專利名稱：活疫苗用耐熱凍干保護(hù)劑及其制備方法及雞新城疫活疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雞新城疫活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑，同時(shí)涉及一種該耐熱凍干保 護(hù)劑的制備方法，以及采用該耐熱凍干保護(hù)劑的雞新城疫活疫苗。
背景技術(shù)：
新城疫(Newcastle disease, ND)也稱亞洲雞瘟或偽雞瘟，由新城疫病毒 (Newcastle disease virus, NDV)引起的一種禽類急性、高度接觸性、致死性傳染病廣泛流 行于世界許多國(guó)家，主要特征是呼吸困難，下痢、神經(jīng)紊亂，黏膜和漿膜出血，嚴(yán)重危害世界 養(yǎng)禽業(yè)，被世界衛(wèi)生組織(OIE)列為A類傳染病。NDV是單股、負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA病毒，為有囊膜的近似球形粒子，直徑一般為 100—400nm，有囊膜的病毒粒子一般呈圓形，但常因囊膜破損而形態(tài)不規(guī)則，也可見(jiàn)橫斷面 直徑IOOnm左右的不同長(zhǎng)度的細(xì)絲。病毒囊膜上有8nm長(zhǎng)的纖突，病毒粒子內(nèi)部為一直徑 約17nm的卷曲的核衣殼。一般在55°C經(jīng)45分鐘或者太陽(yáng)直射下經(jīng)30分鐘滅活，但NDV在 4°C經(jīng)幾周，在_20°C經(jīng)幾個(gè)月，在_70°C經(jīng)幾年仍能保持感染力。大多數(shù)去污劑能迅速將其 滅活，但碳酸氫鈉和NaOH的消毒效果不穩(wěn)定。NDV對(duì)酸、堿的耐受力較強(qiáng)，在pH 2和pHIO 條件下可存活數(shù)小時(shí)。總的來(lái)說(shuō)，NDV對(duì)理化因素的抵抗力較強(qiáng)，能在自然界頑強(qiáng)存活。影 響其在宿主體外生存的主要因素有病毒的數(shù)量、毒株的種類、溫度、濕度、陽(yáng)光照射、貯存條 件及是否存在有機(jī)物等。ND是對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害最大的烈性傳染病之一，而新城疫活疫苗是預(yù)防該類傳染病的 主要疫苗之一?；钜呙缡俏⑸锏淖匀粡?qiáng)毒株通過(guò)物理的、化學(xué)的以及生物學(xué)的方法，連續(xù) 傳代，使其對(duì)原宿主動(dòng)物失去致病力或只引起亞臨床感染，但仍保持良好的免疫原性、遺傳 特性的毒株，用以制備的疫苗。雞新城疫活疫苗一般是通過(guò)把雞ND疫苗毒接種9-11日齡 雞胚，經(jīng)過(guò)4-5天的繼續(xù)孵化，擴(kuò)增病毒，然后收取含有大量雞新城疫疫苗毒的尿囊液冷凍 干燥而成。其成本相對(duì)較小，適合大規(guī)模推廣使用。這類疫苗常能有效的刺激機(jī)體的免疫 系統(tǒng)，全面快速的激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，給易感雞提供更全面的疫苗保護(hù)。疫苗毒還可 從免疫雞傳給未免疫的雞，使其獲得部分免疫力。其使用方便，可作為群體免疫(飲水免疫、 氣霧免疫)使用。但活疫苗的缺點(diǎn)主要表現(xiàn)接種機(jī)體后毒力可能返強(qiáng)導(dǎo)致散毒或發(fā)病，運(yùn) 輸、保存、使用時(shí)要求的條件較高，需要保持在冷鏈狀態(tài)下。在我國(guó)的禽用疫苗中，凍干弱毒疫苗占相當(dāng)大的比例。目前國(guó)內(nèi)疫苗生產(chǎn)企業(yè)常 用的保護(hù)劑主要是蔗糖、牛奶、明膠等，組方簡(jiǎn)單，保護(hù)性能較差。如果在2-8°C條件下，保存 期只有3-6個(gè)月，常需要在_15°C以下保存，保存條件較為苛刻，使疫苗的長(zhǎng)期保存和長(zhǎng)途 運(yùn)輸受到很大限制，在具體的使用過(guò)程中容易造成免疫失敗而造成疫病流行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種保存條件相對(duì)寬松、保存時(shí)間長(zhǎng)的活疫苗用耐熱凍干保 護(hù)劑。
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為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明活疫苗用耐熱凍干保護(hù)劑所采用的技術(shù)方案是一種 活疫苗用耐熱凍干保護(hù)劑，是由以下重量百分含量的組分組成海藻糖10-15%，聚乙烯吡 咯烷酮(PVP) 1-2%，明礬1_2%，谷氨酰胺1-2%，山梨醇2-10%，磷酸二氫鉀0. 1-0. 5%，維生素 CO. 5-1%，余量為水。所述的水為注射用水。本發(fā)明的目的還在于提供一種耐熱凍干保護(hù)劑的制備方法。本發(fā)明耐熱凍干保護(hù)劑的制備方法所采用的技術(shù)方案是一種雞新城疫活疫苗的 耐熱凍干保護(hù)劑的制備方法，將明礬、聚乙烯吡咯烷酮、谷氨酸鈉、山梨醇溶于水后進(jìn)行高 溫高壓滅菌；將海藻糖、維生素C加水溶解后用微孔濾膜過(guò)濾除菌；將滅菌后的各原料混合 得到耐熱凍干保護(hù)劑。本發(fā)明的目的還在于提供一種采用耐熱凍干保護(hù)劑的雞新城疫活疫苗。本發(fā)明的雞新城疫活疫苗所采用的技術(shù)方案是一種耐熱凍干保護(hù)劑的雞新城疫 活疫苗，將雞新城疫活疫苗與耐熱凍干保護(hù)劑采用0. 9-1. 2 1的重量比均勻混合，加入抗 生素，然后進(jìn)行冷凍干燥，得到雞新城疫活疫苗；其中耐熱凍干保護(hù)劑是由以下重量百分含 量的組分組成海藻糖10-15%，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)l-2%，明礬1_2%，谷氨酰胺1_2%，山梨 醇2-10%，磷酸二氫鉀0. 1-0. 5%，維生素CO. 5-1%，余量為水。所述抗生素為氨芐青霉素和硫酸鏈霉素。所述冷凍干燥的具體步驟為將加入抗生素后的混合物置入0_4°C的凍干箱內(nèi)， 以1-2°C /min的速度降至-30 -40°C，并在此溫度下維持2_3h，然后開(kāi)啟真空泵至箱內(nèi)真 空度達(dá)到0. Olmber時(shí)開(kāi)始升溫，在14_20h時(shí)間內(nèi)升溫至-10 _5°C，再以每小時(shí)5_8°C升 溫至20-25°C，并在此溫度下維持4-6h，得到耐熱凍干保護(hù)劑。本發(fā)明的活疫苗用耐熱凍干保護(hù)劑，與傳統(tǒng)疫苗相比，耐熱保護(hù)劑疫苗具有以下 優(yōu)點(diǎn)⑴保存溫度較高，在2°C _8°C時(shí)保護(hù)性能相對(duì)穩(wěn)定，便于貯存、運(yùn)輸和使用；⑵保存時(shí) 間長(zhǎng)，通常在2°C _8°C能保存2年以上；⑶耐熱保護(hù)劑減少了病毒在冷凍干燥過(guò)程中各種理 化因素可能對(duì)制品活性的損傷，活疫苗在保存時(shí)間內(nèi)的活性變化較小，對(duì)活疫苗起到了很 好的保護(hù)作用；⑷耐熱保護(hù)劑組方中多采用分子量很高且易溶的物質(zhì)如海藻糖、聚乙烯吡 咯烷酮(PVP)等原料，所以產(chǎn)品易溶性好；(5)保護(hù)劑配方選用相對(duì)靈活，易于尋找最優(yōu)化的 適合該生物制品的保護(hù)劑。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、雞新城疫活疫苗制備
測(cè)定雞新城疫疫苗株血凝效價(jià)為640，用無(wú)菌生理鹽水稀釋20倍，在無(wú)菌條件下，將新 城疫疫苗株稀釋液0. 2ml接入9-10日齡的SPF雞胚，每個(gè)雞胚接種于尿囊腔中，用石蠟封 口置36°C培養(yǎng)箱孵化4-5d，培養(yǎng)結(jié)束后在4°C冰箱過(guò)夜，然后在無(wú)菌條件下取出尿囊液。最 后測(cè)定病毒血凝效價(jià)在604-1280之間，再用0. 45 μ微孔濾膜，加壓過(guò)濾。2、耐熱凍干保護(hù)劑的配置
本保護(hù)劑可分為兩部份配置一部分是可耐高溫的聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 1-2%、明礬1_2%、谷氨酰胺1-2%、山梨醇2-10%、磷酸二氫鉀0. 1-0. 5%溶于注射用水后116°C滅菌 15-30分鐘；另一部分是將不耐熱的海藻糖10-15%和維生素CO. 5-1%加注射用水溶解后用 微孔濾膜過(guò)濾除菌。最后將分別除菌后的保護(hù)劑混合均勻，即為耐熱凍干保護(hù)劑。3、配苗及凍干
將活疫苗與耐熱凍干保護(hù)劑按0. 9-1. 2 1進(jìn)行配置，同時(shí)加入抗生素，抗生素可 以選用常規(guī)含量的常規(guī)抗生素，本實(shí)施例采用10000-20000單位/ml的氨芐青霉素或 10000-20000 μ g/ml的硫酸鏈霉素；定量分裝進(jìn)行凍干干燥，冷凍干燥可以采用常規(guī)方法 進(jìn)行，本實(shí)施例采用如下具體冷凍干燥凍干箱預(yù)先降溫至0-4°C，把分裝好的疫苗放入 凍干箱內(nèi)，再以1_2°C /min的速度降溫至-36 -40°C，并在此溫度下維持2_3h后，啟動(dòng) 真空泵在30min之內(nèi)使真空度達(dá)到0. Olmber,當(dāng)真空度達(dá)到時(shí)開(kāi)始升溫，在14_20h升溫 至-10 -5°C，以后以每小時(shí)5-8°C升溫至20-25°C，并在此溫度下維持4_6h后即可。凍干 全過(guò)程需要25-38h。凍干后的疫苗每羽份苗含量應(yīng)彡IO6EID50 4、成品檢驗(yàn)
4. 1、無(wú)菌檢驗(yàn)將制備好的耐熱凍干保護(hù)劑接種在常規(guī)的培養(yǎng)基中，放入37°C恒溫培 養(yǎng)過(guò)夜，同時(shí)設(shè)立對(duì)照。在24-72h后，接種疫苗的培養(yǎng)基均無(wú)菌落產(chǎn)生，而對(duì)照培養(yǎng)基上出 現(xiàn)大量菌落，試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明所制備的耐熱凍干保護(hù)劑經(jīng)除菌后，無(wú)菌檢驗(yàn)為陰性。4. 2、性狀檢驗(yàn)將成品疫苗保存在2_8°C條件下定期取出，觀察其性狀，在保存24 個(gè)月其性狀沒(méi)有變化。4. 3、疫苗保存期試驗(yàn)
將凍干干燥好的疫苗分別放置于2-8°C、37°C條件下保存，與不同時(shí)間檢測(cè)疫苗效價(jià)變 化情況。(1)效力檢驗(yàn)將保存在2-8°C、37°C條件下的疫苗定期取出，按瓶簽注明的羽份， 用滅菌注射用水稀釋至1羽份/0. Iml，在作10倍系列稀釋，取10_5、10_6、10_7三個(gè)稀釋度，每 個(gè)稀釋度接種5枚10日齡SPF雞胚的尿囊腔，0. Iml/胚，置37°C孵育，在接種48-120h內(nèi)死 亡的雞胚取出，收獲尿囊液，將同一稀釋度的尿囊液混合，分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，至120h， 取出所有活的雞胚，分別測(cè)定凝集價(jià)。當(dāng)凝集價(jià) 128者判為感染，計(jì)數(shù)半數(shù)感染量。本試驗(yàn)的對(duì)照組1為常規(guī)5%蔗糖脫脂乳配制的普通凍干保護(hù)劑配置的新城疫活 疫苗，對(duì)照組2為購(gòu)置美國(guó)梅里亞公司生產(chǎn)的新城疫活疫苗，實(shí)驗(yàn)組為利用本發(fā)明耐熱凍 干保護(hù)劑配置的新城疫活疫苗，具體采用的技術(shù)方案如表1所示，
表1實(shí)驗(yàn)組中耐熱凍干保護(hù)劑的應(yīng)用參數(shù)
實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組2實(shí)驗(yàn)組3海藻糖(％)1012. 515聚乙烯吡咯烷酮(％)121. 5明礬(％)21. 51谷氨酰胺(％)11. 52山梨醇(％)6210磷酸二氫鉀(％)0. 10. 30. 5維生素C (%)0. 50. 751水余量余量余量活疫苗耐熱凍干保護(hù)劑(重量)0. 9 11 11. 2 1
5(2)試驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表2、表3 表2疫苗在2-8°C條件下保存6、12、18、24個(gè)月效價(jià)測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
一種活疫苗用耐熱凍干保護(hù)劑，其特征在于是由以下重量百分含量的組分組成海藻糖10 15%，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)1 2%，明礬1 2%，谷氨酰胺1 2%，山梨醇2 10%，磷酸二氫鉀0.1 0.5%，維生素C 0.5 1%，余量為水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞新城疫活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑，其特征在于所述的水 為注射用水。
3.—種如權(quán)利要求1所述雞新城疫活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑的制備方法，其特征在 于將明礬、聚乙烯吡咯烷酮、谷氨酸鈉、山梨醇溶于水后進(jìn)行高溫高壓滅菌；將海藻糖、維 生素C加水溶解后用微孔濾膜過(guò)濾除菌；將滅菌后的各原料混合得到耐熱凍干保護(hù)劑。
4.一種采用如權(quán)利要求1所述耐熱凍干保護(hù)劑的雞新城疫活疫苗，其特征在于將雞 新城疫活疫苗與耐熱凍干保護(hù)劑采用0. 9-1.21的重量比均勻混合，加入抗生素，然后進(jìn) 行冷凍干燥，得到雞新城疫活疫苗；其中耐熱凍干保護(hù)劑是由以下重量百分含量的組分組 成海藻糖10-15%，聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 1-2%，明礬1_2%，谷氨酰胺1-2%,山梨醇2-10%, 磷酸二氫鉀0. 1-0. 5%，維生素C 0. 5-1%，余量為水。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雞新城疫活疫苗，其特征在于所述抗生素為氨芐青霉素或 硫酸鏈霉素。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雞新城疫活疫苗，其特征在于所述冷凍干燥的具體步驟為 將加入抗生素后的混合物置入0-4°C的凍干箱內(nèi)，以1_2°C /min的速度降至-30 _40°C， 并在此溫度下維持2-3h，然后開(kāi)啟真空泵至箱內(nèi)真空度達(dá)到0. Olmber時(shí)開(kāi)始升溫，在 14-20h時(shí)間內(nèi)升溫至-10 -5°C，再以每小時(shí)5-8°C升溫至20-25°C，并在此溫度下維持 4_6h，得到耐熱凍干保護(hù)劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種活疫苗用耐熱凍干保護(hù)劑及其制備方法，以及采用該凍干保護(hù)劑的雞新城疫活疫苗，其中活疫苗用耐熱凍干保護(hù)劑是由以下重量百分含量的組分組成海藻糖10-15%，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)1-2%，明礬1-2%，谷氨酰胺1-2%，山梨醇2-10%，磷酸二氫鉀0.1-0.5%，維生素C0.5-1%，余量為水。本發(fā)明的活疫苗用耐熱凍干保護(hù)劑，與傳統(tǒng)疫苗相比具有穩(wěn)定性好、保存時(shí)間長(zhǎng)、保存條件低、活疫苗的活性損傷小、溶解性好、原料簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C08L39/06GK101947321SQ20101029801
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者吳紅云, 李建正, 范金紅 申請(qǐng)人:鄭州后羿制藥有限公司