-13649),或本領(lǐng)域已知的任何增強(qiáng)子(Chudalayandi,S.(2011)MethodsMol.Biol.701:285-300)。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明包括亞結(jié)構(gòu)域、片段、或重復(fù)增強(qiáng)子元件(Benfrey等,(1990)EMBOJ9:1677-1684)。本發(fā)明還提供通過將啟動子或增強(qiáng)子插入植物基因組使其調(diào)節(jié)內(nèi)源或外源序列的表達(dá)來調(diào)節(jié)植物中TF表達(dá)的方法。如上所述,使用本文提供的序列確定啟動子或增強(qiáng)子的插入位點(diǎn)的方法和在給定插入位點(diǎn)處將啟動子或增強(qiáng)子序列插入植物基因組的方法是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明的方法也包括TF的下調(diào)或活性降低(也稱為基因沉默或基因抑制)。許多基因沉默的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的,包括但不限于,反義技術(shù)(參見,例如,Sheehy等,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8805-8809;和美國專利號5,107,065;5,453,566;和5,759,829);共抑制(例如,Taylor(1997)PlantCell9:1245;Jorgensen(1990)TrendsBiotech.8(12):340-344;Flavell(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3490-3496;Finnegan等,(1994)Bio/Technology12:883-888;和Neuhuber等,(1994)Mol.Gen.Genet.244:230-241);RNA干擾(Napoli等,(1990)PlantCell2:279-289;美國專利號5,034,323;Sharp(1999)GenesDev.13:139-141;Zamore等,(2000)Cell101:25-33;和Montgomery等,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:15502-15507),病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Burton等,(2000)PlantCell12:691-705;和Baulcombe(1999)Curr.Op.PlantBio.2:109-113);靶-RNA-特異性核酶(Haseloff等,(1988)Nature334:585-591);發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Smith等,(2000)Nature407:319-320;WO99/53050;WO02/00904;WO98/53083;Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:4985-4990;Stoutjesdijk等,(2002)PlantPhysiol.129:1723-1731;Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38;Pandolfini等,BMCBiotechnology3:7,美國專利公開號20030175965;Panstruga等,(2003)Mol.Biol.Rep.30:135-140;Wesley等,(2001)PlantJ.27:581-590;Wang和Waterhouse(2001)Curr.Opin.PlantBiol.5:146-150;美國專利公開號20030180945;和WO02/00904,其全部通過引用納入本文);核酶(Steinecke等,(1992)EMBOJ.11:1525;和Perriman等,(1993)AntisenseRes.Dev.3:253);寡核苷酸-介導(dǎo)的靶向修飾(例如,WO03/076574和WO99/25853);Zn-指靶向的分子(例如,WO01/52620;WO03/048345;和WO00/42219);轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽(Maes等,(1999)TrendsPlantSci.4:90-96;Dharmapuri和Sonti(1999)FEMSMicrobiol.Lett.179:53-59;Meissner等,(2000)PlantJ.22:265-274;Phogat等,(2000)J.Biosci.25:57-63;Walbot(2000)Curr.Opin.PlantBiol.2:103-107;Gai等,(2000)NucleicAcidsRes.28:94-96;Fitzmaurice等,(1999)Genetics153:1919-1928;Bensen等,(1995)PlantCell7:75-84;Mena等,(1996)Science274:1537-1540;和美國專利號5,962,764);dCas9-基轉(zhuǎn)錄因子(Piatek等,(2015)PlantBiotechnolJ13:578-589);其各自通過引用納入本文;和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法或上述方法的組合。也可通過使用衍生自植物病毒的自復(fù)制DNA序列而不是通過將一種或多種感興趣基因穩(wěn)定插入植物核基因組來調(diào)節(jié)一種或多種本發(fā)明的TF的表達(dá)。已經(jīng)成功使用衍生自植物病毒如雙粒病毒的序列來實(shí)現(xiàn)在植物中表達(dá)多種感興趣基因(Mozes-Koch等,(2012)PlantPhysiol158:1883-1892)。通過將編碼一種或多種本發(fā)明的TF的一種或多種基因插入衍生自植物病毒的自復(fù)制構(gòu)建體,可通過將病毒衍生的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中并選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)所述TF在感興趣植物物種中的上調(diào)。認(rèn)識到使用本發(fā)明的多核苷酸,可構(gòu)建與TF序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互補(bǔ)的反義構(gòu)建體。構(gòu)建反義核苷酸以與相應(yīng)mRNA雜交??蛇M(jìn)行反義序列的修飾,至少該序列雜交并干擾相應(yīng)mRNA的表達(dá)。在這種方式中,可使用與待沉默的相應(yīng)序列有70%,較佳80%,更佳85%或更大的序列相同性的反義構(gòu)建體。此外,可使用反義核苷酸的部分來破壞編碼TF的靶基因的表達(dá)。也可以正義取向使用本發(fā)明的多核苷酸以抑制植物中內(nèi)源性基因的表達(dá)。方法一般包括用包含啟動子的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物,所述啟動子驅(qū)動植物中可操作連接至對應(yīng)于內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄本的多核苷酸的至少一部分的表達(dá)。一般而言,這種核苷酸序列與內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄本有明顯序列相同性,較佳超過約65%序列相同性,更佳超過約85%序列相同性,最佳超過約95%序列相同性。參見美國專利號5,283,184和5,034,323,其通過引用納入本文。可使用這類方法來降低至少一種TF的表達(dá)??墒褂帽景l(fā)明的多核苷酸來從其他植物中分離相應(yīng)序列。在這種方式中,PCR、雜交和其他類似方法可用于根據(jù)此類序列與本文所示序列的序列同源性來鑒定該序列。根據(jù)該序列與本文所示完整序列或其變體和片段的序列相同性而分離的序列涵蓋在本發(fā)明中。此類序列包括公開序列的直向同源物序列?!爸毕蛲次铩笔侵冈醋怨餐嫦然蚯矣捎谖锓N形成而在不同物種中發(fā)現(xiàn)的基因。在不同物種中發(fā)現(xiàn)的基因當(dāng)它們的核苷酸序列和/或它們的編碼蛋白質(zhì)序列具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列相同性時被認(rèn)為是直向同源物。直向同源物的功能通常在物種之間高度保守。因此,本發(fā)明包括轉(zhuǎn)錄活化或增強(qiáng)子激活并在嚴(yán)格條件下與本文公開的序列或其變體或片段雜交的分離的多核苷酸??赏ㄟ^PCR分離變體序列。設(shè)計PCR引物和PCR克隆的方法是本領(lǐng)域熟知的并且公開于Sambrook等,(1989)《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(第2版,紐約州普萊恩維尤的冷泉港出版社)。還參見Innis等編,(1990)《PCR方案:方法和應(yīng)用指南》(PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications)(紐約學(xué)術(shù)出版社);Innis和Gelfand編,(1995)《PCR策略》(PCRStrategies)(紐約學(xué)術(shù)出版社);以及Innis和Gelfand編,(1999)《PCR方法手冊》(PCRMethodsManual)(紐約學(xué)術(shù)出版社)。也可通過分析測序的基因組的現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫來鑒定變體序列。在這種方式中,可鑒定相應(yīng)TF或啟動子序列并用于本發(fā)明的方法中。比對序列的比較方法是本領(lǐng)域熟知的。因此,可采用數(shù)學(xué)算法確定兩個序列的序列相同性百分?jǐn)?shù)。該數(shù)學(xué)算法的非限制性示例是Myers和Miller(1988)CABIOS4:11-17的算法;Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部比對算法;Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的全局比對算法;Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的搜索局部比對方法;Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264的算法,由Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877改良。這些數(shù)學(xué)算法的計算機(jī)實(shí)施可用于比較序列來確定序列相同性。這類實(shí)施包括但不限于:PC/Gene程序中的CLUSTAL(購自美國加利福尼亞州芒廷維尤的智慧遺傳公司(Intelligenetics,MountainView,California);ALIGN程序(2.0版)和GCGWisconsin遺傳軟件包中的GAP,BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA,10版(購自阿克賽勒里公司(AccelrysInc.),美國加利福尼亞州圣地亞哥Scranton路9685號)??捎媚J(rèn)參數(shù)來進(jìn)行使用這些程序的比對。CLUSTAL程序由以下詳細(xì)描述:Higgins等,(1988)Gene73:237-244(1988);Higgins等,(1989)CABIOS5:151-153;Corpet等,(1988)NucleicAcidsRes.16:10881-90;Huang等,(1992)CABIOS8:155-65;和Pearson等,(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331。ALIGN程序基于Myers和Miller(1988)同上的算法。比較氨基酸序列時,PAM120權(quán)重殘基表、缺口長度罰分12、和缺口罰分4可與ALIGN程序聯(lián)用。Altschul等,(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLAST程序基于Karlin和Altschul(1990)同上的算法??衫肂LASTN程序進(jìn)行BLAST核苷酸搜索(評分=100,字長=12),以獲得與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核苷酸序列同源的核苷酸序列??衫肂LASTX程序進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索(評分=50,字長=3),以獲得與本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽同源的氨基酸序列。為了獲得缺口比對(出于比較目的),可如Altschul等,(1997)NucleicAcidsRes.,25:33893402所述利用缺口BLAST(在BLAST2.0中)。或者,可利用PSI-BLAST(在BLAST2.0中)進(jìn)行迭代搜索,其用來檢測分子之間的遠(yuǎn)近關(guān)系。參見Altschul等,(1997)同上。利用BLAST、缺口BLAST和PSI-BLAST程序時,可使用各程序(例如針對蛋白質(zhì)的BLASTX,針對核苷酸的BLASTN)的默認(rèn)參數(shù)。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。也可通過檢查來人工進(jìn)行比對??稍诒磉_(dá)盒中提供本發(fā)明的多核苷酸用于在感興趣植物中表達(dá)。該盒將包括與可操作連接至本發(fā)明的TF多核苷酸的5′和3′調(diào)節(jié)序列?!翱刹僮鞯剡B接”是指2個或更多個元件之間的功能性連接。盒還可含有至少一種待共轉(zhuǎn)化到生物體中的額外基因?;蛘?,可在多個表達(dá)盒上提供額外基因。這種表達(dá)盒可提供多個限制位點(diǎn)和/或重組位點(diǎn)用于在調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄條件下插入TF多核苷酸。表達(dá)盒還可含有選擇性標(biāo)記基因。表達(dá)盒將包括5′-3′方向的轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即,啟動子),本發(fā)明的TF多核苷酸,和在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即,終止區(qū))。本發(fā)明的實(shí)踐中可使用多種啟動子。組成型啟動子包括CaMV35S啟動子(Odell等,(1985)Nature313:810-812);水稻肌動蛋白(McElroy等,(1990)PlantCell2:163-171);泛素(Christensen等,(1989)PlantMol.Biol.12:619-632和Christensen等,(1992)PlantMol.Biol.18:675-689);pEMU(Last等,(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588);MAS(Velten等,(1984)EMBOJ.3:2723-2730);ALS啟動子(美國專利號5,659,026)等。組織優(yōu)選的啟動子包括Yamamoto等,(1997)PlantJ.12(2):255-265;Kawamata等,(1997)PlantCellPhysiol.38(7):792-803;Hansen等,(1997)Mol.GenGenet.254(3):337-343;Russell等,(1997)TransgenicRes.6(2):157-168;Rinehart等,(1996)PlantPhysiol.112(3):1331-1341;VanCamp等,(1996)PlantPhysiol.112(2):525-535;Canevascini等,(1996)PlantPhysiol.112(2):513-524;Yamamoto等,(1994)PlantCellPhysiol.35(5):773-778;Lam(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20:181-196;Orozco等,(1993)PlantMolBiol.23(6):1129-1138;Matsuoka等,(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590;和Guevara-Garcia等,(1993)PlantJ.4(3):495-505。葉優(yōu)選啟動子也是本領(lǐng)域已知的。參見,例如,Yamamoto等,(1997)PlantJ.12(2):255-265;Kwon等,(1994)PlantPhysiol.105:357-67;Yamamoto等,(1994)PlantCellPhysiol.35(5):773-778;Gotor等,(1993)PlantJ.3:509-18;Orozco等,(1993)PlantMol.Biol.23(6):1129-1138;和Matsuoka等,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590。認(rèn)識到特異性非組成型表達(dá)概況可相對于一種或多種感興趣基因的組成型表達(dá)提供改善的植物表型。例如,通過光條件、施加特定應(yīng)力、晝夜循環(huán)、或植物發(fā)育階段來調(diào)節(jié)許多植物基因。這些表達(dá)概況對于植物中基因或基因產(chǎn)物的功能而言是非常重要的??捎糜谔峁┧璧谋磉_(dá)概況的一個策略是使用含有在植物中所需的時間和位置處驅(qū)動所需的表達(dá)水平的順式調(diào)節(jié)元件的合成啟動子。多名研究人員已經(jīng)鑒定了可用于改變植物中基因表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件(Vandepoele等,(2009)PlantPhysiol150:535-546;Rushton等,(2002)PlantCell14:749-762)。已經(jīng)對使用順式調(diào)節(jié)元件來改變啟動子表達(dá)概況進(jìn)行了綜述(Venter(2007)TrendsPlantSci.12:118-124)。轉(zhuǎn)錄組研究的新技術(shù)和分析這類數(shù)據(jù)庫的新方法的快速開發(fā)使得能夠發(fā)現(xiàn)新的順式調(diào)節(jié)元件。已知之前使用的微陣列數(shù)據(jù)庫沒有與使用RNA-Seq生成的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相同的分辨率。使用這些更新的技術(shù)來生成轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和開發(fā)用于分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的新軟件算法使得能夠發(fā)現(xiàn)包括本文所述的那些的新順式調(diào)節(jié)元件。本領(lǐng)域已知植物終止子并且包括來自根癌土壤桿菌(A.tumefaciens)的Ti-質(zhì)粒的那些,如真蛸堿合酶和膽脂堿合酶終止區(qū)。還參見Guerineau等,(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144;Proudfoot(1991)Cell64:671-674;Sanfacon等.(1991)GenesDev.5:141-149;Mogen等,(1990)PlantCell2:1261-1272;Munroe等,(1990)Gene91:151-158;Ballas等,(1989)NucleicAcidsRes.17:7891-7903;和Joshi等,(1987)NucleicAcidsRes.15:9627-9639。如上所述,TF可用于表達(dá)盒來轉(zhuǎn)化感興趣植物。轉(zhuǎn)化方案以及向植物中導(dǎo)入多肽或多核苷酸序列的方案可根據(jù)轉(zhuǎn)化靶向的植物或植物細(xì)胞的類型變化,即,單子葉或雙子葉。向植物細(xì)胞中導(dǎo)入多肽和多核苷酸的合適方法包括微注射(Crossway等,(1986)Biotechniques4:320-334)、電穿孔(Riggs等,(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602-5606),農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國專利號5,563,055和美國專利號5,981,840),直接基因轉(zhuǎn)化(Paszkowski等,(1984)EMBOJ.3:2717-2722),和彈道顆粒加速(參見例如,美國專利號4,945,050;美國專利號5,879,918;美國專利號5,886,244;和5,932,782;Tomes等,(1995)《植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)中的基礎(chǔ)方法》(PlantCell,Tissue,andOrganCulture:FundamentalMethods),Gamborg和Phillips編(Springer-Verlag,Berlin);McCabe等,(1988)Biotechnology6:923-926);和Lec1轉(zhuǎn)化(WO00/28058)。還參見Weissinger等,(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477;Sanford等,(1987)ParticulateScienceandTechnology5:2737(洋蔥);Christou等,(1988)PlantPhysiol.87:671-674(大豆);McCabe等,(1988)Bio/Technology6:923-926(大豆);Finer和McMullen(1991)InVitroCellDev.Biol.27P:175-182(大豆);Singh等,(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆);Datta等,(1990)Biotechnology8:736(水稻);Klein等,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4305-4309(玉米);Klein等,(1988)Biotechnology6:559-563(玉米);美國專利號5,240,855;5,322,783;和5,324,646;Klein等,(1988)PlantPhysiol.91:440-444(玉米);Fromm等,(1990)Biotechnology8:833-839(玉米);Hooykaas-VanSlogteren等,(1984)Nature(倫敦)311:763-764;美國專利號5,736,369(谷類);Bytebier等,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:5345-5349(百合);DeWet等,(1985)《胚珠組織實(shí)驗(yàn)操作》(TheExperimentalManipulationofOvuleTissues),Chapman等編,(紐約朗文出版社(Longman,NewYork),第197-209頁(花粉);Kaeppler等,(1990)PlantCellReports9:415-418和Kaeppler等,(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(須-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化);D′Halluin等,(1992)PlantCell4:1495-1505(電穿孔);Li等,(1993)PlantCellReports12:250-255以及Christou和Ford(1995)AnnalsofBotany75:407-413(水稻);Osjoda等,(1996)NatureBiotechnology14:745-750(玉米,通過根癌農(nóng)桿菌);其全部通過引用納入本文?!胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”是指導(dǎo)入植物的核苷酸構(gòu)建體整合到植物的基因組中并且能夠被其后代遺傳。“順式轉(zhuǎn)化”是指導(dǎo)入植物的核苷酸構(gòu)建體并不穩(wěn)定整合到植物的基因組中,但是在植物細(xì)胞中保持足夠的時間以允許導(dǎo)入基因的表達(dá)。按照常規(guī)方式,已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可長成植物。參見,例如,McCormick等,(1986)PlantCellReports5:81-84。在這種方式中,本發(fā)明提供了具有穩(wěn)定整合到其基因組中的本發(fā)明的多核苷酸,例如,本發(fā)明的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化的種子(也稱為“轉(zhuǎn)基因種子”)。本發(fā)明可用于任何植物物種的轉(zhuǎn)化,包括但不限于單子葉和雙子葉。感興趣植物物種的示例包括但不限于,玉米(Zeamays),油菜種(例如,甘藍(lán)型油菜(B.napus)、白菜型油菜(B.rapa)、芥菜型油菜(B.juncea)),尤其是用作菜籽油來源的那些油菜物種,苜蓿(Medicagosativa),水稻(Oryzasativa),黑麥(Secalecereale),高粱(Sorghumbicolor,Sorghumvulgare),粟(例如,珍珠粟(Pennisetumglaucum),黍(Panicummiliaceum),小米(Setariaitalica),穇子(Eleusinecoracana)),向日葵(Helianthusannuus),紅花(Carthamustinctorius),小麥(Triticumaestivum),大豆(Glycinemax),煙草(Nicotianatabacum),馬鈴薯(Solanumtuberosum),花生(Arachishypogaea),棉花(Gossypiumbarbadense,Gossypiumhirsutum),甘薯(Ipomoeabatatas),木薯(Manihotesculenta),咖啡(Coffeaspp.),椰子(Cocosnucifera),菠蘿(Ananascomosus),檸檬樹(Citrusspp.),可可(Theobromacacao),茶(Camelliasinensis),香蕉(Musaspp.),鱷梨(Perseaamericana),無花果(Ficuscasica),番石榴(Psidiumguajava),芒果(Mangiferaindica),橄欖(Oleaeuropaea),番木瓜(Caricapapaya),腰果(Anacardiumoccidentale),澳洲堅果(Macadamiaintegrifolia),杏(Prunusamygdalus)、甜菜(Betavulgaris)、甘蔗(Saccharumspp.)、油棕櫚(Elaeisguineensis)、楊樹(Populussp.)、桉樹(Eucalyptussp.)、燕麥、大麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹。通過說明的方式,而非限制性方式提供以下實(shí)施例。本說明書中涉及的所有專利申請和出版物指示本發(fā)明涉及領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。所有發(fā)表物和專利申請通過引用納入本文,就好像將各篇單獨(dú)的發(fā)表物或?qū)@暾埦唧w和單獨(dú)地通過引用納入本文那樣。雖然出于方便理解的目的,通過闡述和舉例的方式詳細(xì)描述了上述發(fā)明,但可明顯看出,某些改變和修改應(yīng)屬于所附權(quán)利要求書的范圍。實(shí)驗(yàn)部分實(shí)施例1-二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)中的GRMZM2G143718表達(dá)對GRMZM2G143718編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,用于在二穗短柄草中表達(dá)(SEQIDNO:1)。將所得的編碼序列克隆到4個分開的二元載體中,各自具有不同的啟動子和5’UTR。這些二元載體描述于表1。表1:GRMZM2G143718構(gòu)建體使用表1所述的載體來轉(zhuǎn)化二穗短柄草細(xì)胞。使用植物組織培養(yǎng)技術(shù)來再生轉(zhuǎn)化的二穗短柄草細(xì)胞以產(chǎn)生含有這些載體中的GRMZM2G143718轉(zhuǎn)基因盒的轉(zhuǎn)基因二穗短柄草植物。通過使用從再生植物的葉中提取的DNA作為模板的PCR來確認(rèn)轉(zhuǎn)基因盒的導(dǎo)入。在這些轉(zhuǎn)化過程期間,發(fā)現(xiàn)不可能從用載體130020轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中再生植物,該載體含有由ZmUbi啟動子和5’UTR驅(qū)動的GRMZM2G143718編碼序列。這表明預(yù)期由該啟動子產(chǎn)生的高水平組成型基因表達(dá)對于組織培養(yǎng)過程期間的植物細(xì)胞而言是不利的。相反,可從用130028、130036、和130044載體轉(zhuǎn)化的二穗短柄草細(xì)胞再生植物。用130028、130036、和130044載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因二穗短柄草植物培養(yǎng)并生長至成熟。這些植物自花授粉以產(chǎn)生種子,然后收獲這些種子并種植以使T1-代植物生長。T1-代植物和野生型二穗短柄草植物一起在生長室中以20小時光/4小時黑暗循環(huán)生長。植物在單獨(dú)盆中生長。在用給定構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的個體事件中觀察生長差異。這三種構(gòu)建體的選擇事件的生物質(zhì)產(chǎn)量數(shù)據(jù)與野生型二穗短柄草植物的類似數(shù)據(jù)一起示于表2。表2:來自GRMZM2G143718二穗短柄草植物的T1-代生物質(zhì)和種子數(shù)據(jù)構(gòu)建體事件n生物質(zhì)產(chǎn)量(g)130028B5135.01±2.06130036F9-144.66±0.88130044B6-1104.98±1.21野生型n/a561.70±0.85從130028二穗短柄草植物的葉中提取RNA。進(jìn)行定量RT-PCR實(shí)驗(yàn),并且發(fā)現(xiàn)GRMZM2G143718轉(zhuǎn)錄本以比二穗短柄草中存在的組成型表達(dá)的天然Ubi10基因高約0.252倍的轉(zhuǎn)錄本水平存在。實(shí)施例2-二穗短柄草中的GRMZM2G117497表達(dá)對GRMZM2G117497編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,用于在二穗短柄草中表達(dá)(SEQIDNO:3)。將所得的編碼序列克隆到4個分開的二元載體中,各自具有不同的啟動子和5’UTR。這些二元載體描述于表3。表3:GRMZM2G117497構(gòu)建體使用表3所述的載體來轉(zhuǎn)化二穗短柄草細(xì)胞。使用植物組織培養(yǎng)技術(shù)來再生轉(zhuǎn)化的二穗短柄草細(xì)胞以產(chǎn)生含有這些載體中的GRMZM2G117497轉(zhuǎn)基因盒的轉(zhuǎn)基因二穗短柄草植物。通過使用從再生植物的葉中提取的DNA作為模板的PCR來確認(rèn)轉(zhuǎn)基因盒的導(dǎo)入。通過使用從再生植物的葉中提取的DNA作為模板的PCR來確認(rèn)轉(zhuǎn)基因盒的導(dǎo)入。含GRMZM2G117497基因的T0-代植物生長至成熟并且允許自花授粉以產(chǎn)生T1-代種子。種植所得的T1-代種子,T1-代植物與野生型二穗短柄草植物在20小時光/4小時黑暗的光周期下一起培養(yǎng)。植物在單個盆中生長。來自130032和130040構(gòu)建體的選擇事件的生物質(zhì)產(chǎn)量數(shù)據(jù)與野生型二穗短柄草植物的類似數(shù)據(jù)一起示于表4。表4:來自GRMZM2G117497二穗短柄草植物的T1-代生物質(zhì)和種子數(shù)據(jù)構(gòu)建體事件n生物質(zhì)產(chǎn)量(g)130032E14-242.17±0.66130040I4-324.61±0.31野生型n/a561.70±0.85實(shí)施例3-二穗短柄草中的GRMZM2G158117表達(dá)對GRMZM2G158117編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,用于在二穗短柄草中表達(dá)(SEQIDNO:5)。將所得的編碼序列克隆到4個分開的二元載體中,各自具有不同的啟動子和5’UTR。這些二元載體描述于表5。表5:GRMZM2G158117構(gòu)建體使用表5所述的載體來轉(zhuǎn)化二穗短柄草細(xì)胞。使用植物組織培養(yǎng)技術(shù)來再生轉(zhuǎn)化的二穗短柄草細(xì)胞以產(chǎn)生含有GRMZM2G158117轉(zhuǎn)基因盒的轉(zhuǎn)基因二穗短柄草植物。用130018構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化嘗試都是不成功的,而表5所列的其他三種構(gòu)建體都產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。這表明來自構(gòu)建體130018中ZmUbi啟動子的強(qiáng)烈組成型表達(dá)產(chǎn)生不利的表型。通過使用從再生植物的葉中提取的DNA作為模板的PCR來確認(rèn)轉(zhuǎn)基因盒的導(dǎo)入。T0-代植物生長至成熟并且自花授粉以產(chǎn)生T1-代種子。所得的T1-代種子與同齡的野生型二穗短柄草植物在20小時光/4小時黑暗的光周期下一起種植。植物在單個盆中生長。來自130026和130034構(gòu)建體的選擇事件的生物質(zhì)產(chǎn)量數(shù)據(jù)與野生型二穗短柄草植物的類似數(shù)據(jù)一起示于表6。表6:來自GRMZM2G158117二穗短柄草植物的T1-代生物質(zhì)和種子數(shù)據(jù)出乎意料,當(dāng)由玉米PepC啟動子和5’UTR(SEQIDNO:17)驅(qū)動時,GRMZM2G158117開放閱讀框在二穗短柄草中的表達(dá)導(dǎo)致不利的表型。在載體130042中,玉米PepC啟動子和5’UTR剛好位于GRMZM158117編碼序列(SEQIDNO:5)的上游。在這些130042植物中,T0-代植物沒有在移植到土壤中之后存活或者生長不良并且不產(chǎn)生任何種子。這些130042植物中的許多無法產(chǎn)生任何花。從130026和130034二穗短柄草植物的葉中提取RNA。進(jìn)行定量RT-PCR實(shí)驗(yàn),并且發(fā)現(xiàn)GRMZM2G158117轉(zhuǎn)錄本以比二穗短柄草中存在的組成型表達(dá)的天然Ubi10基因的轉(zhuǎn)錄本水平分別高約0.027倍和0.072倍的水平存在。實(shí)施例4-二穗短柄草中的GRMZM2G150260表達(dá)對GRMZM2G150260編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,用于在二穗短柄草中表達(dá)(SEQIDNO:7)。將所得的編碼序列克隆到3個分開的二元載體中,各自具有不同的啟動子和5’UTR。這些二元載體描述于表7。表7:GRMZM2G150260構(gòu)建體使用植物組織培養(yǎng)技術(shù)來再生轉(zhuǎn)化的二穗短柄草細(xì)胞,以產(chǎn)生含有表7所述的GRMZM2G150260轉(zhuǎn)基因盒的轉(zhuǎn)基因二穗短柄草植物。通過使用從再生植物的葉中提取的DNA作為模板的PCR來確認(rèn)轉(zhuǎn)基因盒的導(dǎo)入。T0-代植物生長至成熟并且自花授粉以產(chǎn)生T1-代種子。所得的T1-代種子與同齡的野生型二穗短柄草植物在20小時光/4小時黑暗的光周期下一起種植。植物在單個盆中生長。這些構(gòu)建體的選擇事件的生物質(zhì)產(chǎn)量數(shù)據(jù)與野生型二穗短柄草植物的類似數(shù)據(jù)一起示于表8,并且其中有無效分離子(nullsegregant)植物。表8:來自GRMZM2G150260二穗短柄草植物的T1-代生物質(zhì)和種子數(shù)據(jù)從130027二穗短柄草植物的葉中提取RNA。進(jìn)行定量RT-PCR實(shí)驗(yàn),并且發(fā)現(xiàn)GRMZM2G150260轉(zhuǎn)錄本以比二穗短柄草中存在的組成型表達(dá)的天然Ubi10基因高約0.006倍的轉(zhuǎn)錄本水平存在。實(shí)施例5-二穗短柄草中的GRMZM2G165042表達(dá)對GRMZM2G165042編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,用于在二穗短柄草中表達(dá)(SEQIDNO:9)。將所得的編碼序列克隆到4個分開的二元載體中,各自具有不同的啟動子和5’UTR。這些二元載體描述于表9。表9:GRMZM2G165042構(gòu)建體使用植物組織培養(yǎng)技術(shù)來再生轉(zhuǎn)化的二穗短柄草細(xì)胞以產(chǎn)生含有表9所述的GRMZM2G165042轉(zhuǎn)基因盒的轉(zhuǎn)基因二穗短柄草植物。通過使用從再生植物的葉中提取的DNA作為模板的PCR來確認(rèn)轉(zhuǎn)基因盒的導(dǎo)入。含有GRMZM2G165042轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物生長并允許自花授粉以產(chǎn)生T1種子。轉(zhuǎn)基因130041二穗短柄草植物顯示不利的生長表型。24個產(chǎn)生的130041植物中的11個沒有在移植到土壤之后存活。24個130041植物中的8個顯示非常弱的生長,其生物質(zhì)累積較低。24個130041植物中的5個顯示良好生長,但是在其葉上有棕色病變。來自構(gòu)建體130017、130025、和130033的T1-代植物與野生型二穗短柄草植物一起在生長室中以20小時光/4小時黑暗的光周期生長。植物在單個盆中生長。這些構(gòu)建體的選擇事件的生物質(zhì)產(chǎn)量數(shù)據(jù)與野生型二穗短柄草植物的類似數(shù)據(jù)一起示于表10。表10:來自GRMZM2G165042二穗短柄草植物的T1-代生物質(zhì)和種子數(shù)據(jù)構(gòu)建體事件n生物質(zhì)產(chǎn)量(g)130017C3-221.50±0.58130033C132.41±0.85130033D741.54±0.43野生型n/a561.70±0.85實(shí)施例6-二穗短柄草中的GRMZM2G162749表達(dá)對GRMZM2G162749編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,用于在二穗短柄草中表達(dá)(SEQIDNO:11)。將所得的編碼序列克隆到4個分開的二元載體中,各自具有不同的啟動子和5’UTR。這些二元載體描述于表11。表11:GRMZM2G162749構(gòu)建體使用植物組織培養(yǎng)技術(shù)來再生轉(zhuǎn)化的二穗短柄草細(xì)胞以產(chǎn)生含有表11所述的GRMZM2G162749轉(zhuǎn)基因盒的轉(zhuǎn)基因二穗短柄草植物。通過使用從再生植物的葉中提取的DNA作為模板的PCR來確認(rèn)轉(zhuǎn)基因盒的導(dǎo)入。在使用其中ZmUbi啟動子驅(qū)動GRMZM2G162749序列的130021構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的重復(fù)嘗試之后,不可能生成任何轉(zhuǎn)基因事件。這強(qiáng)烈表明由ZmUbi啟動子賦予的強(qiáng)組成型表達(dá)對于植物再生而言是不利的。從130029、130037、和130045載體中回收轉(zhuǎn)基因植物。這些植物生長至成熟并且允許自花授粉以產(chǎn)生T1-代種子。種植T1-代種子,并且所得的植物與野生型二穗短柄草植物在20小時光/4小時黑暗的光周期下一起生長。植物在單獨(dú)盆中生長。這些構(gòu)建體的選擇事件的生物質(zhì)產(chǎn)量數(shù)據(jù)與野生型二穗短柄草植物的類似數(shù)據(jù)一起示于表12。表12:來自GRMZM2G162749二穗短柄草植物的T1-代生物質(zhì)和種子數(shù)據(jù)從130037二穗短柄草植物的葉中提取RNA。進(jìn)行定量RT-PCR實(shí)驗(yàn),并且發(fā)現(xiàn)GRMZM2G162749轉(zhuǎn)錄本以比二穗短柄草中存在的組成型表達(dá)的天然Ubi10基因高約0.260倍的轉(zhuǎn)錄本水平存在。實(shí)施例7-操作天然植物轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)用于改善的生長表15所列的玉米TF克隆到植物轉(zhuǎn)化載體中用于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員預(yù)期天然玉米TF在玉米中的表達(dá)將導(dǎo)致增加的生長、生物質(zhì)積累、種子產(chǎn)量、和/或其他改善的植物特性,包括但不限于干旱耐受性、熱脅迫耐受性、和耐受鹽脅迫的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將充分理解這些TF的直向同源物在感興趣植物物種中的表達(dá)也可到配制改善的植物特性,包括但不限于,改善的生長、生物質(zhì)積累、種子產(chǎn)量、和/或?qū)ι锘蚍巧锩{迫的抵抗。由于預(yù)期改變表15所列的玉米TF的直向同源物的表達(dá)水平和/或表達(dá)概況可改善植物特性,在感興趣植物物種中鑒定這些TF的直向同源物。鑒定的直向同源物的表達(dá)水平和/或表達(dá)概況然后在感興趣植物物種中處理以改善所述植物的農(nóng)業(yè)性質(zhì)。例如,本文所述的玉米TF的水稻(O.sativa)和二穗短柄草直向同源物示于表15。表15:玉米TF及其在水稻(Oryzasativa)和二穗短柄草中的直向同源物除了表15所列的玉米TF的水稻(Oryzasativa)和二穗短柄草直向同源物以外,通過使用生物信息學(xué)工具鑒定到其他直向同源物。用于鑒定直向同源基因的方法已經(jīng)描述于科學(xué)文獻(xiàn)中并且可用于鑒定對于表15中所列的TF而言直向同源的TF(Li等,(2003)GenomeRes13:2178-2189;Fulton等,(2002)PlantCell14:1457-1467)。在感興趣植物中改變這類直向同源基因的表達(dá)以實(shí)現(xiàn)植物生長或產(chǎn)量的所需增加或增加的對生物或非生物脅迫的抵抗。實(shí)施例8-確定TF結(jié)合位點(diǎn)通過酵母單雜交試驗(yàn)方法來確定感興趣TF的結(jié)合序列。在該方法中,表15中所列的TF被克隆到適于在微生物系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的載體(例如,pET-系列載體;生命技術(shù)公司)。TF在含有蛋白質(zhì)產(chǎn)生質(zhì)粒的合適微生物中產(chǎn)生并純化。純化的TF針對酵母單雜交試驗(yàn)中的合成啟動子文庫進(jìn)行篩選。這種啟動子文庫在至少2種不同情況中含有全部8聚體DNA序列。這些酵母單雜交試驗(yàn)的結(jié)果是測試TF的結(jié)合位點(diǎn)。已經(jīng)在科學(xué)文獻(xiàn)中描述了類似的策略用于基于酵母單雜交試驗(yàn)篩選來確定TF結(jié)合位點(diǎn)(Pruneda-Paz等,(2009)Science323:481-485)。實(shí)施例9-狗尾草(Setariaviridis)和水稻(Oryzasativa)中的TF表達(dá)使用表16所列構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化狗尾草組織。在共培養(yǎng)含有表16中所示的轉(zhuǎn)化構(gòu)建體的根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)細(xì)胞和狗尾草愈傷組織之后,狗尾草細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)基中用于植物再生。使用PCR試驗(yàn)確認(rèn)感興趣基因的存在以檢測所述基因存在與否。這些轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化體生長至成熟并且允許自花授粉以產(chǎn)生T1-代種子。表16:用于狗尾草轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體將用表16所列構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的狗尾草植物的T1-代種子種植在土壤中并且所得的T1植物與野生型狗尾草植物一起在溫室中在單獨(dú)盆中生長。表17顯示了來自用載體130027和130044轉(zhuǎn)化的可用狗尾草品系的收獲的生物質(zhì)以及與這些130027和130044植物一起生長的野生型狗尾草的生物質(zhì)的干重。表17:選擇的130027和130044狗尾草事件的干重表18顯示了來自用載體130026、130034、130037、和130045轉(zhuǎn)化的可用狗尾草品系的收獲的生物質(zhì)以及與這些植物一起生長的野生型狗尾草的生物質(zhì)的干重。表18:選擇的130026、130034、130037、和130045狗尾草事件的干重也使用表16所列構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化水稻(Oryzasativacv.Kitaake)細(xì)胞。在與含有表16所述轉(zhuǎn)化構(gòu)建體的根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)細(xì)胞共培養(yǎng)之后,使用組織培養(yǎng)技術(shù)再生轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。通過使用從植物的葉提取的DNA和對感興趣基因特異性的引物來確認(rèn)再生的水稻植物中感興趣基因的存在。這些轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化體生長至成熟并且允許自花授粉以產(chǎn)生T1-代種子。在收獲T1-代種子之后,將這些種子種植在土壤中并且允許與野生型和/或空分離子植物作為陰性對照一起發(fā)芽。通過PCR或另一種合適的分子試驗(yàn)來對T1-代植物進(jìn)行基因分型以檢測感興趣TF基因是否存在。T1植物生長至成熟并且自花授粉以產(chǎn)生T2-代種子。收獲地上總生物質(zhì)并在37℃烘箱中干燥。這些種子被單獨(dú)收獲、干燥、并稱重,并計數(shù)。用一種或多種表16所列構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的水稻植物產(chǎn)生的生物質(zhì)的干重與由野生型和/或空分離子水稻植物產(chǎn)生的生物質(zhì)的干重進(jìn)行比較。用一種或多種表16所列構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的水稻植物產(chǎn)生的種子的干重和總數(shù)也與由野生型和/或空分離子水稻植物產(chǎn)生的種子的干重和總數(shù)進(jìn)行比較。進(jìn)行合適的統(tǒng)計學(xué)分析以確定轉(zhuǎn)基因水稻植物是否產(chǎn)生比陰性對照植物明顯更多的生物質(zhì)和/或種子。實(shí)施例10-測試鹽和高pH耐受性如實(shí)施例11所述,使用表16所列載體來轉(zhuǎn)化水稻(Oryzasativacv.Kitaake)。所得的水稻植物在溫室環(huán)境中生長。這些水稻植物用水刺激,如表19所述。該表顯示了其水稻植物培養(yǎng)區(qū)間所列的各種離子的平均濃度以及這段時間上的平均pH。該水中的高pH、高Na+、高S、高SO42-、和高Cl-含量明顯在一般用于對植物進(jìn)行澆水的范圍以外。表19-用于TF-表達(dá)水稻植物的水的離子含量用表16所列載體轉(zhuǎn)化的所有水稻植物在營養(yǎng)生長期間顯示表型正常。然而,在到達(dá)繁殖階段之后,許多植物無法產(chǎn)生有活力的種子。表20總結(jié)了用表16所述的載體轉(zhuǎn)化的水稻植物的種子產(chǎn)生。表20-轉(zhuǎn)基因水稻植物的種子產(chǎn)生如表20所示,這些轉(zhuǎn)基因水稻品系中的大部分在用表19所示的水刺激時不能產(chǎn)生有活力的種子。用130024、130026、和130028構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因水稻品系則是例外。這些植物中的許多都成功自花授粉并且產(chǎn)生有活力的種子。將由表達(dá)感興趣TF的水稻植物產(chǎn)生的種子種植到土壤中以培養(yǎng)T1-代水稻。T1-代水稻植物在正常條件以及高鹽和/或高pH條件下與空分離子和/或野生型陰性對照植物一起生長。在成熟之后,植物進(jìn)行自花授粉以產(chǎn)生種子。由水稻植物產(chǎn)生的生物質(zhì)與種子一起收獲并干燥。測量有水稻植物產(chǎn)生的生物質(zhì)的重量、產(chǎn)生的種子的數(shù)量、和產(chǎn)生的種子的重量,并且進(jìn)行合適的統(tǒng)計學(xué)分析以比較由TF-表達(dá)水稻植物的生物質(zhì)和種子產(chǎn)生與陰性對照植物的生物質(zhì)和種子產(chǎn)生。序列表<110>T·P·布魯特內(nèi)爾(Brutnell,ThomasP.)B·N·格雷(Gray,BenjaminN.)T·C·莫克勒(Mockler,ToddChristopher)王林(Wang,Lin)<120>用于增加植物生長和產(chǎn)量的方法和組合物<130>061808/464578<150>62/022,925<151>2014-07-10<160>52<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210>1<211>621<212>DNA<213>玉米(Zeamays)<220><221>misc_feature<222>(1)...(641)<223>基因標(biāo)識符:GRMZM2G143718<400>1atgaggaccatctgcgacgtgtgcgagtccgccccggccgtgctcttctgcgccgccgac60gaggccgccctctgcaggccgtgcgacgagaaggtgcacatgtgcaacaagctcgcctcc120aggcacgtgagggtgggcctcgccgacccgaacaagctcgtgaggtgcgacatctgcgag180aactccccggccttcttctactgcgagatcgacggcacctccctctgcctctcctgcgac240atgaccgtgcacgtgggcggcaagaggacccacggcaggtacctcctcctcaggcagagg300gtggagttcccgggcgacaagccgggccacatggacgacgtgccgatggagatccaggac360ccggagaaccagagggaccagaagaagccgccgaaggagcagaccgccaaccaccacaac420ggcgacgacccggccaccgacggcaactgcgacgaccagggcaacatcgactccaagatg480atcgacctcaacatgaggccggtgaggacccacggccaggagtccaactcccagacccag540ggcgtgggcctctccgtgaacaaccacgactccccgggcgtggtgccgacctccaactcc600gagagggacacctccaagtga621<210>2<211>206<212>PRT<213>玉米(Zeamays)<220><221>結(jié)構(gòu)域<222>(1)...(206)<223>基因標(biāo)識符:GRMZM2G143718<400>2MetArgThrIleCysAspValCysGluSerAlaProAlaValLeuPhe151015CysAlaAlaAspGluAlaAlaLeuCysArgProCysAspGluLysVal202530HisMetCysAsnLysLeuAlaSerArgHisValArgValGlyLeuAla354045AspProAsnLysLeuValArgCysAspIleCysGluAsnSerProAla505560PhePheTyrCysGluIleAspGlyThrSerLeuCysLeuSerCysAsp65707580MetThrValHisValGlyGlyLysArgThrHisGlyArgTyrLeuLeu859095LeuArgGlnArgValGluPheProGlyAspLysProGlyHisMetAsp100105110AspValProMetGluIleGlnAspProGluAsnGlnArgAspGlnLys115120125LysProProLysGluGlnThrAlaAsnHisHisAsnGlyAspAspPro130135140AlaThrAspGlyAsnCysAspAspGlnGlyAsnIleAspSerLysMet145150155160IleAspLeuAsnMetArgProValArgThrHisGlyGlnGluSerAsn165170175SerGlnThrGlnGlyValGlyLeuSerValAsnAsnHisAspSerPro180185190GlyValValProThrSerAsnSerGluArgAspThrSerLys195200205<210>3<211>258<212>DNA<213>玉米(Zeamays)<220><221>misc_feature<222>(1)...(258)<223>基因標(biāo)識符:GRMZM2G117497<400>3atgtccgcctcacgcagctcctctcccaactccatctcacagtggagccagaaagagaac60aagatgtttgaagaggcactcgcatactacggcgagggcacatccaaccggtgggacaag120gtgtccagagccatgggaggcatcaagtctgctgaggaggtgcgctgccactatgaagat180cttgactatgacgtcaagatgattgaatcaggccacgtgccgtaccccaagtacaagaca240catggattctggacctga258<210>4<211>85<212>PRT<213>玉米(Zeamays)<220><221>結(jié)構(gòu)域<222>(1)...(85)<223>基因標(biāo)識符:GRMZM2G117497<400>4MetSerAlaSerArgSerSerSerProAsnSerIleSerGlnTrpSer151015GlnLysGluAsnLysMetPheGluGluAlaLeuAlaTyrTyrGlyGlu202530GlyThrSerAsnArgTrpAspLysValSerArgAlaMetGlyGlyIle354045LysSerAlaGluGluValArgCysHisTyrGluAspLeuAspTyrAsp505560ValLysMetIleGluSerG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