專(zhuān)利名稱(chēng)：pH敏感普魯蘭多糖衍生物納米藥物載體和載藥粒子及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種pH敏感普魯蘭多糖衍生物納米藥物載體和載藥粒子及制備方法。具體說(shuō)是以具有主動(dòng)肝靶向作用的普魯蘭多糖為載體材料，通過(guò)化學(xué)鍵引入PH敏感基團(tuán)制備能對(duì)腫瘤弱酸性微環(huán)境或其細(xì)胞內(nèi)涵體酸性環(huán)境產(chǎn)生響應(yīng)的納米載體，并通過(guò)化學(xué)鍵合或物理包埋的方法對(duì)不同作用機(jī)制的抗腫瘤藥物進(jìn)行共載，實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位的共同投遞及有序釋放，達(dá)到對(duì)腫瘤的協(xié)同治療作用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多功能納米載體是指通過(guò)巧妙設(shè)計(jì)在單一穩(wěn)定的納米粒子中整合多個(gè)功能的載 體材料，如血液循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)；靶向作用；生理環(huán)境敏感的藥物釋放(pH敏感、溫度敏感)、不同治療劑或治療劑與顯像劑造影劑的同載等。多功能納米載體能夠作為多種藥物傳遞的有效平臺(tái)，通過(guò)識(shí)別靶向細(xì)胞的獨(dú)特表面信號(hào)以及對(duì)藥物的可控有序釋放，使藥物發(fā)揮協(xié)同增效作用，并顯著降低藥物的毒副作用，對(duì)腫瘤的治療具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。實(shí)體瘤內(nèi)部存在不同的酸性環(huán)境，包括細(xì)胞間質(zhì)中的弱酸性環(huán)境和癌細(xì)胞中內(nèi)涵體和溶酶體中更強(qiáng)的酸性環(huán)境。實(shí)體瘤內(nèi)部的缺氧狀態(tài)使腫瘤細(xì)胞無(wú)氧糖酵解產(chǎn)生乳酸，而腫瘤內(nèi)部血管系統(tǒng)的缺乏使產(chǎn)生的乳酸不能充分排出，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)呈酸性，用電子及化學(xué)探針等方法測(cè)量腫瘤內(nèi)口1^在5. 7 7. 8，均值為7. 06。腫瘤細(xì)胞中早期內(nèi)涵體的pH值在6. O左右，有的甚至低于5. 4，而晚期內(nèi)涵體的pH值一般在5. O左右；溶酶體的pH值更低。因此，腫瘤中酸性環(huán)境可以作為信號(hào)用于觸發(fā)PH敏感載藥納米體系在腫瘤組織中的釋藥、細(xì)胞內(nèi)吞及其細(xì)胞器(如細(xì)胞核)的靶向給藥。在眾多pH敏感基團(tuán)中，弱堿性的咪唑基由于其結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)受到該領(lǐng)域的關(guān)注。咪唑基具有弱堿性，質(zhì)子化后可由疏水性轉(zhuǎn)化為親水性，并且其PKa接近生理pH值，已有研究(Macromol Biosci, 2005, 5 :1118-1124 ；JControl Release, 2006,115 37)表明高分子結(jié)構(gòu)中引入咪唑基制備pH敏載藥體系，可實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位或腫瘤細(xì)胞中的的選擇性釋放。將不同機(jī)制的抗腫瘤藥物同載于納米粒子中共同進(jìn)行投遞，可模擬臨床腫瘤治療的聯(lián)合用藥模式，達(dá)到微觀水平上的序貫協(xié)同作用，顯著增加藥物療效。目前研究較多的藥物組合包括化療藥/抗血管生成藥組合,從腫瘤組織內(nèi)部分別攻擊腫瘤血管和腫瘤細(xì)胞，在摧毀腫瘤血管的條件下使化療藥更有效地聚集于腫瘤部位，從而實(shí)現(xiàn)高效、靶向的抗腫瘤作用(Science，2005，307 :58-62)?；熕?多藥耐藥(MDR)抑制劑組合，用靶向納米載體攜載MDR多藥耐藥抑制劑可降低抑制劑的毒性，同時(shí)在有效抑制腫瘤細(xì)胞耐藥性的條件下，顯著增強(qiáng)腫瘤對(duì)化療藥的敏感性(Expert Opin Drug Deliv, 2006, 3 (2) :205-216);此夕卜，針對(duì)細(xì)胞內(nèi)涵體/溶酶體低PH值(pH 5. O 5. 5)特點(diǎn)設(shè)計(jì)的pH敏感納米載藥體系，能通過(guò)胞吞進(jìn)入細(xì)胞觸發(fā)釋藥，有效逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR。不同的化療藥的組合，如紫杉醇/順鉬、紫杉醇/阿霉素對(duì)乳腺癌的治療?；熕?基因組合，基因治療聯(lián)合化療可解決化療過(guò)程中的難題，更為有效地抑制腫瘤的惡化、侵襲與遷移。
普魯蘭多糖(Pullulan)中文亦譯為茁霉多糖、出芽短梗孢糖或普聚多糖。它是出芽孢梗霉(Aureobacidium pullulan)產(chǎn)生的胞外多糖，以a _1，4糖苷鍵結(jié)合的麥芽三糖，兩端再以a _1，6糖苷鍵同另外的麥芽三糖結(jié)合，如此重復(fù)連接而成高分子多糖。a_l，4糖苷鍵同a-l，6糖苷鍵的比例為2 1，聚合度為100 5000，分子量4. 8 X IO4
2.2X IO6 Da0普魯蘭多糖無(wú)毒，無(wú)免疫原性，具有良好的生物相容性和可生物降解性，目前已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。日本是最早開(kāi)發(fā)普魯蘭多糖的國(guó)家，至今仍壟斷國(guó)際市場(chǎng)，年產(chǎn)量已達(dá)萬(wàn)噸，而近幾年我國(guó)生產(chǎn)普魯蘭多糖的廠家也逐漸增多，同時(shí)也開(kāi)展了大量相關(guān)的基礎(chǔ)及應(yīng)用方面的研究工作。由于普魯蘭多糖分子中含有大量活性基團(tuán)-0H，并且由于組成多糖的糖苷鍵類(lèi)型不同(a-l，4、a_l，6)，單糖吡喃環(huán)中不同位置羥基的性質(zhì)不同以及分子微環(huán)境的不同，則對(duì)-OH進(jìn)行化學(xué)改性具有一定的選擇性，因此可通過(guò)可控化學(xué)改性合成普魯蘭多糖衍生物。普魯蘭多糖及其衍生物有許多潛在的藥物、臨床和醫(yī)療方面的用途。如0-羧甲基普魯蘭多糖是一種較好的緩控釋載體材料，能延長(zhǎng)藥物在人體內(nèi)的保留時(shí)間(Biol PharmBull, 2000, 23 (5) :621-626);硫酸化普魯藍(lán)糖具有抗凝血活性作用，副作用小，可替代肝素成為一種新的抗凝血活性劑(Eur Polym J，2001，37 (3) =541-546);此外，普魯蘭多糖具有良好的成膜特性，可以用作做藥物包衣材料，其口服治療產(chǎn)品已經(jīng)進(jìn)入規(guī)模生產(chǎn)。近年來(lái)，多種基于普魯蘭多糖的納米載體也相繼報(bào)道，如對(duì)普魯蘭多糖進(jìn)行烷基化與膽甾類(lèi)疏水改性，然后通過(guò)自組裝制備納米粒子，用作疏水藥物、大分子蛋白或基因藥物載體(J Control Release,1998,54(3) :313-320 ;Colloids and Surfaces B Biointerfaces,2009,71 19-26 ；J Biomed Mater Res B Appl Biomater,2009,91 (I) :55-60 ;ArchPharm Res.2010,33(5) :761-767 ;Chinese Journal of Polymer Science,2008,26, (3)369-374)，起到增強(qiáng)藥物療效和降低藥物毒副作用的目的。此外，已有參考文獻(xiàn)表明普魯蘭多糖能與肝細(xì)胞表面的去唾液酸糖蛋白受體特異性結(jié)合，是一種性質(zhì)優(yōu)良的肝靶向載體材料，可有效攜載小分子藥物及基因進(jìn)入肝腫瘤細(xì)胞發(fā)揮治療作用(J Control Release,2001,70 (3) :365-373 ；J Control Release,2002, 83(I) :75-88 ;Int J Pharm，2004，277 :39-61 ;Int J Pharm,2004, 286 :9-17 ；Biomaterials,2009, 30(34) :6655-6664)。申請(qǐng)者前期參與的小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，普魯蘭多糖納米粒子主要蓄積于肝臟(Drugdelivery,2010,17(7) :552-558)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種pH敏感普魯蘭多糖衍生物納米藥物載體和載藥粒子及制備方法。它是具有對(duì)腫瘤組織弱酸性微環(huán)境和/或腫瘤細(xì)胞內(nèi)涵體較強(qiáng)酸性條件敏感的多功能普魯蘭多糖納米藥物載體的制備方法及其靶向抗肝癌的應(yīng)用。由本發(fā)明方法制備的納米載體，對(duì)肝臟具有主動(dòng)靶向性，能有效攜載不同作用機(jī)制的抗腫瘤藥物，并且能對(duì)腫瘤組織微環(huán)境和/或細(xì)胞內(nèi)涵體的酸性條件產(chǎn)生快速響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤病灶部位的有序釋放，從而達(dá)到協(xié)同增效作用，是一種良好的抗腫瘤藥物的載體形式。本發(fā)明提供的一種pH敏感普魯蘭多糖衍生物納米藥物載體材料，它是以分子中具有咪唑基改性基團(tuán)和普魯蘭多糖、羧甲基普魯蘭多糖及普魯蘭多糖琥珀酸酯為原料合成，其中改性基團(tuán)與普魯蘭多糖中葡萄糖單元的摩爾比為I : 10 I : 4;合成方法將具有pH響應(yīng)特性的咪唑基團(tuán)改性分子通過(guò)化學(xué)鍵接枝于普魯蘭多糖的多糖骨架，合成pH敏感普魯蘭多糖衍生物，并通過(guò)透析法或乳化擴(kuò)散法制備納米粒子。所制備的納米粒子產(chǎn)率高、球狀形態(tài)規(guī)則、粒徑范圍50 200nm，分布均勻、穩(wěn)定性好，響應(yīng)pH值根據(jù)改性基團(tuán)不同，有差異，變化范圍為6. O 7. O。所述的咪唑基改性基團(tuán)為尿刊酸、聚L-組氨酸、IH-咪唑-4-甲酸、2-甲基咪唑-4-甲酸及苯并咪唑-4-甲酸。所述的咪唑基改性基團(tuán)的取代度(即100個(gè)糖環(huán)單元含有的改性基團(tuán)數(shù)目)為2 10%，響應(yīng)pH為6. O 7. O。本發(fā)明所述的pH敏感普魯蘭多糖衍生物納米藥物載體材料的合成方法包括的步驟 I)按計(jì)量將改性基團(tuán)分子、N，N' -二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)與4_ 二甲基氨基吡啶(DMAP)溶于二甲基亞砜(DMSO)溶液，室溫下攪拌反應(yīng)I 2h，生成活性酯形式；2)普魯蘭多糖、O-羧甲基普魯蘭多糖或普魯蘭多糖琥珀酸酯溶解于DMSO中，攪拌下將I)中反應(yīng)液加至多糖溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)24 48h ；3)過(guò)濾除去反應(yīng)液中生成的白色沉淀，然后將濾液滴加至過(guò)量無(wú)水乙醇中進(jìn)行醇沉處理，收集沉淀，干燥，即得白色粉末狀改性普魯蘭多糖；4)透析法將改性普魯蘭多糖溶解于DMSO溶液并轉(zhuǎn)移至透析袋中，于生理鹽水或去離子水中透析24h，前12h每I 2h更換透析液，后12h每3 4h更換透析液至溶液中DMSO全部除盡，而后從透析袋中取出，探頭超聲處理約5min，輸出功率20W，間歇脈沖工作方式脈沖寬度為2s，間歇時(shí)間為2s，即得納米懸液；或乳化擴(kuò)散法將改性普魯蘭多糖溶解于DMSO溶液中，電磁攪拌下用注射器持續(xù)緩慢注入O. 5%聚乙烯醇(PVA)溶液中，形成納米懸液，將納米懸液離心處理，用去離子水反復(fù)洗滌、離心，除去表面PVA，然后加入去離子水吹打分散制成納米懸液。所述DCC、DMAP與改性分子的摩爾比為I. O I. 2 I。所述的普魯蘭多糖的分子量范圍5X IO4 2X IO5Da;所述O-羧甲基普魯蘭多糖分子中羧甲基取代度為50 70% ;所述普魯蘭多糖琥珀酸酯分子中琥珀酰基取代度為25 50%。所述改性普魯蘭多糖的濃度為O. 5 5% (g/1OOmL)。所述的透析袋的截留分子量12 14kDa。所述的咪唑基改性基團(tuán)分子為尿刊酸、聚L-組氨酸、IH-咪唑-4甲酸、2-甲基咪唑-4-甲酸及苯并咪唑-4-甲酸。所述的pH敏感普魯蘭多糖衍生物納米藥物體系是以pH敏感普魯蘭多糖衍生物納米材料為藥物載體，負(fù)載有combretastatin A_4(CA_4)、CA_4磷酸酯、多藥耐藥抑制劑維拉帕米、阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、10-羥基喜樹(shù)堿、米托蒽醌、長(zhǎng)春新堿中的至少一種，其質(zhì)量比為3 10 : I。本發(fā)明所述的pH敏感普魯蘭多糖衍生物納米藥物體系合成方法包括的步驟取碳二亞胺活化劑，DMAP和化療藥物溶解于無(wú)水DMSO中，室溫下避光攪拌12h，備用；取PH敏感普魯蘭多糖衍生物納米材料溶解于無(wú)水DMSO中，然后滴加至上述反應(yīng)液中，室溫下繼續(xù)避光攪拌反應(yīng)48h，醇沉處理，反復(fù)洗滌，干燥；所述水溶性碳二亞胺、DMAP與藥物的摩爾比為I : I. O I : 1.2。
所述化療藥物與多糖分子中糖單元的摩爾比為I : I I : 3。所述醇沉處理步驟采用大于20倍量反應(yīng)液的乙醇溶液。所述的碳二亞胺活化劑為I-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)及其鹽酸鹽、或N，N’ - 二異丙基碳二亞胺(DIC)及其鹽酸鹽、碘化[I-環(huán)己基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亞胺]?？蛇x地，本發(fā)明提供的 一種pH敏感普魯蘭多糖衍生物納米藥物載體材料為尿刊酸改性普魯蘭多糖衍生物(尿刊?；斕m多糖，URPA)納米藥物載體材料，改性分子為尿刊酸。所述DCC、DMAP與尿刊酸的摩爾比為1.0 I. 2。所述普魯蘭多糖的分子量范圍5 X IO4
2X IO5Da;所述尿刊酸與普魯蘭多糖分子中葡萄糖單元的摩爾比為I : 10 I : 4，尿刊酰基取代度通過(guò)反應(yīng)物的投料比加以控制，范圍為2 10%。本發(fā)明提供的多功能載藥納米粒子是以尿刊?；蒸斕m多糖(或其它咪唑基改性普魯蘭多糖衍生物)為載體負(fù)載不同作用機(jī)制的抗腫瘤藥物(化療藥/抗血管生成藥、化療藥/MDR抑制劑或化療藥/化療藥)構(gòu)成?；熕幹苯踊蛲ㄟ^(guò)連接橋接枝于多糖骨架，以高分子前藥形式存在，負(fù)載量可通過(guò)化學(xué)反應(yīng)條件加以控制。疏水性抗血管生成藥(或MDR抑制劑及其它化療藥)通過(guò)物理包埋的方式負(fù)載于納米粒的疏水內(nèi)核。上述pH敏感普魯蘭多糖納米粒子為載體，負(fù)載不同作用機(jī)制的抗腫瘤藥物構(gòu)成，抗腫瘤藥物組合包括化療藥/血管生成抑制劑、化療藥/多藥耐藥(MDR)逆轉(zhuǎn)劑和化療藥/化療藥。其中化療藥通過(guò)化學(xué)鍵合與多糖骨架偶聯(lián)，以高分子前藥形式存在，血管生成抑制劑(或MDR逆轉(zhuǎn)劑、另一種化療藥)以游離方式物理包埋于納米粒子的疏水核。該多功能載藥納米體系對(duì)肝臟具有主動(dòng)靶向性，能對(duì)腫瘤微環(huán)境或細(xì)胞內(nèi)涵體的弱酸性條件產(chǎn)生響應(yīng)，有序釋放兩種抗腫瘤藥物，起到協(xié)同增效以及降低毒性的作用。此外，該納米載藥體系能夠攜載藥物入胞釋放，從而有效逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥。本發(fā)明提供的化療藥物鍵合尿刊酰基普魯蘭多糖高分子前藥的制備方法包括的步驟I)取碳二亞胺活化劑，DMAP和甲氨喋呤(MTX)溶解于無(wú)水DMSO中，室溫下避光攪拌12h，備用；取尿刊酰基普魯蘭多糖溶解于無(wú)水DMSO中，然后滴加至上述反應(yīng)液中，室溫下繼續(xù)避光攪拌反應(yīng)48h，醇沉處理，反復(fù)洗滌，干燥即得MTX-尿刊酰基普魯蘭多糖(MTX-URPA)高分子前藥，MTX負(fù)載量為10 35%。2)所述MTX可以用阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、10-羥基喜樹(shù)堿、米托蒽醌、長(zhǎng)春新堿替代。這些替代藥物首先通過(guò)和琥珀酸酐(或馬來(lái)酸酐)反應(yīng)引入-C00H，然后按照上述方法制備化療藥鍵合普魯蘭多糖高分子前藥。3)所述碳二亞胺活化劑包括I-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)及其鹽酸鹽、或N，N’ - 二異丙基碳二亞胺(DIC)及其鹽酸鹽、碘化[I-環(huán)己基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亞胺]。4)所述水溶性碳二亞胺、DMAP與MTX的摩爾比為I : I. 0 I : I. 2。5)所述MTX與尿刊?；蒸斕m多糖分子中糖單元的摩爾比為I : I I : 3。6)所述醇沉處理步驟采用大于20倍量反應(yīng)液的乙醇溶液。本發(fā)明提供的多功能普魯蘭多糖載藥納米粒子的制備方法包括透析法和乳化溶劑擴(kuò)散法，步驟如下
I)將上述MTX-URPA高分子前藥溶解于DMSO溶液，加入CA_4(抑制腫瘤血管生成)，室溫下避光攪拌過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)移至透析袋中，于生理鹽水或去離子水中透析24h，前12h每I 2h更換透析液，后12h每3 4h更換透析液至溶液中DMSO全部除盡，取出探頭超聲處理約5min(輸出功率20W，間歇脈沖工作方式脈沖寬度為2s，間歇時(shí)間為2s)即得MTX與CA4的URPA納米共載體系。制備的載藥納米粒子呈規(guī)則球狀形態(tài)，大小均勻，粒徑范圍100 500nm，CA-4的載藥量范圍5 20%。2)稱(chēng)取MTX-URPA、CA4充分溶解于DMSO中，電磁攪拌下用注射器持續(xù)緩慢注入O. 5%聚乙烯醇(PVA)溶液中，形成納米懸液。將納米懸液離心處理，用去離子水反復(fù)洗滌、離心，除去表面PVA，然后加入去離子水吹打分散制成MTX與CA-4共載的URPA納米懸液。
2)所述MTX-尿刊酰普魯蘭多糖高分子前藥的濃度為I 5% (g/100mL)。3)所述 CA-4 與 MTX-URPA 的質(zhì)量比為 I : 10 I : 3。4)所述透析袋的截留分子量12 14kDa。6)所述CA-4可以用其它不同作用機(jī)制的疏水抗腫瘤藥物代替，如抗血管生成藥CA4磷酸酯、MDR抑制劑維拉帕米及紫杉醇、喜樹(shù)堿、阿霉素等替代。所述普魯蘭多糖可用O-羧甲基普魯蘭多糖(按照文獻(xiàn)Int J Biol Macromol,1997,20 :179-191方法合成)替代，羧甲基取代度通過(guò)反應(yīng)物的投料比控制在50 70%范圍。所述普魯蘭多糖可用普魯蘭多糖琥珀酸酯替代，按照以下方法合成普魯蘭多糖溶于去離子水,配成一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液,用NaOH溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH 8 9，加入二倍量甲醇溶液稀釋?zhuān)粚㈢晁狒苡诙读考状既芤?，緩慢滴加至普魯蘭多糖溶液中，控制在Ih內(nèi)加完，反應(yīng)過(guò)程中用I. 5% NaOH溶液維持體系pH弱堿性，反應(yīng)約24 48h。反應(yīng)結(jié)束后，用3% HCl溶液調(diào)節(jié)體系pH至中性，用乙醇沉淀、洗滌，干燥即得。琥珀?；〈瓤赏ㄟ^(guò)反應(yīng)物的投料比及反應(yīng)時(shí)間控制在25 50%范圍。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)藥物的共同投遞及對(duì)肝癌的聯(lián)合治療。體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示該類(lèi)納米藥物共載體系具有顯著PH可控釋藥性質(zhì)，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的有序釋放；細(xì)胞試驗(yàn)顯示該類(lèi)納米藥物共載體系比游離藥物具有更高的細(xì)胞毒性，能富集于腫瘤細(xì)胞，有效逆轉(zhuǎn)MDR ;小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，該類(lèi)納米藥物共載體系能顯著增強(qiáng)藥物對(duì)肝腫瘤模型的作用，藥物主要分布于肝脾部位。本發(fā)明基于普魯蘭多糖的多功能納米藥物載體的顯著優(yōu)點(diǎn)是制備的普魯蘭多糖納米材料具有良好的生物相容性、可生物降解性、無(wú)毒性，無(wú)免疫原性，是一種良好的醫(yī)用生物及藥用高分子材料。涉及的多功能普魯藍(lán)多糖納米粒子的制備工藝簡(jiǎn)單、條件溫和、且制備成本低，性質(zhì)穩(wěn)定。本發(fā)明制備的多功能普魯蘭多糖納米藥物載體能夠和肝細(xì)胞表面的去唾液酸糖蛋白受體特異性結(jié)合，具有主動(dòng)肝靶向性；能夠?qū)Σ煌饔脵C(jī)制的抗腫瘤藥物進(jìn)行有效負(fù)載，并且通過(guò)對(duì)癌細(xì)胞內(nèi)涵體的酸性條件的快速響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤病灶部位的有序遞送，從而達(dá)到藥物協(xié)同增效的作用，降低藥物毒性，并且能有效逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥，是一種良好的抗肝癌藥物載體。本發(fā)明在實(shí)現(xiàn)靶向抗肝癌的治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖I、實(shí)施例I中原料普魯蘭多糖(PA)及合成的尿刊?；蒸斕m多糖(URPA)、MTX鍵合尿刊?；蒸斕m多糖(MTX-URPA)高分子前藥的紅外圖譜。圖2、實(shí)施例I中原料普魯蘭多糖(PA)及合成的尿刊酰基普魯蘭多糖(URPA)、MTX鍵合尿刊?；蒸斕m多糖(MTX-URPA)高分子前藥的核磁共振氫譜圖。 圖3、實(shí)施例I中制備的載CA-4的MTX-URPA納米粒子的透射電鏡照片。圖4、實(shí)施例I中制備的URPA納米藥物共載體系的體外藥物釋放曲線，A =MTX的釋放曲線；B CA-4的釋放曲線。圖5、實(shí)施例I中注射空白URPA納米粒子后ICR小鼠的體重變化曲線。圖6、實(shí)施例I中制備的URPA納米藥物共載體系對(duì)小鼠體內(nèi)肝腫瘤模型的抑制作 用。圖7、實(shí)例2中制備的載阿霉素(ADR)的URPA納米粒子對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7 (A)及其耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR (B)的細(xì)胞毒作用。圖8、實(shí)例2中流式細(xì)胞儀檢測(cè)ADR-URPA納米粒子在乳腺癌細(xì)胞MCF-7及其耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR中蓄積。圖9、實(shí)施例2中制備的的URPA納米藥物共載體系的小鼠體內(nèi)組織分布圖。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，它們只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容做出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，均屬本發(fā)明保護(hù)范圍。實(shí)施例I :I、尿刊?；蒸斕m多糖(URPA)的合成尿刊酸0. 35g溶于DMSO溶液IOmL中，加入DCC 0. 55g和DMAP 0. 3g，室溫下攪拌Ih進(jìn)行羧基的活化，隨后轉(zhuǎn)至含有0. 5g普魯蘭多糖的DMSO溶液IOmL中，室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后，反復(fù)多次過(guò)濾除去白色沉淀，濾液滴加入300mL無(wú)水乙醇中進(jìn)行醇沉處理，離心(5000轉(zhuǎn)/分)收集沉出的多糖材料，用去離子水中反復(fù)清洗，冷凍干燥，即得白色粉末狀產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)確證圖譜見(jiàn)圖1、2。尿刊酰基的取代度，即多糖骨架上每100個(gè)葡萄糖單元上的尿刊?；又α考s為5. 2%。2、MTX鍵合尿刊?；蒸斕m多糖(MTX-URPA)的合成取1-(3-二甲基氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI) 0.8g，DMAP 0. 5g和MTX 1.5g溶解于IOmL無(wú)水DMSO中，室溫下攪拌12h，備用；取上述尿刊?；蒸斕m多糖0. 5g溶解于IOmL無(wú)水DMSO中，然后將其滴加至上述反應(yīng)液中，室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)48h，停止反應(yīng)。將反應(yīng)液滴入500mL無(wú)水乙醇中，析出淺黃色沉淀，離心收集沉淀，置于透析袋中，先用pH 8的碳酸氫鈉緩沖液IL透析處理24h，前12h每3h換水I次，后12h每6h換水I次，然后用蒸餾水透析處理48h，每24h每6h換水I次，后24h每12h換水I次，冷凍干燥即得MTX鍵合尿刊?；蒸斕m多糖高分子前藥，其結(jié)構(gòu)確證圖譜見(jiàn)圖1、2。MTX的載藥量采用紫外分光光度法檢測(cè)(檢測(cè)波長(zhǎng)為306nm)，為17. 6%。3、共載MTX和CA-4的URPA納米粒子的制備取上述合成的MTX-URPA210mg溶于IOmLDMSO溶液，然后加入CA_470mg，避光攪拌過(guò)夜，于200mL生理鹽水或去離子水中透析24h，前12h每I 2h換水I次，后每12h每3 4h換水I次，然后探頭超聲處理約IOmin (輸出功率20W，間歇脈沖工作方式脈沖寬度為2s,間歇時(shí)間為2s)，即CA-4與MTX共載納米粒子。制備的納米粒子呈規(guī)則球狀形態(tài)，大小均勻(圖 3)，粒徑為 179. 3 ±15. 4nm，分布系數(shù)為 O. 127 ± O. 045，zeta 電位為-4. 65 ± O. 32，CA-4的載藥量用甲醇萃取法后通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，為16. 8%。4、MTX與CA4的共載納米粒子的體外藥物釋放將共載納米分散液2mL放于透析袋(截留分子量12 14kDa)中，分別置于25mLρΗ5. 0、6· O和7· 4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，37°C，IOOrpm的條件下避光振蕩，規(guī)定時(shí)間點(diǎn)將整個(gè)釋放介質(zhì)用新鮮介質(zhì)置換，采用高效液相色譜法(HPLC)，檢測(cè)MTX和CA-4的含量。色譜條件色譜柱為L(zhǎng)ichrospher C18(4. 6mmX 150mm, 5 μ m);流動(dòng)相為乙腈-水-冰醋酸-三乙胺(體積比14 85 O. 5 O. 3);流速為O. 5mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為308nm。藥物釋放百分率按照以下公式進(jìn)行計(jì)算釋放百分率=(藥物釋放量/藥物總量)X 100%釋放曲線如圖4，MTX釋放緩慢(A)，在不同pH的PBS中的釋放沒(méi)有顯著差別，是由于MTX以化學(xué)鍵連接于多糖骨架，釋放依賴于鍵的斷裂。和MTX相比，CA-4的釋放較快，呈現(xiàn)明顯的PH響應(yīng)性，在pH 5. O和6. O條件下釋放速度顯著快于pH 7. 4 (B)。該釋藥方式有利于載體攜載藥物通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞后逃逸內(nèi)涵體釋放藥物。5、空白URPA納米粒子的小鼠體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)取4 6周齡的ICR小鼠30只，體重18 22g，隨機(jī)分為3組，每組10只，雌雄各半，尾靜脈給藥，給藥容量為200 μ L/只，每3天給藥I次，給藥10次。3組分別為對(duì)照組(NS組)，只給生理鹽水；小劑量組20mg/Kg ;大劑量組200mg/Kg。每周測(cè)量體重，30天后，眶靜脈取血，進(jìn)行血液學(xué)評(píng)價(jià)，測(cè)定紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)、血小板(PLT)數(shù)量。另外測(cè)定天冬氨酸氨基移換酶(AST)、丙氨酸氨基移換酶(ALT)、血液尿素氮(BUN)和血肌酐(Creatinine)含量,評(píng)價(jià)載體對(duì)肝腎功能的影響。 尾靜脈多次注射URPA納米粒子后，小鼠的體重變化如圖5所示，低劑量組、高劑量組的小鼠體重和對(duì)照組相比都沒(méi)有明顯改變，呈緩慢增加的趨勢(shì)。高劑量組小鼠出現(xiàn)精神較差，活動(dòng)減少的現(xiàn)象，但給藥后24h內(nèi)恢復(fù)，食量未見(jiàn)明顯差異，也未見(jiàn)抽搐和紫紺等異常。表I列出了注射納米粒子后小鼠的血液常規(guī)和血液生化值的變化。和對(duì)照組相比，兩種劑量組的小鼠的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(LY)和血紅蛋白濃度(Hb)都沒(méi)有顯著性差異。血液生化指標(biāo)谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)的檢測(cè)值都在正常范圍內(nèi)，說(shuō)明小鼠在多次后肝腎功能沒(méi)有受到影響。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明URPA納米粒子沒(méi)有引起明顯的毒副作用，作為藥物載體是安全的。 表IICR小鼠尾靜脈注射URPA納米粒子后的血常規(guī)及血液生化檢測(cè)值權(quán)利要求
1.一種pH敏感普魯蘭多糖衍生物納米藥物載體材料，其特征在于它是以分子中具有咪唑基改性基團(tuán)和普魯蘭多糖、羧甲基普魯蘭多糖及普魯蘭多糖琥珀酸酯為原料合成，其中改性基團(tuán)與普魯蘭多糖中葡萄糖單元的摩爾比為I : 10 I : 4;合成方法將具有pH響應(yīng)特性的咪唑基團(tuán)改性分子通過(guò)化學(xué)鍵接枝于普魯蘭多糖的多糖骨架，合成pH敏感普魯蘭多糖衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的納米藥物載體材料，其特征在于所述的咪唑基改性基團(tuán)為尿刊酸、聚L-組氨酸、IH-咪唑-4甲酸、2-甲基咪唑-4-甲酸及苯并咪唑-4-甲酸；所述的咪唑基改性基團(tuán)的取代度為2 10%，響應(yīng)pH為6. O 7. O。
3.一種權(quán)利要求I所述的pH敏感普魯蘭多糖衍生物納米藥物載體材料的合成方法，其 特征在于包括的步驟 1)按計(jì)量將改性基團(tuán)分子、N,N' - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)與4- 二甲基氨基吡啶(DMAP)溶于二甲基亞砜(DMSO)溶液，室溫下攪拌反應(yīng)I 2h，生成活性酯形式； 2)普魯蘭多糖、O-羧甲基普魯蘭多糖或普魯蘭多糖琥珀酸酯溶解于DMSO中，攪拌下將I)中反應(yīng)液加至多糖溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)24 48h ； 3)過(guò)濾除去反應(yīng)液中生成的白色沉淀，然后將濾液滴加至過(guò)量無(wú)水乙醇中進(jìn)行醇沉處理，收集沉淀，干燥，即得白色粉末狀改性普魯蘭多糖； 4)透析法將改性普魯蘭多糖溶解于DMSO溶液并轉(zhuǎn)移至透析袋中，于生理鹽水或去離子水中透析24h，前12h每I 2h更換透析液，后12h每3 4h更換透析液至溶液中DMSO全部除盡，而后從透析袋中取出，探頭超聲處理約5min，輸出功率20W，間歇脈沖工作方式脈沖寬度為2s，間歇時(shí)間為2s，即得納米懸液；或 乳化擴(kuò)散法將改性普魯蘭多糖溶解于DMSO溶液中，電磁攪拌下用注射器持續(xù)緩慢注入O. 5%聚乙烯醇(PVA)溶液中，形成納米懸液，將納米懸液離心處理，用去離子水反復(fù)洗滌、離心,除去表面PVA，然后加入去離子水吹打分散制成納米懸液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述DCC、DMAP與改性分子的摩爾比為I.O I. 2 I。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的普魯蘭多糖的分子量范圍5X IO4 2X IO5Da ;所述O-羧甲基普魯蘭多糖分子中羧甲基取代度為50 70% ;所述普魯蘭多糖琥珀酸酯分子中琥珀?；〈葹?5 50%。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述改性普魯蘭多糖的濃度為O.5 5%(g/1OOmL);所述的透析袋的截留分子量12 14kDa。
7.—種權(quán)利要求I所述的pH敏感普魯蘭多糖衍生物納米藥物體系，其特征在于它是以pH敏感普魯蘭多糖衍生物納米材料為藥物載體，負(fù)載有CA-4、CA-4磷酸酯、MDR抑制劑維拉帕米、阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、10-羥基喜樹(shù)堿、米托蒽醌、長(zhǎng)春新堿中的至少一種，其質(zhì)量比為3 10 I。
8.權(quán)利要求7所述的pH敏感普魯蘭多糖衍生物納米藥物體系合成方法，其特征在于它包括的步驟 取碳二亞胺活化劑，DMAP和化療藥物溶解于無(wú)水DMSO中，室溫下避光攪拌12h，備用；取pH敏感普魯蘭多糖衍生物納米材料溶解于無(wú)水DMSO中，然后滴加至上述反應(yīng)液中，室溫下繼續(xù)避光攪拌反應(yīng)48h，醇沉處理，反復(fù)洗滌，干燥；所述水溶性碳二亞胺、DMAP與藥物的摩爾比為I : 1.0 I : 1.2; 所述化療藥物與多糖分子中糖單元的摩爾比為I:I I:3; 所述醇沉處理步驟采用20倍量反應(yīng)液的乙醇溶液； 所述的碳二亞胺活化劑為1_ (3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)及其鹽酸鹽、或N，N’ - 二異丙基碳二亞胺(DIC)及其鹽酸鹽、碘化[I-環(huán)己基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亞胺]。
9.一種尿刊酰基普魯蘭多糖納米藥物載體材料，其特征在于它是由尿刊酸改性普魯蘭多糖制成；尿刊酸與普魯蘭多糖分子中葡萄糖單元的摩爾比為I : 10 I : 4，尿刊?；〈葹?% 10% ;所述普魯蘭多糖的分子量范圍5X IO4 2X IO5Da;制備方法包括的步驟 1)按計(jì)量將尿刊酸、N，N/- 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)與4- 二甲基氨基吡啶(DMAP)溶于二甲基亞砜(DMSO)溶液，室溫下攪拌反應(yīng)I 2h，加入普魯蘭多糖的DMSO溶液，攪拌反應(yīng)24 48h ； 2)過(guò)濾，濾液滴加至過(guò)量無(wú)水乙醇中進(jìn)行醇沉處理，收集沉淀，干燥，即得尿刊酸改性普魯蘭多糖； 3)透析法將尿刊酸改性普魯蘭多糖溶解于DMSO溶液并轉(zhuǎn)移至透析袋中，于生理鹽水或去離子水中透析24h，前12h每I 2h更換透析液，后12h每3 4h更換透析液至溶液中DMSO全部除盡，而后從透析袋中取出，探頭超聲處理約5min，輸出功率20W，間歇脈沖工作方式脈沖寬度為2s，間歇時(shí)間為2s，即得納米懸液；或 乳化擴(kuò)散法將尿刊酸改性普魯蘭多糖溶解于DMSO溶液中，攪拌下用注射器持續(xù)緩慢注入0.5%聚乙烯醇(PVA)溶液中，形成納米懸液，將納米懸液離心處理，用去離子水反復(fù)洗滌、離心，除去表面PVA，然后加入去離子水吹打分散制成納米懸液； 所述DCC、DMAP與尿刊酸的摩爾比為1.0 1.2。
10.一種權(quán)利要求9所述的尿刊酰基普魯蘭多糖高分子前藥及載藥納米粒子，其特征在于包括如下的步驟 . 1)取碳二亞胺活化劑，DMAP和甲氨喋呤(MTX)溶解于無(wú)水DMSO中，室溫下避光攪拌12h，備用；取尿刊酰基普魯蘭多糖溶解于無(wú)水DMSO中，然后滴加至上述反應(yīng)液中，室溫下繼續(xù)避光攪拌反應(yīng)48h，醇沉處理，反復(fù)洗滌，干燥即得MTX-尿刊?；蒸斕m多糖(MTX-URPA)高分子前藥，MTX負(fù)載量為10% 35%;所述碳二亞胺活化劑包括1-(3- 二甲基氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺(EDC)及其鹽酸鹽、或N，N’ -二異丙基碳二亞胺(DIC)及其鹽酸鹽、碘化[I-環(huán)己基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亞胺]; 所述水溶性碳二亞胺、DMAP與甲氨喋呤的摩爾比為I : 1.0 I : 1.2; 所述MTX與尿刊?；蒸斕m多糖分子中糖單元的摩爾比為I : I I : 3; 所述醇沉處理步驟采用20倍量反應(yīng)液的乙醇溶液； . 2)將上述MTX-URPA高分子前藥溶解于DMSO溶液，加入combretastatinA-4，室溫下避光攪拌過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)移至透析袋中，于生理鹽水或去離子水中透析24h，前12h每I 2h更換透析液，后12h每3 4h更換透析液至溶液中DMSO全部除盡，取出探頭超聲處理約5min即得MTX與CA-4的URPA納米共載體系，CA-4的載藥量范圍5% 20% ; .3)稱(chēng)取MTX-URPA、CA-4充分溶解于DMSO中，攪拌下用注射器持續(xù)緩慢注入0.5%聚乙烯醇(PVA)溶液中，形成納米懸液。將納米懸液離心處理，去離子水反復(fù)洗滌、離心，除去表面PVA，然后加入去離子水吹打分散制成MTX與CA-4共載的URPA納米懸液； 所述MTX-尿刊酰普魯蘭多糖高分子前藥的濃度為I 5% (g/100mL)； 所述CA-4與MT X-URPA的質(zhì)量比為I : 10 I : 3 ; 所述透析袋的截留分子量12 14kDa。
全文摘要
本發(fā)明旨在提供一種pH敏感普魯蘭多糖衍生物納米藥物載體和載藥粒子及制備方法。以分子中具有咪唑基改性基團(tuán)和普魯蘭多糖、羧甲基普魯蘭多糖及普魯蘭多糖琥珀酸酯為原料合成，改性基團(tuán)與普魯蘭多糖中葡萄糖單元的摩爾比為1∶10～1∶4。本發(fā)明產(chǎn)率高、球狀形態(tài)規(guī)則、粒徑范圍50～200nm，分布均勻、穩(wěn)定性好。多功能普魯蘭多糖納米藥物載體能夠和肝細(xì)胞表面的去唾液酸糖蛋白受體特異性結(jié)合，具有主動(dòng)肝靶向性；能夠?qū)Σ煌饔脵C(jī)制的抗腫瘤藥物進(jìn)行有效負(fù)載，并且通過(guò)對(duì)癌細(xì)胞內(nèi)涵體的酸性條件的快速響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤病灶部位的有序遞送，達(dá)到藥物協(xié)同增效的作用，降低藥物毒性，并且能有效逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥。在靶向抗肝癌的治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C08B37/00GK102631679SQ20121007736
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月22日
發(fā)明者劉媛媛, 吳靜, 張寧, 楊曉英, 王銀松 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)