本發(fā)明涉及從微生物生物質(zhì)進(jìn)行脂質(zhì)分級(jí)的方法，進(jìn)一步詳細(xì)而言，涉及利用液化二甲醚在萃取脂質(zhì)時(shí)的分離選擇性進(jìn)行脂質(zhì)分級(jí)的方法。
背景技術(shù)：
作為從微生物生物質(zhì)萃取脂質(zhì)的方法，以往已知并廣泛利用的是使用己烷等有機(jī)溶劑的溶劑萃取、利用超臨界二氧化碳的萃取等各種萃取技術(shù)。例如，已知渦鞭毛藻(Dinoflagellate)中的寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)、網(wǎng)粘菌(Labyrinthulea)中的海洋壺菌(Aurantiochytrium limacinum)(也稱為裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum))、絲狀真菌中的高山被孢霉(Mortierellaalpina)等微生物生產(chǎn)含有二十二碳六烯酸、花生四烯酸等有用的高度不飽和脂肪酸的脂質(zhì)。由這些微生物生產(chǎn)的含有高度不飽和脂肪酸的脂質(zhì)已經(jīng)有多家企業(yè)在實(shí)際生產(chǎn)，廣泛用于嬰兒用奶粉添加用途、食品配合用途。在制造這些脂質(zhì)時(shí)，已知有通過(guò)使用己烷等有機(jī)溶劑的溶劑萃取法而從細(xì)胞進(jìn)行萃取的方法(非專利文獻(xiàn)1)。此外，已知通過(guò)對(duì)作為微藻類之一的綠藻中的雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)控制培養(yǎng)條件，從而在休眠細(xì)胞(包囊細(xì)胞)中以高濃度蓄積蝦青素，這種利用藻類生產(chǎn)蝦青素的方法也已經(jīng)由多家企業(yè)實(shí)際應(yīng)用，但在從細(xì)胞萃取時(shí)，進(jìn)行的是使用丙酮等有機(jī)溶劑的溶劑萃取(專利文獻(xiàn)1)、利用超臨界二氧化碳的萃取(非專利文獻(xiàn)2)。
與如上所述的現(xiàn)有萃取方法并行的、近年引起注目的方法是，使用液化二甲醚(以下也稱為DME)作為溶劑的萃取方法。該方法具有不需要干燥生物質(zhì)、不需要破碎細(xì)胞、不需要除去萃取中所使用的有機(jī)溶劑等特征(專利文獻(xiàn)2、3)。使用液化二甲醚的萃取方法由于不經(jīng)歷原料的干燥、不經(jīng)歷從萃取物除去溶劑等需要加熱的工序，因此在用于例如從微生物生物質(zhì)萃取脂質(zhì)時(shí)，脂質(zhì)的氧化被抑制到最低限度，能夠制造高品質(zhì)的脂質(zhì)。此外，由于省略了干燥、破碎、除溶劑所需要的能量，因此能夠以更低的能耗來(lái)制造脂質(zhì)。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1：日本專利第4934272號(hào)
專利文獻(xiàn)2：日本特開2010-240609號(hào)
專利文獻(xiàn)3：日本特開2011-031170號(hào)
非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn)1：James Wynn,Paul Behrens,Anand Sundararajan,Joe Hansen,and Kirk Apt,Production of Single Cell Oils by Dinoflagellates,in Single Cell Oils,Zvi Cohen,and Colin Ratledge,eds.,AOCS Press,Champaign,Illinois,2005,pp.86-98；
非專利文獻(xiàn)2：岡村俊宏：食品工業(yè),Vol.50,No.6,p.56-62,光琳(2007)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
發(fā)明要解決的課題
該專利文獻(xiàn)2的使用液化二甲醚作為溶劑的萃取方法是從對(duì)象材料萃取可萃取的全部油分的技術(shù)。
本發(fā)明人想到，能否將這種使用液化DME進(jìn)行的萃取用于脂質(zhì)分級(jí)中，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明。即，本申請(qǐng)發(fā)明的課題在于，提供一種使用液化DME作為溶劑的脂質(zhì)分級(jí)方法。
用于解決課題的手段
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，以微生物生物質(zhì)為對(duì)象，使用迄今尚不知道具有對(duì)脂質(zhì)的分離選擇性的液化二甲醚作為溶劑進(jìn)行萃取，將萃取物經(jīng)時(shí)地分級(jí)，結(jié)果分級(jí)物的脂肪酸組成經(jīng)時(shí)地發(fā)生變化，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明的目的在于，提供一種從微生物生物質(zhì)進(jìn)行的脂質(zhì)的新的分級(jí)方法。
本發(fā)明的主旨為以下的(1)～(7)中記載的方法。
(1)一種對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行分級(jí)的方法，其將微生物生物質(zhì)供于使用液化二甲醚作為溶劑的萃取，利用對(duì)脂質(zhì)的分離選擇性將脂質(zhì)分級(jí)。
(2)一種改變微生物生物質(zhì)中殘留的脂質(zhì)的脂肪酸組成的方法，通過(guò)將微生物生物質(zhì)供于使用液化二甲醚作為溶劑的萃取，利用對(duì)脂質(zhì)的分離選擇性將部分脂質(zhì)分級(jí)，從而改變微生物生物質(zhì)中殘留的脂質(zhì)的脂肪酸組成。
(3)一種制造脂質(zhì)的方法，其特征在于，從通過(guò)(2)的方法獲得的脂肪酸組成已改變的微生物生物質(zhì)進(jìn)一步萃取脂肪酸組成已改變的脂質(zhì)。
(4)根據(jù)(1)～(3)中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，微生物生物質(zhì)為培養(yǎng)屬于網(wǎng)粘菌(Labyrinthulea)綱的微生物而獲得的生物質(zhì)。
(5)根據(jù)(4)所述的方法，其中，網(wǎng)粘菌綱為海洋壺菌(Aurantiochytrium)屬的網(wǎng)粘菌綱。
(6)根據(jù)(1)～(3)中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，微生物生物質(zhì)為培養(yǎng)屬于綠藻綱的微生物而獲得的生物質(zhì)。
(7)根據(jù)(6)所述的方法，其中，綠藻綱為紅球藻(Haematococcus)屬的綠藻綱。
發(fā)明的效果
根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種以液化DME為溶劑的、從微生物生物質(zhì)進(jìn)行的脂質(zhì)的新的分級(jí)方法。例如，僅使用液化DME進(jìn)行分級(jí)，就能夠?qū)⒑休^多飽和脂肪酸的脂質(zhì)與含有較多高度不飽和脂肪酸的脂質(zhì)分離。
附圖說(shuō)明
圖1為示出本發(fā)明中使用的裝置的1個(gè)方式的示意圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明是在獲取微生物生物質(zhì)的菌體內(nèi)所含的脂質(zhì)時(shí)，利用液化DME對(duì)脂質(zhì)的選擇性的差異，將脂質(zhì)分級(jí)。
本發(fā)明中使用的液化DME(IUPAC名：甲氧基甲烷)的沸點(diǎn)為-23.6℃，因此在常溫下為氣體。將其制成液體而用作本發(fā)明的溶劑。為了將DME液化，可以在壓力0.25～1.14MPa、溫度0～50℃左右的范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)。
本發(fā)明中，微生物是指其菌體內(nèi)生產(chǎn)脂質(zhì)的微生物?？梢岳境隼鐚儆陔[甲藻(Crypthecodinium)屬、破囊壺菌(Thraustochytrium)屬、裂殖壺菌(Schizochytrium)屬、吾肯氏壺菌(Ulkenia)屬、Japonochytrium屬、海壺菌(Haliphthoros)屬、被孢霉(Mortierella)屬、青霉(Penicillium)屬、曲霉(Aspergillus)屬、紅酵母(Rhodotorula)屬、鐮孢(Fusarium)屬的微生物。具體而言，可以例示出渦鞭毛藻中的寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)、網(wǎng)粘菌中的海洋壺菌(Aurantiochytrium limacinum)(也稱為裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum))、絲狀真菌中的高山被孢霉(Mortierella alpina)等微生物，綠藻中的雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)。
本發(fā)明中，脂質(zhì)是指微生物所生產(chǎn)的脂質(zhì)，主要為甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯、磷脂、游離脂肪酸、甾醇類、烴等。進(jìn)而，蝦青素等類胡蘿卜素那樣的、包含于微生物生產(chǎn)的脂質(zhì)中的色素等成分也能夠與脂質(zhì)一起分級(jí)。
鍵合于脂質(zhì)的脂肪酸的組成根據(jù)微生物不同而不同，通常以各種各樣的比率含有碳數(shù)為12～24、雙鍵數(shù)為0～6的脂肪酸。有生理活性而被認(rèn)為有用的脂肪酸是高度不飽和脂肪酸，高度不飽和脂肪酸是指碳數(shù)為18以上、雙鍵數(shù)為3以上的脂肪酸，更優(yōu)選碳數(shù)為20以上、雙鍵數(shù)為3以上的脂肪酸。具體而言，可以例示出α-亞麻酸(18：3，n-3)、γ-亞麻酸(18：3，n-6)、花生四烯酸(20：4，n-6)、二均-γ-亞麻酸(20：3，n-6)、二十碳五烯酸(20：5，n-3)、二十二碳五烯酸(22：5，n-6)、二十二碳六烯酸(22：6，n-3)等。
在微生物菌體中的脂質(zhì)中，這些脂肪酸是作為甘油三酯、磷脂等的構(gòu)成脂肪酸而鍵合。
利用液化DME的分離選擇性的最簡(jiǎn)單的方法如下：將微生物菌體填充到柱中，使液化DME以一定速度流過(guò)該柱而將流出液分級(jí)的方法。如實(shí)施例所示，液化DME在從微生物菌體溶出脂質(zhì)時(shí)具有選擇性。
含有飽和脂肪酸的脂質(zhì)溶出快，含有高度不飽和脂肪酸的脂質(zhì)溶出慢。利用該差異能夠提高全部脂肪酸中包含的高度不飽和脂肪酸的濃度。不使用柱，而是通過(guò)分批處理，反復(fù)用少量的液化DME萃取也能夠?qū)崿F(xiàn)同樣效果。此外，還可以使用發(fā)揮同樣效果的任意裝置。
以往，從微生物菌體進(jìn)行溶劑萃取時(shí)，例如利用己烷進(jìn)行高效萃取，但由于己烷對(duì)脂質(zhì)的分離選擇性低，因此所萃取的中性脂質(zhì)的脂肪酸組成與微生物生物質(zhì)中的中性脂質(zhì)的脂肪酸組成基本相同。如果要對(duì)所萃取的脂質(zhì)中的高度不飽和脂肪酸進(jìn)行濃縮，則是在萃取后另外進(jìn)行純化工序。作為改變脂肪酸組成的純化方法，已知有脲加成法、冬化(wintering)法、精密蒸餾法、利用脂肪酶的濃縮法等，均為基于分子量、不飽和鍵數(shù)這樣的脂肪酸性狀差異來(lái)改變脂肪酸組成的方法。
根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠在從微生物菌體進(jìn)行萃取的階段進(jìn)行一定程度的濃縮。在進(jìn)行本發(fā)明的分離后，還可以進(jìn)一步使用上述的以往純化方法。
利用上述分離選擇性，還能夠利用液化DME從微生物菌體選擇性地萃取除去飽和脂肪酸等不需要的脂肪酸，然后用己烷等萃取殘存的全部脂質(zhì)。
通過(guò)利用液化DME進(jìn)行分級(jí)，蝦青素那樣的包含于脂質(zhì)中的色素也與含有較多該色素的脂質(zhì)一起被濃縮，能夠直接以濃縮色素形式使用，或者，還可以進(jìn)一步應(yīng)用利用超臨界二氧化碳進(jìn)行萃取等的蝦青素純化方法進(jìn)行純化。
以下記載本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明不限于此。
將實(shí)施例中使用的萃取裝置的構(gòu)成示于圖1。將填充微生物的萃取柱(HPG-10-5，耐壓硝子工業(yè)株式會(huì)社制，180mm×26mm(內(nèi)徑))的出口側(cè)與儲(chǔ)藏容器(HPG-96-3，耐壓硝子工業(yè)株式會(huì)社制，容量96cm3)用不銹鋼管連接。萃取柱和儲(chǔ)藏容器包含使用了玻璃和聚碳酸酯的耐壓容器。將液化二甲醚由二甲醚儲(chǔ)槽輸送到填充有微生物菌體的萃取柱，來(lái)自萃取柱的萃取液被回收到儲(chǔ)藏容器內(nèi)。進(jìn)行規(guī)定時(shí)間的萃取后，打開儲(chǔ)藏容器的減壓閥，使二甲醚氣化而將其除去，將殘留的萃取物與水的混合物回收。
實(shí)施例1
從網(wǎng)粘菌萃取脂質(zhì)
用GY培養(yǎng)基(將30g葡萄糖、10g酵母萃取物溶解于50％濃度的人工海水1L中，調(diào)節(jié)為pH 7.0)培養(yǎng)屬于網(wǎng)粘菌綱的微生物海洋壺菌(Aurantiochytrium limacinum)的種菌。培養(yǎng)中使用50mL的三角燒瓶，在其中加入30mL的GY培養(yǎng)基，一邊以100rpm振蕩一邊在28℃培養(yǎng)3天。通過(guò)離心分離從該培養(yǎng)液回收菌體，將回收的菌體用蒸餾水洗滌而除去培養(yǎng)基成分后，進(jìn)一步通過(guò)離心分離回收菌體。將回收的菌體進(jìn)行冷凍干燥，獲得微生物生物質(zhì)。獲得的微生物生物質(zhì)用-20℃的冰箱保存直至進(jìn)行萃取。
在冷凍干燥的微生物生物質(zhì)0.33g中加入蒸餾水1.263g并充分?jǐn)嚢?，將由此得到的樣品用圖1的萃取裝置一邊分級(jí)一邊萃取。此時(shí)，將液化二甲醚的流量設(shè)為5mL/min。萃取柱的溫度設(shè)為20℃，壓力為0.51MPa。需要說(shuō)明的是，之所以在微生物生物質(zhì)中加入蒸餾水而使其呈含水狀態(tài)，目的在于再現(xiàn)與從培養(yǎng)液回收的菌體相近的狀態(tài)。期間不進(jìn)行以破碎細(xì)胞為目的的操作。
關(guān)于萃取液，按照表1中記載的各時(shí)間而進(jìn)行分級(jí)。將通入液化二甲醚而獲得的各級(jí)分恢復(fù)到常溫、常壓，從而使二甲醚氣化，由此從各級(jí)分中的萃取物除去二甲醚。進(jìn)而，通過(guò)使干燥氣體(本實(shí)施例中使用二甲醚)與萃取物充分接觸而從各級(jí)分中的萃取物除去水分，獲得表1中記載的量的油。
[表1]
注)級(jí)分編號(hào)為1～6的油的重量為實(shí)測(cè)值，合計(jì)重量為計(jì)算值。
利用如上獲得的各油制備脂肪酸甲酯，供于利用氣相色譜的脂肪酸組成分析。分析中，使用氣相色譜：Agilent Technologies 7890A GC System，柱：J&W DB-WAX(內(nèi)徑0.25mm×長(zhǎng)度30m，膜厚0.25μm)，在下述條件下進(jìn)行分析：柱溫度(升溫條件)為140℃→240℃(4℃/分鐘)，在240℃保持10分鐘，載氣為He(1.05ml/min)。將其結(jié)果示于表2。獲得了各油的脂肪酸組成差異較大的結(jié)果，由此可知，以液化二甲醚為溶劑的萃取方法具有對(duì)脂質(zhì)的分離選擇性。
關(guān)于表2的級(jí)分編號(hào)為1和2的油，脂肪酸組成中的棕櫚酸(C16:0)的值為約80％，極高。這是比本實(shí)施例的全部級(jí)分的油相加時(shí)的棕櫚酸的脂肪酸組成還要高的值。因此可知，以液化二甲醚為溶劑的萃取方法是能夠使含有被期待作為生物燃料的棕櫚酸的脂質(zhì)的比例提高的分級(jí)方法。
此外顯示，表2的級(jí)分編號(hào)3、4、5的油的DHA的脂肪酸組成是比本實(shí)施例的全部級(jí)分的油相加時(shí)的DHA的脂肪酸組成還要高的值。因此可知，以液化二甲醚為溶劑的萃取方法是能夠使含有DHA的脂質(zhì)的比例提高的分級(jí)方法。
[表2]
注)級(jí)分編號(hào)為1～6的油的脂肪酸組成為實(shí)測(cè)值，
合計(jì)的脂肪酸組成為基于重量比的計(jì)算值。
實(shí)施例2
通過(guò)使用二甲醚進(jìn)行選擇性萃取而獲得DHA濃度已濃縮的微生物油的方法
根據(jù)實(shí)施例1的結(jié)果，認(rèn)為能夠從微生物生物質(zhì)選擇性萃取除去C16：0等，使DHA等殘留在生物質(zhì)中。
實(shí)施例1中使用的微生物生物質(zhì)中含有表3的“原料”一欄中記載的油。對(duì)該生物質(zhì)僅進(jìn)行萃取至表2的級(jí)分編號(hào)2為止。這樣一來(lái)，在計(jì)算時(shí)，生物質(zhì)中殘留有表3的“萃取后生物質(zhì)”所示組成的油脂。
如表3所示，可知通過(guò)利用以液化二甲醚為溶劑的萃取方法來(lái)萃取含有棕櫚酸的脂質(zhì)的比例高的脂質(zhì)，能夠提高含有微生物生物質(zhì)中的其它脂肪酸例如DHA的脂質(zhì)的比例。
使用該微生物生物質(zhì)作為進(jìn)一步萃取的原料，用己烷那樣的對(duì)脂質(zhì)的分離選擇性低的溶劑進(jìn)行萃取，從而能夠高效地萃取含有DHA的脂質(zhì)的比例已提高的脂質(zhì)。
[表3]
實(shí)施例3
從紅球藻萃取脂質(zhì)
將購(gòu)自BIOGENIC株式會(huì)社的紅球藻干燥生物質(zhì)(雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)，BM070828，未破碎品)作為微生物生物質(zhì)供于萃取。在微生物生物質(zhì)0.403g中加入蒸餾水2.317g并充分?jǐn)嚢瑁瑢⒂纱说玫降臉悠饭┯谑褂脠D1的萃取裝置的萃取。此時(shí)，將液化二甲醚的流量設(shè)為10mL/min。萃取柱的溫度設(shè)為20℃，壓力為0.51MPa。期間不進(jìn)行以細(xì)胞的破碎為目的的操作。將進(jìn)行與實(shí)施例1同樣的操作而獲得的油的量示于表4，此外將對(duì)這些油進(jìn)行脂肪酸組成分析而得到的結(jié)果示于表5。獲得了各油的脂肪酸組成差異較大的結(jié)果，與實(shí)施例1同樣地，可知以液化二甲醚為溶劑的萃取方法具有對(duì)脂質(zhì)的分離選擇性。
由實(shí)施例1及本實(shí)施例的結(jié)果可知，以液化二甲醚為溶劑、利用對(duì)脂質(zhì)的分離選擇性將脂質(zhì)分級(jí)的方法能夠不依賴于微生物種類而進(jìn)行應(yīng)用。
[表4]
[表5]
通過(guò)HPLC法測(cè)定實(shí)施例3中獲得的各油中的蝦青素的重量。蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品及各油溶解于丙酮：氯仿＝2：1，供于分析。分析條件如下(柱：COSMOSIL 250×4.6mm(i.d.),5C18-MS-PAQ類型(Nacalai Tesque株式會(huì)社制)；檢測(cè)器：智能紫外可見檢測(cè)器UV-2075plus(日本分光株式會(huì)社制)；流動(dòng)相：甲醇:四氫呋喃＝9:1；流速：1.5mL/min；檢測(cè)：470nm)。將結(jié)果示于表6。此外，表6中還記載了目視確認(rèn)的各油的色調(diào)。雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是屬于綠藻綱的微藻類，含有脂溶性色素即葉綠素(綠色)作為光合成色素。此外知道：其包囊細(xì)胞中確實(shí)高濃度地蓄積作為脂溶性色素的蝦青素(橙紅色)。通過(guò)以液化二甲醚為溶劑的萃取而獲得的各油的色調(diào)明顯不同，由此確認(rèn)液化二甲醚對(duì)這些脂溶性色素也具有分離選擇性。利用該性質(zhì)，能夠降低例如葉綠素，其結(jié)果是能夠提供一種制造呈更鮮艷的橙紅色的含有蝦青素的油的方法。
[表6]
產(chǎn)業(yè)上的利用可能性
根據(jù)本發(fā)明，能夠從含有有用的高度不飽和脂肪酸的微生物生物質(zhì)萃取脂質(zhì)，同時(shí)能夠?qū)⒑休^多飽和脂肪酸的脂質(zhì)與含有較多高度不飽和脂肪酸的脂質(zhì)分級(jí)。提供一種將液化二甲醚并非單純地作為萃取溶劑、而是作為一邊分級(jí)一邊萃取的溶劑來(lái)使用的方法。