核酸治療的可行性基本上取決于將核酸遞送到細(xì)胞中和/或遞送至或遞送到組織(一個或多個)中的有效方法的利用度。

在核酸遞送中，總體上，使用裸核酸在一些情況下是適當(dāng)?shù)牟⑶易阋赞D(zhuǎn)染細(xì)胞(Wolff等，1990，Science，247，1465-1468)。然而，在大多數(shù)設(shè)想的實際應(yīng)用中，將核酸與至少第二試劑(保護核酸免于在遞送過程中降解和/或促進分配至目標(biāo)組織和分配在目標(biāo)組織中和/或促進細(xì)胞攝取和能夠?qū)崿F(xiàn)適當(dāng)?shù)陌麅?nèi)加工)配制在一起是有利或甚至有必要的。這種用于核酸遞送的制劑在科學(xué)文獻中被稱為載體。多種用于核酸載體化的化合物，所謂轉(zhuǎn)染試劑，此前已被描述。這些化合物通常是聚陽離子或包括陽離子脂質(zhì)或脂質(zhì)樣化合物如類脂質(zhì)(lipidoids)的組合物(US 8,450,298)。核酸與聚陽離子的絡(luò)合物被稱為多聚絡(luò)合物(polyplexes)，與陽離子脂質(zhì)的絡(luò)合物被稱為脂質(zhì)絡(luò)合物(Felgner等，1997，Hum Gene Ther，8，511-512)。包括聚陽離子和脂質(zhì)的絡(luò)合物也已被描述(Li和Huang，“Nonviral Vectors for Gene Therapy”，Academic Press 1999，第13章，295-303)。轉(zhuǎn)染試劑用于結(jié)合和致密化核酸，產(chǎn)生納米大小范圍的主要絡(luò)合物。在含鹽介質(zhì)中，這些絡(luò)合物容易聚集，也被稱為鹽誘導(dǎo)性聚集，這可有利于細(xì)胞培養(yǎng)或體內(nèi)局部化給予中的轉(zhuǎn)染(Ogris等，1998，Gene Ther，5，1425-1433；Ogris等，2001，AAPS PharmSci，3，E21)。通過利用多聚體如聚(乙二醇)表面遮蔽，可避免聚集和可穩(wěn)定化核酸與轉(zhuǎn)染試劑的絡(luò)合物。遮蔽還用于避免核酸與轉(zhuǎn)染試劑的絡(luò)合物的調(diào)理作用和補體活化作用(Finsinger等，2000，Gene Ther，7，1183-1192)。通過轉(zhuǎn)染試劑致密化核酸不僅保護免于被核酸酶降解，而且使其適于通過內(nèi)吞作用進行細(xì)胞攝取。很多線性和分支聚陽離子適于結(jié)合和致密化核酸，包括但不限于聚(亞乙基亞胺)、聚(酰胺-胺)樹枝狀多聚體、聚(2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(pDMAEMA)或聚(N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺)(pHPMA)的陽離子衍生物、聚(β-氨基酯)(Akinc等，2003，Bioconj Chem 14(5)：979-88)、天然和合成陽離子聚(氨基酸)或肽如聚(賴氨酸)、組蛋白、HMG蛋白或陽離子碳水化合物如殼聚糖。除上述包含伯-、仲-和/或叔胺的多聚體外，包含胍基部分的結(jié)構(gòu)也是重要的一類用于核酸絡(luò)合和遞送的分子。諸如基于精氨酸的結(jié)構(gòu)的胍基修飾多聚體(Yamanouchi等，2008，Biomaterials materials 29(22)：3269-77)、精氨酸修飾的PAMAM(Son等，2013，Bull.Korean Chem.Soc.Vol 34，No.3)或胍基化PEI(Lee等，2008，Bull.Korean Chem.Soc.2008，Vol.29，No.3)已突出了這種系統(tǒng)的功效。特別是在RNA相互作用的情況下，胍基部分的分子特征呈現(xiàn)獨特的結(jié)合特性(Calnan等，19991，Science 252(5009)，1167-1171)。關(guān)于這種結(jié)構(gòu)的生成，可采用Katritzky和Rogovoy(Katritzky&Rogovoy 2005，ARKIVOC(iv)49-87)評述的方法。通常，多聚絡(luò)合物經(jīng)進一步修飾以包含細(xì)胞靶向或胞內(nèi)靶向部分和/或膜去穩(wěn)組分如滅活病毒(Curiel等，1991，ProcNatl Acad Sci USA，88，8850-8854)、病毒衣殼或病毒蛋白或肽(Fender等，1997，Nat Biotechnol，15，52-56，Zhang等，1999，Gene Ther，6，171-181)或膜破壞性合成肽(Wagner等，1992，Proc Natl Acad Sci USA，89，7934-7938，Plank等，1994，J Biol Chem，269，12918-12924)。

然而，盡管具有一些優(yōu)點，當(dāng)前用于基因遞送的病毒載體與包括強免疫原性和插入誘變的安全問題有關(guān)。低基因轉(zhuǎn)運效率限制了非病毒載體(Evans，2012，loc.cit.)。后者已主要歸因于質(zhì)粒DNA到核中的運送不足。

在內(nèi)吞性攝取時，絡(luò)合物被隔離到胞內(nèi)囊泡(如內(nèi)含體和溶酶體)中，在此其暴露于細(xì)胞降解機制。因此，已認(rèn)識到從胞內(nèi)囊泡逃逸對于有效功能性核酸遞送至關(guān)重要——一個也適用于功能性病毒感染的要求(Wagner等，1992，Proc Natl Acad Sci USA，89，7934-7938，Plank等，1994，J Biol Chem，269，12918-12924)。自然界關(guān)于病毒感染性進化的機制已被模擬，以實現(xiàn)通過合成載體進行有效核酸遞送。為此，兩性膜去穩(wěn)肽如INF、GALA和KALA肽或蜂毒肽和蜂毒肽衍生物(Boeckle等，2006，J Control Release，112，240-248)已非常成功地用于向聚陽離子轉(zhuǎn)染試劑補充內(nèi)含體逃逸功能性(Plank等，1998，Adv Drug Deliv Rev，34，21-35)。在脂質(zhì)絡(luò)合物中，因其脂質(zhì)部分融合細(xì)胞膜的能力，這種功能性是固有的(Xu和Szoka 1996，Biochemistry，35，5616-5623；Zelphati和Szoka 1996，Proc Natl Acad Sci USA，93，11493-11498)。因為Boussif等的關(guān)鍵性論文(Boussif等，1995，Proc Natl Acad Sci USA，92，7297-7301)，已知多聚絡(luò)合物的內(nèi)含體逃逸功能性可通過物理-化學(xué)手段實現(xiàn)。當(dāng)聚(亞乙基亞胺)(PEI)用作聚陽離子以形成多聚絡(luò)合物時，其在酸性pH下的緩沖能力足以引發(fā)內(nèi)含體逃逸。已知內(nèi)含體腔通過位于內(nèi)含體膜中的質(zhì)子泵被酸化(Lafourcade等，2008，PLoS One，3，e2758)。這種酸化是一些病毒如流感或腺病毒的內(nèi)含體逃逸的觸發(fā)點。所謂質(zhì)子海綿理論——得到實驗證據(jù)支持——描述了包括PEI的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征的多聚體的假定的機械作用：PEI的大部分氨基在中性(生理)pH下未質(zhì)子化(Ziebarth和Wang 2010，Biomacromolecules，11，29-38)。憑借質(zhì)子化的并且因此帶正電荷的氨基，PEI樣多聚體可結(jié)合和致密化核酸。未質(zhì)子化的胺可在酸性pH下質(zhì)子化，因此在內(nèi)含體內(nèi)具有緩沖能力。通過質(zhì)子泵進行的內(nèi)含體酸化伴隨氯離子累積發(fā)生(Sonawane等，2003，J Biol Chem，278，44826-44831)。在內(nèi)含體腔中存在緩沖分子如PEI的情況下，質(zhì)子泵會隨著氯離子累積將更多質(zhì)子接送到內(nèi)含體腔中，盡管其在達到天然酸性內(nèi)含體pH前不會存在。認(rèn)為內(nèi)含體內(nèi)不成比例的離子累積導(dǎo)致囊泡的滲透性去穩(wěn)，最終導(dǎo)致囊泡破裂和核酸絡(luò)合物釋放到細(xì)胞質(zhì)中。

基于質(zhì)子海綿理論，很多研究人員已在創(chuàng)建包括在酸性pH下具有緩沖能力的胺的新型多聚體文庫時挑選PEI結(jié)構(gòu)特征。在US 7,780,957和US 7,829,657中，Kataoka等描述了基于聚(谷氨酸)或聚(天冬氨酸)骨架的多聚體，其中羧酸側(cè)鏈經(jīng)在酸性pH下可質(zhì)子化的胺側(cè)鏈衍生化。然而，聚陽離子中包含交替的不相同的亞烷基胺單元充當(dāng)轉(zhuǎn)染增強部分的寡(亞烷基胺)的富集結(jié)構(gòu)空間還未被研究。具體地，此前未曾關(guān)于mRNA轉(zhuǎn)染對其進行過研究。

相比之下，Kataoka等的很多科學(xué)著作致力于聚{N-[N′-(2-氨基乙基)-2-氨基乙基]天冬酰胺}。在Uchida等的出版物(2011，J Am Chem Soc，133，15524-15532)中，同一小組已考察過在通式-(CH₂-CH₂-NH)_m-H的側(cè)鏈中具有重復(fù)的氨基亞乙基單元的一系列N-取代聚天冬酰胺。有趣的是，當(dāng)作者考察該多聚體家族在質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染中的有效性時，“觀察到多聚體側(cè)鏈中重復(fù)的氨基亞乙基單元對內(nèi)含體逃逸和幾種細(xì)胞系轉(zhuǎn)染的有效性的奇數(shù)-偶數(shù)區(qū)別效果。與具有奇數(shù)個重復(fù)氨基亞乙基單元(PA-Os)的多聚體的多聚絡(luò)合物相比，具有偶數(shù)個重復(fù)氨基亞乙基單元(PA-Es)的多聚體的多聚絡(luò)合物實現(xiàn)了數(shù)量級較高的轉(zhuǎn)染效率，并且無顯著細(xì)胞毒性。這種奇數(shù)-偶數(shù)效果非常符合這些多聚體的緩沖能力以及其在內(nèi)含體pH下選擇性地破壞膜完整性，導(dǎo)致PA-E多聚絡(luò)合物高度有效的內(nèi)含體逃逸的能力。此外，在多聚體側(cè)鏈中質(zhì)子化氨基之間具有精確間距的多價帶電陣列的形成顯示對于有效破壞內(nèi)含體膜至關(guān)重要，因此促進多聚絡(luò)合物運送到細(xì)胞質(zhì)”中(Uchida等，2011，J Am Chem Soc，133，15524-15532的摘要)。有趣的是，當(dāng)同一組研究人員對承載1，2-二氨基乙烷側(cè)鏈的聚(天冬酰胺)衍生物[PAsp(DET)]與承載1，3-二氨基丙烷側(cè)鏈的類似物[PAsp(DPT)]進行比較時，其觀察到：由于細(xì)胞毒性隨著N/P比而逐漸增加，PAsp(DPT)多聚絡(luò)合物顯示高N/P比的質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效力顯著下降——即使與[PAsp(DET)]在顆粒尺寸和ζ-電位方面的物理化學(xué)差異可忽略不計(Miyata等，2008，J Am Chem Soc，130，16287-16294)。因此，基于奇偶規(guī)則，將預(yù)期包括3個可質(zhì)子化氨基和亞丙基間隔基團的多聚體劣于PAsp(DET)，并且包括1，3-二氨基丙烷的側(cè)鏈關(guān)系到毒性問題。關(guān)于這種多聚體對于mRNA轉(zhuǎn)染的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系一無所知。

Geall和同僚們描述了膽固醇-聚胺氨基甲酸酯，其中聚胺部分具有通式：

-NH-CH₂-(CH₂)_n-CH₂-NH-CH₂-(CH₂)_m-CH₂-NH-CH₂-(CH₂)_n-NH₂，

其中m＝0、1或2并且其中n＝0或1(Geall等，1999，F(xiàn)EBS Lett，459，337-342)。他們考察了這些物質(zhì)的pK_a值和其在牛胸腺DNA縮合(condensation)中的特征。他們發(fā)現(xiàn)，正電荷沿膽固醇聚胺氨基甲酸酯的區(qū)域化學(xué)分配在調(diào)控DNA結(jié)合親和力和脂轉(zhuǎn)染效率中具有重要作用。他們發(fā)現(xiàn)，在考察的膽固醇-聚胺氨基甲酸酯中，構(gòu)成聚胺部分的精胺，-HN-CH₂-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-CH₂-NH₂(丙基/丁基/丙基)，目前為止在細(xì)胞培養(yǎng)中的β半乳糖苷酶編碼質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生最高的報告基因表達，而例如-HN-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH₂(乙基/丙基/乙基)的效率低3至10倍。因此，基于Kataoka等的教導(dǎo)(奇偶規(guī)則)和Geall等的發(fā)現(xiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員在核酸遞送背景下會不考慮后者結(jié)構(gòu)。

Wang等描述了聚(甲基丙烯酸甲酯)-接枝-寡胺作為有效并且低細(xì)胞毒性的轉(zhuǎn)染試劑，用于質(zhì)粒DNA(Wang等，2010，Molecular BioSystems，6，256-263)。這些多聚體通過氨基分解帶有通式H₂N-CH₂-CH₂-(NH-CH₂-CH₂)_m-NH₂(其中m＝1、2或3)的寡胺的聚(甲基丙烯酸甲酯)而獲得。作者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率隨胺長度增加而增加。

Ou等描述了通過與N，N’-胱胺雙丙烯酰胺共聚、由具有Dde-NH-(CH₂)_a-NH-(CH₂)_b-NH-(CH₂)_a-NH-Dde結(jié)構(gòu)的末端有保護的寡胺衍生的聚(二硫酰氨基胺)(Ou等，2009，Biomaterials 30，5804-5814；WO 2010/065660)。他們考察了a＝2和b＝2、a＝2和b＝3、a＝3和b＝2、a＝3和b＝3、a＝3和b＝4(精胺)組合。Dde是2-乙?；p甲酮保護基團。在移除保護基團后，合成生成聚(二硫酰氨基胺)，其中內(nèi)部原來的仲胺變成叔胺作為多聚體主鏈部分，并且末端胺成為懸垂的(pending)亞乙基或亞丙基胺側(cè)鏈部分。這種多聚體在核酸遞送相關(guān)pH范圍內(nèi)具有緩沖能力，并且可用于將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。

近來，一種新類型的脂質(zhì)樣但非脂質(zhì)合成結(jié)構(gòu)——所謂類脂質(zhì)——對于體外和體內(nèi)核酸遞送的有用性已被發(fā)現(xiàn)(US 8,450,298；Love等，2010，PNAS 107，1864-1869；WO2006/138380；Akinc等，2008，Nat Biotechnol 26，561-569)。通過使含胺化合物與脂肪族環(huán)氧化物、丙烯酸酯、丙烯酰胺或醛反應(yīng)獲得類脂質(zhì)。作者/發(fā)明人提供了用于獲得類脂質(zhì)文庫的合成程序和用于選擇在核酸體外遞送至細(xì)胞中有用的可用化合物的篩選程序。

由上可知，關(guān)于其它核酸分子如質(zhì)粒DNA、寡核苷酸、siRNA或核酸類似物的遞送，過去已經(jīng)完成很多研究和研發(fā)工作。mRNA遞送還未有很深研究。一些作者主張有效作用于DNA或siRNA遞送的化合物和制劑將同樣作用于mRNA遞送。然而，與質(zhì)粒DNA或siRNA相比，mRNA是單鏈分子。因此，僅僅基于結(jié)構(gòu)考慮的話，會預(yù)期對用于mRNA遞送與用于DNA或siRNA遞送的化合物和制劑有不同要求。

上述以前的文獻描述雙鏈核酸如質(zhì)粒DNA或siRNA遞送到細(xì)胞或組織(一個或多個)中。更具體地，采用基于口服或直腸給予DNA——主要是質(zhì)粒DNA(pDNA)——的基因治療方法。代表性實例在Dass(Journal of Drug Targeting 16(4)，2008，257-61)、Bhavsar(AAPS ParmSciTech 9(1)，2008，288-94；Gene Therapy 15，2008，1200-09；Journal of Controlled Release 119，2007，339-48)、Dhadwar(Journal of Thrombosis and Haemostasis 8，2010，2743-50)、Chen(World J Gastroenterol 10(1)，2004，112-6)，Roy(Nature Medecine5(4)，1999，387-91)、Bowman(Journal of Controlled Release 132，2008，252-9)、Kanbe(Biochem和Biophys Research Communications 345，2006，1517-25)、Tai(Gene Therapy20，2013，187-93)和Jean(Gene Therapy 18，2011，807-16)中得到描述。在這種情況下，常采用殼聚糖介導(dǎo)的DNA遞送——例如通過利用殼聚糖/DNA納米顆粒(Dass同上、Jean同上、Dhadwar同上、Chen同上、Roy同上和Bowman同上)。還采用微球口服系統(tǒng)中含納米顆粒(NiMOS)(Bhavsar同上)。還提出裸基因治療(Kanbe同上)。然而，所述方法和化合物是否能夠?qū)捂満怂崛鏼RNA遞送到細(xì)胞或組織(一個或多個)中還未知，更不必說這是否可通過口服給予RNA實現(xiàn)。尤其，此前已觀察到mRNA轉(zhuǎn)染與質(zhì)粒DNA到細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染顯著不同(Bettinger等，2001，Nucleic Acids Res，29，3882-91；Uzgün等，2011，Pharm Res，28，2223-32)。

據(jù)此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)篩選WO 2011/154331公開的多聚體家族中超過100個成員的RNA遞送(優(yōu)選地，單鏈RNA如mRNA遞送至細(xì)胞)適用性時，該化合物均不可用于以引起mRNA編碼的基因表達的方式轉(zhuǎn)染mRNA。相比之下，這些化合物在質(zhì)粒DNA和/或siRNA遞送中全部都有效。因此，雙鏈核酸遞送到細(xì)胞中的已建立規(guī)則不適于單鏈mRNA的先驗。WO 2011/154331的公開包括化學(xué)定義為2-60個單元的寡(亞烷基氨基)酸單元的寡聚體，該寡(亞烷基氨基)酸單元相應(yīng)于通式HOOC-Z-R-NH-[(CH₂)_b-NH]_a-H，其中Z是一系列亞甲基或各種其它基團，R是亞甲基或羧基殘基，并且a和b分別獨立地是1-7或2-7的整數(shù)。該家族的寡聚體包括能夠發(fā)揮所謂質(zhì)子海綿效應(yīng)的可質(zhì)子化氨基，并且已在體外和體內(nèi)質(zhì)粒DNA和siRNA轉(zhuǎn)染中顯示高活性。重要地，WO 2011/154331和相關(guān)科學(xué)出版物詳細(xì)教導(dǎo)了可如何由相應(yīng)于通式HOOC-Z-R-NH-[(CH₂)_b-NH]_a-H的構(gòu)建模塊建立序列確定的寡聚體/多聚體文庫。

基于DNA的基因治療的一種替代手段是信使RNA(mRNA)遞送。具體地，mRNA近來已顯露作為非病毒基因治療的替代手段。由于mRNA在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮其功能，關(guān)于跨核膜運送的限制被克服；其與基于mRNA的轉(zhuǎn)錄物治療無關(guān)。

然而，實現(xiàn)簡單并且良好耐受的基于RNA的基因治療的適當(dāng)并且可靠的方法仍然懸而未決。

因此，本發(fā)明背后的技術(shù)工作是提供用于遞送RNA(優(yōu)選單鏈-RNA，如mRNA)、并且高效遞送到細(xì)胞中或遞送到組織(特別是在基因治療方法的情況下)的簡單、可靠并且良好耐受的手段和方法。

這個工作已經(jīng)通過提供在權(quán)利要求書中限定的并且在下文概述和實施例中進一步詳細(xì)示例的實施方式而完成。

因此，本發(fā)明以本文進一步限定的其各種實施方式提供：

(i)藥物組合物，包括(包括下列的組合物)RNA和陽離子劑，其中所述藥物組合物被配制成固體劑型——用于給予至GI道(或到GI道中)(例如，用于直腸給予，或優(yōu)選口服給予)；

(ii)本發(fā)明的藥物組合物用于全身性遞送RNA、和/或由其翻譯的蛋白質(zhì)、和/或遞送RNA到細(xì)胞和/或組織(具體地，GI道的細(xì)胞和/或組織)中的應(yīng)用；和

(iii)用于全身性遞送RNA、和/或由其翻譯的蛋白質(zhì)至對象或用于遞送RNA至對象的細(xì)胞和/或組織(具體地，GI道的細(xì)胞和/或組織)的方法，包括步驟：口服給予本發(fā)明的藥物組合物至GI道(或到GI道中)(例如直腸，或優(yōu)選口服)。

驚人地發(fā)現(xiàn)，RNA如mRNA，在其與陽離子劑(例如PEI或C12-(2-3-2))組合給予和在其被配制在固體劑型中/配制成固體劑型(例如在膠囊中提供)時，的確可被口服給予，而不降解和從而不喪失其期望治療功能。

更具體地，發(fā)現(xiàn)當(dāng)類脂質(zhì)/mRNA絡(luò)合物作為固體劑型(例如在硬明膠膠囊中(參見圖35))被口服給予時，mRNA在大鼠GI道中被有效表達(熒光素酶信號)。類脂質(zhì)/mRNA絡(luò)合物可與海藻糖一起凍干和/或負(fù)載到納米顆粒(NP)和/或微粒(MP)中。相比之下，主要器官(心臟、肺、肝、脾、腎)和當(dāng)mRNA作為非固體，即液體制劑，被口服給予時，檢測不到顯著表達。

另一驚人發(fā)現(xiàn)是，當(dāng)與PEI組合給予時，甚至在不使用助劑脂質(zhì)和/或MP的情況下也實現(xiàn)了有效mRNA表達(參見圖36)。然而，在NP和/或MP中/作為NP和/或MP的制劑在mRNA表達中也顯示非常好的結(jié)果(參見圖36)。

原則上，陽離子劑是根據(jù)本發(fā)明的提供正電荷并且因此能夠分別與核酸(一般帶負(fù)電荷)絡(luò)合和與核酸一起形成絡(luò)合物的任何試劑。一般，在本發(fā)明環(huán)境中使用的陽離子劑是寡陽離子劑或聚陽離子劑。陽離子劑可以是陽離子寡聚體、陽離子多聚體或陽離子脂質(zhì)或類脂質(zhì)。

一種非限制性但優(yōu)選的陽離子多聚體是聚亞乙基亞胺(PEI)。原則上，任何PEI可根據(jù)本發(fā)明使用。因此，PEI可以是不分支的、部分分支的或分支的PEI(brPEI)。優(yōu)選BrPEI。

在另一實施方式中，陽離子劑(具體地，陽離子寡聚體、多聚體或類脂質(zhì))可以包括寡(亞烷基胺)部分，如，例如，PCT/EP2014/063756描述的特征性寡(亞烷基胺)部分。更具體地，陽離子劑可以是PCT/EP2014/063756描述的寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)。一種非限制性但優(yōu)選的陽離子類脂質(zhì)是PCT/EP2014/06375描述的并且本文限定和描述的“C12-(2-3-2)”。

在一個具體實施方式中，藥物組合物或其組分中的至少一種——具體地，包括的RNA，優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA——是分離的和/或非天然存在的。

具體地，在本發(fā)明環(huán)境和本文進一步限定的其各種實施方式中，使用下列：

-陽離子寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)，其包括含有交替的不相同的亞烷基胺單元的寡(亞烷基胺)，可用于將RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)遞送到細(xì)胞中或到組織——具體地，在被包括在藥物組合物中時，該包括所述RNA并且可被胃腸給予并因此可以采用固體劑型(例如(硬或軟明膠)膠囊、片劑、栓劑、丸劑、顆?；?細(xì)分)粉末形式，如本文其它部分限定)；

-包括以上的組合物和藥物組合物，其包括這些寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)——該寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)包括含有交替的不相同的亞烷基胺單元的寡(亞烷基胺)——與RNA(具體地mRNA)的組合，其可用于將RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)遞送到細(xì)胞中或到組織。具體地，所述(藥物)組合物可被胃腸給予并且因此可以采用任何上述劑型形式；

-制備所述化合物和組合物的方法；以及

-利用所述化合物和組合物將RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)遞送到細(xì)胞中的方法，以及利用根據(jù)本發(fā)明的組合物遞送RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)的能力的醫(yī)藥應(yīng)用和治療方法。

可用于將RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)遞送至細(xì)胞的組合物所包括的寡聚體或多聚體化合物(包括線性的、分支和樹枝狀的、無規(guī)的或序列確定的化合物)或類脂質(zhì)化合物中包含交替的不相同的亞烷基胺單元的寡(亞烷基胺)的富集結(jié)構(gòu)空間還未被研究。這種化合物的序列空間也因此還未被研究。

在本發(fā)明環(huán)境中，作為寡聚體、多聚體和類脂質(zhì)的一般原則，進一步驚人地發(fā)現(xiàn)，在用于利用RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的組合物中，具有三個或更多個單元并且包含亞乙基胺單元的基團中交替長度的亞烷基胺單元的排列總是比非交替長度亞烷基胺單元的類似排列更加有效。因此，在本發(fā)明環(huán)境中使用具有如下式(I)示例的共同結(jié)構(gòu)實體的寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)，具體地陽離子寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)：

下文對其進一步說明。

具體地，本發(fā)明的藥物組合物一方面包括(包括下列的組合物)RNA(優(yōu)選，單鏈RNA，如mRNA)和包括寡(亞烷基胺)的組分，該組分選自：

a)包括多個式(II)基團作為側(cè)鏈和/或作為末端基團的寡聚體或多聚體，具體地陽離子寡聚體或多聚體：

其中多個式(II)基團中的每個式(II)基團的變量a、b、p、m、n和R²至R⁶獨立地限定如下：

a是1，并且b是2至4的整數(shù)；或a是2至4的整數(shù)，并且b是1，

p是1或2，

m是1或2；n是0或1和m+n≥2；并且

R²至R⁵彼此獨立地選自氫；基團-CH₂-CH(OH)-R⁷、-CH(R⁷)-CH₂-OH、-CH₂-CH₂-(C＝O)-O-R⁷、-CH₂-CH₂-(C＝O)-NH-R⁷或-CH₂-R⁷，其中R⁷選自C3-C18烷基或具有一個C-C雙鍵的C3-C18烯基；氨基保護基團；和聚(乙二醇)鏈；

R⁶選自氫；基團-CH₂-CH(OH)-R⁷、-CH(R⁷)-CH₂-OH、-CH₂-CH₂-(C＝O)-O-R⁷、-CH₂-CH₂-(C＝O)-NH-R⁷或-CH₂-R⁷，其中R⁷選自C3-C18烷基或具有一個C-C雙鍵的C3-C18烯基；氨基保護基團；-C(NH)-NH₂；聚(乙二醇)鏈；和受體配體，

并且，其中式(II)所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供式(II)的陽離子基團；

b)寡聚體或多聚體，具體地陽離子寡聚體或多聚體，包括多個式(III)基團作為重復(fù)單元：

其中多個式(III)基團中的每個式(III)基團的變量a、b、p、m、n和R²至R⁵獨立地限定如下：

a是1，并且b是2至4的整數(shù)；或a是2至4的整數(shù)，并且b是1，

p是1或2，

m是1或2；n是0或1和m+n≥2；并且

R²至R⁵彼此獨立地選自氫；基團-CH₂-CH(OH)-R⁷、-CH(R⁷)-CH₂-OH、-CH₂-CH₂-(C＝O)-O-R⁷、-CH₂-CH₂-(C＝O)-NH-R⁷或-CH₂-R⁷，其中R⁷選自C3-C18烷基或具有一個C-C雙鍵的C3-C18烯基；氨基保護基團；-C(NH)-NH₂；和聚(乙二醇)鏈；

并且，其中式(III)所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供式(III)的陽離子基團；和

c)類脂質(zhì)，具體地陽離子類脂質(zhì)，具有式(IV)的結(jié)構(gòu)：

其中變量a、b、p、m、n和R¹至R⁶限定如下：

a是1，并且b是2至4的整數(shù)；或a是2至4的整數(shù)，并且b是1，

p是1或2，

m是1或2；n是0或1和m+n≥2；并且

R¹至R⁶彼此獨立地選自氫；基團-CH₂-CH(OH)-R⁷、-CH(R⁷)-CH₂-OH、-CH₂-CH₂-(C＝O)-O-R⁷、-CH₂-CH₂-(C＝O)-NH-R⁷或-CH₂-R⁷，其中R⁷選自C3-C18烷基或具有一個C-C雙鍵的C3-C18烯基；氨基保護基團；-C(NH)-NH₂；聚(乙二醇)鏈；和受體配體；條件是R¹至R⁶之中至少兩個殘基是基團-CH₂-CH(OH)-R⁷、-CH(R⁷)-CH₂-OH、-CH₂-CH₂-(C＝O)-O-R⁷、-CH₂-CH₂-(C＝O)-NH-R⁷或-CH₂-R⁷，其中R⁷選自C3-C18烷基或具有一個C-C雙鍵的C3-C18烯基；

并且，其中式(IV)所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供式(IV)的陽離子基團。

在進一步方面，在本發(fā)明環(huán)境中采用如上限定的寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)作為制備根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的組合物和包括所述組合物的藥物組合物的可用中間體。本文還描述了制備根據(jù)本發(fā)明的寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)以及根據(jù)本發(fā)明的組合物和藥物組合物的方法。

再進一步方面描述了根據(jù)本發(fā)明的(藥物)組合物或根據(jù)本發(fā)明的陽離子多聚體或樹枝狀聚合物或類脂質(zhì)用于遞送RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)到目標(biāo)細(xì)胞中或到組織的應(yīng)用——具體地通過以固體劑型給予至GI道(或到GI道中)，和遞送RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)到細(xì)胞或組織中的方法——具體地通過以固體劑型給予至GI道(或到GI道中)，包括步驟：使根據(jù)本發(fā)明的(藥物)組合物接觸細(xì)胞或組織。

寡(亞烷基胺)基團

式(II)、(III)和(IV)的寡(亞烷基胺)結(jié)構(gòu)的特征在于其以交替方式組合較短的(也被稱為例如“S”)亞乙基胺單元(即，a或b是1)與較長的(也被稱為例如“L”)亞烷基胺單元(即，a或b中另一個是2至4的整數(shù))。出乎意料地，發(fā)現(xiàn)可質(zhì)子化單元的這種排列在所得基團為遞送RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)到細(xì)胞中提供媒介的適應(yīng)性方面提供優(yōu)勢。

如上所述，可用于根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式的(藥物)組合物的寡聚體或多聚體包括多個式(II)寡(亞烷基胺)基團作為側(cè)鏈和/或作為末端基團：

-NR²{CH₂-(CH₂)_a-NR³-[CH₂-(CH₂)_b-NR⁴]_p}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NR⁵]_n-R⁶ (II)，

其中多個式(II)基團中的每個式(II)基團的變量a、b、p、m、n和R²至R⁶獨立地限定如下：

a是1，并且b是2至4的整數(shù)；或a是2至4的整數(shù)，并且b是1，

p是1或2，

m是1或2；n是0或1和m+n≥2；并且

R²至R⁵彼此獨立地選自氫；基團-CH₂-CH(OH)-R⁷、-CH(R⁷)-CH₂-OH、-CH₂-CH₂-(C＝O)-O-R⁷、-CH₂-CH₂-(C＝O)-NH-R⁷或-CH₂-R⁷，其中R⁷選自C3-C18烷基或具有一個C-C雙鍵的C3-C18烯基；氨基保護基團；-C(NH)-NH₂；和聚(乙二醇)鏈；

R⁶選自氫；基團-CH₂-CH(OH)-R⁷、-CH(R⁷)-CH₂-OH、-CH₂-CH₂-(C＝O)-O-R⁷、-CH₂-CH₂-(C＝O)-NH-R⁷或-CH₂-R⁷，其中R⁷選自C3-C16烷基或具有一個C-C雙鍵的C3-C16烯基；氨基保護基團；-C(NH)-NH₂；聚(乙二醇)鏈；和受體配體。

優(yōu)選地，R²至R⁵是氫，并且R⁶選自氫、氨基保護基團；-C(NH)-NH₂和聚(乙二醇)鏈。更優(yōu)選地，R²至R⁶是氫。優(yōu)選地，R⁷選自C8-C18烷基或具有一個C-C雙鍵的C8-C18烯基，更優(yōu)選選自C8-C12烷基或具有一個C-C雙鍵的C8-C12烯基，最優(yōu)選選自C10-C12烷基或具有一個C-C雙鍵的C10-C12烯基。

式(II)或其優(yōu)選實施方式所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供式(II)的陽離子基團。

多個式(II)基團意為根據(jù)本發(fā)明的寡聚體或多聚體包含式(II)基團或其優(yōu)選實施方式的兩個或更多個，優(yōu)選三個或更多個。在包含多個式(II)基團的多聚體中，優(yōu)選存在10個或更多個式(II)基團。會理解，多聚體或寡聚體中的式(II)基團或其優(yōu)選實施方式可具有相同結(jié)構(gòu)，或可具有式(II)范圍內(nèi)的兩種或更多種不同結(jié)構(gòu)。

根據(jù)另一優(yōu)選實施方式，可用于根據(jù)本發(fā)明的(藥物)組合物的寡聚體或多聚體包括多個式(III)寡(亞烷基胺)基團作為重復(fù)單元：

-NR²{CH₂-(CH₂)_a-NR³-[CH₂-(CH₂)_b-NR⁴]_p}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NR⁵]_n- (III)，

其中多個式(III)基團中的每個式(III)基團的變量a、b、p、m、n和R²至R⁵獨立地限定如下：

a是1，并且b是2至4的整數(shù)；或a是2至4的整數(shù)，并且b是1，

p是1或2，

m是1或2；n是0或1和m+n≥2；并且

R²至R⁵彼此獨立地選自氫；基團-CH₂-CH(OH)-R⁷、-CH(R⁷)-CH₂-OH、-CH₂-CH₂-(C＝O)-O-R⁷、-CH₂-CH₂-(C＝O)-NH-R⁷或-CH₂-R⁷，其中R⁷選自C3-C18烷基或具有一個C-C雙鍵的C3-C18烯基；氨基保護基團；-C(NH)-NH₂；聚(乙二醇)鏈；內(nèi)含體逃逸效應(yīng)器(effector)和受體配體。優(yōu)選地，R²至R⁵是氫。優(yōu)選地，R⁷選自C8-C18烷基或具有一個C-C雙鍵的C8-C18烯基.，更優(yōu)選選自C8-C12烷基或具有一個C-C雙鍵的C8-C12烯基，最優(yōu)選選自C10-C12烷基或具有一個C-C雙鍵的C10-C12烯基。

式(III)或其優(yōu)選實施方式所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供式(III)的陽離子基團。

任選地，包括多個式(III)基團或其優(yōu)選實施方式作為重復(fù)單元的寡聚體或多聚體可另外包括一個或多個式(II)寡(亞烷基胺)基團作為側(cè)鏈和/或作為末端基團。

多個式(III)基團作為重復(fù)單元意為根據(jù)本發(fā)明的寡聚體或多聚體包含式(III)基團或其優(yōu)選實施方式的兩個或更多個，優(yōu)選三個或更多個?？傮w上，在本文中，包括2至9個重復(fù)單元的物質(zhì)被稱為寡聚體，包括10個和更多個重復(fù)單元的物質(zhì)被稱為多聚體。因此，在包含多個式(III)基團作為重復(fù)單元的多聚體中，優(yōu)選存在10個和更多個式(III)基團。會理解，在多聚體或寡聚體中式(III)基團或其優(yōu)選實施方式可具有相同結(jié)構(gòu)，或可具有式(III)范圍內(nèi)的兩種或更多種不同結(jié)構(gòu)。有利地，并且根據(jù)優(yōu)選實施方式，包含多個式(III)基團作為重復(fù)單元的寡聚體或多聚體可以在受控的分步聚合中由不同式(III)基團制備的序列確定的多聚體文庫的形式提供。

根據(jù)上文式(II)和(III)，亞烷基胺單元可以在交替鏈中重復(fù)一次，使得-S-L-L-S-或-L-S-S-L-型寡(亞烷基胺)部分可以生成，其中S表示較短亞乙基胺單元，和L表示較長亞烷基胺單元。然而，優(yōu)選式(II)和(III)基團是其中無重復(fù)存在的基團，即，其中p是1，使得較短或較長單元不成對出現(xiàn)。換句話說，式(II)基團優(yōu)選是式(IIa)的寡(亞烷基胺)基團并且式(III)基團優(yōu)選是(IIIa)的寡(亞烷基胺)基團：

-NR²{CH₂-(CH₂)_a-NR³-CH₂-(CH₂)_b-NR⁴}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NR⁵]_n-R⁶ (IIa)，

其中a、b、m、n、和R²至R⁶限定如式(II)——包括優(yōu)選實施方式，并且其中式(IIa)所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供陽離子寡聚體或多聚體結(jié)構(gòu)；

-NR²{CH₂-(CH₂)_a-NR³-CH₂-(CH₂)_b-NR⁴}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NR⁵]_n- (IIIa)，

其中a、b、m、n、和R²至R⁵限定如式(III)——包括優(yōu)選實施方式，并且其中式(IIIa)所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供陽離子寡聚體或多聚體結(jié)構(gòu)。

此外，式(II)和(III)的寡(亞烷基胺)基團總體上優(yōu)選n是1，并且更優(yōu)選m是1并且n是1。因此，特別優(yōu)選式(II)基團是式(IIb)的寡(亞烷基胺)基團，以及式(III)的基團是式(IIIb)的寡(亞烷基胺)基團：

-NR²-CH₂-(CH₂)_a-NR³-CH₂-(CH₂)_b-NR⁴-CH₂-(CH₂)_a-(NR⁵)-R⁶ (IIb)，

其中a、b、和R²至R⁶限定如式(II)——包括優(yōu)選實施方式，并且其中式(IIb)所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供陽離子寡聚體或多聚體結(jié)構(gòu)；

-NR²-CH₂-(CH₂)_a-NR³-CH₂-(CH₂)_b-NR⁴-CH₂-(CH₂)_a-NR⁵- (IIIb)，

其中a、b、和R²至R⁵限定如式(III)——包括優(yōu)選實施方式，并且其中式(IIIb)所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供陽離子寡聚體或多聚體結(jié)構(gòu)。

關(guān)于式(II)、(IIa)、(IIb)和(III)、(IIIa)、(IIIb)的寡(亞烷基胺)基團中的亞烷基胺單元長度，會理解，其中一個交替單元需要是亞乙基胺單元(即，a或b必須是1)。另一交替單元可以是亞丙基胺單元、亞丁基胺單元或亞戊基胺單元(即，a或b中另一個是2至4的整數(shù)。優(yōu)選地，a或b中另一個是2或3，并且最優(yōu)選a是1并且b是2，或a是2并且b是1。因此，還更優(yōu)選作為基團(II)的是式(IIc)的寡(亞烷基胺)基團，并且還更優(yōu)選作為基團(III)的是式(IIIc)的寡(亞烷基胺)基團：

-NR²-CH₂-CH₂-NR³-CH₂-CH₂-CH₂-NR⁴-CH₂-CH₂-NR⁵-R⁶ (IIc)，

其中R²至R⁶限定如式(II)和其優(yōu)選實施方式，并且最優(yōu)選是氫，并且其中式(IIc)所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供陽離子寡聚體或多聚體結(jié)構(gòu)；

-NR²-CH₂-CH₂-NR³-CH₂-CH₂-CH₂-NR⁴-CH₂-CH₂-NR⁵- (IIIc)，

其中R²至R⁵限定如式(III)和其優(yōu)選實施方式，并且最優(yōu)選是氫，并且其中式(IIIc)所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供陽離子寡聚體或多聚體結(jié)構(gòu)。

只要式(II)、(IIa)、(IIb)和(IIc)的基團R²至R⁶或式(III)、(IIIa)、(IIIb)和(IIIc)的基團R²至R⁵中的任意者是如例如WO2006/138380描述的氨基保護基團，其優(yōu)選實施方式是叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、或芐氧羰基(Cbz)。

只要式(II)、(IIa)、(IIb)和(IIc)的基團R¹至R⁶或式(III)、(IIIa)、(IIIb)和(IIIc)的基團R²至R⁵中的任意者是受體配體，可用的實例在Philipp和Wagner在“Gene and Cell Therapy-Therapeutic Mechanisms and Strategy”，第3版，第15章，CRC Press，Taylor&Francis Group LLC，Boca Raton 2009中被給出。肺組織優(yōu)選的受體配體被描述于Pfeifer等，2010，Ther.Deliv.1(1)：133-48。優(yōu)選的受體配體包括合成的環(huán)狀或線性肽——如通過針對結(jié)合至具體細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)或具體細(xì)胞類型篩選肽文庫而得到的環(huán)狀或線性肽、環(huán)狀或線性RGD肽、合成或天然的碳水化合物如唾液酸，半乳糖或甘露糖或通過使碳水化合物例如與肽反應(yīng)而得到的合成配體、特異性識別細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的抗體、葉酸、表皮生長因子和其衍生肽、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體、納米抗體(nanobodies)和抗體片段、結(jié)合至已知細(xì)胞表面分子的已批準(zhǔn)藥物等。

只要式(II)、(IIa)、(IIb)和(IIc)的基團R¹至R⁶或式(III)、(IIIa)、(IIIb)和(IIIc)的基團R²至R⁵中的任意者是聚(乙二醇)鏈，聚(乙二醇)鏈的優(yōu)選分子量是100-20,000g/mol，更優(yōu)選是1,000-10,000g/mol，并且最優(yōu)選是1,000-5,000g/mol。

最優(yōu)選作為基團(II)的是式(IId)的寡(亞烷基胺)基團：

-NH-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH-H (IId)，

其中式(IId)所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供陽離子多聚體或樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)。

最優(yōu)選作為基團(III)的是式(IIId)的寡(亞烷基胺)基團：

-NH-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH- (IIId)，

其中式(IIId)所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供陽離子多聚體或樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)。

如上所述，可用于根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式的(藥物)組合物的類脂質(zhì)具有式(IV)的結(jié)構(gòu)：

R¹-NR²{CH₂-(CH₂)_a-NR³-[CH₂-(CH₂)_b-NR⁴]_p}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NR⁵]_n-R⁶ (IV)，

其中變量a、b、p、m、n和R¹至R⁶限定如下：

a是1，并且b是2至4的整數(shù)；或a是2至4的整數(shù)，并且b是1，

p是1或2，

m是1或2；n是0或1和m+n≥2；并且

R¹至R⁶彼此獨立地選自氫；基團-CH₂-CH(OH)-R⁷、-CH(R⁷)-CH₂-OH、-CH₂-CH₂-(C＝O)-O-R⁷、-CH₂-CH₂-(C＝O)-NH-R⁷或-CH₂-R⁷，其中R⁷選自C3-C18烷基或具有一個C-C雙鍵的C3-C18烯基；氨基保護基團；-C(NH)-NH₂；聚(乙二醇)鏈；和受體配體；條件是R¹至R⁶之中至少兩個殘基是基團-CH₂-CH(OH)-R⁷、-CH(R⁷)-CH₂-OH、-CH₂-CH₂-(C＝O)-O-R⁷、-CH₂-CH₂-(C＝O)-NH-R⁷或-CH₂-R⁷，其中R⁷選自C3-C18烷基或具有一個C-C雙鍵的C3-C18烯基。

優(yōu)選地，R¹至R⁶獨立地選自氫；基團-CH₂-C(OH)H-R⁷或-CH(R⁷)-CH₂-OH，其中R⁷選自C3-C18烷基或具有一個C-C雙鍵的C3-C18烯基；氨基保護基團；和聚(乙二醇)鏈；條件是R¹至R⁶之中至少兩個殘基是基團-CH₂-C(OH)H-R⁷或-CH(R⁷)-CH₂-OH，其中R⁷選自C3-C18烷基或具有一個C-C雙鍵的C3-C18烯基。更優(yōu)選地，R¹至R⁶獨立地選自氫；和基團-CH₂-CH(OH)-R⁷或-CH(R⁷)-CH₂-OH，其中R⁷選自C3-C16烷基或具有一個C-C雙鍵的C3-C16烯基；條件是R¹至R⁶之中至少兩個殘基是基團-CH₂-CH(OH)-R⁷或-CH(R⁷)-CH₂-OH，其中R⁷選自C3-C18烷基或具有一個C-C雙鍵的C3-C18烯基。再進一步優(yōu)選下列組合(constellation)：R¹和R⁶獨立地選自氫；和基團-CH₂-CH(OH)-R⁷或-CH(R⁷)-CH₂-OH，其中R⁷選自C3-C18烷基或具有一個C-C雙鍵的C3-C18烯基；和R²至R⁵全部是基團-CH₂-CH(OH)-R⁷或-CH(R⁷)-CH₂-OH，其中R⁷選自C3-C18烷基或具有一個C-C雙鍵的C3-C18烯基。優(yōu)選地，R⁷選自C8-C16烷基或具有一個C-C雙鍵的C8-C18烯基，更優(yōu)選選自C8-C12烷基或具有一個C-C雙鍵的C8-C12烯基，最優(yōu)選選自C10-C12烷基或具有一個C-C雙鍵的C10-C12烯基。

式(IV)所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供式(IV)的陽離子類脂質(zhì)。

根據(jù)上述式(IV)，亞烷基胺單元可以在交替鏈中重復(fù)一次，使得-S-L-L-S-或-L-S-S-L-型的寡(亞烷基胺)部分可以生成，其中S表示較短亞乙基胺單元，并且L表示較長亞烷基胺單元。然而，式(IV)的優(yōu)選類脂質(zhì)是其中不存在重復(fù)的類脂質(zhì)，即，其中p是1，使得較短或較長單元不成對出現(xiàn)。換句話說，式(IV)的類脂質(zhì)優(yōu)選是(IVa)的類脂質(zhì)：

R¹-NR²{CH₂-(CH₂)_a-NR³-CH₂-(CH₂)_b-NR⁴}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NR⁵]_n-R⁶ (IVa)，

其中a、b、m、n、和R¹至R⁶限定如式(IV)——包括優(yōu)選實施方式，并且其中式(IVa)所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供陽離子類脂質(zhì)；

此外，式(IV)的類脂質(zhì)總體上優(yōu)選n是1，更優(yōu)選m是1并且n是1。因此，特別優(yōu)選式(IV)的類脂質(zhì)是式(IVb)的類脂質(zhì)：

R¹-NR²-CH₂-(CH₂)_a-NR³-CH₂-(CH₂)_b-NR⁴-CH₂-(CH₂)_a-NR⁵-R⁶ (IVb)，

其中a、b、和R¹至R⁶限定如式(IV)——包括優(yōu)選實施方式，并且其中式(IVb)所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供陽離子類脂質(zhì)。

關(guān)于式(IV)、(IVa)和(IVb)的類脂質(zhì)中的亞烷基胺單元長度，會理解，其中一個交替單元需要是亞乙基胺單元(即，a或b必須是1)。另一交替單元可以是亞丙基胺單元、亞丁基胺單元或亞戊基胺單元(即，a或b中另一個是2至4的整數(shù)。優(yōu)選地，a或b中另一個是2或3，并且最優(yōu)選地，a是1并且b是2、或a是2并且b是1。因此，還更優(yōu)選作為式(IV)的類脂質(zhì)的是式(IVc)的類脂質(zhì)：

R¹-NR²-CH₂-CH₂-NR³-CH₂-CH₂-CH₂-NR⁴-CH₂-CH₂-NR⁵-R⁶ (IVc)，

其中R¹至R⁶限定如式(IV)和其優(yōu)選實施方式，并且其中式(IVc)所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供陽離子類脂質(zhì)；

只要式(IV)、(IVa)、(IVb)和(IVc)的基團R¹至R⁶是如例如WO 2006/138380描述的氨基保護基團，其優(yōu)選實施方式是叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、或芐氧羰基(Cbz)。

只要式(IV)、(IVa)、(IVb)和(IVc)的基團R¹至R⁶是受體配體，可用實例在Philipp和Wagner的“Gene and Cell Therapy-Therapeutic Mechanisms and Strategy”，第3版，第15章，CRC Press，Taylor&Francis Group LLC，Boca Raton 2009中被給出。肺組織的優(yōu)選受體配體在Pfeifer等，2010，Ther Deliv.1(1)：133-48中得到描述。優(yōu)選受體配體包括合成的環(huán)狀或線性肽——如通過針對結(jié)合至具體細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)或具體細(xì)胞類型篩選肽文庫得到的環(huán)狀或線性肽、環(huán)狀或線性RGD肽、合成或天然的碳水化合物如唾液酸、半乳糖或甘露糖、或通過使碳水化合物例如與肽反應(yīng)而得到的合成配體、特異性識別細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的抗體、葉酸、表皮生長因子和其衍生肽、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體、納米抗體和抗體片段、結(jié)合至已知細(xì)胞表面分子的已批準(zhǔn)藥物等。

只要式(IV)、(IVa)、(IVb)和(IVc)的基團R¹至R⁶是聚(乙二醇)鏈，聚(乙二醇)鏈的優(yōu)選分子量是100-20,000g/mol，更優(yōu)選是1,000-10,000g/mol，并且最優(yōu)選1,000-5,000g/mol。

如上所述，式(I)和包括式(IIa)-(IId)、(IIIa)-(IIId)和(IVa)-(IVc)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式所示的氮原子中的一個或多個可以被質(zhì)子化以生成陽離子形式(一般寡陽離子或聚陽離子形式)的寡聚體或多聚體或類脂質(zhì)。會理解，式(I)和包括式(IIa)-(IId)、(IIIa)-(IIId)和(IVa)-(IVc)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的基團中的伯氨基和/或仲氨基和/或叔氨基可充當(dāng)質(zhì)子受體——特別是在水和水溶液(包括生理流體)中。因此，本發(fā)明的寡聚體、多聚體和類脂質(zhì)在pH在7.5以下的水溶液中一般具有總體正電荷。本文所稱的水溶液是其中溶劑包括50％(vol./vol.)(或更優(yōu)選80或90％或更多，并且最優(yōu)選100％)的水的溶液。而且，如果根據(jù)本發(fā)明的(藥物)組合物接觸pH在7.5以下的生理流體(包括例如血液和肺流體)，則式(I)和包括式(IIa)-(IId)、(IIIa)-(IIId)和(IVa)-(IVc)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的基團一般包含一個或多個質(zhì)子化的氨基。這些化合物的pK_a值可利用自動pK_a滴定器通過酸堿滴定來確定。然后根據(jù)Henderson-HasselbaCH方程式可計算出給定pH值下的凈電荷。根據(jù)Geall等(J.Geall等，1998，Chem Commun，1403-1404)，認(rèn)識到任何電荷都被數(shù)個堿性中心共享以及不能歸結(jié)于單點是非常重要的。1，9-二氨基-3，7-二氮壬烷(丙基/乙基/丙基)例如具有9.3、7.6和5.7的pK_a，意味著在生理pH下顯著部分的氨基處于質(zhì)子化和未質(zhì)子化狀態(tài)。

然而，技術(shù)人員讀者會理解，根據(jù)本發(fā)明使用的寡聚體、多聚體和類脂質(zhì)以及根據(jù)本發(fā)明的(藥物)組合物也可以包含陽離子形式的寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)的干燥鹽形式提供。

可進一步理解，根據(jù)本發(fā)明的包括寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)和RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)的(藥物)組合物中的質(zhì)子化氨基的正電荷的反離子(陰離子)一般由RNA包含的陰離子部分提供。如果帶正電荷的基團與RNA中的陰離子部分相比過量存在，則正電荷可以被其它陰離子(如一般在生理流體中相遇的Cl^-或HCO₃^-)平衡。

適用于本發(fā)明環(huán)境的寡(亞烷基胺)可購自已知的化學(xué)品供應(yīng)商，或可通過本領(lǐng)域已知的方法(例如van Alphen 1936，Recueil des Travaux Chimiques des Pays-Bas，55，835-840)合成。可通過標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)合成方法來實現(xiàn)任何可能需要的改動。

寡聚體/多聚體結(jié)構(gòu)

如上所述，式(I)和包括式(IIa)-(IId)和(IIIa)-(IIId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的基團可以結(jié)合到、或可提供多種寡聚體或多聚體骨架結(jié)構(gòu)。

總體上，包括多個式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的基團的寡聚體或多聚體也可被稱為攜帶多個式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的基團作為側(cè)鏈和/或末端基團的多聚體骨架。可以攜帶多個式(II)的基團和包括式(IIa)至(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的基團作為側(cè)鏈或末端基團的多聚體骨架包括線性、分支或交聯(lián)的多聚體以及樹枝狀多聚體(樹枝狀聚合物)。多聚體包括合成的或生物多聚體。優(yōu)選線性或分支的多聚體骨架結(jié)構(gòu)。這也適用于攜帶式(II)的基團和包括式(IIa)至(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的基團作為側(cè)鏈或末端基團的寡聚體，區(qū)別是多聚體骨架一般包括10個和更多個重復(fù)單元，而寡聚體骨架包括2至9個，優(yōu)選3至9個重復(fù)單元?？傮w上，在包括多個式(II)的基團和包括式(IIa)至(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的基團作為側(cè)鏈或末端基團的寡聚體和多聚體之中，優(yōu)選多聚體。

為提供根據(jù)本發(fā)明的多聚體，可利用已知的化學(xué)官能性和反應(yīng)，將式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的側(cè)鏈或末端基團常規(guī)地接枝至多聚體或寡聚體骨架。技術(shù)人員讀者會理解，術(shù)語“接枝至多聚體或寡聚體”不排除側(cè)鏈在聚合反應(yīng)前結(jié)合至單體的選項。如式(II)的自由價(free valence)所示，側(cè)鏈或末端基團通過共價鍵附接至多聚體或寡聚體骨架。

會進一步理解，本文使用的術(shù)語“多聚體”和“寡聚體”包括可通過多種反應(yīng)(如，加成聚合、和縮聚反應(yīng)，包括自由基聚合、陰離子或陽離子聚合)獲得的多聚體和寡聚體、以及可通過分步偶聯(lián)反應(yīng)(例如分步生長法)獲得的多聚體和寡聚體。

因此，適合作為攜帶多個式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的基團作為側(cè)鏈或末端基團的多聚體或寡聚體骨架的多聚體或寡聚體包括多聚體或寡聚體，如聚酰胺、聚酯、具有碳鏈骨架的多聚體、和多糖。通過如下提供示例性多聚體或寡聚體骨架：包括多個谷氨酸或天冬氨酸單元的聚(氨基酸)(如聚(谷氨酸)和聚(天冬氨酸))、蛋白質(zhì)、聚炔烴、聚胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚馬來酸、聚磺酸酯、聚苯乙烯磺酸酯、聚磷酸酯、聚硫酸戊聚糖、聚(乙烯基膦酸)、聚(丁二烯-共-馬來酸)、聚(丙烯酸乙酯-共-丙烯酸)、聚(乙烯-共-丙烯酸)、聚(乙烯-共-馬來酸酐)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸)、聚(苯乙烯磺酸-共-馬來酸)、聚(氯乙烯-共-乙酸乙烯酯-共-馬來酸)碳水化合物如肝素、硫酸乙酰肝素、聚(葡萄糖醛酸)、聚(半乳糖醛酸)、透明質(zhì)酸、一般的聚(糖醛酸)、或羧基封端的樹枝狀聚合物。其中，優(yōu)選包括多個谷氨酸或天冬氨酸單元的聚(氨基酸)如聚(谷氨酸)和聚(天冬氨酸)、和聚(甲基)丙烯酸。出于本發(fā)明目的，最優(yōu)選聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸。

優(yōu)選地，多聚體骨架的聚合程度(在聚合單元平均數(shù)方面，例如通過凝膠滲透色譜(GPC)確定)為10至10,000，優(yōu)選50至5,000。

根據(jù)本發(fā)明的多聚體可以通過如下提供：均聚體或共聚體。共聚體可以包含不同結(jié)構(gòu)的聚合單元，使得多聚體骨架是共聚體?？蛇x地，可以基于均聚體獲得共聚體作為多聚體骨架，其中并非所有聚合單元攜帶式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的基團。會理解，通過將側(cè)鏈接枝至共聚體骨架中一定百分比的單元來組合這兩種選擇也是一種選擇。共聚體可以是無規(guī)、梯度或嵌段共聚體形式。

如果根據(jù)本發(fā)明的多聚體是均聚體，全部聚合單元都攜帶式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的基團。如果根據(jù)本發(fā)明的多聚體是共聚體，優(yōu)選全部聚合單元中的5至100％攜帶式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的基團，更優(yōu)選25至100％，特別是50至100％。該百分比根據(jù)攜帶式(II)基團的單元相對于全部聚合單元的數(shù)量給出。

上述共聚體可以除式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的基團外還包含包含側(cè)鏈或末端基團的其它胺。然而，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的多聚體不包含式-NH-(CH₂)_x-(NH(CH₂)₂)_y-NH₂的側(cè)鏈或末端基團，其中x表示1至5的整數(shù)，并且y表示1至5的整數(shù)。

優(yōu)選攜帶式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的側(cè)鏈的聚酰胺包含重復(fù)的式(V)單元：

其中變量具有下列含義：

R⁸和R⁹獨立地選自鍵和C1-C6烷二基(alkanediyl)；

R¹⁰選自H和C1-C6烷基；

R¹¹選自鍵和C1-C6烷二基，

L¹是二價連接基團，和

A¹表示式(II)的寡(亞烷基胺)基團。

優(yōu)選地，R⁸和R⁹獨立地選自鍵和C1-C5烷二基，更優(yōu)選是鍵。優(yōu)選地，R¹⁰選自H和甲基，最優(yōu)選是H。R¹¹優(yōu)選是C1-C6烷二基。

連接基團L¹在優(yōu)選實施方式中具有-Z¹-R’-Z²-結(jié)構(gòu)，其中Z¹選自鍵、-NH-(C＝O)-、-NH-C(S)-NH-、-NH-(C＝O)-NH-、-NH-S(O)₂-、-NH-CH₂-C(OH)-、-NH-(C＝O)-O-、-NH-C(NH)-、-CH＝N-NH-(C＝O)-、-S-S-、-硫醚鍵-、-S-CH₂-(C＝O)-、-S-、-S-CH₂-CH-NH₂-、和-芳基硫醚鍵-；R’選自鍵、C1-C6烷二基和-(CH₂-CH₂-O)_n-H，其中n＝1-3；并且Z²選自鍵、-(C＝O)-、-NH-C(S)-、-NH-(C＝O)-、-S(O)₂-、-O-P(O)₂-、-CH(OH)-CH₂、-O-(C＝O)-和-C(NH)-。優(yōu)選地，Z¹選自鍵、-NH-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-NH-、-NH-(C＝O)-O-、-NH-C(NH)-；R’選自鍵和C1-C6烷二基，并且Z²選自鍵、-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-、和-O-(C＝O)-；條件是Z¹和Z²其中一個不是鍵。關(guān)于L¹，最優(yōu)選Z¹和R’是鍵并且Z²是-(C＝O)-，或者Z¹是-NH-(C＝O)-，R’是C1-C6烷二基，并且Z²是-(C＝O)-。

A¹是優(yōu)選是關(guān)于式(II)的寡(亞烷基胺)基團本文限定的優(yōu)選實施方式中的一種，具體地是式(IIa)-(IId)基團中的一種。

在包含重復(fù)式(V)單元的優(yōu)選聚酰胺中，優(yōu)選全部聚合單元的5至100％是式(V)的單元，更優(yōu)選25至100％，特別是50至100％。該百分比根據(jù)式(V)單元相對于全部聚合單元的數(shù)量給出。在關(guān)于式(V)的變量給出的限定和優(yōu)選限定之內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選多聚體中的重復(fù)式(V)單元可以相同或不同。

特別優(yōu)選作為聚酰胺多聚體用于本發(fā)明的是式(Va)和(Vb)的多聚體。

在這些式中，R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹，L¹和A¹限定如式(V)——包括其優(yōu)選實施方式。R¹²選自O(shè)H或C1-C6烷氧基、-NH₂、聚(乙二醇)鏈、或受體配體。R¹³是H、氨基保護基團、聚(乙二醇)鏈、或受體配體，X¹選自H、-NH₂、-COOH和-COOR”——其中R”是C1-C6烷基、聚(乙二醇)鏈、或受體配體。在式(Va)中，s(表示聚合單元平均數(shù)，例如通過凝膠滲透色譜(GPC)確定)是10至10,000，優(yōu)選50至5,000。在式(Vb)中，括號中的單元是可在多聚體中以任何順序(包括具體地?zé)o規(guī)的、交替的或分塊的排列)排列的重復(fù)單元。q+r之和(表示聚合單元平均數(shù)，例如通過凝膠滲透色譜(GPC)確定)是10至10,000，優(yōu)選50至5,000，并且q/(q+r)的比的范圍為0.05至1，優(yōu)選0.25至1，更優(yōu)選0.5至1。

可被式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的側(cè)鏈常規(guī)修飾的示例性的優(yōu)選聚(氨基酸)是聚(谷氨酸)、聚(天冬氨酸)、聚賴氨酸、聚鳥氨酸或包含谷氨酸、天冬氨酸、鳥氨酸和/或賴氨酸單元的聚(氨基酸)。更優(yōu)選聚(谷氨酸)。

碳鏈骨架攜帶式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的側(cè)鏈的優(yōu)選多聚體包含重復(fù)的式(VI)單元：

其中變量具有下列含義：

R¹⁴和R¹⁵獨立地選自鍵和C1-C6烷二基；

R¹⁶選自H和C1-C6烷基；

R¹⁷選自鍵和C1-C6烷二基，

L²是二價連接基團，和

A¹表示式(II)的寡(亞烷基胺)基團。

優(yōu)選地，R¹⁴是鍵，并且R¹⁵是鍵或-CH₂-。更優(yōu)選地，R¹⁴是鍵，并且R¹⁵是-CH₂-。優(yōu)選地，R¹⁶選自H和甲基。R¹⁷優(yōu)選是鍵或-CH₂-。

連接基團L²在優(yōu)選實施方式中具有-Z³-R’-Z⁴-結(jié)構(gòu)，其中Z³選自鍵、-NH-(C＝O)-、-NH-C(S)-NH-、-NH-(C＝O)-NH-、-NH-S(O)₂-、-NH-CH₂-C(OH)-、-NH-(C＝O)-O-、-NH-C(NH)-、-S-S、-CH＝N-NH-(C＝O)-、-硫醚鍵-、-S-CH₂-(C＝O)-、-S-、-S-CH₂-CH-NH₂-、和-芳基硫醚鍵-；R’選自鍵、C1-C6烷二基和-(CH₂-CH₂-O)_n-H，其中n＝1-3；并且Z⁴選自鍵、-(C＝O)-、-NH-C(S)-、-NH-(C＝O)-、-S(O)₂-、-O-P(O)₂-、-CH(OH)-CH₂、-O-(C＝O)-和-C(NH)-。優(yōu)選地，Z³選自鍵、-NH-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-NH-、-NH-(C＝O)-O-、-NH-C(NH)-；R’選自鍵和C1-C6烷二基，并且Z⁴選自鍵、-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-、和-O-(C＝O)-；條件是Z³和Z⁴其中一個不是鍵。關(guān)于L²，最優(yōu)選Z³和R’是鍵，并且Z⁴是-(C＝O)-。

A¹優(yōu)選是關(guān)于式(II)的寡(亞烷基胺)基團本文限定的優(yōu)選實施方式中的一種，具體地是式(IIa)-(IId)基團中的一種。

在包含重復(fù)式(VI)單元的優(yōu)選聚酰胺中，優(yōu)選全部聚合單元的5至100％是式(VI)的單元，更優(yōu)選25至100％，特別是50至100％。該百分比根據(jù)式(VI)單元相對于全部聚合單元的數(shù)量給出。在關(guān)于式(VI)的變量給出的限定和優(yōu)選限定之內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選多聚體中的重復(fù)式(VI)單元可以相同或不同。

特別優(yōu)選作為其中碳鏈骨架攜帶式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的側(cè)鏈的多聚體的是式(VIa)和(VIb)的多聚體。

在這些式中，R¹⁴、R¹⁵、R¹⁶、R¹⁷、L²和A¹限定如式(VI)——包括其優(yōu)選實施方式。X²選自-COOH和-COOR”，其中R”是C1-C6烷基、聚(乙二醇)鏈、或受體配體。在式(VIa)中，s(表示聚合單元平均數(shù)，例如通過凝膠滲透色譜(GPC)確定)是10至10,000，優(yōu)選50至5,000。在式(VIb)中，括號內(nèi)的單元是可在多聚體中以任何順序(包括具體地?zé)o規(guī)的、交替的或分塊的排列)排列的重復(fù)單元。q+r之和(表示聚合單元平均數(shù)，例如通過凝膠滲透色譜(GPC)確定)是10至10,000，優(yōu)選50至5,000，并且q/(q+r)之比的范圍是0.05至1，優(yōu)選0.25至1，更優(yōu)選0.5至1。

示例性優(yōu)選的其中碳鏈骨架可被式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的側(cè)鏈常規(guī)修飾的多聚體是聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸或聚馬來酸，更優(yōu)選是聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸。

優(yōu)選的攜帶式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的側(cè)鏈的多糖包含重復(fù)的式(VII)單元：

其中變量具有下列含義：

R¹⁹和R²²獨立地選自鍵和-(CH)₂-；t是0或1；

并且R¹⁸、R²⁰和R²¹其中一個表示-L³-A¹，其中L³是二價連接基團并且A¹表示式(II)的寡(亞烷基胺)基團，并且其它的獨立地選自-H、-OH、和-(CH₂)_n-OH，其中n＝1或2。

優(yōu)選地，R¹⁹和R²²是鍵。優(yōu)選地，R¹⁸、R²⁰和R²¹其中一個表示-L³-A¹，其中L³是二價連接基團并且A¹表示式(II)的寡(亞烷基胺)基團，和其它的是-OH。

連接基團L³在優(yōu)選實施方式中具有-Z⁵-R’-Z⁶-結(jié)構(gòu)，其中Z⁵選自鍵、-NH-(C＝O)-、-NH-C(S)-NH-、-NH-(C＝O)-NH-、-NH-S(O)₂-、-NH-CH₂-C(OH)-、-NH-(C＝O)-O-、-NH-C(NH)-、-S-S、-CH＝N-NH-(C＝O)-、-硫醚鍵-、-S-CH₂-(C＝O)-、-S-、-S-CH₂-CH-NH₂-、和-芳基硫醚鍵-；R’選自鍵、C1-C6烷二基和-(CH₂-CH₂-O)_n-H，其中n＝1-3；并且Z⁶選自鍵、-(C＝O)-、-NH-C(S)-、-NH-(C＝O)-、-S(O)₂-、-O-P(O)₂-、-CH(OH)-CH₂、-O-(C＝O)-和-C(NH)-；條件是Z⁵和Z⁶其中一個不是鍵。優(yōu)選地，Z⁵選自鍵、-NH-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-NH-、-NH-(C＝O)-O-、-NH-C(NH)-；R’選自鍵和C1-C6烷二基和Z⁶選自鍵、-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-、和-O-(C＝O)-；條件是Z⁵和Z⁶其中一個不是鍵。關(guān)于L³，最優(yōu)選Z⁵和R’是鍵，并且Z⁶是-(C＝O)-。

A¹優(yōu)選是關(guān)于式(II)的寡(亞烷基胺)基團本文限定的優(yōu)選實施方式中的一種，具體地是式(IIa)-(IId)的基團。

在包含重復(fù)式(VII)單元的優(yōu)選多糖中，優(yōu)選全部聚合單元中的5至100％是式(VII)的單元，更優(yōu)選25至100％，特別是50至100％。該百分比根據(jù)式(VII)單元相對于全部聚合單元的數(shù)量給出。在關(guān)于式(VII)的變量的限定和優(yōu)選限定之內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選多聚體中的重復(fù)式(VII)單元可以相同或不同。

特別優(yōu)選作為攜帶式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的側(cè)鏈的多糖的是式(VIIa)的多聚體。

在此式中，R¹⁸、R¹⁹、R²⁰、R²¹、R²²和t限定如式(VII)——包括其優(yōu)選實施方式。s(表示聚合單元平均數(shù)，例如通過凝膠滲透色譜(GPC)確定)是10至10,000，優(yōu)選50至5,000。

其多糖骨架可被式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的側(cè)鏈常規(guī)地修飾的示例性多聚體是淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原、纖維素、葡聚糖、糊精、環(huán)糊精、幾丁質(zhì)、殼聚糖、菊粉、普魯蘭多糖(Pullulan)、硬葡聚糖、產(chǎn)堿桿菌多糖、胼胝質(zhì)(callose)、海帶多糖、金藻昆布多糖、木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、甘露聚糖、墨角藻聚糖和半乳甘露聚糖、蛋白聚糖、聚葡萄糖酸聚醣(polyglucuronan)、聚葡萄糖酸聚醣、纖維糖酸(cellouronic acid)、幾丁糖醛酸(chitouronic acid)、聚糖醛酸、果膠、葡萄糖胺聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質(zhì)酸瓊脂、海藻酸鈉、海藻酸、阿拉伯膠、卡拉膠、墨角藻聚糖、巖藻半乳聚糖、八乙酸殼二糖、十一乙酸殼三糖、麥芽糖寡糖。優(yōu)選殼聚糖、羥乙基淀粉、葡聚糖、糊精、環(huán)糊精(α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、和δ-環(huán)糊精)。

可經(jīng)修飾在其分支結(jié)構(gòu)中包含多個末端式(II)基團或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式基團的各種樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)在本領(lǐng)域是已知的并且被描述，例如聚酰胺基胺(PAMAM)(Tomalia等，1990，Angew.Chem.Int.Edn.Engl.29，138-175)或斷裂PAMAM(Tang等，1996，Bioconjug.Chem.7，703-714)、聚胺(Hawker等，1990，J.Am.Chem.Soc.112，7638-7647)、聚酰胺(多肽)(Sadler等，2002，J.Biotechnol.90，195-229)、聚(芳基醚)(Hawker等，1990，J.Am.Chem.Soc.112，7638-7647)、聚酯(Ihre等，1996，J.Am.Chem.Soc.118，6388-6395；Grinstaff等，2002，Chemistry 8，2838-2846)、碳水化合物(Turnbull等，2002，J.Biotechnol.90，231-255)、DNA(Nilsen等，1997，J.Theor.Biol.187，273-284；Li等，2004，Nat.Mater.3，38-42)、脂質(zhì)(Ewert等，2006，Bioconjug Chem.17，877-88)、聚(醚酰亞胺)(Thankappan等，2011，Bioconjug Chem.22，115-9.)、三嗪(Lim等，2012，Adv Drug Deliv Rev.15，826-35)和聚甘油(Fischer等，2010，Bioconjug Chem.21，1744-52)。

會理解，包括多個式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式基團作為末端基團的寡聚體還包括這樣的寡聚體：其中多個這種基團作為末端基團共價附接至多官能核結(jié)構(gòu)，該多官能核結(jié)構(gòu)提供適于附接多個式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式基團的官能團。這些多官能核結(jié)構(gòu)具體地包括二價、三價或更高價羧酸或聚胺。如需，為允許式(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式基團的基團附接，可使多官能核結(jié)構(gòu)的官能團用連接基團活化或與連接基團反應(yīng)?？杀恍揎椧詳y帶多個這種基團的示例性分支核結(jié)構(gòu)通過以下式(VIIIa-g)示例：

本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，包括基團(II)或包括式(IIa)-(IId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式作為側(cè)鏈和/或末端基團的多聚體或寡聚體可容易經(jīng)由各種合成途徑通過偶聯(lián)寡(亞烷基胺)至包括或經(jīng)修飾包括適于偶聯(lián)化學(xué)的官能團的多聚體骨架而獲得。這種官能團包括-COOH、-CO-、-CHO、-SO₃H、-PO₄H、-NH-、-NH₂、-OH、或-SH。會理解，還可以用式(II)基團修飾適當(dāng)?shù)膯误w——在其聚合前——以提供根據(jù)本發(fā)明的包含式(II)的側(cè)鏈和/或末端基團的多聚體或寡聚體。然而，總體上優(yōu)選多聚體修飾。

例如，包括羧酸基團的母體多聚體(即，提供根據(jù)本發(fā)明的多聚體中的多聚體骨架的多聚體)適于控制偶聯(lián)——在需要時通過活化，例如利用碳化二亞胺和隨后與以下式(前II)的寡(亞烷基胺)形成酰胺鍵(其中變量a、b、p、m、n和R²至R⁶限定如式(II))，以提供式(II)的側(cè)鏈和/或末端基團。

H-NR²{CH₂-(CH₂)_a-NR³-[CH₂-(CH₂)_b-NR⁴]_p}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NR⁵]_n-R⁶ (前II)。

如需，式(前II)化合物其一個或全部末端和/或中間的仲氨基可以有保護——利用常規(guī)的氨基保護基團，如例如WO 2006/138380描述的氨基保護基團，優(yōu)選叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、或芐氧羰基(Cbz)。

如果不期望有交聯(lián)反應(yīng)，這種反應(yīng)優(yōu)選在相對于母體多聚體的羧酸基團過量的式(前II)寡(亞烷基胺)的反應(yīng)性氨基存在的情況下進行。根據(jù)母體多聚體的性質(zhì)，偶聯(lián)反應(yīng)可在含水溶劑或有機溶劑中進行。適當(dāng)?shù)呐悸?lián)條件在肽和生物綴合物領(lǐng)域公知(Greg T.Hermanson，Bioconjugate Techniques，第2版，Academic Press 2008)。如上所述，適當(dāng)?shù)亩嗑垠w骨架包括但不限于，包括多個谷氨酸或天冬氨酸單元的聚(氨基酸)——如聚(谷氨酸)和聚(天冬氨酸)、蛋白質(zhì)、聚炔烴、聚胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚馬來酸、聚磺酸酯、聚苯乙烯磺酸酯、聚磷酸酯、聚硫酸戊聚糖、聚(乙烯基膦酸)、聚(丁二烯-共-馬來酸)、聚(丙烯酸乙酯-共-丙烯酸)、聚(乙烯-共-丙烯酸)、聚(乙烯-共-馬來酸酐)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸)、聚(苯乙烯磺酸-共-馬來酸)、聚(氯乙烯-共-乙酸乙烯酯-共-馬來酸)碳水化合物如肝素、硫酸乙酰肝素、聚(葡萄糖醛酸)、聚(半乳糖醛酸)、透明質(zhì)酸、一般的聚(糖醛酸)、或羧基封端的樹枝狀聚合物。

關(guān)于本發(fā)明的其它實施方式，可通過還原氨化母體多聚體獲得包括式(II)側(cè)鏈和/或末端基團的多聚體?？蓪⑻妓衔锘蛱茄趸扇?，然后與寡(亞烷基胺)反應(yīng)生成亞胺，該亞胺可利用例如氰基硼氫化鈉還原，生成胺。

關(guān)于本發(fā)明的另一進一步實施方式，可第一步將寡(亞烷基胺)衍生化，生成適于偶聯(lián)至母體多聚體的羥基和氨基的羧基封端的寡(亞烷基胺)——例如具有式(前II’)：

HOOC-(CH₂)_u-L’-NR²{CH₂-(CH₂)_a-NR³-[CH₂-(CH₂)_b-NR⁴]_p}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NR⁵]_n-R⁶

(前II’)，

其中u是1至6的整數(shù)，L’是鍵或-(CH)₂-，并且其它變量限定如式(II)。如需，式(前II)或(前II’)化合物的任何末端和/或內(nèi)部仲氨基可以利用常規(guī)氨基保護基團(如例如WO2006/138380所述，優(yōu)選叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、或芐氧羰基(Cbz))來保護。

為此，可使寡(亞烷基胺)與二羧酸酐、二羧酸或醛反應(yīng)，生成結(jié)構(gòu)(前II’)。即使不給寡(亞烷基胺)(前II)中的胺提供正交保護基團也可獲得結(jié)構(gòu)(前II’)，也優(yōu)選這樣做。結(jié)構(gòu)(前II’)允許通過直接偶聯(lián)修飾例如聚(賴氨酸)、聚(鳥氨酸)或聚(乙烯胺)，導(dǎo)致酰胺鍵形成。在偶聯(lián)反應(yīng)完成后，可通過常規(guī)方法去除任何保護基團。隨后可例如通過透析或離子交換或尺寸排阻或反相或疏水相互作用色譜純化所得多聚體。

可在胺保護基團被去除后并且在最后的偶聯(lián)步驟前(在樹枝狀聚合物情況下)通過沉淀、透析或尺寸排阻色譜純化中間體和最終產(chǎn)物。

包含多個重復(fù)式(III)或包括式(IIIa)-(IIId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式單元的多聚體或寡聚體可以是線性的、分支的、或交聯(lián)的多聚體、或樹枝狀多聚體(樹枝狀聚合物)。優(yōu)選地，包含多個重復(fù)式(III)或包括式(IIIa)-(IIId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式單元的多聚體或寡聚體包含至少25％，更優(yōu)選至少40％的這種重復(fù)單元——根據(jù)相對于多聚體或寡聚體的重復(fù)單元總數(shù)的式(III)單元數(shù)。尤其優(yōu)選包含多個重復(fù)式(III)或包括式(IIIa)-(IIId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式單元的多聚體或寡聚體中的全部重復(fù)單元的50％或更多是這種單元。其余重復(fù)單元通過允許重復(fù)式(III)或包括式(IIIa)-(IIId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式單元(具體地，衍生自二價、三價或更高價羧酸的單元)偶聯(lián)的分子來提供。

包含多個重復(fù)式(III)或包括式(IIIa)-(IIId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式單元的多聚體或寡聚體可以常規(guī)地利用式(前III)化合物獲得：

H-NR²{CH₂-(CH₂)_a-NR³-[CH₂-(CH₂)_b-NR⁴]_p}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NR⁵]_n-R⁶ (前III)，

其中“前”表示式(前III)是式(III)的前體，并且其中變量a、b、p、m、n和R²至R⁵限定如式(III)，和R⁶限定如式(II)——包括其優(yōu)選實施方式；或優(yōu)選利用式(前IIIa)-(前IIId)化合物獲得，其中變量分別限定如式(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)或(IIId)：

H-NR²{CH₂-(CH₂)_a-NR³-CH₂-(CH₂)_b-NR⁴}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NR⁵]_n-R⁶ (前IIIa)，

H-NR²-CH₂-(CH₂)_a-NR³-CH₂-(CH₂)_b-NR⁴-CH₂-(CH₂)_a-NR⁵-R⁶ (前IIIb)，

H-NR²-CH₂-CH₂-NR³-CH₂-CH₂-CH₂-NR⁴-CH₂-CH₂-NR⁵-R⁶ (前IIIc)，

H-NH-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH-H (前IIId)，

攜帶末端胺基團的這些化合物可利用常規(guī)偶聯(lián)反應(yīng)連接形成線性的、分支的、交聯(lián)的或樹枝狀多聚體?？稍谶@種偶聯(lián)反應(yīng)中用作反應(yīng)物的適當(dāng)化合物包括二價、三價或更高價羧酸。市售并且可分別與式(前III)、(前IIIa)、(前IIIb)、(前IIIc)和(前IIId)的連接體化合物反應(yīng)的示例性化合物通過以下式(VIIIa-g)示例：

雖然多價羧酸與二胺的直接反應(yīng)可通過常規(guī)技術(shù)實現(xiàn)，但會理解，連接體化合物不限于那些提供羧酸基團(或其活化形式)。例如，可在利用二羧酸如琥珀酸形成式(前III)化合物的二酰胺后，使式(VIIIg)化合物與式(前III)化合物反應(yīng)。

而且，可第一步將寡(亞烷基胺)衍生化，生成羧基封端的式(前III’)的寡(亞烷基胺)，例如如上文關(guān)于式(前II’)化合物的制備所述：

HOOC-(CH₂)_u-L”-NR²{CH₂-(CH₂)_a-NR³-[CH₂-(CH₂)_b-NR⁴]_p}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NR⁵]_n-R⁶(前III’)，

其中u是1至6的整數(shù)，L”是鍵或-(CH)₂-、并且其它變量限定如式(III)，和R⁶限定如式(II)。如需，可以利用常規(guī)氨基保護基團(如例如WO 2006/138380所述，優(yōu)選叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、或芐氧羰基(Cbz))保護式(前III’)化合物的任何內(nèi)部仲氨基。如果剩余的末端氨基基團-NR⁵R⁶以無保護形式/允許與羧酸基團形成酰胺的的形式存在，則式(前III’)化合物可多聚或寡聚，以提供包括多個式(III)或包括式(IIIa)-(IIId)在內(nèi)的優(yōu)選實施方式寡(亞烷基胺)基團作為重復(fù)單元的寡聚體或多聚體。這種多聚體可以是線性的或分支的。

例如，可利用結(jié)構(gòu)(前III’)通過無規(guī)聚合或以確定方式形成分支結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^碳化二亞胺活化，在寡(亞烷基胺)(內(nèi)部氨基任選地有保護)和聚羧酸(VIIIa-VIIIg)在含水或有機溶劑中的混合物中，原位激活共聚。

還可以制備包含多個式(III)或包括式(IIIa)-(IIId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式基團作為重復(fù)單元的樹枝狀聚合物——例如利用多價偶聯(lián)分子。樹枝狀聚合物是由從中央核徑向放射的多個完全分支單體(聯(lián)想到樹，其中樹枝狀聚合物顧名思義(Greek，dendra))構(gòu)成的多聚體分子。當(dāng)樹枝狀聚合物的核被去除時，多個相同片段(稱為樹突)仍在，樹突的數(shù)量取決于中央核的多重性(2、3、4個或更多)。樹突可細(xì)分成三個不同的部分：核、內(nèi)部(或枝)和周邊(或終端或末端基團)。從樹突核至其周邊向外移動時遇到的分支點的數(shù)量決定其代(generation)(G-1、G-2、G-3)；較高代的樹枝狀聚合物比較低代樹枝狀聚合物更大，分支更多，并且具有更多其周邊終端基團。

合成可以是發(fā)散的，造成指數(shù)樣生長；或收斂的，在這種情況下樹突分開生長并且在最后一步附接至核。樹枝狀聚合物以分步方式制備——類似于用于固相多肽和寡核苷酸合成的方法，因此產(chǎn)物的尺寸理論上是單分散性的，這與傳統(tǒng)多聚體合成(其中鏈生長是統(tǒng)計學(xué)，并且獲得多分散性產(chǎn)物)相反。不僅因為合成再現(xiàn)性，而且由于降低實驗和治療變化性，單分散性產(chǎn)物是非常期望的。在實踐中，對于低代樹枝狀聚合物(上至G-3)可容易獲得單分散性產(chǎn)物，但有時在較高代不能從具有結(jié)構(gòu)非常相似的細(xì)微瑕疵的樹枝狀聚合物純化完全樹枝狀聚合物導(dǎo)致絕對單分散性偏差，盡管一般是輕微的偏差。

作為根據(jù)本發(fā)明的包括多個式(III)或包括式(IIIa)-(IIId)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的寡(亞烷基)的多聚體，優(yōu)選的樹枝狀聚合物具有G1至G10范圍內(nèi)的多個代，更優(yōu)選G2-G8，特別是G3-G6。這些樹枝狀聚合物的分子量(其可基于反應(yīng)步驟混合的反應(yīng)物計算)優(yōu)選在1,500至1,000,000范圍內(nèi)，更優(yōu)選3,000至230,000，特別是6,000至60,000，最優(yōu)選15,000至30,000。

關(guān)于限定的聚(酰胺基胺)的生成，樹枝狀聚合物(有保護)結(jié)構(gòu)(前III)和/或(前III’)可用于分支核的分步產(chǎn)生，如文獻描述(例如Lee等，2005，Nat Biotechnol 23，1517-1526)。作為起始分子，可采用通過二羧酸、酐或丙烯酸或聚羧酸(例如VIIIa-VIIIg)活化的寡(烷基胺)(例如，前III)。利用該核，使其與結(jié)構(gòu)(前III)的寡(烷基胺)分步反應(yīng)，然后純化和通過例如丙烯酸活化末端氨基。在純化后，可利用該核添加另一層寡(亞烷基胺)。用于獲得樹枝狀聚合物的反應(yīng)條件已在文獻中得到詳細(xì)描述(參見例如，Lee等，同上和其中包含的參考文獻)。

根據(jù)進一步實施方式，兩端以羧基封端的寡(亞烷基胺)的一側(cè)可有保護和/或如需內(nèi)部胺可有保護，并且可與二胺或具有末端胺基團或具有寡(亞烷基胺)本身的樹枝狀起始結(jié)構(gòu)共聚。

中間體和最終產(chǎn)物可在去除胺保護基團后并且在最后的偶聯(lián)步驟(在樹枝狀聚合物情況下)前通過沉淀、透析或尺寸排阻色譜純化。

在另一進一步實施方式中，具有末端羧基基團(或其適當(dāng)保護或活化形式)和末端氨基基團(或其適當(dāng)保護形式)的寡(亞烷基胺)，例如式(前III’)的寡(亞烷基胺)，可用于完全確定的肽線性或分支結(jié)構(gòu)的分步產(chǎn)生，類似地如WO 2011/154331和(SCHaffert等，2011，Angew Chem Int Ed Engl 50(38)，8986-9)所述。分步反應(yīng)可根據(jù)肽化學(xué)原理進行，并且可在自動肽合成儀上進行。肽合成領(lǐng)域技術(shù)人員已知，二氨基酸，如賴氨酸或鳥氨酸，可用于構(gòu)建分支結(jié)構(gòu)。因此，可提供多種線性和分支均聚體，而且可提供在多聚體的期望位置包括不同的式(I)寡(亞烷基胺)的雜多聚體。另外，標(biāo)準(zhǔn)氨基酸可被引入這種確定結(jié)構(gòu)的任何位置。

關(guān)于式(IV)和包括式(IVa)、(IVb)和(IVc)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的類脂質(zhì)的制備，可采用類似于如下描述的方法：US 2010/0331234 A1、US 8,450,298；Love等，2010，PNAS 107，1864-1869；WO 2006/138380；Akinc等，2008，Nat Biotechnol 26，561-569。

例如，式(IV)和包括式(IVa)、(IVb)和(IVc)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的類脂質(zhì)可通過使R⁷-環(huán)氧化物或R⁷-O-(C＝O)-CH＝CH₂或R⁷-NH-(C＝O)-CH＝CH₂或R⁷-(C＝O)-H與如下式(前IV)的寡(亞烷基胺)反應(yīng)獲得：

H-NR²{CH₂-(CH₂)_a-NR³-[CH₂-(CH₂)_b-NR⁴]_p}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NR⁵]_n-R⁶ (前IV)，

其中變量a、b、p、m、n限定如式(IV)，并且R²至R⁶彼此獨立地是氫或氨基保護基團，R⁷選自C3-C18烷基或具有一個C-C雙鍵的C3-C18烯基。優(yōu)選地，R⁷是C8-C16烷基或烯基，更優(yōu)選C8-C12烷基或烯基，并且最優(yōu)選C10-C12烷基或烯基。有利地，多種一端以環(huán)氧、丙烯酸酯、丙烯酰胺或醛封端的脂肪族化合物是市售的。

優(yōu)選地，由如下寡(亞烷基胺)(前IV’)制備式(IV)的類脂質(zhì)：

H-NH-{CH₂-(CH₂)_a-NH-[CH₂-(CH₂)_b-NH]_p}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NH]_n-H (前IV’)；

更優(yōu)選地，式(前IV)的前體具有四個或更多個氨基。最優(yōu)選地，式(IV)的類脂質(zhì)由如下寡(亞烷基胺)(前IV”)制備：

H-NH-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH-H (前IV”)。

反應(yīng)可在50℃和90℃之間的升溫下有溶劑或無溶劑進行。適當(dāng)?shù)娜軇├缡荂H₂Cl₂、CH₂Cl₃、甲醇、乙醇、THF、己烷、甲苯、苯等。

本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，如下式(前IV’)的寡(亞烷基胺)中的氮

H-NH-{CH₂-(CH₂)_a-NH-[CH₂-(CH₂)_b-NH]_p}_m-[CH₂-(CH₂)_a-NH]_n-H (前IV’)，

可被提供以例如WO 2006/138380描述的正交保護基團。這種環(huán)境下的保護基團適于暫時阻擋式(前IV’)化合物中的一個或數(shù)個氮，使得反應(yīng)可選擇性地在相同分子中的其它無保護氮處進行。在反應(yīng)后，通過不影響相同分子內(nèi)連接至氮原子的其它殘基的化學(xué)反應(yīng)去除保護基團。正交保護基團是可通過特異性地影響給定分子內(nèi)的一類保護基團的化學(xué)反應(yīng)選擇性地去除的不同保護基團。例如，如實施例描述，式(前IV’)的寡(亞烷基胺)中的末端伯氨基可選擇性地用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保護基團保護，而內(nèi)部仲胺可用叔丁氧基羰基(Boc)保護基團保護。Fmoc基團通過堿，Boc保護基團通過酸，可被選擇性地去除?？赏ㄟ^色譜分離有保護和部分有保護的中間體。因此，通過正交保護基團的確定定位和/或選擇性去除，可以例如使式(前IV’)的寡(亞烷基胺)的內(nèi)部仲氨基的全部或部分或末端伯氨基的兩個效價的全部或部分與一端以環(huán)氧化物或丙烯酸酯或丙烯酰胺封端的脂肪族鏈選擇性地反應(yīng)。通過相同原理，可以將超過一個種類的R⁷-環(huán)氧化物或R⁷-O-(CO)-CH＝CH₂或R⁷-NH-(CO)-CH＝CH₂或R⁷-(CO)-H偶聯(lián)至給定的式(前IV’)寡(亞烷基胺)——其中“種類”指代烷基或是烯基方面和脂肪族鏈長度方面不同類型的殘基R⁷——和偶聯(lián)至末端環(huán)氧化物、丙烯酸酯、丙烯酰胺或醛。在這種反應(yīng)中式(前IV’)的寡(亞烷基胺)的衍生化程度可通過如現(xiàn)有技術(shù)描述的反應(yīng)物的化學(xué)計量來控制。在去除保護基團后，可利用氮原子的剩余效價附接胍基(-C(NH)-NH₂)、聚(乙二醇)鏈或受體配體?？赏ㄟ^沉淀、萃取或色譜純化式(IV)的類脂質(zhì)。基于可通過借助保護基團調(diào)控的分步反應(yīng)制備式(IV)的類脂質(zhì)和可通過反應(yīng)物的化學(xué)計量控制式(前IV’)的寡(亞烷基胺)的衍生化程度的選擇，本發(fā)明的類脂質(zhì)可包含伯、仲、叔和/或季胺、和其鹽。因此，通過合理設(shè)計衍生化程度使得式(IV)中的氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供適于結(jié)合和致密化并且保護RNA的式(IV)陽離子類脂質(zhì)，還可以調(diào)節(jié)類脂質(zhì)的pK_a值。此外，可調(diào)節(jié)pK_a值，使得式(IV)中的氮原子中的一個或多個可以在酸性pH下具有緩沖能力，并因此在內(nèi)吞性攝取到細(xì)胞中后可以發(fā)揮質(zhì)子海綿效應(yīng)。優(yōu)選地，式(IV)的類脂質(zhì)的pK_a值在3.0和9.0之間，更優(yōu)選至少一個pK_a值在5.0和8.0之間。

可偶聯(lián)至式(前IV’)的寡(亞烷基胺)以獲得式(IV)的類脂質(zhì)的脂肪族側(cè)鏈的最多個數(shù)是(p+1)xm+n+3，最少個數(shù)是1，其中p、m和n限定如式(IV)。優(yōu)選地，如果殘基R¹至R⁶都不是氫或-CH₂-CH(OH)-R⁷、-CH(R⁷)-CH₂-OH、-CH₂-CH₂-C(O)-O-R⁷、-CH₂-CH₂-C(O)-NH-R⁷或-CH₂-R⁷，則該脂肪族側(cè)鏈個數(shù)至少是2并且至多是(p+1)xm+n+2，并且優(yōu)選地，如果殘基R¹至R⁶其中一個是氨基保護基團或-C(NH)-NH₂或聚(乙二醇)鏈或受體配體，則該脂肪族側(cè)鏈個數(shù)至多是(p+1)xm+n+1。

根據(jù)本發(fā)明所采用的陽離子寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)的一個優(yōu)選但非限制性實例是通過如下制備的陽離子脂質(zhì)：混合100mg N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(0.623mmol)與575.07mg 1，2-環(huán)氧癸烷(3.12mmol，(N-1)等份，其中N是單位寡(亞烷基胺)中2x伯胺量加1x仲胺量)并在80℃在恒定振蕩下混合96h。這種陽離子寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)也被稱為類脂質(zhì)“C12-(2-3-2)”。在此和附加實施例提供關(guān)于這種脂質(zhì)(和根據(jù)本發(fā)明采用的其它陽離子寡聚體、多聚體或類脂質(zhì))的制備的進一步指導(dǎo)。

核酸

本發(fā)明的(藥物)組合物包括核酸，優(yōu)選RNA，還更優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA。

術(shù)語″核酸″包括天然存在的核酸類型的所有形式以及化學(xué)和/或酶促合成的核酸，并且還包括核酸類似物和核酸衍生物，如例如鎖定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、寡核苷酸硫代磷酸酯和磷酸三酯、嗎啉寡核苷酸、陽離子寡核苷酸(US 6017700 A、WO 2007/069092)、取代核糖寡核苷酸或硫代磷酸(phosphorothioates)。此外，術(shù)語″核酸″還指代包括核苷酸或核苷酸類似物的任何分子。關(guān)于本發(fā)明組合物包括的核酸的序列或尺寸沒有限制。核酸主要通過在本發(fā)明組合物遞送到達的生物學(xué)目標(biāo)處所要實現(xiàn)的生物學(xué)效果來限定。例如，在應(yīng)用于基因或核酸治療的情況下，核酸或核酸序列可通過下列限定：所要表達的基因或基因片段、或缺陷基因或任何基因目標(biāo)序列的有意取代或修復(fù)、或抑制、敲除或下調(diào)的基因目標(biāo)序列。

優(yōu)選地，術(shù)語″核酸″指代寡核苷酸或多核苷酸，包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。關(guān)于RNA，原則上任何類型的RNA可用于本發(fā)明環(huán)境。在一個優(yōu)選實施方式中，RNA是單鏈RNA。相對于兩個或更多個單獨鏈因單獨鏈雜交而形成雙鏈分子的RNA分子，術(shù)語“單鏈RNA”意為核糖核苷酸單連續(xù)鏈。術(shù)語“單鏈RNA”不排除單鏈分子本身形成雙鏈結(jié)構(gòu)，如環(huán)、二級或三級結(jié)構(gòu)。

術(shù)語“RNA”涵蓋編碼氨基酸序列的RNA以及不編碼氨基酸序列的RNA。已提出基因組中超過80％包含不編碼蛋白質(zhì)的功能性DNA元件。這些非編碼序列包括調(diào)控型DNA元件(轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)節(jié)因子和共調(diào)節(jié)因子等的結(jié)合位點)和編碼不翻譯成蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄體的序列。被基因組編碼并且轉(zhuǎn)錄到RNA中但不被翻譯成蛋白質(zhì)的這些轉(zhuǎn)錄體被稱為非編碼RNA(ncRNA)。因此，在一個實施方式中，RNA是非編碼RNA。優(yōu)選地，非編碼RNA是單鏈分子。研究證明，ncRNA在基因調(diào)控、維持基因組完整性、細(xì)胞分化、和發(fā)育中具有重要作用，并且在多種人類疾病中其被誤調(diào)。有不同類型的ncRNA：短型(20-50nt)、中型(50-200nt)、和長型(＞200nt)ncRNA。短型ncRNA包括微RNA(miRNA)、小干擾RNA(siRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、和轉(zhuǎn)錄起始RNA(tiRNA)。中型ncRNA的實例是小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)、錄起始位點相關(guān)RNA(TSSaRNA)、啟動子相關(guān)小RNA(PASR)、和啟動子上游轉(zhuǎn)錄體(PROMPT)。長型非編碼RNA(lncRNA)包括長型基因間非編碼RNA(lincRNA)、反義lncRNA、內(nèi)含子lncRNA、轉(zhuǎn)錄超保守RNA(T-UCR)、和其它(Bhan A，Mandal SS，ChemMedChem.2014Mar 26.doi：10.1002/cmdc.201300534)。在上述非編碼RNA中，僅siRNA是雙鏈的。因此，由于在優(yōu)選實施方式中非編碼RNA是單鏈的，優(yōu)選非編碼RNA不是siRNA。在另一實施方式中，RNA是編碼RNA，即，編碼氨基酸序列的RNA。這種RNA分子也被稱為mRNA(信使RNA)，并且是單鏈RNA分子。核酸可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的合成化學(xué)和酶促方法、或通過利用重組技術(shù)制備，或可從天然來源分離，或其組合。寡核苷酸或多核苷酸可以任選地包括非天然核苷酸，并且可以是單鏈或雙鏈或三鏈的。“核酸”還指代正義和反義寡核苷酸或多核苷酸，即與DNA和/或RNA中的具體核苷酸序列互補的核苷酸序列。

優(yōu)選地，術(shù)語核酸指代mRNA，最優(yōu)選指代修飾的mRNA。

信使RNA(mRNA)是由磷酸核苷構(gòu)建模塊構(gòu)建的多聚體——其中腺苷、胞苷、尿苷和鳥苷主要作為核苷，其作為中間載體將細(xì)胞核中DNA的遺傳信息帶入細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中被翻譯成蛋白質(zhì)。因此其適合作為用于基因表達的替代選擇。

在本發(fā)明環(huán)境中，mRNA應(yīng)被理解意為任何這樣的多核糖核苷酸分子：如果其進入細(xì)胞，則適合用于蛋白質(zhì)或其片段的表達，或可翻譯成蛋白質(zhì)或其片段。術(shù)語“蛋白質(zhì)”在此包括任何種類的氨基酸序列，即兩個或更多個氨基酸的鏈——其中每個氨基酸通過肽鍵連接，并且還包括肽和融合蛋白。

mRNA包含編碼在細(xì)胞中或在細(xì)胞附近的功能是有需要的或有益的蛋白質(zhì)或其片段(例如，其缺失或缺陷形式是疾病或病癥的觸發(fā)事件的蛋白質(zhì))的核糖核苷酸序列——提供其可緩解或預(yù)防疾病或病癥；或可在細(xì)胞或其附近促進對身體有益的過程的蛋白質(zhì)。mRNA可以包含完全蛋白質(zhì)或其功能性變體的序列。進一步，核糖核苷酸序列可編碼充當(dāng)因子、誘導(dǎo)劑、調(diào)控劑、刺激劑或酶、或其功能性片段的蛋白質(zhì)，其中這種蛋白質(zhì)是其功能是治療障礙(具體地，代謝障礙)或啟動體內(nèi)過程如新血管、組織等形成所必需的蛋白質(zhì)。在此，功能性變體被理解意為在細(xì)胞中可擔(dān)負(fù)蛋白質(zhì)(其在細(xì)胞中的功能被需要或其缺失或缺陷形式具有病原性)的功能的片段。另外，mRNA還可以具有進一步的功能性區(qū)域和/或3’或5’非編碼區(qū)域。3’和/或5’非編碼區(qū)域可以是天然在蛋白質(zhì)編碼序列側(cè)翼的區(qū)域或有助于RNA穩(wěn)定化的人工序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過常規(guī)實驗確定在每種情況下于此合適的序列。

在優(yōu)選實施方式中，mRNA包含m7GpppG帽、內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)和/或3’端多A尾——具體地，為提高翻譯。mRNA可具有進一步的促進翻譯的區(qū)域。

在優(yōu)選實施方式中，mRNA是包含修飾的和未修飾的核苷酸的組合的mRNA。優(yōu)選地，其是包含WO 2011/012316描述的修飾的和未修飾的核苷酸的組合的mRNA。這種mRNA也被稱為和冠以商品名為WO 2011/012316描述的mRNA據(jù)報告顯示增加的穩(wěn)定性和減弱的免疫原性。在優(yōu)選實施方式中，在這種修飾的mRNA中，5至50％的胞苷核苷酸和5至50％的尿苷核苷酸是修飾的。含腺苷和含鳥苷的核苷酸可以是未修飾的。腺苷和鳥苷核苷酸可以是未修飾的或部分修飾的，并且其優(yōu)選以未修飾的形式存在。優(yōu)選10至35％的胞苷和尿苷核苷酸是修飾的，特別優(yōu)選修飾胞苷核苷酸的含量在7.5至25％范圍內(nèi)，并且修飾尿苷核苷酸的含量在7.5至25％范圍內(nèi)。已發(fā)現(xiàn)，事實上相對低含量(例如僅各10％)的修飾胞苷和尿苷核苷酸就可實現(xiàn)期望的特性。特別優(yōu)選修飾胞苷核苷酸是5-甲基胞苷殘基，并且修飾尿苷核苷酸是2-硫代尿苷殘基。最優(yōu)選地，修飾胞苷核苷酸的含量和修飾尿苷核苷酸的含量分別是25％。

在另一優(yōu)選實施方式中，為使期望的mRNA僅在相關(guān)細(xì)胞中活動，可以使mRNA與目標(biāo)結(jié)合位點、靶向序列和/或微RNA結(jié)合位點組合。在進一步優(yōu)選實施方式中，RNA可與微RNA或3’多A尾下游的shRNA組合。

此外，術(shù)語″核酸″可以指代DNA或RNA或其混合物或現(xiàn)有技術(shù)中已知的其任何修飾(修飾實例參見，例如，US 8278036、WO 2013/052523、WO 2011/012316、US 5525711、US 4711955、US 5792608或EP 302175、(Lorenz等，2004，Bioorg Med Chem Lett，14，4975-4977；SoutsCHek等，2004，Nature，432，173-178))。這種核酸分子(一種或多種)是單鏈或雙鏈的，線性或環(huán)狀的，天然或合成的，并且沒有任何尺寸限制。例如，核酸分子(一種或多種)可以是基因組DNA、cDNA、mRNA、反義RNA、核酶、或小干擾RNA(siRNA)、微RNA、拮抗劑、或短發(fā)夾RNA(shRNA)、tRNA或長雙鏈RNA或編碼這種RNA的DNA構(gòu)建物或嵌合體(Chimeraplasts)(Colestrauss等，1996，Science，273，1386-1389)、或適體(aptamers)、聚集的規(guī)律性相互間隔短回文重復(fù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)(用于RNA導(dǎo)向的位點特異性DNA切割的“CRISPR”)(Cong等，2013，Science，339，819-823)、或RNA和DNA。所述核酸分子(一種或多種)可以是質(zhì)粒、粘粒、人工染色體、病毒DNA或RNA、噬菌體DNA、編碼和非編碼單鏈的(mRNA)或雙鏈RNA和寡核苷酸(一種或多種)的形式，其中包括糖骨架和/或堿基的任何上述現(xiàn)有技術(shù)修飾和3’-或5’-修飾。在特別優(yōu)選實施方式中，核酸是RNA，更優(yōu)選mRNA或siRNA，還更優(yōu)選mRNA。

核酸(一種或多種)可以包含編碼在目標(biāo)細(xì)胞中所要表達的多肽的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法可用于構(gòu)建重組核酸分子；參見，例如，Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)N.Y.和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)描述的技術(shù)。

在優(yōu)選實施方式中，所述核酸是治療或藥物活性核酸，包括所有上述核酸類型和修飾和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可以具有治療或預(yù)防效果的那些。因此，所述核酸可以用于基因治療和相關(guān)應(yīng)用。在這種環(huán)境下，根據(jù)本發(fā)明，可以利用RNA代替常用的DNA(例如pDNA)?？傮w上，治療或預(yù)防效果可通過核酸與細(xì)胞分子和細(xì)胞器的相互作用來實現(xiàn)。這種相互作用獨自可以例如活化先天免疫系統(tǒng)，正如被設(shè)計與toll樣和其它胞外或胞內(nèi)受體特異性相互作用的某些CpG寡核苷酸和序列。此外，核酸在細(xì)胞中的攝取或引入可意在導(dǎo)致核苷酸序列(如核酸包括的基因)表達，可意在因胞內(nèi)存在引入的外源核酸而導(dǎo)致的內(nèi)源基因表達下調(diào)、沉默或敲除，或可意在內(nèi)源核酸序列修飾，如選定的內(nèi)源核酸序列的堿基或整段的修復(fù)、切除、插入或交換，或可意在因引入的外源核酸的胞內(nèi)存在和相互作用而導(dǎo)致的基本上任何細(xì)胞過程的干擾。引入的外源核酸的過表達可以意在彌補或補充內(nèi)源基因表達，具體地在內(nèi)源基因缺陷或沉默，導(dǎo)致無基因表達產(chǎn)物、基因表達產(chǎn)物不足或缺陷或功能失調(diào)的情況下，正如很多代謝和遺傳疾病，諸如囊性纖維化、血友病或肌營養(yǎng)不良列為幾例。引入的外源核酸的過表達還可以意在使表達產(chǎn)物與下列相互作用或干擾下列：任何內(nèi)源細(xì)胞過程，如基因表達調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和其它細(xì)胞過程。引入的外源核酸的過表達還可以意在在轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞駐留或迫使轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞駐留的生物體環(huán)境中產(chǎn)生免疫響應(yīng)。實例是抗原呈遞細(xì)胞如樹枝狀細(xì)胞的遺傳修飾——為使其呈遞疫苗接種目的的抗原。其它實例是細(xì)胞因子在腫瘤中的過表達，從而引起腫瘤特異性免疫響應(yīng)。此外，引入的外源核酸的過表達還可以意在生成用于細(xì)胞治療的體內(nèi)或離體的暫時遺傳修飾的細(xì)胞，如用于再生藥物的修飾的T細(xì)胞或前體或干細(xì)胞或其它細(xì)胞。

治療目的的內(nèi)源基因表達下調(diào)、沉默或敲除可例如通過利用核酶、反義寡核苷酸、tRNA、長雙鏈RNA進行的RNA干擾(RNAi)實現(xiàn)，其中這種下調(diào)可以是序列特異性或非特異性的，并且還可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，正如長雙鏈RNA被引入細(xì)胞時。內(nèi)源或預(yù)先存在的基因表達的下調(diào)、沉默或敲除可有效用于獲得性、遺傳性或自發(fā)性疾病(包括病毒感染和癌癥)的治療。還可設(shè)想，核酸在細(xì)胞中的引入可作為預(yù)防措施來實踐，以預(yù)防例如病毒感染或瘤。內(nèi)源基因表達的下調(diào)、沉默或敲除可在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上施加。多種機制是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且包括例如表觀遺傳修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化、轉(zhuǎn)錄因子通過引入的核酸選擇性結(jié)合、引入的核酸與基因組DNA、mRNA或其它RNA種類中的互補序列通過堿基配對(包括非常規(guī)堿基配對機制，如三螺旋形成)雜交。類似地，基因修復(fù)、堿基或序列變化可在基因組水平和在mRNA水平實現(xiàn)——包括外顯子跳躍(exon skipping)。堿基或序列變化可例如通過如下實現(xiàn)：通過RNA導(dǎo)向的位點特異性DNA切割；通過利用反式剪接、反式剪接核酶、嵌合體、剪接體介導(dǎo)的RNA反式剪接的剪切和粘貼機制，或通過利用基團II或重靶向內(nèi)含子，或通過利用病毒介導(dǎo)的插入誘變，或利用靶向基因組插入——利用原核生物、真核生物或病毒整合酶系統(tǒng)。由于核酸是活體系統(tǒng)構(gòu)建方案的載體并且由于其以直接和間接方式參與很多細(xì)胞過程，理論上任何細(xì)胞過程都可受到核酸從外部引入細(xì)胞的影響。注意，這種引入可直接在體內(nèi)進行和在細(xì)胞或器官培養(yǎng)中離體進行進行然后將由此修飾的器官或細(xì)胞移植入接受者。本發(fā)明的核酸絡(luò)合物作為活性劑可以有效用于所有上述目的。

組合物或分別的藥物組合物(其包括組合物)

如上文公開，根據(jù)本發(fā)明的組合物和分別的藥物組合物包括核酸和陽離子劑——如例如PEI或包括寡(亞烷基胺)的組分，該組分選自：

a)包括多個式(II)基團作為側(cè)鏈和/或作為末端基團的寡聚體或多聚體：

其中變量a、b、p、m、n和R²至R⁶限定如上——包括優(yōu)選實施方式，具體地是優(yōu)選的式(IIa)-(IId)基團；并且其中式(II)所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供式(II)的陽離子基團；

b)包括多個式(III)基團作為重復(fù)單元的寡聚體或多聚體：

其中變量a、b、p、m、n和R²至R⁵限定如上——包括優(yōu)選實施方式，具體地是優(yōu)選的式(IIIa)-(IIId)基團；并且其中式(III)所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供式(III)的陽離子基團；或

c)具有式(IV)結(jié)構(gòu)的類脂質(zhì)：

其中變量a、b、p、m、n和R1至R6限定如上——包括優(yōu)選實施方式，具體地是優(yōu)選的式(IVa)-(IVc)結(jié)構(gòu)；并且其中式(IV)所示氮原子中的一個或多個可被質(zhì)子化以提供式(IV)的陽離子基團。

本發(fā)明還包括由下列組成(或包括下列)的(藥物)組合物：RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)和陽離子劑(諸如PEI或選自本文限定的組分a)至c)(包括其優(yōu)選實施方式)的包括寡(亞烷基胺)的組分)。(藥物)組合物還可以包括進一步的組分，例如脂質(zhì)制劑組分和/或在RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)遞送到細(xì)胞和/或組織(一個或多個)和到細(xì)胞和/或組織(一個或多個)中期間發(fā)揮效應(yīng)器功能的組分。

會理解，根據(jù)本發(fā)明的(藥物)組合物總體上提供RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)與諸如PEI或寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)的陽離子劑和任選的進一步組分的結(jié)合，該進一步組分以有限的實體(finite entity)結(jié)合，穩(wěn)定到足以在應(yīng)用期間，例如在期望的RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)遞送途徑期間，維持所述組分大部分的結(jié)合，直到到達生物學(xué)目標(biāo)或生物學(xué)目標(biāo)周圍。

由于根據(jù)本發(fā)明的諸如PEI或寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)的陽離子劑中存在可質(zhì)子化氨基，這些陽離子劑可以包括陽離子電荷(例如在式(II)或(III)基團中或在式(IV)結(jié)構(gòu)中)，使得其在存在質(zhì)子的情況下，例如在水或水溶液中、或在存在供質(zhì)子酸的情況下形成陽離子，一般是包含多個陽離子部分的寡陽離子或聚陽離子。因此，優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的(藥物)組合物包含下列或由下列組成：RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)和根據(jù)本發(fā)明的陽離子劑的絡(luò)合物。換句話說，在本發(fā)明環(huán)境中采用的RNA和陽離子劑可以形成絡(luò)合物。會理解，在這種絡(luò)合物中陽離子劑和陰離子核酸總體上通過靜電相互作用結(jié)合。然而，根據(jù)該試劑和RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)的具體結(jié)構(gòu)，其它吸引性相互作用也可以參與穩(wěn)定化絡(luò)合物，包括氫鍵和共價鍵。根據(jù)本發(fā)明的絡(luò)合物的非限制實例是脂質(zhì)體或脂質(zhì)絡(luò)合物或被包含在脂質(zhì)體或脂質(zhì)絡(luò)合物內(nèi)。陽離子劑分別可以是陽離子類脂質(zhì)或脂質(zhì)。

在具體方面，RNA和陽離子劑——例如絡(luò)合物形式，如脂質(zhì)體或脂質(zhì)絡(luò)合物——可以是(配制成)NP，或可以被包含在NP內(nèi)。這種NP可以進一步包括(a)進一步組分(一種或多種)，如一種或多種“助劑脂質(zhì)”，例如一種或多種助劑脂質(zhì)，如本文其它部分描述。NP是直徑約1-1000nm，優(yōu)選約5-900nm，的顆粒。

在另一具體方面，RNA和陽離子劑——例如絡(luò)合物形式，如脂質(zhì)體或脂質(zhì)絡(luò)合物——可以配制成MP(也被稱為微球)，或可被包含在MP內(nèi)。這種MP可以(進一步)包括聚乳酸，或可以是聚乳酸MP。根據(jù)本發(fā)明的聚乳酸的非限制性但優(yōu)選的實例是聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。優(yōu)選但非限制性的MP是RNA、陽離子劑和聚乳酸(例如PLGA)配制成MP。在更具體方面，本文限定的NP被包含在本文限定的MP內(nèi)。類似的方法已知用于口服給予DNA，并且被命名為“微球口服系統(tǒng)中納米顆粒”(NiMOS；Bhavsar同上)。原則上，NiMOS也可以適用于本發(fā)明環(huán)境，然而，則要采用RNA代替DNA。MP是直徑約1-1000μm，優(yōu)選2-1000μm，的顆粒。

技術(shù)人員能夠容易地生產(chǎn)和配制根據(jù)本發(fā)明的絡(luò)合物、NP和MP。在此環(huán)境中，技術(shù)人員可依靠本文描述的手段和方法和附加實施例。此外，技術(shù)人員可依靠Bhavsar同上。例如，NP可以在混合陽離子劑和RNA(和任選地一種或多種助劑脂質(zhì))時被生產(chǎn)/配制。各自的比例的實例被描述于本文其它部分。同樣，MP可以在混合陽離子劑和RNA(和任選地一個或多個助劑脂質(zhì))、包括其的或NP與MP材料(例如本文描述的聚乳酸)時被/被配制。各自的比例的實例同樣被描述于本文其它部分。

在本發(fā)明的(藥物)組合物中，陽離子劑和RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)可例如以0.25/1-50/1，優(yōu)選0.5/1-30/1，更優(yōu)選1/1-20/1的寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)重量/核酸重量的比(w/w)被包含。

更優(yōu)選地，在(藥物)組合物包含RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)和根據(jù)本發(fā)明的陽離子劑的絡(luò)合物的情況下，可以考慮相互電荷中和程度來選擇該試劑和RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)在本發(fā)明的(藥物)組合物中的相對比。在通過RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)與陽離子劑的絡(luò)合物進行的RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)遞送中，總體上，將至少導(dǎo)致RNA負(fù)電荷的電荷中和，優(yōu)選導(dǎo)致RNA負(fù)電荷過度補償，的陽離子劑量與給定量RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)混合。

陽離子劑和RNA之間的適當(dāng)比例可容易通過凝膠遲滯試驗、熒光淬滅方法如溴化乙錠置換/猝滅測定，通過顆粒尺寸設(shè)定和ζ電位測量確定。試劑類(agentoid)和RNA之間的可用比例通常特征在于與陽離子劑的絡(luò)合物包含的RNA在經(jīng)歷瓊脂糖凝膠電泳時至少部分遲滯，優(yōu)選完全遲滯；染料如溴化乙錠、RiboGreen或YOYO在插入RNA時高度熒光淬滅；或由混合劑和RNA形成(納米)顆粒。關(guān)于化學(xué)明確定義的陽離子，計算N/P比是選擇和限定該試劑和RNA的相對比的適合因素。例如，N/P比指定在本發(fā)明的(藥物)組合物中本發(fā)明的寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)的式(II)(或其優(yōu)選實施方式)基團、式(III)(或其優(yōu)選實施方式)基團或式(IV)(或其優(yōu)選實施方式)結(jié)構(gòu)中的可質(zhì)子化氮原子相對于磷酸基的摩爾比。N/P比是表征這種RNA與陽離子媒介的絡(luò)合物的已建立參數(shù)，并且技術(shù)人員讀者會理解例如酰胺鍵中的氮原子不算作可質(zhì)子化氮原子。在陽離子寡聚體或多聚體的情況下，可例如根據(jù)下式常規(guī)計算N/P比：

其中w_p是寡聚體或多聚體的重量，n是每個重復(fù)單元的可質(zhì)子化氨基數(shù)量，M_wp是重復(fù)單元(包括反離子)的分子量，w_na是RNA的重量，和M_堿基是RNA中的核苷酸的平均分子量——在RNA情況下是346。在根據(jù)本發(fā)明的用于RNA遞送的二元聚陽離子/RNA絡(luò)合物中，應(yīng)優(yōu)選采用這樣的陽離子劑相對于RNA的相對量：提供的N/P比導(dǎo)致最終二元(藥物)組合物的正ζ電位。關(guān)于包括式(IV)類脂質(zhì)和RNA的(藥物)組合物，可考慮類脂質(zhì)中可質(zhì)子化氮原子的數(shù)量和組合物所用類脂質(zhì)的摩爾數(shù)來常規(guī)地計算N/P比。在本發(fā)明環(huán)境中，關(guān)于本發(fā)明的二元(藥物)組合物，優(yōu)選1至100的N/P比，更優(yōu)選3至60的N/P比，并且最優(yōu)選4至44的N/P比。

根據(jù)本發(fā)明的(藥物)組合物任選地包括脂質(zhì)制劑的進一步組分。例如，包括陽離子劑(如式(IV)或包括式(IVa)至(IVc)在內(nèi)的其優(yōu)選實施方式的類脂質(zhì))的(藥物)組合物可以包括進一步的脂質(zhì)，如膽固醇、DOPE、DOPC、DSPC、DPPC、DPG(例如DPG-PEG，如DPG-PEG 2k)或DMG(例如DMG-PEG200)，其科學(xué)文獻中被稱為“助劑脂質(zhì)”；和/或PEG化脂質(zhì)(例如DMG-PEG200、DMPE-PEG)或可用于制備脂質(zhì)絡(luò)合物的任何其它脂質(zhì)。在本發(fā)明環(huán)境中優(yōu)選的助劑脂質(zhì)是DSPC、DPPC、膽固醇、DMG(例如DMG-PEG200)和DPG(例如DPG-PEG，如DPG-PEG 2k)。在某些實施方式中，包含類脂質(zhì)的組合物為約40-60％類脂質(zhì)、約40-60％膽固醇、和約5-20％PEG-脂質(zhì)(以基于組合物總重量的重量百分比表示)。在某些實施方式中，包含類脂質(zhì)的組合物為約50-60％類脂質(zhì)、約40-50％膽固醇、和約5-10％PEG-脂質(zhì)。在某些實施方式中，包含類脂質(zhì)的組合物為約50-75％類脂質(zhì)、約20-40％膽固醇、和約1-10％PEG-脂質(zhì)。在某些實施方式中，包含類脂質(zhì)的組合物為約60-70％類脂質(zhì)、約25-35％膽固醇、和約5-10％PEG-脂質(zhì)。組合物可以通過本領(lǐng)域已知的任何手段提供(例如，如Akinc等，2007，Nat Biotech，26，561-569；Akinc等，2009，Mol Ther，17，872-9；Love等，2010，PNAS，107，1864-9；US 8,450,298、WO2006/138380描述)。RNA/類脂質(zhì)絡(luò)合物可以形成可用于將RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)遞送至細(xì)胞中的顆粒。多種類脂質(zhì)分子可以與RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)分子結(jié)合。例如，絡(luò)合物可以包括1-100個類脂質(zhì)分子、1-1,000個類脂質(zhì)分子、10-1,000個類脂質(zhì)分子、或100-10,000個類脂質(zhì)分子。(m)RNA和類脂質(zhì)的絡(luò)合物可以形成顆粒。顆粒直徑可以在例如10-1,200nm范圍內(nèi)，更優(yōu)選顆粒直徑在10-500nm范圍內(nèi)，最優(yōu)選20-150nm。

本發(fā)明的組合物任選地包括在RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)遞送到細(xì)胞和到細(xì)胞中期間發(fā)揮效應(yīng)器功能的組分。這種組分可以是但不限于聚陰離子、上述脂質(zhì)、非本文其它部分特別限定的所用陽離子劑(包括陽離子肽、遮蔽寡聚體或多聚體)的聚陽離子、泊洛沙姆(也被稱為普朗尼克)、泊洛沙胺、靶向配體、內(nèi)含體溶解劑、細(xì)胞滲透和信號肽、磁性和非磁性納米顆粒、RNA酶抑制劑、熒光染料、用于醫(yī)療成像的放射性同位素或?qū)Ρ葎?。術(shù)語“效應(yīng)器功能”包括支持在生物學(xué)目標(biāo)或生物學(xué)目標(biāo)周圍之處或之中實現(xiàn)組合物的RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)的目的生物學(xué)效果的任何功能。例如，用于核酸遞送的組合物已被配制以包括非編碼核酸或非核酸聚陰離子作為素材(Kichler等，2005，J Gene Med，7，1459-1467)。這種素材適于減少具有目的生物學(xué)效果的核酸的劑量，同時維持在不存在這種素材時以較高核酸劑量獲得的那種規(guī)?；虺潭鹊男Ч?。非核酸聚陰離子還已被用于以減少的毒性獲得延長的體內(nèi)基因表達(Uchida等，2011，J Control Release，155，296-302)。本發(fā)明的組合物還可包括陽離子、陰離子或中性脂質(zhì)，如脂質(zhì)多聚絡(luò)合物(Li和Huang，“Nonviral Vectors for Gene Therapy”，Academic Press 1999，第13章，295-303)。脂質(zhì)多聚絡(luò)合物可以有利地由下列制備：PEI(具體地，brPEI)、或相應(yīng)于由本發(fā)明的式(II)和(III)的多聚體——并且類脂質(zhì)相應(yīng)于本發(fā)明的式(IV)。此外，本發(fā)明的組合物可包括非本發(fā)明環(huán)境中描述的陽離子劑的寡陽離子或聚陽離子。這種另外的聚陽離子可有效用于實現(xiàn)期望程度的核酸致密化或在聚陽離子肽情況下可具有核定位信號功能，如此前描述(Ritter等，2003，J Mol Med，81，708-717)。遮蔽多聚體，如聚(乙二醇)(PEG)，也可被包含在本發(fā)明的組合物中，并且常用于穩(wěn)定化多聚絡(luò)合物和脂質(zhì)絡(luò)合物，以免在生物學(xué)環(huán)境中的聚集和/或不期望的相互作用(調(diào)理作用)，例如與血清組分、血液細(xì)胞或胞外基質(zhì)的相互作用。遮蔽還可適于降低含核酸組合物的毒性(Finsinger等，2000，Gene Ther，7，1183-1192)。遮蔽多聚體，如PEG，可直接共價偶聯(lián)至本發(fā)明的多聚體或類脂質(zhì)。偶聯(lián)可在多聚體骨架中實現(xiàn)，若可行，優(yōu)選偶聯(lián)至多聚體骨架或樹枝狀聚合物的末端。然而，可例如還實現(xiàn)與式(II)、(III)和(IV)的氨基的偶聯(lián)。

聚乙烯基衍生物，如PVP和泊洛沙姆，已被發(fā)現(xiàn)通過肌內(nèi)注射可用于增強轉(zhuǎn)染(Mumper等，1996，Pharm Res，13，701-709；Lemieux等，2000，GeneTher，7，986-991)，并且因此可用于被包含在本發(fā)明的組合物中。

用于核酸遞送的組合物中包含的包括抗體的靶向配體可用于優(yōu)先并且提高的目標(biāo)細(xì)胞轉(zhuǎn)染(Philipp和Wagner，“Gene and Cell Therapy-Therapeutic Mechanisms and Strategy”，第3版，第15章，CRC Press，Taylor&Francis Group LLC，Boca Raton 2009)。靶向配體可以是以直接或間接方式賦予本發(fā)明組合物以目標(biāo)識別和/或目標(biāo)結(jié)合功能的任何化合物。最概括而言，目標(biāo)是靶向配體通過分子相互作用可特異性結(jié)合的獨特生物學(xué)結(jié)構(gòu)，并且其中這種結(jié)合最終導(dǎo)致組合物包含的核酸優(yōu)先在目標(biāo)組織中和/或在目標(biāo)細(xì)胞處或在目標(biāo)細(xì)胞中累積。類似于PEG鏈，靶向配體可偶聯(lián)至多聚體骨架或樹枝狀聚合物的末端。然而，還可實現(xiàn)至式(II)、(III)和(IV)的基團的偶聯(lián)。

此外，內(nèi)含體溶解劑如內(nèi)含體溶解肽(Plank等，1998，Adv Drug Deliv Rev，34，21-35)或適于增強內(nèi)吞核酸的內(nèi)含體釋放的任何其它化合物是本發(fā)明的組合物的有用組分。類似地，細(xì)胞滲透肽(在其它環(huán)境中也被稱為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)(Lindgren等，2000，Trends Pharmacol Sci，21，99-103)可以是本發(fā)明的組合物的有用組分，以介導(dǎo)核酸的胞內(nèi)遞送。所謂TAT肽落入此類，并且也具有核定位功能(Rudolph等，2003，J Biol Chem，278，11411-11418)。

可以被包含在本發(fā)明的組合物中的磁性納米顆?？捎糜谕ㄟ^磁力遞送物理靶向并且可用于急劇增強核酸轉(zhuǎn)運效率，一種也被稱為磁轉(zhuǎn)染(Magnetofection)的機制(EP1297169；Plank等，2011，Adv Drug Deliv Rev，63，1300-1331)。類似地，本發(fā)明的組合物也可以是用于通過超聲和任選地磁場應(yīng)用物理增強和靶向核酸遞送非非磁性或磁性微泡(Holzbach等，2010，J Cell Mol Med，14，587-599；Vlaskou等，2010，Adv Funct Mater，20，3881-3894)。量子點(ZintCHenko等，2009，Mol Ther，17，1849-1856)，用于醫(yī)療成像非放射性示蹤劑和對比劑，可有利地用于追蹤核酸遞送和確定核酸遞送組合物的生物分布。概括而言，很多用于核酸遞送的效應(yīng)器已被描述，并且可以是根據(jù)本發(fā)明的包括核酸和陽離子劑的組合物中的有用組分。

本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的(藥物)組合物所包含的每種組分的物質(zhì)量有很大程度的靈活性。例如，所謂單分子二元多聚絡(luò)合物已關(guān)于質(zhì)粒DNA被描述，其中組合物由通過混合聚陽離子和質(zhì)粒DNA形成的納米顆粒(其實際上包括一個質(zhì)粒DNA分子和電荷中和或電荷過度補償(正電荷超過負(fù)電荷)所需的多個聚陽離子分子)組成(DeRouchey等，2006，J Phys Chem B。110(10)：4548-54)。關(guān)于通常用于轉(zhuǎn)染的N/P比下的PEI-DNA絡(luò)合物，通過熒光相關(guān)光譜(fluorescence correlation spectroscopy)發(fā)現(xiàn)，其包含平均3.5(+/-1)個DNA質(zhì)粒分子和30個PEI分子，而用于制備絡(luò)合物的PEI分子的約86％是游離形式(Clamme等，2003，Biophys J 84，1960-1968)。在另一極端中發(fā)現(xiàn)，聚集的PEI和質(zhì)粒DNA絡(luò)合物——推定包括大量(數(shù)十至數(shù)百)組分分子——在轉(zhuǎn)染方面小型離散的PEI-DNA納米顆粒表現(xiàn)更好(Ogris等，1998，Gene Ther，5，1425-1433；Ogris等，2001，AAPS PharmSci，3，E21)。因此，根據(jù)本發(fā)明的(藥物)組合物可以是或包括包含少量RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)分子的(納米和/或微米)顆粒，但也可以是或包括包含大量RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)分子的宏觀物，如沉淀或干燥粉末。概括而言，本發(fā)明的組合物的特征在于自組裝前其組分的輸入比。個體組分相對于RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)組分的一般輸入w/w比在1和50之間。在陽離子劑被化學(xué)明確定義時，N/P比是二元陽離子劑組合物的輸入比的適當(dāng)度量。如果本發(fā)明的組合物包括進一步的組分，N/P比的分配可以是不明確的。在這種情況下，通過下列確定適當(dāng)?shù)妮斎氡龋喊ǖ幌抻谀z遲滯測定、熒光淬滅測定如溴化乙錠置換/猝滅測定的實驗、顆粒尺寸設(shè)定和ζ電位測量、和功能性測定如本文描述的轉(zhuǎn)染測定。在包括另外的聚陰離子或遮蔽多聚體的三元絡(luò)合物中，凈電荷比(正負(fù)比)可以小于1并且ζ電位可以是中性或負(fù)的。

可如下描述生成本發(fā)明的(藥物)組合物。在自組裝過程后，可以將本發(fā)明的組合物從任何未合并組分分離，并且在同一步驟種，可將懸浮介質(zhì)通過離心或通過超濾或尺寸排阻色譜或透析或任何相關(guān)方法更換。純化或未純化的本發(fā)明的組合物的組分的化學(xué)計量可通過如下確定：包括光譜方法如UV/VIS光譜或熒光相關(guān)光譜(DeRouchey等，2006，J Phys Chem B。110(10)：4548-54)的多種分析方法、個體組分的正交熒光或放射性同位素標(biāo)記、NMR和IR光譜或色譜分析和組合物拆解后的定量。拆解可例如通過添加過量聚陰離子如本文描述的肝素或硫酸軟骨素或通過添加十二烷基硫酸鈉來實現(xiàn)。

本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明的(藥物)組合物的方法。陽離子劑如PEI或本發(fā)明的寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)可如本文描述生產(chǎn)和純化。其可被儲存在水溶液中或作為干燥粉末儲存——在這種情況下在生產(chǎn)組合物前其被重新溶解在含水介質(zhì)(優(yōu)選地，水)中。如需，溶液的pH被用酸(優(yōu)選用鹽酸或檸檬酸)調(diào)節(jié)至中性或略酸性(下至pH 4.5)。在RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)是組合物包含的核酸的情況下，優(yōu)選pH被調(diào)節(jié)至約4.5至5.5，優(yōu)選約4.9至5.1，更優(yōu)選約5.0。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)和純化核酸。核酸作為含水介質(zhì)(優(yōu)選水)中的溶液被提供。任選地，陽離子劑或核酸或兩者與效應(yīng)器分子如靶向配體、信號肽、細(xì)胞滲透肽、內(nèi)含體溶解物質(zhì)或遮蔽多聚體化學(xué)連接。然而，根據(jù)效應(yīng)器分子的化學(xué)屬性，其可以無需通過化學(xué)鍵附接，而可通過自組裝(基于與組合物任何其它組分的非共價結(jié)合，即靜電、疏水或范德華相互作用)被并入本發(fā)明的組合物中。為此目的，調(diào)節(jié)個體組分溶液的離子強度、反離子類型、pH或有機溶劑含量可以是有利的。

有機溶劑可用于制備陽離子劑(具體地，式(IV)類脂質(zhì))的原液，和可以被進一步難溶性或非水溶性組分如脂質(zhì)或疏水寡聚體或多聚體的共組裝需要。適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑例如是水混溶性溶劑，如乙醇和其它醇、二甲基砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、或四氫呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)和WO 2013/045455描述的其它溶劑。在一個實施方式中，本發(fā)明的含類脂質(zhì)組合物由溶于這些溶劑中任一者(優(yōu)選乙醇)的類脂質(zhì)和進一步組分如助劑脂質(zhì)、和溶于含水介質(zhì)(優(yōu)選緩沖至酸性pH)的RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)制備。在第一步，將溶于有機相的組分以期望的化學(xué)計量比混合并用選擇的有機溶劑稀釋至期望的最終體積。將與類脂質(zhì)的期望最終比的相應(yīng)量的RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)稀釋在含水介質(zhì)中。優(yōu)選地，含水介質(zhì)的體積至少等于組合的組分溶液(在有機溶劑中)的體積。優(yōu)選地，包括RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)的水相的體積超過組合的組分有機溶劑溶液的體積，最優(yōu)選地，水相和有機相的v/v比是4∶1。在第二步，將含類脂質(zhì)有機混合物快速注入RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)水溶液——優(yōu)選同時進行渦流。任選地，在這個步驟之前或之后，將RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)和含類脂質(zhì)組分的溶液加熱至上至70℃。如需或期望，現(xiàn)可通過蒸發(fā)、透析、超濾、滲濾或尺寸排阻色譜將有機溶劑去除，同時在相同步驟中可將分散介換成最終的期望的緩沖劑組合物，如PBS。任選地，可將組合物通過滅菌和/或獲得單分散性制劑所期望的孔尺寸的的濾膜擠出。

作為上述混合程序的替代選擇，可利用諸如例如Hirota等(Hirota等，1999，BioTechniques，27，286-290)或Kasper等(Kasper等，2011，Eur J Pharm Biopharm，77，182-185)描述的微混合自動裝置或通過諸如Xuan等(Xuan等，2010，Microfluidics and Nanofluidics，9，1-16)評述的微流體集中，將RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)和類脂質(zhì)組分混合。

獲得根據(jù)本發(fā)明的含類脂質(zhì)組合物的替代選擇是通過脂質(zhì)體或微團作為中間體。脂質(zhì)絡(luò)合物通常由在水懸浮液中是微團或脂質(zhì)體的市售轉(zhuǎn)染試劑制備。本發(fā)明的類脂質(zhì)可以用于制備微團或脂質(zhì)體。很多制備微團和脂質(zhì)體的技術(shù)在本領(lǐng)域已知，并且任何方法可以用于本發(fā)明類脂質(zhì)以制備微團和脂質(zhì)體。另外，任何包括RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)、小分子、蛋白質(zhì)、肽、金屬、有機金屬化合物等的試劑可以被包含在微團或脂質(zhì)體中。在某些實施方式中，脂質(zhì)體(脂質(zhì)或類脂質(zhì)囊泡)通過自發(fā)組裝而形成。在其它實施方式中，脂質(zhì)體在脂質(zhì)薄膜或脂質(zhì)餅被水化并且脂質(zhì)晶體雙層堆疊體變成流體和溶脹時形成。水化脂質(zhì)層在攪動期間分離，并自封閉以形成大型多層囊泡(LMV)。這防止在邊緣處水與雙層烴核相互作用。在這些脂質(zhì)體形成后，可通過輸入聲波能(聲處理)或機械能(擠出)改進顆粒尺寸的縮小(Szoka等，1980，Ann Rev Biophys Bioeng，9，467-508)。脂質(zhì)體制備涉及制備用于水化的類脂質(zhì)，利用攪動水化類脂質(zhì)，和設(shè)定囊泡尺寸以實現(xiàn)脂質(zhì)體均勻分布。為此目的，將本發(fā)明組合物所要包含的脂質(zhì)組分溶解在有機溶劑如氯仿中作為原液。然后將組分以期望的化學(xué)計量比混合，并通過在適當(dāng)?shù)娜萜魅鐖A底燒瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以去除有機溶劑，在容器壁上產(chǎn)生脂質(zhì)薄膜。優(yōu)選地，使膜在高真空中干燥。類脂質(zhì)膜/餅的水化通過添加含水介質(zhì)至干燥類脂質(zhì)容器和攪動混合物來實現(xiàn)。利用聲波能瓦解LMV懸浮液一般產(chǎn)生直徑在15-50nm范圍內(nèi)的小型單層囊泡(SUV)。脂質(zhì)擠出是迫使脂質(zhì)懸浮液通過孔尺寸確定的聚碳酸酯過濾器以生成直徑接近所用過濾器孔尺寸的顆粒的技術(shù)。通過100nm孔過濾器的擠出一般生成平均直徑為120-140nm的大型單層囊泡(LUV)。某些類脂質(zhì)可圍繞某些分子如核酸(例如DNA和mRNA)自發(fā)地自組裝以形成脂質(zhì)體。在一些實施方式中，應(yīng)用是遞送RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)。這些類脂質(zhì)的應(yīng)用能夠?qū)崿F(xiàn)簡單的脂質(zhì)體組裝，無需另外的步驟或裝置，如擠出機。

然后可通過混合組分溶液后的自組裝制備包括RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)的本發(fā)明組合物。自組裝可通過如下實現(xiàn)：通過利用移液和振蕩/渦流的手動混合、或利用諸如例如Hirota等(Hirota等，1999，BioTechniques，27，286-290)或Kasper等(Kasper等，2011，Eur J Pharm Biopharm，77，182-185)描述的微混合自動裝置、或通過諸如Xuan等(Xuan等，2010，Microfluidics and Nanofluidics，9，1-16)評述的微流體集中。如果本發(fā)明的組合物除RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)和本發(fā)明的陽離子劑外還包括進一步組分，可需要順序混合。在這種情況下，任何進一步組分可以在陽離子劑和RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)自組裝后被添加，或其可以在混合前被添加至這些中的任一者。最適當(dāng)?shù)幕旌喜襟E順序?qū)⑷Q于另外的組分的化學(xué)屬性。例如，如果另外的組分帶負(fù)電荷，則將其添加至與陽離子劑混合前的RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)組分或添加至陽離子劑和RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)的預(yù)形成絡(luò)合物(其中寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)過量存在(根據(jù)正電荷與(m)RNA和陰離子型的另外的組分的負(fù)電荷之和之比))可以是最適合的。反之，如果另外的組分是陽離子，將其添加至與(m)RNA混合前的寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)可以是最適合的。或者，其可以化學(xué)計量使用，以部分中和(m)RNA的負(fù)電荷，然后(m)RNA與本發(fā)明寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)溶液混合。在含(m)RNA的磁轉(zhuǎn)染絡(luò)合物的情況下，已顯示鹽誘導(dǎo)性膠體聚集是適于制備包括(m)RNA、聚陽離子或陽離子脂質(zhì)和磁性顆粒的絡(luò)合物的手段(EP1297169)。在(m)RNA組分是陽離子寡核苷酸的特殊情況下，可利用聚陰離子自組裝本發(fā)明的寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)與(m)RNA。在這種情況下，將本發(fā)明的陽離子劑與陽離子寡核苷酸混合，然后與聚陰離子混合。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，多種制劑選擇可用以獲得本發(fā)明的組合物。根據(jù)本發(fā)明組合物的目的用途選擇個體組分的濃度。相關(guān)參數(shù)是(m)RNA組分的最終濃度和組分比，如上所述。關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)物中的(m)RNA遞送，1和100μg/ml之間的最終(m)RNA濃度總體上是優(yōu)選的。關(guān)于體內(nèi)應(yīng)用，可用的最終(m)RNA濃度可以是上至5mg/ml。

本發(fā)明的(藥物)組合物、或其組分(例如RNA和陽離子劑、一種或多種助劑脂質(zhì)NP和MP)的一種或多種可被儲存在水懸浮液中或可被干燥。因此，在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的(藥物)組合物、或其組分的一種或多種以干燥形式，任選地以冷凍-干燥(凍干)形式，儲存。在另一優(yōu)選實施方式中，(藥物)組合物、或其一個或多個組分，如RNA和陽離子劑(或其絡(luò)合物)被凍干——例如與凍干保護劑一起。在更優(yōu)選實施方式中，干燥或凍干的絡(luò)合物或(藥物)組合物(或其一個或多個組分)還包括凍干保護劑。凍干保護劑是保護(冷凍-)干燥材料的的分子。這種分子一般是多羥基化合物，如糖(單糖、二糖和多糖)、聚醇和其衍生物。海藻糖和蔗糖已知是干燥過程的天然保護劑。海藻糖通過多種植物、真菌和在干旱期停留在假死狀態(tài)(也被稱為低濕休眠(anhydrobiosis))的無脊椎動物生產(chǎn)。糖如海藻糖、乳糖、棉子糖、蔗糖、甘露糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇、糊精、尿素、麥芽糊精、果聚糖、麥芽糖寡糖、甘露寡糖、環(huán)菊己糖(cycloinulohexaose)、羥乙基淀粉、葡聚糖、菊粉、聚乙烯基吡咯烷酮或氨基酸如色氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸是在本發(fā)明范圍內(nèi)特別適合的凍干保護劑。最優(yōu)選地，海藻糖用于此環(huán)境。因此，在更具體方面，本發(fā)明的藥物組合物進一步包括海藻糖(或其它凍干保護劑(一種或多種))。

制藥方面

本發(fā)明的藥物組合物被配制成固體劑型，用于給予到GI道或到GI道中，本文也稱為胃腸(GI)給予。GI給予意為通過任何(形式的)給予，本發(fā)明的藥物組合物最終到達GI道。GI給予包括口服給予、直腸給予和通過探頭/管給予(例如胃管、腸道探頭和腹部探頭(穿過腹壁的探頭)?？傮w上，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選直腸給予，最優(yōu)選口服給予。具體地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物

(i)被胃腸(例如口服、直腸或通過探頭/管)給予或可被胃腸(例如口服、直腸或通過探頭/管)給予；

(ii)被設(shè)計或被配制或可被設(shè)計或被配制用于GI給予(例如，用于口服或直腸給予或通過探頭/管)；

(iii)用于GI給予(例如用于口服或直腸給予或通過探頭/管)；和/或

(iv)將被胃腸(例如口服，直腸或通過探頭/管)給予。

因此，藥物組合物被設(shè)計以適于GI給予(例如適于口服或直腸給予或通過探頭/管)。關(guān)于GI給予，包含根據(jù)本發(fā)明的化合物——例如RNA，優(yōu)選mRNA，和陽離子劑，優(yōu)選與RNA絡(luò)合——的藥物組合物、或本文限定的包括RNA和陽離子劑的組合物被配制成固體劑型。本發(fā)明的藥物組合物可以采用如下形式：例如，顆粒、球、丸劑、片劑、栓劑、包衣片劑、膜、細(xì)分粉末、硬或軟明膠膠囊。根據(jù)本發(fā)明的劑型，具體地固體劑型，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法(例如，如“Pharmazeutische Technologie”，第11版，Deutscher Apotheker Verlag 2010；或“Pharmazeutische TeChologie”，第9版，Wissenschaftliche Verlagsgesellschaff Stuttgart，2012描述)配制——利用一種或多種常用于制劑的賦形劑(一種或多種)例如如i.a.Fiedler`s“Lexikon der Hilfstoffe”第5版，Editio Cantor Verlag Aulendorf 2002；“The Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第4版，American Pharmaceuticals Association，2003所述。其原則上可選自載體、稀釋劑或填充劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、助滑劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、成膜劑、軟化劑、潤濕劑、甜味劑、色素/著色劑、抗氧化劑、防腐劑和類似物。這種賦形劑(一種或多種)優(yōu)選是固體。然而，也可以使用其它賦形劑(一種或多種)，只要其產(chǎn)生固體劑型。

原則上，“固體劑型”是任何可作為固體被提供和/或給予的劑型。更具體地，根據(jù)本發(fā)明的“固體劑型”是對本發(fā)明的藥物組合物所包含的RNA提供一定保護(例如，以免其在GI道中降解)和/或有助于/增強所述RNA(例如對其對在GI道中降解的抗性)的劑型。在本發(fā)明環(huán)境中所用的固體劑型在本領(lǐng)域公知，并且例如如“Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie”，第8版，Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart(第14章)描述。

固體劑型可例如選自顆粒、球、丸劑、片劑、栓劑、包衣片劑、膜、粉末、細(xì)分粉末、丸片和膠囊(例如兩件式膠囊(一種或多種))。這種劑型也在本領(lǐng)域公知，并且例如如“Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie”同上；“Pharmazeutische Technologie”，第10版，Deutscher Apotheker Verlag Stuttgart；和“Innovative Arzneiformen”，2010(ISBN 978-3-8047-2455-6)，Wissenschaftliche Verlagsgesellschaff Stuttgart描述。

更具體地，粉末(及其生產(chǎn))被描述于第14.2章，并且顆粒(及其生產(chǎn))被描述于“Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie”同上的第14.3章。丸片和片劑(及其生產(chǎn))被描述于“Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie”同上的第14.4章。丸劑(及其生產(chǎn))被描述于“Innovative Arzneiformen”同上的第8章。膠囊(及其生產(chǎn))被描述于“Pharmazeutische Technologie”同上的第11章。栓劑(及其生產(chǎn))被描述于“Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie”同上的第13和14章和“Pharmazeutische Technologie”同上的第13章。

例如，根據(jù)本發(fā)明，粉末可以用于生產(chǎn)顆粒，粉末和/或顆?？梢杂糜谏a(chǎn)丸劑，和/或粉末和/或顆粒和/或丸劑可以用于生產(chǎn)片劑(一種或多種)、丸片(一種或多種)或膠囊(一種或多種)。

在具體方面，膠囊(一種或多種)可以是明膠膠囊(一種或多種)。一般，明膠膠囊是硬或軟明膠膠囊。在本發(fā)明環(huán)境中特別優(yōu)選硬明膠膠囊。適當(dāng)?shù)哪z囊，具體地明膠膠囊，在本領(lǐng)域公知并且商品化，例如，可作為Belgium NV，Bornem，Belgium經(jīng)銷的膠囊、膠囊或膠囊(或作為其它膠囊)獲得，并且被描述于“Pharmazeutische Technologie”同上的第11章。

在另一具體方面，栓劑可以是直腸栓劑(rectalia)，如例如“Pharmazeutische Technologie”同上的第13章描述。

適當(dāng)?shù)恼澈蟿┓窍拗频匕ㄕ澈蟿┚垡蚁┗量┩橥?PVP)、聚乙二醇(PEG)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、預(yù)膠化(玉米)淀粉及其組合。

適當(dāng)?shù)妮d體/填充劑/稀釋劑非限制地包括微晶纖維素、甘露醇、蔗糖或其它糖或糖衍生物如如乳糖、磷酸氫鈣、淀粉(優(yōu)選玉米淀粉)、低取代羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素及其組合。

適當(dāng)?shù)臐櫥瑒┓窍拗频匕ㄓ仓徭V、硅酸鋁或硅酸鈣、硬脂酸、氫化蓖麻油、PEG4000-8000、滑石、山崳酸甘油酯、富馬酸硬脂酸鈉及其組合。

適當(dāng)?shù)闹瑒┓窍拗频匕z體SiO2(例如Aerosil 200)、三硅酸鎂、粉末狀纖維素、滑石及其組合。

適當(dāng)?shù)谋澜鈩┓窍拗频匕燃谆w維素鈣(CMC-Ca)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、交聯(lián)PVP(例如Crospovidone，Polyplasdone或Kollidon XL)、海藻酸、海藻酸鈉、馬鈴薯淀粉、瓜爾膠、交聯(lián)CMC(交聯(lián)羧甲基纖維素鈉，例如Ac-Di-Sol)、羧甲基淀粉-Na(乙醇酸淀粉鈉，例如Primojel或Explotab)。

適當(dāng)?shù)臐櫇駝┌ū砻婊钚詣?，如月桂基硫酸鈉。

此外，根據(jù)本發(fā)明的用于GI給予的固體藥物組合物/劑型可以被包衣——例如通過采用膜包衣或改性的釋放包衣，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的包衣方法，利用市售包衣材料如成膜多聚體、不透明劑、著色劑和塑化劑、和類似物的混合物。各個包衣可以是胃液抗性包衣。然而，在本發(fā)明環(huán)境中證明，實現(xiàn)RNA在作為根據(jù)本發(fā)明的固體劑型口服給予(或直腸給予或通過探頭/管)時(即，被包含在本發(fā)明的藥物組合物中時)的有效表達甚至不一定需要包衣——具體地胃液抗性包衣。

GI給予制劑可以通過其它手段，如給出根據(jù)本發(fā)明的化合物(例如(m)RNA和陽離子劑的絡(luò)合物)的受控/改變的釋放的釋放控制基質(zhì)，被適當(dāng)?shù)嘏渲啤?/p>

適當(dāng)?shù)馁x形劑的列舉也可以在教科書中找到，如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(Alfonso R.Gennaro，ed.；Mack Publishing Company，Easton，PA，1990)；Remington：the Science and Practice ofPharmacy第19版(Lippincott，Williams&Wilkins，1995)；Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版(Arthur H.Kibbe，ed.；Amer.Pharmaceutical Assoc，1999)；the Pharmaceutical Codex：Principles and Practice of Pharmaceutics第12版(Walter Lund ed.；Pharmaceutical Press，London，1994)；The United States Pharmacopeia：The National Formulary(United States Pharmacopeial Convention)；和Goodman and Gilman′s：the Pharmacological Basis of Therapeutics(Louis S.Goodman和Lee E.Limbird，eds.；McGraw Hill，1992)，其公開內(nèi)容被引入本文作為參考。適當(dāng)?shù)馁x形劑(例如明膠)、載體和包衣還被描述于“Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie”同上。

在具體實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物是飲食/食品補充劑或食品的形式。在此環(huán)境中，其可以被添加至飲食/食品和/或隨飲食/食品給予。進一步，其可以與食品一起或作為食品被給予。再次，給予這種實施方式同樣關(guān)鍵的是，藥物組合物被配制成固體劑型。因此，各個飲食/食品也被設(shè)想是固體。否則，設(shè)想至少飲食/食品中包含的藥物組合物被配制以使其在其被攝入期間和/或之后維持其固體形式。各個形式的實例是(難溶性或不溶性)顆粒、丸劑、(小)膠囊和類似物。

各個飲食/食品的實例是谷物棒、餅干、零食、糖果、糕點、面包、麥片、面食和類似物。

在具體方面，此實施方式的藥物組合物用于兒科問題環(huán)境，即，用于治療(或預(yù)防)兒童疾病。

當(dāng)作為飲食/食品(飲食/食品形式)被提供時，藥物組合物是耐受的，具體地是兒童耐受的。

飲食/食品包括人類飲食/食品，而且包括動物飼料。

在進一步方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的(藥物)組合物或所述陽離子劑用于遞送RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)至組織或到目標(biāo)細(xì)胞中(具體地，作為固體劑型通過GI給予)的應(yīng)用。術(shù)語“遞送RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)至細(xì)胞”優(yōu)選地意為RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)轉(zhuǎn)運到細(xì)胞中。所述應(yīng)用可以在體內(nèi)或體外。

本發(fā)明還涉及遞送RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)至目標(biāo)細(xì)胞或組織的方法，包括步驟：使根據(jù)本發(fā)明的(藥物)組合物接觸目標(biāo)細(xì)胞或組織，具體地作為固體劑型通過GI給予。這種方法可在體內(nèi)進行。接觸可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的手段和方法實現(xiàn)。在體內(nèi)，接觸細(xì)胞或組織可例如通過經(jīng)由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的給予途徑(具體地，通過GI給予——原則上也被基因治療領(lǐng)域采用)給予組合物至個體來實現(xiàn)。可能的配制組合物和將其給予個體的方式也被本文其它部分進一步描述。

術(shù)語“體內(nèi)”指代任何對活生物體的身體實施的應(yīng)用，其中所述生物體優(yōu)選是多細(xì)胞的，更優(yōu)選是哺乳動物，最優(yōu)選是人。術(shù)語“體外”指代任何對活生物體身體的部分實施的應(yīng)用，該部分從所述生物體分離并且在從所述生物體體外，例如細(xì)胞、組織和器官，其中所述生物體優(yōu)選是細(xì)胞的，更優(yōu)選是哺乳動物，最優(yōu)選是人。

本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包括組合物、和/或RNA陽離子劑如PEI或本文描述的陽離子寡聚體、多聚體或類脂質(zhì)、和任選地藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。術(shù)語“藥物組合物”指代本文描述的組合物的可給予至對象的藥學(xué)上可接受的形式。

術(shù)語″藥學(xué)上可接受的形式″意為組合物被配制成藥物組合物，其中所述藥物組合物可以進一步包括藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。因此，本發(fā)明的藥物組合物可以進一步包括藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。適當(dāng)?shù)乃幬镙d體的實例在本領(lǐng)域公知，包括粘合劑、載體、填充劑、稀釋劑、潤滑劑、助滑劑、崩解劑、賦形劑和各種類型的潤濕劑(如上述)等，只要得到的藥物組合物被配制成根據(jù)本發(fā)明的固體劑型。包括這種載體的組合物可通過公知的常規(guī)方法配制。

本發(fā)明的藥物組合物可以適當(dāng)?shù)膭┝拷o予至對象。劑量方案將由主治醫(yī)師和通過臨床因素確定。醫(yī)療領(lǐng)域公知，任一對象的劑量取決于多個因素，包括對象尺寸、身體表面積、年齡、給予的具體化合物、性別、給藥時間和途徑、總體健康狀況、和同時給予的其它藥物。一般的活性物質(zhì)劑量可例如在1ng至幾克范圍內(nèi)。用于(m)RNA治療時，用于表達或抑制表達的(m)RNA劑量應(yīng)相應(yīng)于此范圍；然而，考慮在此示例性范圍以下或以上的劑量——特別是考慮到上述因素?？傮w上，定期給予藥物組合物的方案應(yīng)在0.1μg至10mg單位/每千克體重/天范圍內(nèi)。如果方案是連續(xù)灌注，其也應(yīng)分別在1μg至10mg單位/千克體重范圍內(nèi)?？赏ㄟ^定期評估監(jiān)測進展。劑量會有變動，但作為本發(fā)明組合物組分的(m)RNA的靜脈內(nèi)給予優(yōu)選劑量為大約10⁶至10¹⁹拷貝的(m)RNA分子。

原則上，術(shù)語“給予”包括任何適于將組合物引入對象身體的方法。然而，如述，當(dāng)用于本發(fā)明環(huán)境中時，其主要包括GI給予方法。因此，適當(dāng)組合物的給予可以以不同方式實施，但具體地通過口服或直腸給予或通過探頭/管。本發(fā)明的組合物可以具體地作為基因活化基質(zhì)被給予，如Shea等(Shea等，1999，Nat Biotechnol，17，551-554)和EP 1198489描述。

原則上，本發(fā)明的藥物組合物可以被全身給予。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的藥物組合物用于全身性遞送RNA(如本文其它部分限定和描述)和/或由其翻譯的蛋白質(zhì)的應(yīng)用，和全身性遞送所述RNA和/或由其翻譯的蛋白質(zhì)至對象(有其需求)的方法，包括步驟：胃腸給予本發(fā)明的藥物組合物。

例如，(將要)由(全身遞送的)RNA翻譯的蛋白質(zhì)可以是分泌的蛋白質(zhì)。其可以由已被遞送RNA(例如通過腸上皮細(xì)胞)的GI道上皮細(xì)胞生成。因此，其可以被全身遞送——例如通過血流(參考圖36“brPEI”，顯示腎中的信號)。因此，本發(fā)明進一步提供通過利用本發(fā)明的藥物組合物全身性遞送蛋白質(zhì)的手段和方法。蛋白質(zhì)由本發(fā)明的藥物組合物所包含的RNA編碼。

此外，藥物組合物可以包括進一步試劑，如白介素或干擾素——取決于藥物組合物的目的用途。

在另一實施方式中，本發(fā)明涉及治療(或預(yù)防)方法，包括口服給予本發(fā)明的藥物組合物至患者(有其需求)，以使所述組合物包含的RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)產(chǎn)生預(yù)防或治療效果。注意，術(shù)語“患者”包括動物和人。

本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的用于治療(或預(yù)防)疾病(例如本文其它部分描述和限定的疾病)的藥物組合物。

在此環(huán)境中，設(shè)想藥物組合物被胃腸給予和被配制成固體劑型。

通過給予本發(fā)明的藥物組合物，可治療、預(yù)防或免疫接種疾病。術(shù)語“疾病”指代可通過采用本發(fā)明的實施方式治療、預(yù)防或免疫接種的任何可以想到的病理狀況。

在所述方法或藥物組合物的優(yōu)選實施方式中，所述疾病可以是遺傳性的、獲得性的、感染性的或非感染性的、年齡相關(guān)的、心血管的、代謝的、腸的、腫瘤性的(具體地癌癥)或基因的。疾病可基于例如生物體內(nèi)的生理過程、分子過程、生物化學(xué)反應(yīng)異常，進而可基于例如生物體的基因裝備；行為、社會或環(huán)境因素，如化學(xué)品或輻射暴露。在特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物用于治療(或預(yù)防)，如專利申請WO2011/012316的公開。

原則上，本發(fā)明的藥物組合物和各自的應(yīng)用和方法不限于治療(或預(yù)防)某些疾病(一種或多種)或障礙(一種或多種)。而是設(shè)想其治療(或預(yù)防)任何可通過GI給予根據(jù)本發(fā)明的RNA(即，通過胃腸給予本發(fā)明的藥物組合物)治療(或預(yù)防)的疾病或障礙。在這方面設(shè)想以下三個主要治療(或預(yù)防)領(lǐng)域。

第一，GI給予患者以治療(或預(yù)防)與(胃)腸道相關(guān)的局部疾病。最突出的代表性實例是Morbus Crohn和潰瘍性結(jié)腸炎(炎性腸疾病)。在這個領(lǐng)域的環(huán)境中，mRNA可例如編碼與相關(guān)信號傳導(dǎo)途徑相互作用的任何抗炎性因子。IL-10等可以是實例。同樣，設(shè)想GI道中與相應(yīng)信號傳導(dǎo)途徑(一個或個種)相互作用的抗體的局部表達(例如抗TNFα抗體；Humira)?？梢杂辛硗獾木植?例如局部炎性)疾病。

第二，GI給予患者以替代缺失的蛋白質(zhì)，具體地缺失的通常全身存在的蛋白質(zhì)。在這個領(lǐng)域的環(huán)境中，預(yù)期GI道的上皮細(xì)胞表達mRNA，并且翻譯的蛋白質(zhì)然后分泌到患者血液循環(huán)中以全身性發(fā)揮其功能。非限制性實例是EPO、hGH、hCSF、凝血因子(FVIII，F(xiàn)IX)等。各個疾病可以是代謝的或基因的疾病。另一非限制性實例可以是功能性酶表達，如酶替代治療的情況，例如溶酶體貯積疾病等。(參見Leader，Nature Reviews Drug Discovery 7，2008，21-39)。此外，可想到抗體被局部表達并且在分泌到血流后在遠端器官中發(fā)揮其功能(例如炎性疾病，癌癥等，也參見：http：//www.Pharmazeutische-zeitung.de/index.php？id＝35238或http：//www.vfa.de/de/arzneimittel-forschung/datenbanken-zu-arzneimitteln/amzulassungen-gentec.html。

在這個領(lǐng)域的環(huán)境中，本發(fā)明的藥物組合物可以代表，即各個RNA可以編碼，下列化合物。代表性疾病可以被治療(或預(yù)防)：

血管生成抑制劑，如貝伐單抗(Bevacizumab)蘭尼單抗(Ranibizumab)或哌加他尼(Pegaptanib)抗哮喘劑，如奧馬珠單抗(Omalizumab)抗貧血藥，如依泊汀(Epoetin)α依泊汀α、生物仿制藥(Epoetin alfa)、依泊汀θ依泊汀ζ、生物仿制藥依泊汀β依泊汀δ達依泊汀α(Darbepoetin alfa)或甲氧基-聚乙二醇-依泊汀β抗糖尿病藥，如人胰島素重組體(例如Insulin Human)、賴脯胰島素門冬胰島素賴谷胰島素甘精胰島素地特胰島素胰高血糖素艾塞那肽(Exenatide)(或利拉魯肽(Liraglutid)抗感染藥/呼吸系統(tǒng)治療劑，如干擾素-α-2aPeg干擾素-α-2a干擾素-α-2b(Intron)、Peg干擾素-α-2b干擾素γ-1b帕利珠單抗(Palivizumab)或恩夫韋肽(Enfuvirtide)抗銀屑病藥，如依法利珠單抗(Efalizumab)阿來塞普(Alefacept)優(yōu)特克單抗(Ustekinumab)英夫利昔單抗(Infliximab)阿達木單抗(Adalimumab)或依那西普(Etanercept)抗風(fēng)濕藥，如利妥昔單抗(Rituximab)英夫利昔單抗阿達木單抗戈利木單抗(Golimumab)聚乙二醇化塞妥珠單抗(Certolizumab pegol)依那西普阿那白滯(Anakinra)阿巴西普(Abatacept)托珠單抗(Tocilizumab)或康納單抗(Canakinumab)抗血栓藥/抗纖溶藥，如鏈球菌激酶(Streptokinase)尿激酶(Corase)、阿昔單抗(Abciximab)抗凝血酶α來匹盧定(Lepirudin)地西盧定(Desirudin)比伐盧定(Bivalirudin)阿替普酶(Alteplase)瑞替普酶(Reteplase)或替奈普酶(Tenecteplase)凝結(jié)因子，如依他凝血素α(Eptacog alfa)(aktiviert)辛凝血素α(Octocog alfa)莫羅凝血素α(Moroctocog alfa)或諾那凝血素α(Nonacog alfa)溶血素抑制劑，如依庫珠單抗(Eculizumab)治療(或預(yù)防)生育能力障礙的激素，如促卵泡素(Follitropin)β促卵泡素α絨促卵泡素α(Corifollitropin alfa)促黃體素α(Lutropin alfa)促卵泡素α/促黃體素α或絨毛膜促性腺激素α(CHoriogonadotropin alfa)免疫系統(tǒng)(例如多發(fā)性硬化癥)調(diào)控因子，如干擾素β-1b干擾素β-1a那他珠單抗(Natalizumab)或醋酸格拉替雷(Glatirameracetat)免疫抑制劑(例如預(yù)防移植物抗宿主病)，如抗人T淋巴細(xì)胞球蛋白(來自兔子)(ATG-S)、抗胸腺細(xì)胞(Thymozyten)球蛋白(來自兔子)巴利昔單抗(Basiliximab)或達利珠單抗(Daclizumab)疫苗，如乙肝(rDNA)疫苗(-B)、人乳頭狀瘤病毒疫苗肺炎球菌綴合物疫苗或口服霍亂疫苗(Duk口服)。骨生長因子，如地博特明α(Dibotermin alfa)或艾托特明α(Eptotermin alfa)粘液粘稠病治療劑，如脫氧RNA酶α(Dornase alfa)骨質(zhì)疏松治療劑，如特立帕肽(Teriparatid)甲狀旁腺激素鮭魚降鈣素(Lachs-Calcitonin)或地諾單抗(Denosumab)膿毒病治療劑，如Drotrecoginα替代治療劑，如伊米苷酶(Imiglucerase)半乳糖苷酶α半乳糖苷酶β拉羅尼酶(Laronidase)艾度硫酸酯酶(Idursulfase)加硫酶(Galsulfase)或Aglucosidaseα血小板生長因子，如omiplostim癌癥/腫瘤治療劑，如阿地白介素(Aldesleukin)他索爾明(Tasonermin)干擾素α-2a(-A)、干擾素α-2b西妥昔單抗(Cetuximab)帕尼單抗(Panitumumab)尼妥珠單抗(Nimotuzumab)曲妥珠單抗(Trastuzumab)帕妥珠單抗(Pertuzumab)厄馬索單抗(Ertumaxomab)利妥昔單抗替伊莫單抗(Ibritumomab-Tiuxetan)托西莫單抗(Tositumomab)阿侖單抗(Alemtuzumab))、貝伐單抗門冬酰胺酶(Asparaginase)(Asparaginase)、培加帕酶(Pegaspargase)非格司亭(Filgrastim)非格司亭生物仿制藥(Filgrastim Filgrastim)、培非格司亭來格司亭(Lenograstim)Palifermin拉布立酶(Rasburicase)促甲狀腺素α或奧法木單抗(Ofatumumab)生長激素，如Somatropin(MiniQuick、Norditropin Norditropin)、美卡舍明(Mecasermin)或Pegvisomat傷口愈合劑，如貝卡普勒明(Becaplermin)

第三，在患者體內(nèi)引入局部耐受性(例如口服耐受性)，例如避免(重組體)蛋白質(zhì)的免疫原性(參見Wang，Advanced Drug Delivery Reviews 65，2013，759-73)?？诜褪苄允菦]有口服給予無害抗原如食品蛋白質(zhì)引起的局部和全身免疫響應(yīng)的狀態(tài)(參見Pabst，Mucosal Immunology 5(3)，2012，232-9)?？诜褪苄员欢x為特定的對因口服途徑給予抗原而產(chǎn)生的對該抗原的體液和/或細(xì)胞免疫響應(yīng)的抑制。這是在GI道用于翻譯和分泌蛋白質(zhì)到患者血流中時mRNA技術(shù)的另外一個益處。通過這樣做，可避免關(guān)于表達的蛋白質(zhì)的任何免疫顧慮。這可能對于身體之前從未遇到該表達的治療蛋白質(zhì)的基因疾病患者尤其重要，因為其因基因缺陷未被表達。如果這樣的患者被給予(或表達)未知的蛋白質(zhì)，則免疫系統(tǒng)很可能將這種蛋白質(zhì)識別為外來者，因為其在免疫系統(tǒng)成熟期間是不存在于患者體內(nèi)。在這種情況下，若建立免疫耐受性劑，會是有幫助的。

因此，在具體實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物用于將局部(免疫)耐受性(例如口服(免疫)耐受性)引入患者(例如，在第二個領(lǐng)域、上文、或本文其它部分描述和限定的的環(huán)境中，與基因疾病和/或待治療(或預(yù)防)疾病治療結(jié)合)。

根據(jù)上述治療方法，本發(fā)明在另一實施方式中涉及本發(fā)明的組合物用于疾病治療的藥物組合物的制備的應(yīng)用，該疾病可通過提供所述組合物包含的所述RNA(優(yōu)選單鏈RNA，如mRNA)至患病患者身體內(nèi)的組織或器官而得到治療。

本發(fā)明的藥物組合物可以連同說明手冊或說明頁一起提供。說明手冊/頁可以包括給予技術(shù)人員/主治醫(yī)師的如本文所述根據(jù)本發(fā)明如何治療或預(yù)防疾病或障礙的指導(dǎo)。具體地，說明手冊/頁可以包括關(guān)于本文描述的給藥模式/給藥方案(例如給藥途徑、劑量方案、給藥時間、給藥頻率)的指導(dǎo)。具體地，說明手冊/頁可以包括將藥物組合物給予到GI道/到GI道中(例如口服或直腸或通過探頭/管(例如胃管))的說明。這種說明可以包括將藥物組合物作為固體劑型(例如，(設(shè)計)用于口服或直腸給予)給予的說明。原則上，本文其它部分關(guān)于給藥模式/給藥方案的描述可以被包括作為說明手冊/頁中給予技術(shù)人員/主治醫(yī)師的指導(dǎo)。

本發(fā)明的藥物組合物可以在試劑盒中(或以試劑盒形式)提供。試劑盒可以包括本發(fā)明的藥物組合物組分的一種或多種——例如在一個或多個單獨的容器中。例如，試劑盒可以包括RNA、陽離子劑和/或助劑脂質(zhì)(一種或多種)，例如分別在一個、兩個或三個(或更多)單獨的容器。試劑盒還可以包括說明手冊或說明頁。

為進一步示例，下列項目總結(jié)了本發(fā)明的優(yōu)選方面，其構(gòu)成前文概括公開的一部分，并且其中公開的優(yōu)選實施方式也適用。

附圖描述：

圖1：聚(丙烯酸)的寡(亞烷基胺)側(cè)鏈修飾類型對于mRNA對不同細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)染效率的影響。基于所示細(xì)胞類型，利用N/P比在4和44之間的具有側(cè)鏈修飾(2-3-2)和(3-2-3)或?qū)φ栈鶊F(3-3-3)、(2-2-2)、(2-2)或(3-4-3)的聚(丙烯酸)(MW：8,000Da)和編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA，形成多聚絡(luò)合物。在24h后，將用不同量的RNA(500、250、125或62.5ng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞溶解并分析熒光素酶活性。

圖2：確定(2-3-2)和(3-2-3)修飾的PAA8k的絡(luò)合物形成能力的凝膠遷移測定。如述以所示N/P比形成多聚絡(luò)合物。通過在瓊脂糖凝膠中的遷移分析多聚體和mRNA的相互作用。相互作用越強，mRNA遷移完全受阻需要的多聚體量越低。

圖3：確定(2-3-2)和(3-2-3)修飾的PAA8k的絡(luò)合物形成能力的RiboGreen測定。如述以所示N/P比形成多聚絡(luò)合物。通過添加RiboGreen分析多聚體和mRNA的相互作用。這種與核酸的分子相互作用，造成在高量mRNA時熒光信號增加。核酸與多聚體的相互作用越強，檢測到的熒光信號越低。信號以與包含等量游離mRNA的對照相比的相對熒光顯示。

圖4：不同N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(2-3-2)修飾的多聚體的轉(zhuǎn)染效率。利用N/P比在4和20之間的所示N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺修飾的多聚體(PAA8k：聚(丙烯酸)，MW 8,000Da；Glu9.8k：聚(谷氨酸)，MW 9,800Da；PMA9.5k：聚(甲基丙烯酸酯)，MW 9,500Da；Glu64k：聚(谷氨酸)，MW 64,000Da；GluLys：聚(谷氨酸)-聚(賴氨酸)共聚體)(20,000-50,000Da)和編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA，形成多聚絡(luò)合物。在24h后，將用不同量的mRNA(500、250、125或62.5ng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞溶解并分析熒光素酶活性。

圖5：不同分子量的N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(2-3-2)修飾的聚(丙烯酸)的轉(zhuǎn)染效率。利用N/P比在4和20之間的經(jīng)N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(2-3-2)修飾的所示分子量的聚(丙烯酸)和編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA，形成多聚絡(luò)合物。在24h后，將用不同量的mRNA(500、250、125或62.5ng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞溶解并分析熒光素酶活性。

圖6：mRNA多聚體制劑的細(xì)胞毒性。以在4和44之間的N/P比和不同量的mRNA，將包括經(jīng)所示寡(亞烷基胺)修飾的聚(丙烯酸)(MW 8,000Da，20,000Da和70,000Da)和編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA的絡(luò)合物用于轉(zhuǎn)染。在24h后，如述確定細(xì)胞活力。數(shù)據(jù)以與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比的存活細(xì)胞％顯示。

圖7：小鼠肺的報告蛋白表達水平。PAA20k-(2-3-2)和編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA的多聚絡(luò)合物以所示N/P比混合，并通過氣霧劑施用于小鼠。

圖8：N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(2-3-2)修飾的聚(丙烯酸)的物理化學(xué)特性。在體內(nèi)條件下以N/P 10形成多聚絡(luò)合物。所用多聚體：聚(丙烯酸)，MW 20,000Da。

圖9：PAA20k-(2-3-2)和mRNA的透射電子顯微術(shù)圖。多聚絡(luò)合物以N/P 10混合，并通過透射電子顯微術(shù)進行分析。比例條：100nm。所用多聚體：聚(丙烯酸)，MW 20,000Da。

圖10：多聚絡(luò)合物制劑氣霧劑施用后螢火蟲熒光素酶在豬肺組織中的表達。左圖brPEI N/P 10。右圖PAA20k-(2-3-2)N/P 10。所用多聚體：聚(丙烯酸)，MW 20,000Da。

圖11：海藻糖對凍干PAA20k-(2-3-2)絡(luò)合物的能力的影響。絡(luò)合物如述形成，并在存在或不存在1％海藻糖的情況下被凍干。經(jīng)證明，海藻糖能夠保持這些絡(luò)合物在凍干和再水化后的mRNA轉(zhuǎn)染效率。

圖12：(2-3-2)和(3-2-3)修飾的多聚體對DNA轉(zhuǎn)染效率的影響。利用具有所示側(cè)鏈修飾的聚(丙烯酸)(MW：8,000Da)和編碼螢火蟲熒光素酶的pDNA(pCMVLuc)，形成N/P比在4和20之間的多聚絡(luò)合物。在24h后，將用不同量的DNA(500、250、125或62.5ng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞溶解并分析熒光素酶活性。作為對照，分支PEI(brPEI)25kDa用作轉(zhuǎn)染試劑。

圖13：利用GL3-Luc-siRNA和N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(2-3-2)修飾的聚(丙烯酸)的絡(luò)合物，RNAi引起基因沉默。將穩(wěn)定表達螢火蟲熒光素酶的HeLa細(xì)胞用所示N/P比和不同siRNA量的抗螢火蟲熒光素酶siRNA(siLuc)的siRNA或?qū)φ誷iRNA(siGFP)和PAA20k-(2-3-2)的絡(luò)合物轉(zhuǎn)染。在24h后分析熒光素酶表達并顯示為與未處理細(xì)胞相比的相對表達。

圖14：NIH3T3細(xì)胞用不同類脂質(zhì)/mRNA絡(luò)合物轉(zhuǎn)染后的螢火蟲熒光素酶活性。形成mRNA與基于(2-3-2)或?qū)φ展?亞烷基胺)(2-2-2)和(3-3-3)的類脂質(zhì)之間w/w比(類脂質(zhì)重量/mRNA重量)為16的絡(luò)合物。

圖15：聚(丙烯酸)的寡(亞烷基胺)側(cè)鏈修飾對DNA轉(zhuǎn)染效率的影響。利用所示N/P比的具有所示側(cè)鏈修飾的聚(丙烯酸)(MW：8,000Da)和編碼螢火蟲熒光素酶的pDNA(pCMVLuc)形成多聚絡(luò)合物。在24h后，將用不同量的DNA(500、250、125或62.5ng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞溶解并分析熒光素酶活性。與mRNA轉(zhuǎn)染(參見圖1)相比，寡(亞烷基胺)側(cè)鏈修飾不顯著影響轉(zhuǎn)染效率。

圖16：靜脈內(nèi)注射類脂質(zhì)制劑后螢火蟲熒光素酶在鼠肝和脾中的表達。左：與類脂質(zhì)C12-(2-3-2)(C12-(2-3-2)∶DOPE∶膽固醇∶DSPE-PEG2k；3.6∶0.18∶0.76∶1重量比)一起配制在注射用PBS中編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA；右：與類脂質(zhì)C12-(2-3-2)(C12-(2-3-2)∶DOPE∶膽固醇∶DSPE-PEG2k；3.6∶0.18∶0.76∶1重量比)一起在注射用水中配制的編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA。僅PBS中的制劑導(dǎo)致在肝和脾中表達(PBS：1.6404x10^5光子/s；水：檢測不到)。

圖17：靜脈內(nèi)注射類脂質(zhì)制劑后螢火蟲熒光素酶在鼠肝和脾中的表達。A.體內(nèi)生物發(fā)光圖像：左：與類脂質(zhì)C14-(2-3-2)(C14-(2-3-2)∶DOPE∶膽固醇∶DSPE-PEG2k；8∶6∶5∶1)一起配制在注射用PBS中的編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA；中：與類脂質(zhì)C16-(2-3-2)(C16-(2-3-2)∶DOPE∶膽固醇∶DSPE-PEG2k；8∶6∶5∶1)一起配制在注射用PBS中的編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA；右：與類脂質(zhì)C12-(2-3-2)(C12-(2-3-2)∶DOPE∶膽固醇∶DSPE-PEG2k；8∶6∶5∶1)一起配制在注射用PBS中的編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA。B.體內(nèi)生物發(fā)光信號的定量。表達水平隨烷基鏈長度從C12至C16增加而降低。

圖18：靜脈內(nèi)注射類脂質(zhì)制劑后螢火蟲熒光素酶在鼠肝和脾中的表達。從圖17中顯示的治療后的小鼠切除肝、脾、腎、胃、心臟、肺和腦，并關(guān)于熒光素酶表達成像。A.生物發(fā)光圖像：左：與類脂質(zhì)C12-(2-3-2)(C12-(2-3-2)∶DOPE∶膽固醇∶DSPE-PEG2k；8∶6∶5∶1)一起配制在注射用PBS中的編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA；中：與類脂質(zhì)C14-(2-3-2)(C14-(2-3-2)∶DOPE∶膽固醇∶DSPE-PEG2k；8∶6∶5∶1)一起配制在注射用PBS中的編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA；右：與類脂質(zhì)C16-(2-3-3)(C16-(2-3-2)∶DOPE∶膽固醇∶DSPE-PEG2k；8∶6∶5∶1)一起配制在注射用PBS中的編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA。肝中的熒光素酶表達隨類脂質(zhì)烷烴鏈長度增加而減少(C16＜C14＜C12)，并且C16的難檢測到。C14的脾中的熒光素酶表達最高。肺中觀察到一定熒光素酶表達，但心臟、腎、胃或腦中觀察不到。B.A的生物發(fā)光信號的定量。

圖19：不同轉(zhuǎn)染試劑對于其遞送pDNA和mRNA的能力的影響的比較。利用所示轉(zhuǎn)染試劑(根據(jù)相應(yīng)專利WO 2011/154331的命名的結(jié)構(gòu)：#46C-Stp3-C-K-OleA2；#454：C-Y3-Stp2-K(K-OleA2)-Stp2-Y3-C；#512：C-Sph3-K(Sph3-C)2)形成多聚絡(luò)合物。作為核酸負(fù)載，采用所示N/P比的編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA或pDNA(pCMVLuc)。在24h后，將用不同量的mRNA(500、250、125或63ng)轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞溶解并分析熒光素酶活性。

圖20：經(jīng)N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(2-3-2)或N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丁二胺(2-4-2)修飾的PAA8k的轉(zhuǎn)染效率的比較。利用所示N/P比的經(jīng)N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(2-3-2)或N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丁二胺(2-4-2)修飾的PAA8k和編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA，形成多聚絡(luò)合物。在24h后，將用不同量的mRNA(500、250、125或63ng)轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞溶解并分析熒光素酶活性。

圖21：脂質(zhì)絡(luò)合物的透射電子顯微術(shù)圖

如述形成類脂質(zhì)/mRNA絡(luò)合物并通過透射電子顯微術(shù)進行分析。上道：C10-(2-3-2)/DOPE/Chol/DPG-PEG，下道：C10-(2-3-2)/DPPC/Chol/DPG-PEG；左圖概覽比例：100nm；右圖：細(xì)節(jié)放大比例20nm。

圖22：由1-溴癸烷合成的C10-(2-3-2)的轉(zhuǎn)染效率

如在制備實施例VII描述，利用1-溴癸烷合成C10-(2-3-2)。利用每孔500ng、250ng和125ng的劑量在NIH3T3細(xì)胞上測試轉(zhuǎn)染效率。

圖23：由N-十二烷基丙烯酰胺合成的C12-(2-3-2)的轉(zhuǎn)染效率

如制備實施例VIII描述，利用N-十二烷基丙烯酰胺合成C12(2-3-2)。利用每孔500ng、250ng和125ng的劑量在NIH3T3細(xì)胞上測試轉(zhuǎn)染效率。

圖24：由十二烷基-丙烯酸酯合成的C12-(2-3-2)的轉(zhuǎn)染效率

如制備實施例IX描述，利用十二烷基-丙烯酸酯合成C12-(2-3-2)。利用每孔500ng、250ng和125ng的劑量在NIH3T3細(xì)胞上測試轉(zhuǎn)染效率。

圖25：基于C12-(2-3-2)的類脂質(zhì)制劑的轉(zhuǎn)染效率。利用C12-(2-3-2)和DMG-PEG2k與具有編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA的DOPE或DSPC在N/P 17或8下的組合，生成類脂質(zhì)制劑。

圖26：C12修飾寡(烷基胺)(2-3-2)、(3-3-3)和(2-2-2)關(guān)于體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率的比較。

圖27：C12烷基鏈飽和度和定位相異的C12-(2-3-2)形式的轉(zhuǎn)染效率的比較。A：不同C12-(2-3-2)形式的化學(xué)結(jié)構(gòu)；B：NIH3T3細(xì)胞用包括不同脂質(zhì)的制劑轉(zhuǎn)染后的報告蛋白(螢火蟲熒光素酶)表達水平。

圖28：脂質(zhì)絡(luò)合物的凍干穩(wěn)定性

如述形成類脂質(zhì)制劑，對水透析，并與不同濃度的凍干保護劑(海藻糖(A、D)、蔗糖(B、E)和乳糖(C、F))混合。在冷凍、凍干和重懸浮后，測量對NIH3T3細(xì)胞(A-C)的轉(zhuǎn)染效率和流體力學(xué)直徑(D-F)，并與相同條件下的新制脂質(zhì)絡(luò)合物比較。

圖29：用包含C12-(2-3-2)的類脂質(zhì)制劑的轉(zhuǎn)染后離體樣本中的mRNA表達。A：豬肌肉，所有處理的樣本；B：豬脂肪組織，所有處理的樣本；C：綿羊動脈；D：綿羊肌肉，上方樣本：處理的，下方樣本：未處理的；E：綿羊肺，上方樣本：處理的，下方樣本：未處理的。

圖30：細(xì)胞溶解物的關(guān)于ACE-2蛋白的Western印跡分析。左道：ACE-2 mRNA處理后的細(xì)胞的溶解物；右道：無mRNA(空)類脂質(zhì)制劑處理的細(xì)胞的溶解物。上排：ACE-2染色；下排：GAPDH，負(fù)載對照。

圖31：鼠促紅細(xì)胞生成素在小鼠內(nèi)的表達。在靜脈內(nèi)給予包含mEPO mRNA的C12-(2-3-2)制劑后6h，分析血液樣本的mEPO。分析三種不同RNA劑量(20μg、10μg或5μg)和對照組(PBS)。

圖32：不同修飾的聚(烯丙基胺)(PALAM)的轉(zhuǎn)染效率的比較。利用由與PALAM-(2-3-2)、PALAM-(2-2-2)或PALAM-(3-3-3)絡(luò)合的編碼熒光素酶的mRNA構(gòu)成的多聚絡(luò)合物轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞。

圖33：不同修飾的聚聚亞丙基亞胺(PPI)的轉(zhuǎn)染效率的比較。利用由與PPI-(2-3-2)、PPI-(2-2-2)或PPI-(3-3-3)絡(luò)合的編碼熒光素酶的mRNA構(gòu)成的多聚絡(luò)合物轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞。

圖34：皮下注射C12-(2-3-2)制劑后的熒光素酶表達。包含編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA的C12-(2-3-2)/DOPE/膽固醇/DMG-PEG 2k。

圖35：口服給予修飾的編碼FFL的mRNA的(類脂質(zhì))制劑后螢火蟲熒光素酶(FFL)在大鼠GI道中的表達。

A：作為膠囊口服施用。右：如實施例29描述，編碼FFL的mRNA與類脂質(zhì)C12-(2-3-2)和助劑脂質(zhì)DSPC、膽固醇和DPG-PEG 2000一起以8：5.29：4.41：0.88的摩爾比配制。凍干后，將相應(yīng)于50μg mRNA的等份裝入明膠膠囊并通過口服灌胃給予雌性Buffalo大鼠。24小時后，將動物處死，收集器官并培育在包含D-熒光素的PBS中。通過生物發(fā)光成像記錄熒光素酶活性。結(jié)果顯示在GI道中廣泛表達(右上圖)，而其它主要器官(肝、脾、腎、心臟、肺；右下圖)不顯示任何熒光素酶信號。著色標(biāo)度碼(上圖右方)和灰度標(biāo)度碼(下圖右方)表示熒光素酶表達水平。

左：相同類脂質(zhì)制劑封裝在PLGA微粒中并冷凍干燥。如實施例29描述，13.6mg等份，相應(yīng)于ca.25μg mRNA，被裝入明膠膠囊并通過口服灌胃給予雌性Buffalo大鼠。24小時后，將動物處死，收集器官并培育在包含D-熒光素的PBS中。通過生物發(fā)光成像記錄熒光素酶活性。結(jié)果顯示在胃腸道中廣泛表達(左上圖)，而其它主要器官(肝、脾、腎、心臟、肺；左下圖)不顯示任何熒光素酶信號。

B：作為液體口服施用。左：如實施例29描述，編碼FFL的mRNA與類脂質(zhì)C12-(2-3-2)和助劑脂質(zhì)一起配制，利用(SpectrumLabs，Breda，NL)濃縮至1.1mg/mL的濃度，并用10xPBS調(diào)節(jié)以得到1x PBS和1mg/ml mRNA的濃度。利用流動室中5％異氟醚麻醉Sprague-Dawley大鼠，并利用灌胃將1ml測試項目直接施加到胃中。基于受損的一般狀況，在4 ¹/₂小時后處死動物。器官培育在包含D-熒光素(100μg/ml)的PBS中。利用生物發(fā)光成像測量熒光素酶活性。結(jié)果表明腸中和器官中均無熒光素酶蛋白質(zhì)表達。

中：殼聚糖顆粒如實施例29所述配制，凍干，和溶于3mL水。在測試項目按時載入后24小時處死大鼠。生物發(fā)光成像表明腸中和任何器官中均無熒光素酶表達。

右：PLGA微粒如實施例29描述形成，并在凍干后重懸浮于3mL水中。在測試項目按時載入后24小時處死大鼠。生物發(fā)光成像表明腸中和任何器官中均無熒光素酶表達。

圖36：作為膠囊的口服施用，第二實驗。利用灌胃將包含海藻糖(對照)、在無微粒情況下絡(luò)合至C12-(2-3-2)的在有微粒(“MP”)情況下絡(luò)合至C12-(2-3-2)的(根據(jù)WO2011/012316修飾的RNA)和與PEI絡(luò)合的的膠囊直接施加到雌性Sprague-Dawley大鼠的胃中。絡(luò)合物制備如實施例29描述。24小時后離體確定整個腸中和在器官(肝、脾、胃和腎)中熒光素酶蛋白的表達。利用這種方法，在接受海藻糖填充膠囊的大鼠中未發(fā)現(xiàn)表達。在絡(luò)合至C12-(2-3-2)而未并入微粒中時，在發(fā)現(xiàn)腸中和胃中的表達。與C12-(2-3-2)絡(luò)合的并入微粒導(dǎo)致熒光素酶在腸中的表達增加和胃中無表達。與PEI絡(luò)合的產(chǎn)生腸、胃和驚人地腎中的熒光素酶表達。

下列實施例用于示例本發(fā)明。

制備實施例I：

合成N，N’-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺修飾的聚(丙烯酸)，MW8,000Da，PAA8k-(2-3-2)：

將10mg聚(丙烯酸)鈉鹽(MW：8,000Da，Sigma Aldrich)稀釋在2mL包含50mM MES，pH 6.0的反應(yīng)緩沖劑中。將1.69gN，N’-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(100eq./羧基，Sigma Aldrich)稀釋在2mL相同緩沖劑中。由于寡(亞烷基胺)作為游離堿被購入，通過滴加32％HCl將pH重新調(diào)節(jié)至pH 6.0。混合聚(丙烯酸)和寡(亞烷基胺)溶液。為開始反應(yīng)，添加每個羧基10倍摩爾過量的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC，Sigma Aldrich，稀釋在2mL反應(yīng)緩沖劑中)。將最終體積調(diào)節(jié)至10mL。在架空振動器上將混合物在RT下培育3h。通過透析純化產(chǎn)物。為此目的，將反應(yīng)混合物裝入slide-a-lyzer透析盒(3-12mL，MWCO：3,500Da，Thermo Fisher)并對水透析72h。每天換水兩次。在透析后將純化的多聚體凍干。

在相同條件下合成并測試下表1列出的多聚體：

制備實施例II：

通過固相支持的肽合成，合成用于生成刷樣多聚體的寡(亞烷基胺)構(gòu)建模塊：

I.合成三(Boc)保護的N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(EPE(Boc)₃)。

將5gN，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(31.2mmol)溶于100mL二氯甲烷(DCM)并冷卻至0℃。4.43g三氟乙酸乙酯(31.2mmol，1eq./分子)稀釋在100mL DCM中并經(jīng)4h時間滴加至攪拌溶液。在添加后，將溶液在RT下攪拌過夜。第二天，將19.46mL三乙基胺(14.2g，0.1404mol，1.5eq./游離胺)添加至反應(yīng)混合物。30.64g二-叔丁基二碳酸酯(0.1404mol，1.5eq./胺)溶于100mL DCM，滴加至攪拌溶液，并在恒定攪拌下在RT培育24h。反應(yīng)后，將有機相濃縮至大約100mL，并用5％NaHCO₃洗滌3次和用水洗滌3次。將有機相經(jīng)無水Na₂SO₄干燥，過濾，并蒸發(fā)溶劑。將產(chǎn)物稀釋在100mL甲醇和200mL3M NaOH(20eq./分子)中，并在RT下攪拌過夜。將甲醇蒸發(fā)，并將水溶液用DCM洗滌3次。收集有機相，經(jīng)無水Na₂SO₄干燥，過濾和蒸發(fā)。通過H¹-NMR分析得到的分子(EPE(Boc)₃)。

II.合成Fmoc-谷氨酸修飾的boc化的N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(Fmoc-Glu(EPE(Boc)₃-OH)。

將3.5g N-(9-芴基甲氧基羰基)-L-谷氨酸(Fmoc-Glu-OH，9.47mmol)與100mL乙酸酐混合，在油浴中在回流和恒定攪拌下加熱至100℃，直到溶液變澄清。使溶液在冰中冷卻下來，并通過60℃真空蒸發(fā)去除溶劑。將產(chǎn)物溶于100mL四氫呋喃。將5.24g EPE(Boc)₃(11.37mmol，1.2eq./分子)稀釋在100mL四氫呋喃中，與3.3mL N，N-二異丙基乙基胺(18.94mmol，2eq./分子)混合，并添加至包含谷氨酸的溶液。將反應(yīng)混合物在RT下攪拌2h。在溶液通過蒸發(fā)濃縮后，將其稀釋在DCM中，并用檸檬酸三鈉緩沖劑(0.1M，pH 5.5)洗滌3次。有機相經(jīng)無水Na₂SO₄干燥后，在二氧化硅柱上利用庚烷/乙酸乙酯(50/50至0/100)和乙酸乙酯/甲醇(100/0至80/20)的分步梯度通過干柱快速色譜純化樣本。合并二氧化硅TLC上包含UV信號的餾分，蒸發(fā)溶劑，并通過H¹-NMR分析產(chǎn)物。

制備實施例III：

通過固相支持的肽合成，合成用于生成線性和分支多聚體的寡(亞烷基胺)構(gòu)建模塊：

I.合成二(Boc)保護的N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(EPE(Boc)₂)。

將5gN，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(31.2mmol)溶于100mL二氯甲烷(DCM)并冷卻至0℃。將8.86g三氟乙酸乙酯(62.4mmol，2eq./分子)稀釋在100mL DCM中并經(jīng)4h時間滴加至攪拌溶液。在添加后，將溶液在RT下攪拌過夜。第二天，將13mL三乙基胺(9.47g，0.0936mol，1.5eq./游離胺)添加至反應(yīng)混合物。將20.43g二-叔丁基二碳酸酯(0.0936mol，1.5eq./胺)溶于100mL DCM，滴加至攪拌溶液，并在恒定攪拌下在RT培育24h。反應(yīng)后，將有機相濃縮至大約100mL，并用5％NaHCO₃洗滌3次和用水洗滌3次。將有機相經(jīng)無水Na₂SO₄干燥，過濾，并蒸發(fā)溶劑。將產(chǎn)物稀釋在100mL甲醇和200mL3M NaOH(20eq./分子)中，并在RT下攪拌過夜。將甲醇蒸發(fā)，并將水溶液用DCM洗滌3次。收集有機相，經(jīng)無水Na₂SO₄干燥，過濾和蒸發(fā)。通過H¹-NMR分析得到的分子(EPE(Boc)₂)。

II.合成琥珀?；?、fmoc-保護的、boc化的N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(Fmoc-EPE(Boc)₂-OH)。

將3.0g(EPE(Boc)₂)(8.3mmol)溶于50mL四氫呋喃并冷卻至0℃。將0.996g琥珀酸酐(10mmol，1.2eq./分子)溶于200mL四氫呋喃并滴加至攪拌溶液。在添加后，將反應(yīng)在RT下再攪拌1小時。添加4.34mL N，N-二異丙基乙基胺(33.2mmol，4eq./分子)。然后，將溶于乙腈/四氫呋喃的4.2g Fmoc N-羥基琥珀酰亞胺酯(12.45mmol，1.5eq./分子)滴加至反應(yīng)混合物。溶液攪拌過夜。將反應(yīng)混合物濃縮至大約100ml，與100ml二氯甲烷混合，并用0.1M檸檬酸鈉緩沖劑(pH 5.2)洗滌5次。將有機相干燥，濃縮，并在二氧化硅柱上利用正庚烷至乙酸乙酯(100/0-0/100)和進一步至乙酸乙酯/甲醇(100/0-80/20)的分步梯度通過干柱快速色譜純化得到的產(chǎn)物。合并二氧化硅TLC上包含UV信號的餾分，蒸發(fā)溶劑，并通過H¹-NMR分析產(chǎn)物。

制備實施例IV：

合成基于N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺的類脂質(zhì)

將100mgN，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(0.623mmol)與575.07mg 1，2-環(huán)氧癸烷(3.12mmol，(N-1)等份，其中N是每個寡(亞烷基胺)的伯胺的2x量加仲胺的1x量)混合，并在恒定振蕩下在80℃混合96h。反應(yīng)后，將得到的類脂質(zhì)以100μg/mL濃度稀釋在25mM乙酸鈉緩沖劑(ph 5)中，并用于轉(zhuǎn)染。

在相同條件下合成表2列出的類脂質(zhì)：

制備實施例V：

合成N，N’-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺修飾的聚(烯丙基胺)；(PALAM-(2-3-2))

將500mg聚(烯丙基胺)-溶液(Sigma-Aldrich，20％w/w，分子量：17,000Da)稀釋在2mL包含50mM MES、pH 6.0的反應(yīng)緩沖劑中。將10.33g琥珀酸(每胺50eq.，Sigma-Aldrich)稀釋在5mL相同反應(yīng)緩沖劑中。合并溶液，并將pH重新調(diào)節(jié)至6.0。為開始反應(yīng)，添加稀釋在5mL反應(yīng)緩沖劑中的3.36g 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC，每胺10eq.，Sigma Aldrich)。在架空振動器上將混合物在RT下培育3h。通過透析純化產(chǎn)物。為此目的，將反應(yīng)混合物裝入slide-a-lyzer透析盒(3-12mL，MWCO：10,000Da，Thermo Fisher)并對水透析72h。每天換水兩次。在透析后將純化的多聚體凍干。

將5mg凍干的琥珀酸修飾的聚(烯丙基胺)稀釋在包含50mM MES、pH 6.0的2mL反應(yīng)緩沖劑中。將510.38mg N，N’-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(100eq./羧基，Sigma Aldrich)稀釋在2mL相同緩沖劑中。由于寡(亞烷基胺)作為游離堿被購入，通過滴加32％HCl將pH重新調(diào)節(jié)至pH 6.0?；旌暇?烯丙基胺)和寡(亞烷基胺)溶液。為開始反應(yīng)，添加每份羧基10倍摩爾過量的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC，Sigma Aldrich，稀釋在4mL反應(yīng)緩沖劑中)。將最終體積調(diào)節(jié)至10mL。在架空振動器上將混合物在RT下培育3h。通過透析純化產(chǎn)物。為此目的，將反應(yīng)混合物裝入slide-a-lyzer透析盒(3-12mL，MWCO：3,500Da，Thermo Fisher)并對水透析72h。每天換水兩次。在透析后將純化的多聚體凍干。

在相同條件下合成并測試下表3列出的多聚體：

制備實施例VI：

合成N，N’-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺修飾的聚亞丙基亞胺(PPI-(2-3-2))

將100mg聚亞丙基亞胺十六胺樹枝狀聚合物(PPI，3.0代，Sigma Aldrich)溶于包含50mM MES、pH 6.0的1.5mL反應(yīng)緩沖劑中。將11.2g琥珀酸(100eq./伯胺，Sigma-Aldrich)溶于30mL相同反應(yīng)緩沖劑中。合并溶液，并將pH重新調(diào)節(jié)至6.0。為開始反應(yīng)，添加稀釋在2mL反應(yīng)緩沖劑中的1.81g 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC，10eq./伯胺，Sigma Aldrich)。在架空振動器上將混合物在RT下培育過夜。通過透析純化產(chǎn)物。為此目的，將反應(yīng)混合物裝入slide-a-lyzer透析盒(3-12mL，MWCO：2,000Da，Thermo Fisher)并對水透析72h。每天換水兩次。在透析后將純化的多聚體凍干。

將10mg凍干的琥珀酸修飾的PPI在稀釋在包含50mM MES、pH 6.0的2mL反應(yīng)緩沖劑中。將0.776gN，N’-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(100eq./羧基，Sigma Aldrich)稀釋在2mL相同緩沖劑中。由于寡(亞烷基胺)作為游離堿被購入，通過滴加32％HCl將pH重新調(diào)節(jié)至pH 6.0?；旌暇蹃啽鶃啺泛凸?亞烷基胺)溶液。為開始反應(yīng)，添加每份羧基10倍摩爾過量的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC，Sigma Aldrich，稀釋在4mL反應(yīng)緩沖劑中)。將最終體積調(diào)節(jié)至10mL。在架空振動器上將混合物在RT下培育5h。通過透析純化產(chǎn)物。為此目的，將反應(yīng)混合物裝入slide-a-lyzer透析盒(3-12mL，MWCO：3,500Da，Thermo Fisher)并對水透析72h。每天換水兩次。在透析后將純化的多聚體凍干。

在相同條件下合成并測試下表4列出的多聚體：

制備實施例VII：

合成基于N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺和1-溴癸烷的類脂質(zhì)

將100mgN，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(0.623μmol)與10mL四氫呋喃(THF)混合。將815.2μL N，N-二異丙基乙基胺(DIPEA)和690.1mg 1-溴癸烷(3.12μmol，(N-1)eq.，其中N是每份寡(亞烷基胺)的伯胺的2x量加仲胺的1x量)在恒定振蕩下在室溫混合22h。將產(chǎn)物在冷正己烷中沉淀兩次并溶于DCM。在60℃下通過蒸發(fā)去除溶劑。將得到的類脂質(zhì)以50mg/mL濃度稀釋在乙醇中并在4℃下儲存。

制備實施例VIII：

合成基于N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺和N-十二烷基丙烯酰胺的類脂質(zhì)

將100mgN，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(0.623μmol)與746.9mg N-十二烷基丙烯酰胺(3.12μmol，(N-1)eq.，其中N是每份寡(亞烷基胺)的伯胺的2x量加仲胺的1x量)混合并在恒定振蕩下在90℃混合192h。將得到的類脂質(zhì)以50mg/mL濃度稀釋在乙醇中并在4℃下儲存。

制備實施例IX：

合成基于N,N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺和十二烷基丙烯酸酯類脂質(zhì)

將100mgN，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(0.623μmol)與750mg十二烷基丙烯酸酯(3.12μmol，(N-1)eq.，其中N是每份寡(亞烷基胺)的伯胺的2x量加仲胺的1x量)混合并在恒定振蕩下在90℃混合22h。將得到的類脂質(zhì)以50mg/mL濃度稀釋在乙醇中并在4℃下儲存。

制備實施例X：

合成基于N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺和1，2-環(huán)氧癸烷的類脂質(zhì)

將100mgN，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(0.623mmol)與575.07mg 1，2-環(huán)氧癸烷(3.12mmol，(N-1)eq.，其中N是每份寡(亞烷基胺)的伯胺的2x量加仲胺的1x量)混合并和在恒定振蕩下在80℃混合96h。將得到的類脂質(zhì)以50mg/mL濃度稀釋在乙醇并在4℃下儲存。

實施例1

測試陽離子多聚體其運送mRNA到不同細(xì)胞系中的能力

材料和方法

多聚絡(luò)合物形成：

關(guān)于體外轉(zhuǎn)染，形成44μL體積的多聚絡(luò)合物。將包含1100ng編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA(化學(xué)修飾的mRNA，分別包括25％的5-甲基胞苷和2-硫代尿苷)的22μL注射用水與包含期望量多聚體的22μL注射用水混合。多聚體/RNA比限定為多聚體氮/核酸磷酸基(N/P)，并利用恒定量的核酸進行測試。在混合核酸與多聚體后，將樣本在RT下培育30min并用于轉(zhuǎn)染。

多聚絡(luò)合物的體外轉(zhuǎn)染：

基于2種不同細(xì)胞系(NIH3T3和A549)測試了多聚體的轉(zhuǎn)染效率。在處理前4h，將100μL介質(zhì)中的5,000個細(xì)胞(NIH3T3)或7,000個細(xì)胞(A549)接種到96孔板的孔中。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，如述形成多聚絡(luò)合物。為測試不同mRNA量，進行連續(xù)稀釋，混合50％的多聚絡(luò)合物溶液與相同量的介質(zhì)(無FCS)，用此溶液進行類似的再一稀釋步驟，等等，直到達到最終濃度62.5ng/20μL。在無介質(zhì)更換的情況下，將20μL每步稀釋液添加至細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24h，去除介質(zhì)。通過添加100μl溶解緩沖劑(25mM Tris HCl，0.1％TritonX 100，pH 7.8)和在RT下培育20min，使細(xì)胞溶解。將80μL溶解物裝入白色96孔板的孔中，并用于在Wallac Victor²(Perkin Elmer)中熒光素酶活性測量。為此目的，添加100μL熒光素酶測定反應(yīng)劑(0.5mM D-熒光素、0.3mM輔酶A、33mM DTT、0.5mM ATP、1mM碳酸鎂、2.7mM硫酸鎂、0.1mM EDTA、20mM tricine)，并確定化學(xué)發(fā)光。實驗重復(fù)進行三次。

結(jié)果

如圖1所示，不同修飾的多聚體之間熒光素酶表達水平變化很大。利用PAA8k-(2-3-2)或PAA8k-(3-2-3)可實現(xiàn)對所有細(xì)胞類型最有效的轉(zhuǎn)染水平，相比之下包含其中一個烷基鏈被替代((2-2-2)和(3-3-3))或去除(2-2)的寡(亞烷基胺)側(cè)鏈的修飾多聚體效率急劇下降10-1000倍。寡(亞烷基胺)中所有烷基鏈加長(3-4-3)也使效率下降100倍。

實施例2

(2-3-2)和(3-2-3)修飾的PAA8k的絡(luò)合物形成和mRNA結(jié)合能力

材料和方法

凝膠遷移測定：

如實施例1描述以N/P 1、2、4、8和12形成多聚絡(luò)合物。在培育后，將5μL樣本與負(fù)載染料(Fermentas)的5μL 2x RNA混合，在70℃下培育10min，并負(fù)載到包含溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠上。凝膠遷移在TBE-緩沖劑中在150V下進行30min。通過260nm的UV吸收可視化遷移的核酸。

RiboGreen測定：

如實施例1描述以N/P 1、2、4、8和12形成多聚絡(luò)合物。在培育后，將2μL樣本與148μL水和50μL RiboGreen溶液(1∶200，QuantiT RiboGreen RNA測定試劑盒，Invitrogen)在白色96孔板中混合。將樣本在蔽光下在RT培育5min，并利用Wallac Victor²(Perkin Elmer，1s，Ex.：485nm，Em.：535nm)測量熒光。

結(jié)果

多聚體與核酸相互作用形成穩(wěn)定絡(luò)合物的能力是有效運送系統(tǒng)的關(guān)鍵特征。通過凝膠遷移(圖2)和RiboGreen測定(圖3)分析修飾多聚體與mRNA的相互作用。當(dāng)多聚體能夠與核酸相互作用形成穩(wěn)定的絡(luò)合物時，這導(dǎo)致納米尺寸的顆粒和電荷反演(inversion)。兩種效果導(dǎo)致瓊脂糖凝膠電泳期間遷移能力受阻。如圖2所示，與無多聚體(N/P 0)的對照相比，經(jīng)(2-3-2)或(3-2-3)修飾的PAA8k導(dǎo)致游離mRNA缺失/劇烈減少，表明強烈的相互作用。這種結(jié)合與黃金標(biāo)準(zhǔn)分支PEI(brPEI)一般有效。

利用RiboGreen測定可驗證這些數(shù)據(jù)。在此測定中，結(jié)合效率增加導(dǎo)致熒光信號減少。如圖3所示，PAA8k-(2-3-2)和-(3-2-3)的熒光信號減少的程度同brPEI。因此，穩(wěn)定性相似的絡(luò)合物生成。

實施例3

轉(zhuǎn)染效率與多聚體骨架無關(guān)。

材料和方法

根據(jù)實施例1進行多聚絡(luò)合物形成。

多聚絡(luò)合物的體外轉(zhuǎn)染

關(guān)于多聚絡(luò)合物的體外轉(zhuǎn)染和效率測試，使用NIH3T3細(xì)胞。在處理前24h，將包含10％FCS的100μL介質(zhì)中的5,000個細(xì)胞接種到96孔板的孔中。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，使介質(zhì)對無FCS的100μL介質(zhì)交換。如述形成多聚絡(luò)合物。為測試不同mRNA量，將20μL(500ng)、10μL(250ng)、5μL(125ng)和2.5μL(62.5ng)添加至介質(zhì)。在37℃和5％CO2下的4h培育后，將介質(zhì)更換成包含10％FCS的新制介質(zhì)。在轉(zhuǎn)染后24h，去除介質(zhì)。將細(xì)胞溶解并如實施例1描述進行分析。

結(jié)果

為驗證利用(2-3-2)修飾的多聚體運送核酸到細(xì)胞中的能力與骨架結(jié)構(gòu)無關(guān)，在所述條件(表1)下用(2-3-2)修飾不同類型的多聚體(除聚(丙烯酸)，8,000Da實施例1之外)。結(jié)果顯示，不同類型的骨架-多聚體(圖4)以及不同鏈長度(圖5)在用寡(亞烷基胺)(2-3-2)修飾時導(dǎo)致顯著的報告基因表達。

實施例4

用不同類型的寡(亞烷基胺)修飾的多聚體的細(xì)胞毒性的檢驗

材料和方法

轉(zhuǎn)染按照實施例3進行?；罴?xì)胞的確定利用TACS MTT細(xì)胞增殖測定(Trevigen)進行。在轉(zhuǎn)染后24小時，使介質(zhì)對100μl新制介質(zhì)交換。在添加10μl MTT反應(yīng)劑后，將細(xì)胞在37℃和5％CO₂下培育4h。添加100μl洗滌劑反應(yīng)劑，然后進行在RT下過夜的培育步驟。利用Wallac Victor²(Perkin Elmer)通過570nm的吸收測量進行讀出(read out)。結(jié)果顯示為相對于無處理對照的活細(xì)胞％。

結(jié)果

如圖6所示，不同修飾的多聚體在細(xì)胞毒性方面相異。雖然用包含(2-3-2)和(3-2-3)修飾的聚(丙烯酸)的絡(luò)合物處理的細(xì)胞顯示活力在100％左右(PAA8k-(2-3-2)、PAA8k-(3-2-3)、PAA20k-(2-3-2)、PAA70k-(2-3-2))，但側(cè)鏈類型的其它變動產(chǎn)生與毒性標(biāo)準(zhǔn)(brPEI)相當(dāng)?shù)膹姸拘?PAA8k-(3-4-3)、PAA8k-(3-3-3))。

實施例5

小鼠中的信使RNA運送效率

材料和方法

動物：

由Janvier，Route Des SecsBP5，F(xiàn)-53940Le Genest St.Isle，法國獲得6至8周齡的雌性BALB/c小鼠，并飼養(yǎng)在無特定病原體的條件下。在實驗前使小鼠適應(yīng)動物設(shè)施的環(huán)境至少7天。所有動物程序均被當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會批準(zhǔn)并監(jiān)管，并且根據(jù)德國動物生命保護法(the German law of protection of animal life)的指導(dǎo)進行。

多聚絡(luò)合物形成：

如下配制多聚絡(luò)合物：將mRNA和PAA20k-(2-3-2)稀釋在4.0ml雙蒸水中，形成500μg/ml濃度的mRNA和相當(dāng)于N/P 10、20、30或40濃度的PAA20k-(2-3-2)。將mRNA溶液移液至多聚體溶液，通過上下移液混合，產(chǎn)生250μg/ml的最終mRNA濃度。在使用前將絡(luò)合物在環(huán)境溫度下培育20min。

氣霧劑裝置的設(shè)計：

關(guān)于全身裝置中的霧化程序，將小鼠置于可用蓋密封的9.8×13.2×21.5cm塑料箱中。在箱子的一個窄側(cè)，布置四個小孔作為氣霧劑流出口。通過相反窄側(cè)的孔，將箱子通過2.1cm直徑的連接件與連接至15.4cm寬×41.5cm長的塑料圓筒。圓筒底部均勻地鋪蓋150g硅膠(1-3mm，#85330；Fluka，Switzerland)以干燥通過連接至圓筒另一端的噴射式噴霧器( LC plus，PARI GmbH)產(chǎn)生的氣霧劑。(詳細(xì)內(nèi)容描述于Rudolph等，J Gene Med.2005，7：59-66)。

利用體內(nèi)生物發(fā)光成像測量小鼠肺中的Luc活性：

在給藥后24小時，通過頸椎脫位對小鼠實施安樂死。在通過中線切開打開腹腔后，解剖動物的肺，并用PBS灌流。將肺在液氮中速凍并在冷凍狀態(tài)下均質(zhì)化。在添加400μl溶解緩沖劑(250mM Tris pH 7.8，0.1％Triton X-100，Roche完全蛋白酶抑制劑混合物片劑)和在冰上培育20min后，利用Lumat LB9507管式發(fā)光計(EG&G Berthold，MuniCH，德國)測量上清液中的熒光素酶活性。

結(jié)果

實驗顯示，作為與PAA20k-(2-3-2)的組合，在肺部氣霧劑遞送后，mRNA在小鼠肺細(xì)胞中被有效表達，表明多聚體能夠有效在體內(nèi)運送mRNA到肺細(xì)胞中(參見圖7)。

實施例6

豬中的信使RNA運送效率

材料和方法

多聚絡(luò)合物形成：

關(guān)于體內(nèi)轉(zhuǎn)染，形成28mL體積的多聚絡(luò)合物。制備包含5，83mg編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA和1，17mg編碼β-半乳糖苷酶的mRNA的14mL注射用水和包含期望量多聚體的14mL注射用水，并通過雙通道注射器泵(KDS-210-CE；KD Scientifc)混合。利用裝置的吸液功能填充兩個20mL注射器。通過T型件(Discofix C 3SC，B.Braun)連接注射器和利用混合裝置的灌注功能進行混合。將多聚體/mRNA比限定為多聚體氮/核酸磷酸基(N/P)，并以N/P 10進行測試。在混合核酸與多聚體后，將樣本在RT下培育30min，并將24mL用于霧化。剩余體積用于物理化學(xué)分析。利用Zetasizer Nano ZS(Malvem Instruments)確定純樣本的顆粒尺寸和ζ電位。

對豬氣霧劑施用的實驗程序：

通過阿扎哌隆(azaperone)2mg/kg體重、凱他明(ketamine)15mg/kg體重、阿托品(atropine)0.1mg/kg體重預(yù)先引起開始豬的鎮(zhèn)靜，然后將靜脈內(nèi)線插入側(cè)耳靜脈。通過按需靜脈內(nèi)注射丙泊酚(propofol)3-5mg/kg體重將豬麻醉。利用按需持續(xù)靜脈內(nèi)灌注1％丙泊酚維持麻醉。使通風(fēng)參數(shù)匹配呼氣末二氧化碳，并如需進行調(diào)節(jié)。利用脈搏血氧儀，二氧化碳分析儀、直腸溫度探頭和反射狀態(tài)持續(xù)監(jiān)測麻醉、呼吸和心血管參數(shù)。豬接受10ml/kg/h的平衡電解質(zhì)溶液灌注。麻醉持續(xù)時間為大約80-120min。在氣霧劑施用完成(Aeroneb網(wǎng)狀霧化器)后的鎮(zhèn)靜后，利用通過側(cè)耳靜脈彈丸注射戊巴比妥(pentobarbital)100mg/kg體重，將豬處死。將肺切除，并收集來自不同肺區(qū)域的切片的大約1cm厚組織樣品，然后在培育箱中在37℃和5％CO₂下在細(xì)胞培養(yǎng)基中培育24h。為測量熒光素酶活性，將組織樣品在包括PBS中的D-熒光素底物(100μg/ml)的介質(zhì)浴中在37℃培育30min，并進行離體熒光素酶生物發(fā)光成像(IVIS 100、Xenogen，Alameda，USA)。

多聚絡(luò)合物的透射電子顯微術(shù)：

關(guān)于透射電子顯微術(shù)(TEM)，使用一滴生成的用于氣霧劑施用的混合物。將該液滴置于網(wǎng)格(Plano GmbH，Wetzlar)上。培育5min后，利用濾紙去除液滴。樣本用乙酸鈾酰酯溶液染色并通過透射電子顯微鏡進行分析(Jem 1011，Jeol)。

結(jié)果

如圖8所示，N/P比為10的PAA20k-(2-3-2)和mRNA生成直徑在100nm以下并且表面電荷(ζ電位)為40mV的與流體動力學(xué)復(fù)合物的絡(luò)合物。兩參數(shù)均與已顯示有效體內(nèi)運送核酸到細(xì)胞中的基于brPEI的絡(luò)合物在相同大小范圍內(nèi)。在通過TEM分析時，顆粒顯示圓潤形狀和均勻尺寸(圖9)。如圖10所示，這些顆粒能夠在氣霧劑施用后有效遞送mRNA(編碼螢火蟲熒光素酶)到肺組織中，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白質(zhì)表達。表達水平與黃金標(biāo)準(zhǔn)brPEI形成的多聚絡(luò)合物的氣霧化相當(dāng)。

實施例7

絡(luò)合物的凍干穩(wěn)定性

材料和方法

樣本制備

在4個不同小瓶中如實施例1描述形成體積為1mL的N/P20的PAA20k-(2-3-2)/mRNA(編碼metridia熒光素酶)絡(luò)合物。一個小瓶不經(jīng)進一步轉(zhuǎn)染處理使用，向第二小瓶添加100μL 11％海藻糖溶液，生成1％海藻糖的最終體積。第三小瓶凍干并在1mL水中再水化。第四小瓶經(jīng)100μl 11％海藻糖處理，然后凍干并也在1mL水中再水化。

轉(zhuǎn)染：

在轉(zhuǎn)染前24h，將100μL介質(zhì)中的5,000個NIH3T3細(xì)胞接種于96孔板中并在37℃和5％CO2下培育。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將介質(zhì)對無FCS的100μL新制介質(zhì)更換。將20、10、5和2.5μL每種絡(luò)合物溶液添加至細(xì)胞(一式三份)，導(dǎo)致利用500、250、125和62.5ng轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后24h，去除介質(zhì)，收集并用新制介質(zhì)更換。這在48h和72h后重復(fù)進行。分析收集的介質(zhì)的metridia熒光素酶活性。為此，將50μL介質(zhì)裝入白色96孔板，與20μL腔腸素(coelenterazine)溶液(50μM腔腸素在50mM磷酸鈉緩沖劑中)混合，并利用Wallac Victor2(Perkin Elmer)測量化學(xué)發(fā)光信號。

結(jié)果

如圖11所示，新制絡(luò)合物導(dǎo)致24h后methridia熒光素酶表達。表達再保持穩(wěn)定24h，然后緩慢減少。添加海藻糖對這種效果沒有消極影響，而是導(dǎo)致表達水平略微增加。在凍干后，未經(jīng)處理的絡(luò)合物不能夠轉(zhuǎn)染細(xì)胞，導(dǎo)致不存在報告蛋白表達。相比之下，添加海藻糖保護絡(luò)合物和產(chǎn)生的轉(zhuǎn)染效率。

實施例8

PAA8k-(2-3-2)和PAA8k-(3-2-3)作為質(zhì)粒DNA的運送系統(tǒng)的使用

材料和方法

多聚絡(luò)合物形成：

利用編碼螢火蟲熒光素酶的質(zhì)粒DNA(pCMVLuc，Plasmid Factory)代替mRNA，如實施例1描述形成多聚絡(luò)合物。

利用多聚絡(luò)合物的體外轉(zhuǎn)染：

轉(zhuǎn)染實驗如實施例3描述進行。

結(jié)果

在此實驗中，與黃金標(biāo)準(zhǔn)分支PEI(brPEI，圖12)比較分析N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(2-3-2)修飾的多聚體(聚(丙烯酸))在DNA運送和導(dǎo)致的蛋白質(zhì)表達方面的效率。結(jié)果明確顯示，由pDNA和寡(亞烷基胺)(2-3-2)和(3-2-3)修飾的多聚體構(gòu)成的絡(luò)合物對NIH3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致報告蛋白表達顯著增加。表達水平甚至高于黃金標(biāo)準(zhǔn)。

實施例9

PAA20k-(2-3-2)作為siRNA的運送系統(tǒng)以引起RNA干擾的使用

材料和方法

利用GL3-Luc siRNA(Qiagen)，如實施例1描述形成絡(luò)合物。關(guān)于siRNA量的滴定，將絡(luò)合物在RT下30min培育后分步稀釋。為此，將22μL絡(luò)合物溶液與無FCS的22μl介質(zhì)混合。將22μL此稀釋液再與無FCS的22μL介質(zhì)混合。重復(fù)這種連續(xù)稀釋，直到實現(xiàn)7.8ng/20μL的siRNA濃度。利用穩(wěn)定地表達螢火蟲熒光素酶的HeLa細(xì)胞(HeLa-Luc)，按照實施例1描述，將20μL每步稀釋液用于轉(zhuǎn)染。作為熒光素酶表達的基于RNA干擾的下調(diào)的特異性的對照，將不影響細(xì)胞表達(GFP22-siRNA；Qiagen)的對照siRNA用于相同條件下的轉(zhuǎn)染。結(jié)果顯示為相對于無處理的對照細(xì)胞的相對熒光素酶表達。

結(jié)果

如圖13所示，GL3-Luc-siRNA(siLuc)和PAA20k-(2-3-2)的絡(luò)合物導(dǎo)致熒光素酶表達下調(diào)。這種效果是劑量依賴性的(在較低siRNA量下效果降低)和特異性的(對非特異性siRNA(siGFP)無效果)。在較高N/P比下，可觀察到另外的非特異性效果，如siGFP處理的細(xì)胞的信號減少所示。

實施例10

基于寡(亞烷基胺)(2-3-2)的類脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的有益mRNA運送效率

材料和方法

類脂質(zhì)/mRNA絡(luò)合物形成

如制備實施例IV描述合成和稀釋類脂質(zhì)。關(guān)于轉(zhuǎn)染，將50μL水中的250ng編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA與50μL水中的4,000ng類脂質(zhì)在優(yōu)化條件下混合，導(dǎo)致16的w/w比(類脂質(zhì)重量/mRNA重量)。在30min培育后，在RT下將樣本用于轉(zhuǎn)染。

利用類脂質(zhì)/mRNA絡(luò)合物的體外轉(zhuǎn)染

在處理前24h，將100μL介質(zhì)中的5,000個NIH3T3細(xì)胞接種到96孔板的孔中。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，如述形成多聚絡(luò)合物。為測試不同mRNA量，進行連續(xù)稀釋，混合50％的絡(luò)合物溶液與相同量的介質(zhì)(無FCS)，用此溶液進行類似的另外的稀釋步驟，等等，直到達到15.6ng/50μL的最終濃度。在轉(zhuǎn)染前，從細(xì)胞去除介質(zhì)，并換成無FCS的100μL介質(zhì)。將50μL每步稀釋液添加至細(xì)胞并在37℃和5％CO2下培育4h。染后，將介質(zhì)再次換成包含10％FCS的新制介質(zhì)。在轉(zhuǎn)染后24h，去除介質(zhì)。將細(xì)胞溶解，并如實施例1描述分析溶解物的報告蛋白活性。

結(jié)果

如圖14所示，基于結(jié)構(gòu)(2-3-2)的類脂質(zhì)導(dǎo)致螢火蟲熒光素酶表達水平高于基于(2-2-2)或(3-3-3)的相似結(jié)構(gòu)。這種效果可被證明與附接的烷基鏈(C12或C14)無關(guān)。由于螢火蟲熒光素酶活性與其在細(xì)胞中的表達水平有關(guān)因而與mRNA到細(xì)胞中的運送效率有關(guān)，這些結(jié)果顯示基于(2-3-2)的類脂質(zhì)在體外更有效地將mRNA運送到細(xì)胞中。

實施例11

靜脈內(nèi)給予后類脂質(zhì)制劑在小鼠中的信使RNA運送效率

材料和方法

動物：

由Janvier，Route Des SecsBP5，F(xiàn)-53940 Le Genest St.Isle，法國獲得6至8周齡的雌性BALB/c小鼠，并飼養(yǎng)在無特定病原體的條件下。在實驗前使小鼠適應(yīng)動物設(shè)施的環(huán)境至少7天。所有動物程序被當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會批準(zhǔn)和監(jiān)管并且根據(jù)德國動物生命保護法(the German law of protection of animal life)的指導(dǎo)進行。

類脂質(zhì)制劑：

類脂質(zhì)與mRNA一起如下配制：將C12-(2-3-2)、DOPE、Chol和DSPE-PEG2k(3.6∶0.18∶0.76∶1重量比)溶于乙醇并以10.5的脂質(zhì)/mRNA重量比快速注入包括化學(xué)修飾的編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA的檸檬酸鹽緩沖液(10mM檸檬酸，150mM NaCl，pH＝4.5)中，生成20％的最終乙醇濃度，并對水透析。得到的類脂質(zhì)/mRNA絡(luò)合物生成帶正電荷的納米顆粒(92.6±0.7nm；21.0±0.2mV)，并靜脈內(nèi)注入受限制小鼠的尾靜脈。在第二實驗中，在靜脈內(nèi)注射前將類脂質(zhì)/mRNA絡(luò)合物調(diào)整至PBS，生成近乎不帶電荷的納米顆粒(91.5±0.6nm；-0.7±0.2mV)。

利用體內(nèi)生物發(fā)光成像測量小鼠中的Luc活性：

在給藥后24小時，通過腹膜內(nèi)注射美托咪定(medetomidine)(11.5μg/kg BW)、咪達唑侖(midazolame)(115μg/kg BW)和芬太尼(fentanyl)(1.15μg/kg BW)，使小鼠麻醉。通過腹膜內(nèi)注射施加D-熒光素底物(3mg/100μl PBS每只小鼠)。10分鐘后測量生物發(fā)光——利用IVIS 100成像系統(tǒng)(Xenogen，Alameda，USA)和攝像機設(shè)置：Bin(HS)，視野10、f1 f-stop，高分辨率分級和曝光時間5min。利用Living Image軟件2.50版(Xenogen，Alameda，USA)定量和分析信號。

結(jié)果

實驗顯示，只有在類脂質(zhì)/mRNA絡(luò)合物配制在攜帶近乎中性電荷的PBS中時，mRNA在小鼠腹部區(qū)域中被有效表達，而在配制在水中時則不(參見圖16)。

實施例12

靜脈內(nèi)給予后類脂質(zhì)制劑在小鼠中對不同器官的信使RNA運送效率

材料和方法

動物：

由Janvier，Route Des SecsBP5，F(xiàn)-53940 Le Genest St.Isle，法國獲得6至8周齡的雌性BALB/c小鼠，并飼養(yǎng)在無特定病原體的條件下。在實驗前使小鼠適應(yīng)動物設(shè)施的環(huán)境至少7天。所有動物程序被當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會批準(zhǔn)和監(jiān)管并且根據(jù)德國動物生命保護法(the German law of protection of animal life)的指導(dǎo)進行。

類脂質(zhì)制劑：

類脂質(zhì)與mRNA一起如下配制：將類脂質(zhì)、DOPE、Chol和DMPE-PEG2k(8∶6∶5∶1摩爾比)溶于乙醇并以N/P比為15快速注入包括化學(xué)修飾的編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA的檸檬酸緩沖劑(10mM檸檬酸、150mM NaCl，pH＝4.5)溶液，生成20％的最終乙醇濃度，并對水透析。得到的類脂質(zhì)/mRNA絡(luò)合物生成帶正電荷的納米顆粒。在靜脈內(nèi)注射前將類脂質(zhì)/mRNA絡(luò)合物調(diào)整至PBS，產(chǎn)生近乎不帶電荷的納米顆粒(參見表5)。

表5

利用體內(nèi)生物發(fā)光成像測量小鼠中的Luc活性：

在給藥后24小時，通過腹膜內(nèi)注射美托咪定(11.5μg/kg BW)、咪達唑侖(115μg/kg BW)和芬太尼(1.15μg/kg BW)使小鼠麻醉。通過腹膜內(nèi)注射施加D-熒光素底物(3mg/100μl PBS每只小鼠)。10分鐘后測量生物發(fā)光——利用IVIS 100成像系統(tǒng)(Xenogen，Alameda，USA)和攝像機設(shè)置：Bin(HR)，視野10、f1 f-stop，高分辨率分級和曝光時間30s。利用Living Image軟件2.50版(Xenogen，Alameda，USA)定量和分析信號。然后，解剖器官并再次分別成像。

結(jié)果

實驗顯示，mRNA在小鼠腹部區(qū)域中被有效表達，并隨烷烴鏈長度減少而增加(參見圖17A、B)。此外，實驗顯示，對肝的mRNA遞送隨類脂質(zhì)的烷烴鏈長度增加而減少(C16＜C14＜C12)，并且對于C16難檢測到。C14在脾中的熒光素酶表達最高。在肺中觀察到一定熒光素酶表達，但在心臟、腎、胃或腦中觀察不到(參見圖18A、B)。

實施例13

不同轉(zhuǎn)染試劑對其遞送pDNA和mRNA能力的效率的比較

材料和方法

多聚絡(luò)合物形成：

利用編碼螢火蟲熒光素酶的質(zhì)粒DNA(pCMVLuc，Plasmid Factory)或編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA，如實施例1描述形成多聚絡(luò)合物。

利用多聚絡(luò)合物的體外轉(zhuǎn)染：

轉(zhuǎn)染實驗如實施例3描述進行。

結(jié)果

實驗進行證明，如果轉(zhuǎn)染效率僅與轉(zhuǎn)染介質(zhì)(多聚體/類脂質(zhì))有關(guān)或還與核酸類型有關(guān)。結(jié)果(圖19)明確顯示，有效運送pDNA的轉(zhuǎn)染試劑不一定是mRNA運送的有效媒介。因此，pDNA轉(zhuǎn)染效率高的載體系統(tǒng)不對mRNA具有效率預(yù)期。

實施例14：

N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺(2-3-2)或N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丁二胺(2-4-2)修飾的PAA8k的轉(zhuǎn)染效率比較

材料和方法

多聚絡(luò)合物形成：

如實施例1描述形成多聚絡(luò)合物。

利用多聚絡(luò)合物的體外轉(zhuǎn)染：

轉(zhuǎn)染實驗如實施例3描述進行。

結(jié)果

為進一步研究(2-3-2)修飾的多聚體的效率是否與結(jié)構(gòu)(2-3-2)顯著相關(guān)或是否顯示與任何其它結(jié)構(gòu)2-X-2(X＞2)相似的效率，用N，N′-雙(2-氨基乙基)-1，3-丁二胺(2-4-2)修飾PAA8k。PAA8k-(2-3-2)與PAA8k-(2-4-2)的比較(圖20)顯示，兩聚體在編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生幾乎相同的高熒光素酶表達水平。這證明，X＞2的結(jié)構(gòu)(2-X-2)修飾的多聚體與其它寡(烷基胺)修飾相比，總體上產(chǎn)生mRNA運送效率提高的轉(zhuǎn)染試劑。

實施例15：

類脂質(zhì)制劑的透射電子顯微術(shù)

材料和方法

類脂質(zhì)制劑：

類脂質(zhì)與mRNA一起如下配制：將C10-(2-3-2)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、膽固醇和1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2k)或1，2-二棕櫚?；?sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(DPG-PEG2k)(9∶6∶5∶1摩爾比)溶于乙醇并以17的脂質(zhì)氮/mRNA磷酸基摩爾比快速注入包括化學(xué)修飾的編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA的檸檬酸鹽緩沖液(10mM檸檬酸，150mM NaCl，pH 4.5)，生成20％的最終乙醇濃度，并對水透析24h。

透射電子顯微術(shù)：

關(guān)于尺寸分析，利用10,000和60,000放大倍率的TEM(透射電子顯微術(shù))。作為第一步，等離子體清洗銅系板(Plano GmbH；S162-3)。在此處理后，使8μl類脂質(zhì)制劑接觸銅板3min。去除類脂質(zhì)制劑液滴后，通過使類脂質(zhì)負(fù)載的銅板接觸一滴8μl乙酸鈾酰酯溶液30s兩次，將樣本染色。在每個步驟后通過用吸水紙吸液去除液體。最后，將載體板在室溫下再干燥30min并通過Jem1011(Jeol)進行分析。

結(jié)果

TEM圖(圖21)顯示，形成的類脂質(zhì)制劑是尺寸分布均勻的球形顆粒(概觀)。在放大圖中，這些顆粒的尺寸可估測達60-80nm。

實施例16

通過脂環(huán)基鹵合成的C10-(2-3-2)的mRNA運送效率

材料和方法

合成：

C10-(2-3-2)的合成如制備實施例VII描述進行。

類脂質(zhì)制劑：

利用摩爾比為9∶6∶5∶1的C10-(2-3-2)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、膽固醇、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(DPG-PEG2k)和編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA，如實施例15描述以N/P 17形成類脂質(zhì)/mRNA絡(luò)合物。

體外轉(zhuǎn)染：

在處理前24h，將100μL介質(zhì)中的5,000個NIH3T3細(xì)胞接種到96孔板的孔中。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，如述形成類脂質(zhì)制劑并用10x PBS溶液調(diào)節(jié)至1xPBS。將類脂質(zhì)制劑稀釋以實現(xiàn)在50μL中500ng、250ng或125ng，添加至細(xì)胞并在37℃和5％CO₂下培育24h。在轉(zhuǎn)染后24h，去除介質(zhì)。將細(xì)胞溶解并如實施例1描述分析溶解物的報告蛋白活性。

結(jié)果

如圖22所示，通過脂環(huán)基鹵合成的C10-(2-3-2)能夠運送mRNA到細(xì)胞中，導(dǎo)致報告蛋白熒光素酶表達。

實施例17

通過N-十二烷基丙烯酰胺合成的C12-(2-3-2)的mRNA運送效率

材料和方法

合成：

如制備實施例VIII描述進行C12-(2-3-2)的合成。

類脂質(zhì)制劑：

利用摩爾比為9∶6∶5∶1的C12-(2-3-2)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、膽固醇、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(DPG-PEG2k)和編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA，如實施例15描述以N/P 17形成類脂質(zhì)/mRNA絡(luò)合物。

體外轉(zhuǎn)染：

利用500、250或125ng每孔的mRNA劑量，如實施例16描述進行轉(zhuǎn)染實驗。

結(jié)果

如圖23所示，通過N-十二烷基丙烯酰胺合成的C12-(2-3-2)能夠運送mRNA到細(xì)胞中，導(dǎo)致熒光素酶報告基因表達。

實施例18

通過十二烷基-丙烯酸酯合成的C12-(2-3-2)的mRNA運送效率

材料和方法：

如制備實施例IX描述進行C12-(2-3-2)的合成。

類脂質(zhì)制劑：

利用摩爾比為9∶6∶5∶1的C12-(2-3-2)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、膽固醇、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(DPG-PEG2k)和編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA，如實施例15描述以N/P 17形成類脂質(zhì)/mRNA絡(luò)合物。

體外轉(zhuǎn)染：

利用500、250或125ng每孔的mRNA劑量，如實施例16描述進行轉(zhuǎn)染實驗。

結(jié)果

如圖24所示，通過十二烷基丙烯酸酯合成的C12-(2-3-2)能夠運送mRNA到細(xì)胞中，導(dǎo)致報告蛋白熒光素酶表達。

實施例19

利用不同助劑脂質(zhì)和不同類脂質(zhì)/mRNA(N/P)比配制的C12-(2-3-2)的mRNA運送效率

材料和方法

類脂質(zhì)制劑：

利用C12-(2-3-2)與作為PEG-脂質(zhì)的1，2-二肉豆蔻?；?sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG2k)、作為助劑脂質(zhì)的DOPE或DSPC并且N/P比17或8的組合，如實施例15描述形成類脂質(zhì)/mRNA絡(luò)合物。

體外轉(zhuǎn)染：

利用250ng每孔的mRNA劑量，如實施例16描述進行轉(zhuǎn)染實驗。

結(jié)果

如圖25所示，與不同助劑脂質(zhì)(DOPE，DSPC)和不同N/P比的組合的C12-(2-3-2)能夠運送mRNA到細(xì)胞中，導(dǎo)致熒光素酶報告基因表達(17或8)。因此C12-(2-3-2)有效運送RNA到細(xì)胞中，與助劑脂質(zhì)和N/P比無關(guān)。

實施例20

與C12-(2-2-2)和C12-(3-3-3)相比靜脈內(nèi)給予C12-(2-3-2)類脂質(zhì)制劑后mRNA在小鼠中的運送效率提高

材料和方法

動物：

如實施例11描述。

類脂質(zhì)制劑：

如實施例15描述，采用C12-(2-3-2)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、膽固醇、1，2-二肉豆蔻?；?sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG2k)和編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA，N/P為17。

利用體內(nèi)生物發(fā)光成像測量小鼠中的Luc活性：

如實施例11描述，在給藥后6h麻醉動物。

結(jié)果

如圖26所示，與C12-(3-3-3)和C12-(2-2-2)相比，包含C12-(2-3-2)的類脂質(zhì)制劑導(dǎo)致小鼠中的報告基因表達顯著增加。這證明了C12-(2-3-2)的有益mRNA運送能力。

實施例21

以不同量烷基鏈C12飽和的寡(亞烷基胺)(2-3-2)的mRNA運送效率的比較

材料和方法：

類脂質(zhì)制劑：

如實施例15描述，不經(jīng)透析，采用修飾程度和位置不同的寡(烷基胺)(2-3-2)(參見圖27A，SynCom)。

體外轉(zhuǎn)染：

利用250ng每孔的mRNA劑量，如實施例16描述進行轉(zhuǎn)染實驗。

結(jié)果

如圖27A所示，合成三種不同形式的C12-(2-3-2)，以評價每個寡(亞烷基胺)的烷基鏈數(shù)量和位置對mRNA運送能力的影響。轉(zhuǎn)染效率(圖27B)顯示觀察不到報告蛋白表達差異，證明mRNA運送效率無差異。因此不同類型的C12-(2-3-2)類脂質(zhì)制劑以相同效率運送mRNA。

實施例22

類脂質(zhì)制劑的凍干

材料和方法

類脂質(zhì)制劑：

如實施例15描述。

凍干過程：

在水中制備海藻糖、蔗糖和乳糖的保護劑溶液(c：20％w/v)。制備2倍連續(xù)稀釋液，生成20％至0.625％(w/v)的保護劑溶液。向這些溶液添加相同體積的類脂質(zhì)制劑并通過移液混合。將溶液在液氮中冷凍并利用sigmaα1-4(Martin Christ)凍干。凍干后，將顆粒重新懸浮于相同體積的水中并用于分析。作為對照，不經(jīng)冷凍和凍干，混合脂質(zhì)絡(luò)合物與相同濃度的保護劑溶液。

體外轉(zhuǎn)染：

如實施例15描述，采用233ng mRNA每孔。

尺寸測量：

利用ZetaSier Nano(Malvern)測量顆粒的流體動力學(xué)直徑。

結(jié)果

如圖28所示，不同濃度的所有測試糖都能夠維持顆粒尺寸和轉(zhuǎn)染效率。相比之下，無保護劑(0％)的顆粒變得有效性減少并且尺寸因聚集過程而顯著增加。

實施例23

RNA到哺乳動物組織中的離體運送

材料和方法

類脂質(zhì)制劑：

如實施例15描述，采用C12-(2-3-2)、DOPE、膽固醇、DPG-PEG2k和編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA，N/P比為17，不經(jīng)透析。

組織樣本處理：

從剛處死的動物(豬或綿羊；見表)取約1cm³的組織塊(肌肉、脂肪、動脈或肺；見表)，并在PBS中洗滌。向各組織塊中注入100μL包含10μg RNA的類脂質(zhì)制劑或200μL包含20μg RNA的類脂質(zhì)制劑(見表)。在處理綿羊動脈的情況下，將類脂質(zhì)制劑注入兩端被紗布堵住的血管腔。將組織在包含10％FCS的細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)24h。

熒光素酶表達分析：

24h后，將樣本在包含熒光素(100μg/mL)的PBS中培育30min。利用體內(nèi)成像系統(tǒng)(IVIS，Perkin Elmer)測量熒光素酶活性。

結(jié)果

如圖29所示，C12-(2-3-2)能夠運送編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA到不同物種的多種不同組織的細(xì)胞中，導(dǎo)致熒光素酶表達。相比之下，不經(jīng)處理的樣本(D、E，下方組織塊)不顯示成像信號。

實施例24

體外表達血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶2(ACE-2)

類脂質(zhì)制劑：

如實施例15描述，采用C12-(2-3-2)、DOPE、膽固醇、DPG-PEG2k，不添加mRNA，生成空脂質(zhì)絡(luò)合物。類脂質(zhì)mRNA絡(luò)合物的制備通過后負(fù)載(post loading)進行。為此，將1μL編碼ACE-2的(mRNA 1mg/ml)與4μL包含脂質(zhì)絡(luò)合物的溶液混合并在室溫下培育10min。

細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染：

關(guān)于體外轉(zhuǎn)染，在2mL包含10％FCS的介質(zhì)中處理前24h，將300,000個HepG2細(xì)胞接種到6孔板的孔中。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，使介質(zhì)對2mL新制介質(zhì)交換。如述制備類脂質(zhì)制劑，并將包含500ng mRNA的2.5μL添加至每個孔。在對照孔中注入相同量的在制備期間不添加mRNA的類脂質(zhì)制劑。

通過western印跡檢測ACE-2表達：

在轉(zhuǎn)染后24h，去除介質(zhì)并用1mL PBS洗滌細(xì)胞。利用250μl溶解緩沖劑(25mM Tris-HCl，0.1％TritonX，pH 7.4)在冰上使細(xì)胞溶解10min。在溶解物刮取后，通過在14,000rpm下離心10min去除碎片。

在蛋白質(zhì)估測(BCA-測定，Thermo-Fisher scientific)后，將每道10μg負(fù)載到10％SDS-PAGE凝膠(Thermo-Fisher scientific)上。在100V下電泳1.5h后，將凝膠印跡到PVDF膜(TransBlot Turbo，Biorad)上。

在印跡后，利用TBS-T(20mM Tris-HCl、500mM NaCl、pH 7.5、0.1％吐溫20)中的5％乳粉，將膜阻斷30min。在阻斷后，在4℃下用1∶10,000稀釋的抗ACE2抗體(R&D系統(tǒng))探測膜過夜。在三次洗滌步驟(每次10min，TBS-T)后，在室溫下用1∶10,000稀釋的抗山羊-HRP抗體(SCBT)探測膜1h，然后進行三次洗滌步驟(每次10min，TBS-T)。利用發(fā)光HRP-底物(GE healthcare)產(chǎn)生信號，并利用攝像機(ChemiDoc XRS+，Bio-Rad)分析信號。在檢測到ACE2信號后，將在室溫下利用1∶1,000稀釋的抗GAPDH抗體(NEB)分析同等負(fù)載4h。

結(jié)果

在圖30中顯示了轉(zhuǎn)染的Western印跡結(jié)果。左側(cè)兩道顯示經(jīng)處理細(xì)胞的溶解物，右側(cè)兩道顯示未經(jīng)處理細(xì)胞的溶解物。明顯證明，ACE-2表達僅可在負(fù)載編碼ACE-2的RNA后經(jīng)類脂質(zhì)制劑處理的樣本中在觀察到。此實驗顯示，ACE-2mRNA也可通過包含C12-(2-3-2)類脂質(zhì)制劑的來運送。其還證明，后負(fù)載空脂質(zhì)絡(luò)合物的方法也導(dǎo)致有效的mRNA到細(xì)胞中的運送。

實施例25

鼠促紅細(xì)胞生成素(mEPO)在Balb/c小鼠中的表達

材料和方法

類脂質(zhì)制劑：

如實施例15描述，采用C12-(2-3-2)、DOPE、膽固醇、DMPE-PEG2k和編碼鼠促紅細(xì)胞生成素(mEPO)的mRNA，N/P比為15。

動物：

如實施例11描述。

動物的治療：

將類脂質(zhì)制劑調(diào)整至1x PBS，并稀釋實現(xiàn)130μL中各5、10和20μg mRNA。每種劑量通過靜脈內(nèi)注射治療三只小鼠。作為對照，用PBS治療小鼠。在治療后6h，采集血液并分析鼠EPO水平。

鼠EPO的定量：

通過鼠EPO ELISA(Quantikine ELISA、R&D Systems Inc.)按照生產(chǎn)商的方案進行auf鼠促紅細(xì)胞生成素的定量。

結(jié)果

在此實驗中，在用配制在包含C12-(2-3-2)的類脂質(zhì)制劑中的鼠EPO mRNA治療后鼠促紅細(xì)胞生成素在小鼠中的表達。如圖31證明，可在6h后檢測到所有小組的鼠EPO的濃度顯著高于PBS治療對照小組。因此，鼠EPO mRNA被有效運送到細(xì)胞中，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達。

實施例26

寡(亞烷基胺)(2-3-2)修飾的線性多聚體聚(烯丙基胺)的信使RNA運送效率

材料和方法

多聚絡(luò)合物形成：

如實施例1描述，采用寡(亞烷基胺)(2-3-2)、(2-2-2)或(3-3-3)修飾的聚(烯丙基胺)(PALAM)。合成參見制備實施例V。

多聚絡(luò)合物的體外轉(zhuǎn)染：

利用500ng mRNA和N/P 12，如實施例1描述，轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞。

結(jié)果

如圖32所示，在用mRNA和PALAM-(2-3-2)的多聚絡(luò)合物轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞顯示熒光素酶表達顯著高于用PALAM-(2-2-2)/mRNA或PALAM-(3-3-3)/mRNA絡(luò)合物轉(zhuǎn)染后。因此，這些結(jié)果證明帶有交替烷基鏈的寡(亞烷基胺)對線性胺封端的多聚體的修飾導(dǎo)致與對線性羧基封端的多聚體骨架相同的有益效果。

實施例27

寡(亞烷基胺)(2-3-2)修飾的樹枝狀多聚體聚亞丙基亞胺的信使RNA運送效率

材料和方法

多聚絡(luò)合物形成：

如實施例1描述，采用寡(亞烷基胺)(2-3-2)、(2-2-2)或(3-3-3)修飾的聚亞丙基亞胺(PPI)。合成參見制備實施例VI。

多聚絡(luò)合物的體外轉(zhuǎn)染：

利用500ng mRNA和N/P 32，如實施例1描述，轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞。

結(jié)果

如圖33所示，在用mRNA和PPI-(2-3-2)的多聚絡(luò)合物轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞顯示熒光素酶表達高于用PPI-(2-2-2)/mRNA或PPI-(3-3-3)/mRNA絡(luò)合物轉(zhuǎn)染后。因此，這些結(jié)果證明，用帶有交替烷基鏈的寡(亞烷基胺)對樹枝狀多聚體的修飾導(dǎo)致與對線性多聚體骨架相同的有益效果。

實施例28

對大鼠皮下注射后C12-(2-3-2)制劑的胞內(nèi)RNA運送效率

材料和方法

類脂質(zhì)制劑：

如實施例15描述，采用C12-(2-3-2)、DOPE、膽固醇、DMG-PEG2k和編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA，N/P比為17。

動物的治療：

將類脂質(zhì)制劑調(diào)整至1x PBS。將500μL包含63μg RNA的制劑皮下注入雌性Buffalo大鼠。在給藥后6h，通過腹膜內(nèi)注射美托咪定(11.5μg/kg BW)、咪達唑侖(115μg/kg BW)和芬太尼(1.15μg/kg BW)，使大鼠麻醉。通過腹膜內(nèi)注射施加D-熒光素底物(每只小鼠PBS中30mg)。10分鐘后，利用IVIS 100成像系統(tǒng)(Xenogen，Alameda，USA)測量生物發(fā)光。

結(jié)果

如圖34證明，大鼠在注射側(cè)顯示明亮的發(fā)光信號，證明RNA到周圍組織中的運送是非常有效的。由于可生成編碼蛋白質(zhì)，還證明RNA的功能性保持完整。

實施例29

大鼠口服灌胃后mRNA編碼的蛋白質(zhì)在胃腸道中的表達

材料和方法

類脂質(zhì)制劑(絡(luò)合物制劑)：

將類脂質(zhì)C12-(2-3-2)與1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC；Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL，USA)、膽固醇和1，2-二棕櫚?；?sn-甘油甲氧基聚乙二醇(DPG-PEG 2000； GP-020；NOF America Corporation，White Plains，NY，USA)一起配制。為此目的，將化合物分別以50、20、20和20mg/ml的濃度溶于乙醇。將53.2μl C12-(2-3-2)、64.2μl DSPC、26.2μl膽固醇和34.8μl DPG-PEG 2000在微離心管中組合并用乙醇稀釋至200μl的最終體積，生成8∶5.29∶4.41∶0.88的組分摩爾比。作為800μl檸檬酸緩沖劑(10mM檸檬酸基，pH 4.5，0.9％w/v氯化鈉)中的溶液，提供通過25％胞苷和25％尿苷單體分別被5-甲基胞苷和2-硫代尿苷取代的體外轉(zhuǎn)錄制備的200μg修飾的編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA。通過快速溶劑交換進行脂質(zhì)絡(luò)合物形成。通過30G針(U-40胰島素注射器BD Micro-Fine^TM+)，將乙醇中的脂質(zhì)混合物注入800μl mRNA溶液，然后渦流。在室溫下培育30min后，將混合物對10L水透析12h。這產(chǎn)生150μg/ml的最終mRNA濃度，N/P比為17。

凍干類脂質(zhì)制劑和充入明膠膠囊：

在在室溫下30min培育新制類脂質(zhì)制劑后，添加25.6μl水中的40％(w/v)海藻糖(導(dǎo)致最終濃度1％w/v)，然后在液氮中冷凍。隨后，將樣本凍干過夜。利用生產(chǎn)商提供的試劑盒(試劑盒)，將1/3的干燥材料(相當(dāng)于67μg mRNA)充入明膠膠囊(； Belgium NV，Bornem，Belgium)。

PEI絡(luò)合物制劑：

將1mg編碼FFL的-RNA和1.3mg brPEI(Sigma-Aldrich)各自稀釋在2mL水中。為形成絡(luò)合物，將RNA溶液移液到PEI溶液中并通過上下移液三次而混合。將溶液在室溫下培育30min。在絡(luò)合物形成后，將絡(luò)合物溶液與相同體積的2％海藻糖溶液混合，產(chǎn)生1％(w/v)的最終海藻糖濃度。在液氮中冷凍后，將樣本在凍干機(α2-4，Christ)中冷凍干燥。

MP制劑：

通過油包水包油(oil-in-water-in-oil)乳化，由聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)制成MP。完全如上所述制備包括200μg修飾的編碼螢火蟲熒光素酶的mRNA以及摩爾比8∶5.29∶4.41∶0.88的C12-(2-3-2)、DSPC、膽固醇和DPG-PEG 2000的類脂質(zhì)制劑。將1毫升制劑用PBS稀釋至2ml。將該水相與溶于2ml二氯甲烷的100mg PLGA 755-S(Boehringer Ingelheim，Germany)混合。通過利用喇叭聲波儀(horn sonicator)(Branson Digital Sonifier，250-D型喇叭模型聲波儀102-C)以20％幅度強度和0.5s分隔的聲處理，使混合物乳化。隨后，將乳液滴加到包含6ml 4％聚乙烯醇(PVA)的水溶液的50ml Falcon管中。隨后，將混合物渦旋10s。將得到的產(chǎn)物滴加到包含8ml 0.6％-PVA溶液的玻璃燒杯(9.2cm直徑)中，同時在磁力攪拌盤上以中速進行攪拌。在在室溫下攪拌3小時后，通過在1,000rpm下離心5min后替換上清液，將得到的顆粒用注射用水(WFI)洗滌兩次。在將顆粒重懸浮于5ml WFI中后，將產(chǎn)物在液氮中冷凍并凍干14小時。得到的干燥粉末備用。利用生產(chǎn)商提供的試劑盒(試劑盒)，將13.6mg充入明膠膠囊( Belgium NV，Bornem，Belgium)?；谒贸煞值馁|(zhì)量平衡，這相當(dāng)于估計25μg的mRNA劑量。

殼聚糖顆粒制劑：

將50mM檸檬酸鹽緩沖劑(pH4.5)中的100μg/mL殼聚糖(Protasan UP G 213)和-RNA溶液分別加熱至55℃。在恒定渦流下混合10mL各溶液。在RT下培育30min后，將顆粒對水透析12h，冷凍干燥，和冷凍儲存到使用。在使用當(dāng)天，在施用前將顆粒重懸浮于3mL水中。

動物實驗：

使Sprague-Dawley大鼠(或雌性Buffalo大鼠)在充以5％異氟醚的室內(nèi)麻醉。通過灌胃給予膠囊。24小時后，利用戊巴比妥鈉注射將動物處死。收集器官。關(guān)于熒光素酶活性測量，將組織樣品在37℃在PBS中包括D-熒光素底物(100μg/ml)的介質(zhì)浴中培育30min，并進行離體熒光素酶生物發(fā)光成像(IVIS 100，Xenogen，Alameda，USA)。

結(jié)果：

實驗顯示，在類脂質(zhì)/mRNA絡(luò)合物與海藻糖一起凍干或負(fù)載到MP上并利用膠囊口服給予時，mRNA在大鼠的GI道中被有效表達(參見圖35)。其它主要器官(心臟、肺、肝、脾、腎)和當(dāng)mRNA作為液體制劑被口服給予時，檢測不到顯著熒光素酶信號。