專利名稱：殺配子劑草甘膦的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及植物基因工程領(lǐng)域。更詳細(xì)而言，本發(fā)明涉及用草甘膦除草劑選擇性誘導(dǎo)出雄性不育表型的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明所述植物具有草甘膦營養(yǎng)耐受性和雌性耐受性，但對該除草劑為雄性敏感。本發(fā)明的方法和組合物提供用于雜交種子生產(chǎn)、用于使不希望產(chǎn)生的農(nóng)作物異型雜交最小化以及用于延長花期的雄性不育植株。
植物生物學(xué)家始終認(rèn)為，近親植物的異體受精可產(chǎn)生具有所需聯(lián)合性狀的后代，而近交雙親則不具有這些性狀。在主要農(nóng)作物物種中均出現(xiàn)過這種被稱為雜種優(yōu)勢或雜合優(yōu)勢的現(xiàn)象(Stuber,1994)。由于這種雜交種子產(chǎn)生的植株可具有非常優(yōu)越的農(nóng)作物性能特征，如植株大小、谷粒產(chǎn)量、抗病性、除草劑耐受性、氣候適應(yīng)性等，因此開發(fā)該方法用于農(nóng)作物商品化生產(chǎn)具有很大的利益。雜交品種對全世界的食品生產(chǎn)已產(chǎn)生了巨大的影響，它有極大的潛力來為增長的世界人口提供高產(chǎn)量的農(nóng)作物植株。
生產(chǎn)雜交種子的要求是異體授粉相對自體授粉要占優(yōu)勢，目前已開發(fā)出多種試圖克服自體授粉障礙的技術(shù)。但是對大多數(shù)農(nóng)作物物種而言，雜交種子生產(chǎn)的主要限制是缺乏簡單可靠并且經(jīng)濟(jì)的方法來產(chǎn)生雄性不育體，同時保持雌性配子完整且易于被適當(dāng)花粉供體授粉。
導(dǎo)致雄性不育的方法可大致分為物理方法、化學(xué)方法和/或生物方法。在諸如玉米等某些植物中，物理去除含有雄性配子的器官相對而言比較簡單，因?yàn)樵撈鞴俨坏┞对谕猓以诳臻g上與雌性配子相分離。但大多數(shù)農(nóng)作物物種在同一朵花中既含有功能性雄性器官又含有功能性雌性器官，使得去雄既不簡單也不直截了當(dāng)。物理方法導(dǎo)致雄性不育一般為勞動高密集型，并且代價昂貴。此外，利用這些方法很難保證能完全避免自體授粉。因此，開發(fā)出無需費(fèi)力地手工或機(jī)械去雄的替代方法將能夠大大改善生產(chǎn)的基本成本。
除物理方法導(dǎo)致雄性不育外，還可在雜交種子生產(chǎn)中使用化學(xué)殺配子劑，以通過抑制可育花粉的產(chǎn)生來獲得暫時雄性不育體。有效的殺配子劑是在適當(dāng)發(fā)育階段或在性成熟之前施加于一種植物時可殺死植物的雄性配子或有效終止其發(fā)育，同時保留植物中能夠進(jìn)行異花授粉的雌性配子或至少其主要部分的化合物。對一種有效的殺配子劑而言，期望破壞雄性配子的施加量要顯著低于破壞雌性配子所需的量。因此，殺配子劑應(yīng)能夠在無需格外預(yù)防偶爾用藥過量的情況下施加于田間。
利用殺配子劑商業(yè)化生產(chǎn)雜交種子的主要限制是它們一般對配子缺乏選擇性，尤其是對雄性配子。有多種化合物能夠破壞或損傷植物的雄性配子；事實(shí)上幾乎任何系統(tǒng)性除草劑都具有該方面的作用。但這些化合物的大多數(shù)會同時殺死雌性配子和植物的營養(yǎng)組織。遺憾的是，那些在定向于配子方面確實(shí)具有一定選擇性并且其程度遠(yuǎn)高于營養(yǎng)組織的化合物一般又不能分辨所破壞的配子的性別。此外，許多顯示出良好選擇性的化學(xué)殺配子劑具有毒理學(xué)問題或其它環(huán)境問題，這使它們在雜交種子商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用受到了限制。因此，能夠改善殺配子劑選擇性及環(huán)境安全性的方法將會在雜交種子生產(chǎn)中得到廣泛的應(yīng)用。
目前已將一些自然發(fā)生的雄性不育遺傳機(jī)制應(yīng)用于某些植物物種的雜交種子生產(chǎn)。在很多情況下是通過阻滯花粉的發(fā)育和/或阻滯滋養(yǎng)花粉粒并在適當(dāng)時間釋放成熟花粉的花藥組織的發(fā)育來產(chǎn)生雄性不育。目前已在某些植物物種中成功地采用了使用CMS系統(tǒng)的雜交策略。該方法的缺點(diǎn)是它需要三種不同的品系來產(chǎn)生單交叉雜種雄性不育系(母本)、與雄性不育系基因相同但含有全功能線粒體的保持系、以及父本系。
許多CMS類型具有限制其應(yīng)用的不利特性；其中包括連鎖的或多效性的不良特性如疾病易感性、不育性衰竭、不一致性和/或綜合遺傳的可育性恢復(fù)。此外，CMS在許多重要的農(nóng)作物物種中無法使用，并且CMS細(xì)胞質(zhì)無法在不同核遺傳背景下的某個物種中均造成完全不育。在廣泛使用CMS進(jìn)行雜交種子生產(chǎn)的那些物種中存在對單一不育細(xì)胞質(zhì)的依賴性，這種依賴性十分危險(xiǎn)(Williams和Levings,1992)。由T屬Helminthosporium maydis引起的南方玉米大斑病可利用胞質(zhì)性雄性不育T細(xì)胞質(zhì)對所有玉米雜種進(jìn)行劇烈攻擊，這表明了過于依賴單一來源雄性不育細(xì)胞質(zhì)的雜交種子行業(yè)的脆弱性。
遺傳工程具有提供目前所用雜交種子生產(chǎn)方法的經(jīng)濟(jì)的替代方法的潛力，由此為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力做出巨大貢獻(xiàn)(Williams,1995)。例如，細(xì)胞毒素蛋白編碼基因的選擇性表達(dá)可產(chǎn)生單一的雄性不育植株群體。舉一個例子，利用煙草絨氈層特異啟動子在花藥絨氈層細(xì)胞中對細(xì)胞毒素芽孢桿菌RNA酶基因進(jìn)行表達(dá)可導(dǎo)致雄性不育，當(dāng)與含有驅(qū)動芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因表達(dá)的絨氈層特異啟動子的植株雜交時，后代的雄性不育可得到復(fù)原(Marini等，1990；Zhan等，1996)。這種芽孢桿菌RNA酶/芽孢桿菌RNA酶抑制劑的基因聯(lián)合已被用來去除特定類型的花藥細(xì)胞，這些細(xì)胞用于鑒別花藥成熟和花粉釋放所需的細(xì)胞類型(Goldberg等，1995；Beals和Goldberg,1997)。
利用花藥特異啟動子在花藥中表達(dá)時可對花粉形成產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用的DAM-甲基化酶的表達(dá)已作為一種由基因工程導(dǎo)致雄性不育的方法被公開(WO9617945)。
用于產(chǎn)生雄性不育植株的反義RNA策略也已進(jìn)行了嘗試。目前認(rèn)為，與決定花藥或花粉正常生長和發(fā)育的內(nèi)源基因互補(bǔ)的RNA的表達(dá)是通過，例如，由于與花粉或絨氈層細(xì)胞中的天冬氨酸激酶反義而抑制一種必需氨基酸的表達(dá)(EP93109226)，或抑制玉米中QM基因的表達(dá)(美國專利號5,583,210)來發(fā)揮作用的。Fabijanski和Arnison(美國專利號5,356,799)提出一種涉及使用抗生素抗性基因或除草劑抗性基因的反義RNA策略，但未能證明該種方法可成功應(yīng)用于雄性不育植株的產(chǎn)生。另有報(bào)導(dǎo)，花粉或相關(guān)細(xì)胞中諸如ATPase(Zabaleta等，1996)等代謝活性酶的表達(dá)也可導(dǎo)致雄性不育。遺憾的是，這些方法大多實(shí)用性有限，因?yàn)榛謴?fù)可育性需要雜交，而由育種系產(chǎn)生種子仍存在問題。
異型雜交是指通過花粉傳播將遺傳信息散布到相關(guān)植株。這對經(jīng)遺傳修飾的植株而言常被視為是不受歡迎的。轉(zhuǎn)基因植物與相關(guān)野生型植物物種的異型雜交引起人們對雜草生長的關(guān)注，這些雜草由于可通過新基因表達(dá)獲得選擇優(yōu)勢，從而更加強(qiáng)壯。試圖將具有昆蟲抗性、病毒抗性、真菌抗性、除草劑抗性等抗性的植物商品化的種子公司都必須為政府管理機(jī)構(gòu)和環(huán)境利益集團(tuán)解決這些性狀同相關(guān)植物物種異型雜交的問題。人們已就此舉辦了多次會議及專題研究會來討論這些問題(Serratos等，1997)。問題的范圍從雜草增加直到減少相關(guān)野生型親屬的生物多樣性。
來自作為傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)育種產(chǎn)品的農(nóng)作物的基因流動對其雜草親屬的雜草性狀起了很大的作用。其實(shí)例包括甜菜、御谷、稻和黑麥。由于缺乏控制花粉產(chǎn)生的有效方法，使控制基因流動至這些相關(guān)野生型物種的能力受到了限制，其結(jié)果是，如果這些基因確實(shí)從栽培植株擴(kuò)散至相關(guān)野生型物種，那么將無法限制這些基因的擴(kuò)散。因此，在植物生物技術(shù)領(lǐng)域還有一種要求未得到解決，即選擇性阻礙花粉產(chǎn)生以限制重組遺傳物質(zhì)擴(kuò)散的方法，同時還要提供一種手段來選擇性對抗已獲得該遺傳物質(zhì)的野生型植株親屬。
為居住及商業(yè)環(huán)境提供花壇植物的園藝行業(yè)將對可更長時間維持花瓣和/或色彩的花卉產(chǎn)生極大的興趣。花經(jīng)授粉后將很快衰退。因此，阻礙授粉將使產(chǎn)生艷麗花卉的多種花壇植物的使用壽命延長數(shù)天或數(shù)星期。作為其重要性的一個實(shí)例，園藝行業(yè)目前正支持一項(xiàng)使百合花雄性不育，以此來保持花的外殼并使污染外被和組織的百合花花粉無法產(chǎn)生的育種計(jì)劃。在天竺葵等植物物種中實(shí)現(xiàn)類似的雄性不育也將十分有益，因?yàn)檫@些植物早在授粉后2小時即出現(xiàn)花瓣凋落?；ò甑蚵鋾逛N售和作物商品化受到限制。一種可廣泛用來減少這些及其它許多物種的花粉脫落并延長花卉的花瓣壽命的遺傳工程方法將為園藝行業(yè)提供一種生產(chǎn)具有改良特性的產(chǎn)品的重要新工具。
N-膦酰甲基甘氨酸亦稱為草甘膦，它是一種對廣泛的植物物種均具有活性的公知的除草劑。Roundup_(Monsanto Co.)作為一種具有所需的短半壽期和環(huán)境安全性的除草劑，其活性成分即為草甘膦。當(dāng)草甘膦被施加于植物表面時可移動至整個植株。草甘膦通過抑制為芳香族氨基酸合成提供前體的莽草酸途徑而對植物產(chǎn)生毒性。更明確而言，草甘膦通過對5-烯醇丙酮基-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)的抑制來影響磷酸烯醇丙酮酸與3-磷酸莽草酸轉(zhuǎn)化為5-烯醇丙酮基-3-磷酸莽草酸。
利用遺傳工程在植物基因組中插入一種引起野生型EPSPS更高水平產(chǎn)生的DNA分子，由此可能創(chuàng)造出草甘膦耐受植株。通過與草甘膦的親合力更低從而施加草甘膦時亦可保持其催化活性的EPSPS變異體的表達(dá)也可實(shí)現(xiàn)草甘膦耐受性(美國專利號5,633,435)。在植物組織中降解草甘膦的酶(美國專利號5,463,175)也可以使細(xì)胞具有草甘膦耐受性。因此，這些基因使草甘膦耐受性轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物得以產(chǎn)生，從而可將草甘膦應(yīng)用于雜草的有效控制，同時對損害農(nóng)作物的擔(dān)心也降至最低。例如，已利用遺傳工程將草甘膦耐受性引入玉米(美國專利號5,554,798)和小麥(Zhou等，1995)。
有關(guān)草甘膦作為化學(xué)殺配子劑的應(yīng)用已有所描述(美國專利號4,735,649)。其中公開的內(nèi)容有，草甘膦在理想條件下能夠殺死約95％的雄性配子，同時保持約40-60％可受精的雌性配子。此外，在公開的應(yīng)用水平上通常會觀測到一種矮化效應(yīng)，植物尺寸的減小和少量萎黃病即證明了這一點(diǎn)。因此，用草甘膦作為殺配子劑的主要缺點(diǎn)是由于缺乏對雄性配子的足夠選擇性而引起植物毒副作用，對大多數(shù)殺配子劑而言均是如此。
發(fā)明概述從最廣泛的意義上來講，本文所述發(fā)明提供一種由除草劑誘導(dǎo)的選擇性和加以調(diào)控地去除植物中特定類型細(xì)胞的方法。該方法涉及將至少兩種不同的重組DNA分子插入到植物細(xì)胞基因組中。第一DNA分子包含經(jīng)操作按5’-3’方向連接的一種在植物細(xì)胞中促使第一RNA序列產(chǎn)生的第一啟動子；一種編碼第一RNA序列的第一DNA序列，該RNA序列編碼一種產(chǎn)生對系統(tǒng)運(yùn)輸型除草劑，優(yōu)選為草甘膦，的耐受性的蛋白；一種在植物細(xì)胞中促使第一RNA序列3’端多腺苷酸化的第一3’非翻譯區(qū)。
第一DNA分子所用啟動子通常以組成型方式表達(dá)。在該方面有效發(fā)揮作用的適當(dāng)啟動子實(shí)例包括花椰菜花葉病毒19S啟動子、花椰菜花葉病毒35S啟動子、玄參花葉病毒35S啟動子、甘蔗桿狀病毒啟動子、鴨跖草黃色斑點(diǎn)病毒啟動子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亞基啟動子、稻胞質(zhì)性丙糖磷酸異構(gòu)酶啟動子、腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶啟動子、稻肌動蛋白1啟動子、甘露堿合酶啟動子和章魚堿合酶啟動子。
本發(fā)明的第二DNA分子包含經(jīng)操作按5’-3’方向連接的一種能夠在植物細(xì)胞中促使第二RNA序列產(chǎn)生的第二啟動子；一種編碼與第一RNA序列互補(bǔ)的第二RNA序列的第二DNA序列；一種在植物細(xì)胞中促使第二RNA序列3’端多腺苷酸化的第二3’非翻譯區(qū)。
第二DNA分子所用啟動子不以組成型方式表達(dá)。相反，它具有一種更局限的表達(dá)模式，優(yōu)選地局限于一種或多種雄性生殖組織。本發(fā)明的第二DNA分子所采用的優(yōu)選啟動子包括TA29煙草絨氈層特異啟動子、PA1苯基苯乙烯酮二氫黃酮異構(gòu)酶啟動子、PA2苯基苯乙烯酮二氫黃酮異構(gòu)酶啟動子、SLG啟動子、LAT啟動子、聚半乳糖醛酸外切酶啟動子、Zmg13啟動子、LAT52啟動子、LAT59啟動子和psgB6-1啟動子。
本發(fā)明的第一DNA分子的表達(dá)可用來在其表達(dá)的那些組織中產(chǎn)生草甘膦耐受性。另一方面，第二DNA分子的表達(dá)引起產(chǎn)生一種RNA序列，該序列能夠抑制由第一DNA分子表達(dá)所導(dǎo)致的草甘膦耐受性。第二DNA分子采用一種啟動子，其只限制那些表達(dá)第一DNA分子的組織亞類的反義RNA產(chǎn)生，由此，只有表達(dá)第二DNA分子的組織亞類才會對草甘膦毒性敏感。因此，通過對植株施加草甘膦可選擇性去除特定類型或聯(lián)合類型的細(xì)胞，這將取決于所使用的啟動子。
因此，作為本發(fā)明的一個方面則提供一種產(chǎn)生雄性不育植株的方法，該方法的步驟包括將本發(fā)明的第一和第二DNA分子插入植物細(xì)胞基因組；獲得含有第一和第二DNA分子的植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞；由植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)化植株；并將轉(zhuǎn)化植株暴露于草甘膦。
作為本發(fā)明的另一方面則提供一種產(chǎn)生雜交種子的方法，該方法包括用雄性可育供體的花粉對公開的雄性不育植株實(shí)施異體受精；并收集異體受精后代的種子。
作為本方面的又一方面則提供一種產(chǎn)生雜交種子的方法，其中該種子能夠生成已恢復(fù)雄性可育性并能夠在施加草甘膦時保持可育的植株。包含本發(fā)明第一和第二DNA分子的雄性不育植株的產(chǎn)生如文中所述。只是本發(fā)明的該方面所采用的雄性可育花粉雙親在其基因組中含有一種第三DNA分子，該分子包含經(jīng)操作按5’-3’方向連接的一種在植物細(xì)胞中促使第三RNA序列產(chǎn)生的第三啟動子；一種編碼第三RNA序列的第三DNA序列，該RNA序列編碼一種產(chǎn)生草甘膦耐受性的蛋白；一種在植物細(xì)胞中促使第三RNA序列3’端添加多腺苷酸核苷酸的第三3’非翻譯區(qū)；其中第三DNA分子與第一DNA分子不同。
第三DNA分子的草甘膦耐受性基因在結(jié)構(gòu)上與第一DNA分子的草甘膦耐受性基因無關(guān)。因此，第二DNA分子產(chǎn)生的反義或共抑制RNA分子能夠與第一DNA分子產(chǎn)生的RNA雜交從而抑制其表達(dá)，但由于缺乏足夠的互補(bǔ)性而不能與第三DNA分子的草甘膦耐受性基因雜交。作為選擇，也可在第三DNA分子中使用與第一DNA分子所用相同或相似的草甘膦耐受性基因。但是在這種情況下，第一與第三DNA分子間仍存在一段可被第二DNA分子差異定向抑制的不同區(qū)域。
進(jìn)一步提供的還有包含本發(fā)明所述第一、第二和/或第三DNA分子的植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞以及由其產(chǎn)生的植株。
在實(shí)施本發(fā)明時采用的優(yōu)選植物包括，但并不局限于，玉米、小麥、稻、蕓苔、燕麥、大麥、紫苜蓿、胡蘿卜、棉花、油籽油菜(oilseedrape)、甜菜、向日葵、大豆、番茄、黃瓜和南瓜。
附圖簡述以下附圖構(gòu)成該說明書的一部分，它們被用來進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些方面。通過參考一個或多個這些附圖并結(jié)合文中提供的特定實(shí)施方案詳述將能夠更好地理解本項(xiàng)發(fā)明。


圖1(序列標(biāo)號1)說明P-Ztap啟動子的DNA序列。
圖2(序列標(biāo)號2)說明矮牽牛花EPSPS內(nèi)含子的DNA序列。
圖3(序列標(biāo)號3)說明矮牽牛花EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列。
圖4(序列標(biāo)號4)說明矮牽?；‥PSPS內(nèi)含子/矮牽牛花EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列。
圖5．pMON19470和pMON19437質(zhì)粒圖譜圖6．pMON19653和pMON19340質(zhì)粒圖譜圖7．pMON25232質(zhì)粒圖譜圖8．pMON25233質(zhì)粒圖譜圖9．pMON25234和pMON25235質(zhì)粒圖譜圖10．pMON25241質(zhì)粒圖譜圖11．pMON25258的構(gòu)建圖12．pMON25259的構(gòu)建圖13．pMON25260的構(gòu)建圖14．玉米原生質(zhì)體中與控制載體或反義載體共同電穿孔的CP4相對表達(dá)。
圖15．小麥原生質(zhì)體中與控制載體或反義載體共同電穿孔的CP4相對表達(dá)。
發(fā)明詳述重組DNA分子DNA向mRNA的轉(zhuǎn)錄受基因中稱為“啟動子”的區(qū)域的調(diào)控。啟動子區(qū)域包含的雙鏈DNA序列對RNA聚合酶發(fā)出信號，使其與DNA有義鏈和反義鏈結(jié)合并以有義鏈為模板產(chǎn)生與DNA有義鏈互補(bǔ)的相應(yīng)mRNA鏈。這種利用DNA模板產(chǎn)生mRNA的過程稱為基因的“表達(dá)”或“轉(zhuǎn)錄”。
選定在本發(fā)明實(shí)施方案中使用的特定啟動子應(yīng)能夠產(chǎn)生足夠的表達(dá)，以便在第一DNA分子情況下產(chǎn)生草甘膦耐受性，而在第二DNA分子情況下則抑制草甘膦耐受性，其程度足以使組織對草甘膦毒性敏感。
第一DNA分子通常含有一種組成型啟動子，即一種編碼草甘膦耐受性酶的DNA結(jié)構(gòu)序列，和一段3’非翻譯區(qū)。對多種在植物細(xì)胞中發(fā)揮作用的組成型啟動子已進(jìn)行過描述。用于組成型表達(dá)第一DNA分子草甘膦耐受性的適當(dāng)啟動子包括，但并不局限于，花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子(Odell等，1985)、玄參花葉病毒(FMV)35S(Sanger等，1990)、甘蔗桿狀病毒啟動子(Bouhida等，1993)、鴨跖草黃色斑點(diǎn)病毒啟動子(Medberry和Olszewski,1993)、來自核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO)的光誘導(dǎo)型啟動子(Coruzzi等，1984)、稻胞質(zhì)性丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)啟動子(Xu等，1994)、Arabidopsis的腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(APRT)啟動子(Moffatt等，1994)、稻肌動蛋白1基因啟動子(Zhong等，1996)，以及甘露堿合酶啟動子和章魚堿合酶啟動子(Ni等，1995)。所有這些啟動子都曾用來創(chuàng)建各種不同類型的可在植物中表達(dá)的重組DNA構(gòu)建體。通過大腸桿菌uidA(β-葡糖醛酸酶)基因等報(bào)告基因的表達(dá)已對這些和其它啟動子進(jìn)行了組成型啟動子比較分析(Li等，1997；Wen等，1993)。
選定在第二DNA分子中使用的啟動子要能夠提供特殊表達(dá)以產(chǎn)生預(yù)期的細(xì)胞致死性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，啟動子要能夠?qū)ｉT或主要指導(dǎo)諸如花粉本身、花藥絨氈層細(xì)胞層或花藥組織發(fā)育至關(guān)重要的組織內(nèi)的表達(dá)。
能夠調(diào)控特定類型細(xì)胞和組織中基因表達(dá)的植物啟動子已為人們所熟知。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，那些最優(yōu)選的啟動子是在雄性生殖組織發(fā)育期間或能夠在花粉中特異表達(dá)，并且其程度足以產(chǎn)生與第一DNA分子的組成型啟動子轉(zhuǎn)錄出的有義RNA互補(bǔ)的抑制性RNA分子的啟動子。這些啟動子類型的實(shí)例包括TA29煙草絨氈層特異啟動子(Mariani等，1990)、矮牽?；ǖ腜A1及PA2苯基苯乙烯酮二氫黃酮異構(gòu)酶啟動子(van Tunen等，1990)、蕓苔的SLG基因啟動子(Heizmann等，1991)，和番茄的LAT基因啟動子(Twell等，1991)。
稻的花藥特異性啟動子和花粉特異性啟動子均已分離出來。其實(shí)例包括Osg6B啟動子，據(jù)顯示該啟動子在轉(zhuǎn)基因稻中驅(qū)動未成熟花藥內(nèi)的β-葡糖醛酸酶基因表達(dá)。在小穗、葉和根等其它組織中則未檢測到活性(Yokoi等，1997)。據(jù)顯示，稻的PS1花粉特異性啟動子能夠在稻的花粉中特異表達(dá)β-葡糖醛酸酶基因(Zou等，1994)。在稻的花藥絨氈層中特異表達(dá)的其它稻基因也已確定(Tsuchiya等，1994；Tsuchiya等，1997)。主要于花藥發(fā)育期間在稻中表達(dá)的其它基因的分離可通過，例如，構(gòu)建cDNA文庫以確定花藥特異性克隆的方法加以實(shí)現(xiàn)(Qu等，1997)。
該領(lǐng)域的技術(shù)人員均了解從在花粉或涉及花粉產(chǎn)生的植物類細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的基因或基因家族成員中分離啟動子所使用的方法(Stinson等，1987；Brown和Crouch,1990；McCormick等，1989)。這些啟動子的其它實(shí)例包括玉米的聚半乳糖醛酸外切酶基因啟動子(Dubald，等，1993)和Zmc13 mRNA所用的啟動子(Hanson等，1989)。已證明在番茄花粉中優(yōu)先表達(dá)的啟動子是LAT52啟動子和LAT59啟動子(Twell等，1991)。玉米pZtap啟動子的全序列公開于序列標(biāo)號1。在美國專利號5,470,359中則公開了該序列的一部分(psgB6-1)。
本發(fā)明的重組DNA分子通常包含一段5’非翻譯區(qū)、一種啟動子、一段植物DNA內(nèi)含子序列、一段編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP)的結(jié)構(gòu)序列、一段草甘膦耐受性基因的DNA編碼序列，和一段3’非翻譯區(qū)。
5’非翻譯前導(dǎo)序列可來源于表達(dá)異種DNA序列的選定啟動子，并且在需要的情況下可經(jīng)特異修飾以增加mRNA的翻譯。5’非翻譯區(qū)還可來自病毒RNAs、適當(dāng)真核生物基因，或一段合成的基因序列。本發(fā)明并不局限于其中非翻譯區(qū)來自帶有啟動子序列的5’非翻譯序列的構(gòu)建體。前導(dǎo)序列還可來自不相關(guān)的啟動子或編碼序列。
重組DNA分子的3’非翻譯區(qū)包含一段能夠在植物體內(nèi)促使RNA3’末端添加腺苷酸核苷的多腺苷酸化信號。3’非翻譯區(qū)可來源于各種能夠在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的基因。通常能夠在該方面使用的有胭脂堿合酶3’非翻譯區(qū)(Fraley等，1983)、豌豆ssRUBISCO的3’非翻譯區(qū)(Coruzzi等，1994)、大豆75種子貯存蛋白基因的3’非翻譯區(qū)(Schuler等，1982)以及豌豆ssRUBISCO的小亞基基因。含有土壤桿菌腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；虻亩嘞佘账峄盘柕目赊D(zhuǎn)錄3’非翻譯區(qū)也同樣適合。
適合于在單子葉植物中表達(dá)的植物內(nèi)含子實(shí)例包括，例如，玉米hsp70內(nèi)含子、稻肌動蛋白1內(nèi)含子、玉米ADH1內(nèi)含子、ArabidopsisSSU內(nèi)含子、Arabidopsis EPSPS內(nèi)含子、矮牽?；‥PSPS內(nèi)含子和其它為該領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的內(nèi)含子。
適合于將草甘膦耐受性基因產(chǎn)物定向?qū)胫参锛?xì)胞葉綠體的CTPs實(shí)例包括矮牽?；‥PSPS CTP、Arabidopsis EPSPS CTP2內(nèi)含子和其它為該領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的CTPs。
草甘膦耐受性基因目前已開發(fā)出多種可用來在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)異種DNA序列，下文通常指草甘膦耐受性基因或草甘膦耐受性編碼序列，以使植物對除草劑草甘膦具有耐受性的方法。任何為技術(shù)人員所公知的這種草甘膦耐受性基因均適合于在本發(fā)明的實(shí)施中使用。
草甘膦抑制莽草酸途徑，該途徑引起包括氨基酸、植物激素以及維生素等芳香族化合物的生物合成。更明確而言，草甘膦抑制5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。就本發(fā)明而言，術(shù)語“草甘膦”應(yīng)被認(rèn)為包括N-膦酰甲基甘氨酸的任何具有除草劑活性的形式(包括其任何一種鹽)以及其它可在植物體內(nèi)產(chǎn)生草甘膦陰離子的形式。
為提供草甘膦耐受性，有多種天然的和變異的EPSPS酶已在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)(Barry等，1992)，其中任何一種都可在本發(fā)明中使用。這些EPSPS的一些實(shí)例包括美國專利號4,940,835、4,971,908、5,145,783、5,188,642、5,310,667和5,312,910所描述的和/或分離的那些EPSPS，在此均引入作為參考。它們也可來自在結(jié)構(gòu)上分屬不同種類的非同種EPSPS基因，如亦在此引入作為參考的美國專利號5,633,435和5,627,061所描述的由土壤桿菌屬菌株CP4分離的Ⅱ類EPSPS基因。作為選擇，也可使用草甘膦降解酶來提供草甘膦耐受性，如使用一種在此引入作為參考的美國專利號5,312,910所描述的草甘膦氧化還原酶基因。
本發(fā)明的雙鏈DNA分子可利用適當(dāng)方法插入植物的基因組內(nèi)。植物轉(zhuǎn)化的適當(dāng)方法包括土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、采用可提高游離DNA攝取量的脂質(zhì)體、電穿孔和化學(xué)制品、通過微射轟擊提供游離DNA、利用病毒或花粉轉(zhuǎn)化，等。
細(xì)胞(或原生質(zhì)體)轉(zhuǎn)化后，用于再生步驟的方法的選擇并不是關(guān)鍵性的，可使用的規(guī)程有適用于豆科(紫苜蓿、大豆、三葉草等)宿主、傘形科(胡蘿卜、芹菜、歐防風(fēng))宿主、十字花科(甘藍(lán)、蘿卜、油菜籽等)宿主、葫蘆科(甜瓜、黃瓜)宿主、禾本科(小麥、稻、玉米等)宿主以及茄科(馬鈴薯、煙草、蕃茄、胡椒)宿主。
這些用于植物轉(zhuǎn)化和再生的方法對該領(lǐng)域的技術(shù)人員而言已眾所周知，并且能夠很容易獲得(例如，綜述可參考Hinchee等，(1994)和Ritchie & Hodges(1993))。
雄性不育及雜交種子的產(chǎn)生本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案涉及一種用草甘膦作為殺配子劑來產(chǎn)生雄性不育植株的改進(jìn)方法。由于缺乏足夠高的對雄性配子的選擇性，使草甘膦在該方面的有效使用以及一般殺配子劑的使用受到了限制，以防止對雌性配子和營養(yǎng)組織產(chǎn)生不必要的傷害。
本發(fā)明拓展了草甘膦耐受性基因的使用，再加上由RNA介導(dǎo)的對基因表達(dá)的組織特異性抑制(如，通過反義、共抑制、核糖酶等)，從而為草甘膦誘導(dǎo)雄性不育提供了一種改進(jìn)方法。本文描述的技術(shù)基本上可應(yīng)用于所有農(nóng)作物物種，其中包括稻、小麥、燕麥、大麥、玉米等單子葉植物，也包括紫苜蓿、蕓苔、胡蘿卜、棉花、油籽油菜、甜菜、向日葵、大豆、番茄、黃瓜以及甜瓜、南瓜等雙子葉植物以及其它。該方法可應(yīng)用于多種觀賞植物，以對其雜交種子的生產(chǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。
使人尤其感興趣的兩種農(nóng)作物是玉米(Zea mays)和小麥(Triticumaesativum)。目前使玉米產(chǎn)生雄性不育的最常用方法是機(jī)械去雄，而對小麥的最常用方法是利用化學(xué)殺配子劑。本文描述的方法是用于這些農(nóng)作物及其它農(nóng)作物的雜交種子生產(chǎn)的一種有效而又經(jīng)濟(jì)的替代方法。
盡管組成型表達(dá)了由第一DNA分子編碼的草甘膦耐受性酶，但為了使雄性生殖組織選擇性地對草甘膦引起的毒性敏感而采用了一種第二DNA分子。第二DNA分子包含一種組織特異型啟動子，該啟動子專門或主要指導(dǎo)雄性生殖組織中促使一種RNA序列產(chǎn)生的DNA序列的表達(dá)。該RNA序列與第一DNA分子產(chǎn)生的RNA互補(bǔ)，并且能夠與其雜交，從而通過反義機(jī)制或共抑制機(jī)制來阻礙第一DNA分子編碼的蛋白的表達(dá)(例如見Schuch,1991；Bird,1991；Jorgensen,1990)。作為選擇，該RNA也可編碼一種經(jīng)設(shè)計(jì)可裂解第一DNA分子產(chǎn)生的mRNA的RNA催化分子(即核糖酶)(例如見Gibson,1997；Steinecke,1994；Marrs,1995)。因此通過對第一DNA分子表達(dá)的組織特異性抑制，可使草甘膦耐受性以一種雄性特異性方式被選擇性減弱。
第二DNA分子可定向于第一DNA分子的草甘膦抗性基因編碼序列。作為選擇，也可將第一DNA分子的其它區(qū)域作為目標(biāo)，如內(nèi)含子序列和/或CTP編碼序列等。
技術(shù)人員都將承認(rèn)，有多種方法可用來獲得含有本發(fā)明第一及第二DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物。DNA分子可按照任何適當(dāng)?shù)姆绞胶?或順序引入植物，如同時引入、單獨(dú)引入、順序引入等。舉例來說，在將第一和第二DNA分子單獨(dú)引入以產(chǎn)生獨(dú)立品系的情況下，可利用傳統(tǒng)育種方法將兩種植物品系雜交，并測定雜交后代中轉(zhuǎn)基因的存在情況。對同時含有兩種轉(zhuǎn)基因的后代則可以進(jìn)行自花授粉，并測定自花授粉后代中兩種轉(zhuǎn)基因的存在情況。測定兩種基因均為純合型的那些種群對雄性不育體和草甘膦營養(yǎng)耐受體施加草甘膦后的反應(yīng)。顯示出有效的草甘膦營養(yǎng)耐受性以及證實(shí)所需雄性不育水平的品系可進(jìn)一步增殖。
作為選擇，也可將包含第一DNA分子和第二DNA分子的表達(dá)盒容納于同一質(zhì)粒中，并將其作為單一DNA片段轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞內(nèi)。用草甘膦處理由這類轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的再生植株，那些顯示出所需草甘膦耐受性水平和所需雄性不育水平的植株利用野生型花粉授粉，并收集種子。使雜交種子發(fā)芽生長，并測定植株中兩種基因的存在情況。陽性植株則進(jìn)行自花授粉并收集種子。種植一部分收集的種子，測定兩種基因的存在情況，并用草甘膦處理。對植株達(dá)到所需草甘膦耐受性及雄性不育水平的情況進(jìn)行評定。種植同胞種子并增殖，以增加種子數(shù)量。
由包含本發(fā)明所述第一和第二DNA分子的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生出的植株對草甘膦具有營養(yǎng)耐受性和雌性耐受性，但雄性對該化合物敏感。在不噴灑草甘膦時，植株正常生長并完全可育。這使品系維持能夠簡單地通過自花授粉來實(shí)現(xiàn)。當(dāng)在本發(fā)明的植株上噴灑草甘膦時可導(dǎo)致完全雄性不育。
用于產(chǎn)生雄性不育植株的公開方法很容易地適用于雜交種子，其中包括已恢復(fù)可育性的雜交種子，的生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的附加實(shí)施方案有關(guān)，提供一種產(chǎn)生雜交種子的方法，該方法包括首先由包含上述第一和第二DNA分子的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生出植株，在無草甘膦的情況下通過栽培及自花授精來增加植株的數(shù)量，再將植株暴露于草甘膦以產(chǎn)生雄性不育植株，用適當(dāng)供體的花粉進(jìn)行異體受精，并收集異體受精后代的種子。在雜交種子的生產(chǎn)過程中，用草甘膦噴灑種子的雙親植株，并使其雄性不育，再利用雄性不育雙親的花粉進(jìn)行授粉。因此，只要不施加草甘膦，由這種方法產(chǎn)生的雜交種子就會產(chǎn)生恢復(fù)雄性可育性的植株。由于上述原因，對含有本發(fā)明所述第一和第二DNA分子的雜交植株施加草甘膦將會導(dǎo)致其雄性不育。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中提供一種產(chǎn)生雜交種子的方法，其中該種子能生成已恢復(fù)雄性可育性并在施加草甘膦時保持可育性的植株。雄性不育植株的產(chǎn)生如上文所述。但在該實(shí)施方案中，雄性可育雙親的花粉基因組中包含一種第三DNA分子，該分子含有一種組成型啟動子和一段DNA結(jié)構(gòu)序列，該序列可產(chǎn)生一種能夠提供草甘膦耐受性的蛋白，其中所述耐受性基本不受第二DNA分子編碼的RNA的影響。因此，該第三DNA分子能夠，例如，在組成型啟動子的調(diào)控下表達(dá)一種草甘膦耐受性基因，其中該基因提供草甘膦耐受性的能力不受第二DNA分子產(chǎn)生的反義RNA的影響。
第三DNA分子的草甘膦耐受性基因可在結(jié)構(gòu)上獨(dú)立(即，與第一DNA分子的草甘膦耐受性基因無顯著同源性)。因此，第二DNA分子產(chǎn)生的反義或共抑制RNA分子能夠與第一DNA分子產(chǎn)生的RNA雜交從而抑制其表達(dá)，但由于缺乏足夠的互補(bǔ)性而不能與第三DNA分子的草甘膦耐受性基因雜交。適用于該實(shí)施方案的非同源草甘膦耐受性基因聯(lián)合體包括，例如，Ⅰ類和Ⅱ類EPSPS(例如見，美國專利號5,633,435)、或在植物內(nèi)表達(dá)時提供草甘膦耐受性但又充分非同源以致第二DNA分子抑制其中一個的表達(dá)但不抑制另外一個的其它任何聯(lián)合體。另外也可在第一或第三DNA分子中使用草甘膦降解酶編碼基因，同時在另一個中使用，例如，EPSPS。
作為選擇，也可在第三DNA分子中使用與第一DNA分子所用相同或相似的草甘膦耐受性基因。但是在這種情況下，第一與第三DNA分子間仍存在一段可被第二DNA分子差異定向的不同區(qū)域。因此，盡管第一與第三DNA分子可使用相同的草甘膦耐受性基因，但它們?nèi)孕?，例如在其非翻譯區(qū)，具有可被選擇性定向的差異。例如可將第三DNA分子設(shè)計(jì)成包含一段區(qū)域，如一段內(nèi)含子序列或CTP序列，該區(qū)域與第一DNA分子中被第二DNA分子定向抑制的區(qū)域截然不同。
防止與野生親本的異型雜交該領(lǐng)域的技術(shù)人員都將理解，本發(fā)明的方法和組合物可用于希望限制其草甘膦耐受性基因散布至相關(guān)野生型物種的植物，以限制其產(chǎn)生可育的花粉。例如，這對鋪草皮用的草類就非常有益，因?yàn)閷@些草類而言，組成型草甘膦營養(yǎng)耐受性是一種符合需要的特性，但又不希望它們與野生型草類物種進(jìn)行異型雜交。在生長有本發(fā)明所述植物的大田施加草甘膦，將提供具有環(huán)境安全性的雜草控制，同時又限制草甘膦耐受性基因與野生型物種進(jìn)行異型雜交的可能性。
本發(fā)明還可應(yīng)用于林業(yè)樹木，如普通樹種、花旗松、桉樹、火炬松、輻射松、美國長葉松、膠皮糖香樹等(Strauss等，1995)。如此產(chǎn)生的樹木將具有草甘膦耐受性，并且在適當(dāng)發(fā)育期施加草甘膦時可變?yōu)榛ǚ鄄挥?，從而限制可育花粉的擴(kuò)散。
本發(fā)明的另一項(xiàng)應(yīng)用涉及使稻與雜草物種“紅米”的異型雜交最小化。由于第二DNA分子的啟動子，優(yōu)選的為絨氈層特異啟動子，可能會在配伍雜草物種中發(fā)揮作用，因而任何有關(guān)草甘膦耐受性脫逃至雜草物種的潛在擔(dān)憂都將明顯減少。由此，任何異型雜交事件所產(chǎn)生的后代都將具有對草甘膦毒性作用敏感的雄性配子或相關(guān)細(xì)胞。
在大田條件下已對Brassica napus(蕓苔)異型雜交為Brassicarapa和Brassica juncea進(jìn)行了證明。對包含本發(fā)明所述第一和第二DNA分子的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物植株經(jīng)異型雜交所產(chǎn)生的雜交草物種施加草甘膦可導(dǎo)致植株雄性不育，并且經(jīng)草甘膦處理后可強(qiáng)烈抑制其存活能力和/或散布草甘膦耐受性性狀的能力。
此外，根據(jù)本發(fā)明所述方法產(chǎn)生的甜菜、甘蔗、馬鈴薯、甘薯等植物營養(yǎng)體部分是初級農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)作物；萵苣、甘藍(lán)、菠菜和茶葉等多葉植物；胡蘿卜、蘿卜、蕪箐、大蒜和洋蔥等根用營養(yǎng)體作物均對草甘膦的毒性效應(yīng)具有營養(yǎng)抗性。因此，草甘膦可用于控制這些農(nóng)作物中的雜草，并且一旦噴灑草甘膦，這些植物即變?yōu)樾坌圆挥?br> 防止種子由自生植物產(chǎn)生自生作物是指在曾出產(chǎn)前一季農(nóng)作物的大田內(nèi)或大田周圍出現(xiàn)的植物。在某些情況下，自生作物可逸入該環(huán)境并成為雜草。在這些農(nóng)作物含有草甘膦耐受性基因的情況下，草甘膦耐受性基因擴(kuò)散至該環(huán)境的潛在可能性就很值得擔(dān)憂。但如果有一種可有效限制該可能性的方法，那么就會使這些擔(dān)心減至最小。
本文所述的發(fā)明可防止或強(qiáng)烈抑制經(jīng)草甘膦噴灑的自生作物中產(chǎn)生種子，從而防止草甘膦耐受性雜草植株的繁殖。蕓苔(Brassicanapus)已引起特別關(guān)注，因?yàn)槠錃W洲的冬季油籽油菜變種已成為其常種植地區(qū)內(nèi)及周圍的雜草。Brassica napus種子可保持在土壤剖面內(nèi)，并在隨后的作物輪作中長成自生植物。在蕓苔的雜交生產(chǎn)中使用本發(fā)明的方法將使對環(huán)境的關(guān)注減少，因?yàn)閲姙⒉莞熟⒖墒怪仓晷坌圆挥?br> 以下實(shí)施例用來對本發(fā)明某些優(yōu)選實(shí)施方案的實(shí)例加以演示。該領(lǐng)域的技術(shù)人員都應(yīng)理解，以下實(shí)施例中公開的技術(shù)均是發(fā)明人在本發(fā)明實(shí)施過程中發(fā)現(xiàn)可良好運(yùn)作的方法，因此可被認(rèn)為構(gòu)成其優(yōu)選實(shí)施方式的實(shí)例。但是從本公開內(nèi)容的觀點(diǎn)考慮，該領(lǐng)域的技術(shù)人員都應(yīng)理解，在公開的特定實(shí)施方案中可出現(xiàn)多種不脫離本發(fā)明范圍的變化，并且這些變化仍可得到相同或相似的結(jié)果。
實(shí)施例實(shí)施例1利用玉米原生質(zhì)體及小麥原生質(zhì)體中不同的反義基因片段抑制CP4的表達(dá)A．質(zhì)粒pMON19340、pMON25232、pMON25233、pMON25234、pMON25235及pMON25241的制備美國專利號5,424,412中描述的pMON19470質(zhì)粒以pUC119(Yanisch-Perron等，1985)為主鏈，并含有0.65kb的花椰菜花葉病毒(CaMV)35SRNA啟動子(e35S)，該啟動子包括-90--300區(qū)域的一個重復(fù)(Kay等，1987)、玉米HSP70基因的第一內(nèi)含子(美國專利號5,424,412)、一個多克隆位點(diǎn)，和一個含有胭脂堿合酶(NOS)基因3’多腺苷酸序列的0.25kb片段(Fraley等，1983)。pMON19340、pMON25232、pMON25233、pMON25234、pMON25235和pMON25241均來源于pMON19470表達(dá)盒元件。
圖6．pMON19653 e35S/hsp70內(nèi)含子/CTP2/CP4 EPSPS/NOS3’圖6．pMON19340 e35S/PetEPSP內(nèi)含子/PetEPSPS CTP/CP4/NOS3’圖7．pMON25232 e35S/hsp70內(nèi)含子/抗PetEPSPS內(nèi)含子-PEPSPCTP/NOS3’圖8．pMON25233 e35S/hsp70內(nèi)含子/抗PetEPSPS內(nèi)含子/NOS3’圖9．pMON25234 e35S/hsp70內(nèi)含子/抗PetEPSPS CTP/NOS3’圖9．pMON25235 e35S/hsp70內(nèi)含子/抗-CP4 EPSPS/NOS3’圖10．pMON25241 e35S/hsp70內(nèi)含子/抗GUS/NOS3’B．玉米原生質(zhì)體中的基因表達(dá)分析植物原生質(zhì)體中的基因表達(dá)分析已有充分的論述(Sehledzewski等，1994；Steinbiss等，1991；Stefanov等，1991)。原生質(zhì)體表達(dá)分析常作為預(yù)測某些基因是否能在植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的一種有效方法。評估不同反義基因片段對CP4 EPSPS表達(dá)的影響采用的是玉米原生質(zhì)體瞬時表達(dá)系統(tǒng)。玉米葉片原生質(zhì)體的分離和電穿孔則按照Sheen,1991的描述進(jìn)行。質(zhì)粒DNAs的制備采用標(biāo)準(zhǔn)堿裂解然后氯化銫梯度純化的方法(Maniatis等，1982)。利用電穿孔將5μg pMON19340DNA與40μg四種反義質(zhì)粒DNAs(pMON25232、pMON25233、pMON25234，和pMON25235)中的一種以及GUS(β-gluc)反義調(diào)控質(zhì)粒(pMON25241)一同引入玉米原生質(zhì)體。pMON25241 DNA質(zhì)粒作為填充物，以使總質(zhì)粒量與只含CP4 EPSPS DNA的對照電穿孔和5μg LUX質(zhì)粒DNA(pMON19437)的對照電穿孔所使用的總質(zhì)粒量相同。將電穿孔后的細(xì)胞培養(yǎng)24小時，然后離心收集。利用三個冷凍/解凍循環(huán)獲取原生質(zhì)體總蛋白，再離心去除細(xì)胞碎片。利用Bio-Rad蛋白分析(Bio-RadLaboratories，目錄號500-0006)測定總蛋白濃度。
利用ELISA對CP4 EPSPS的表達(dá)進(jìn)行定量。將含有1mg總蛋白的原生質(zhì)體粗提取物加入經(jīng)山羊抗-CP4 EPSPS IgG包被的96-孔板的孔中進(jìn)行反應(yīng)。將板沖洗后加入第二抗體兔抗-CP4 EPSPS IgG，并將板保溫過夜。沖洗板，再將結(jié)合堿性磷酸酶的驢抗兔IgG加入每個孔中，用堿性磷酸酶底物對CP4 EPSPS的存在情況進(jìn)行顯像。樣品中CP4 EPSPS濃度的定量是由每個板的CP4 EPSPS標(biāo)準(zhǔn)曲線得出對數(shù)擬合曲線并外推而實(shí)現(xiàn)。熒光素酶分析則按照美國專利號5,424,412中的描述進(jìn)行。
各反義片段的效果用CP4 EPSPS表達(dá)與熒光素酶內(nèi)部對照表達(dá)水平的比率(CP4 EPSPS/LUX)表示。如圖14及表1所示，各反義型式均使CP4 EPSPS的表達(dá)降低。有趣的是，抗內(nèi)含子構(gòu)建體pMON25232似乎不但能降低CP4 EPSPS，也能降低按反義方向包含CP4 EPSPS完整編碼序列的構(gòu)建體的水平。
表1．玉米原生質(zhì)體中CP4 EPSPS反義片段CP4 EPSPS表達(dá)的影響
C．小麥原生質(zhì)體中的基因表達(dá)分析利用對照及反義構(gòu)建體對Bobwhite wheat原生質(zhì)體進(jìn)行電穿孔。原生質(zhì)體是利用(Zhou等，1993)和(He等，1994)的改進(jìn)規(guī)程由懸浮培養(yǎng)物制得。簡單地說，即利用40ml酶溶液將8g小麥細(xì)胞培養(yǎng)物懸浮，并置40rpm旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)子上于26℃培養(yǎng)2小時。溶液于200g下離心8分鐘。將原生質(zhì)體沖洗兩次，其間離心分離。用10ml清洗液懸浮并置于冰上。測定原生質(zhì)體的數(shù)量并調(diào)整體積使?jié)舛葹?×106原生質(zhì)體/ml。將原生質(zhì)體(0.75ml)加入各電穿孔池，然后在原生質(zhì)體中加入50μl包含50μg質(zhì)粒DNA的溶液。利用Bio-Rad Gene Pulser進(jìn)行電穿孔，其條件為960微法拉和160伏。樣品置冰上保持10分鐘，然后吸至MS1 WSM培養(yǎng)基內(nèi)并置暗處于24℃培養(yǎng)18-22小時。200-250g下離心8分鐘使細(xì)胞沉淀。將沉淀置干冰上冷凍。
利用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)方法對玉米葉片、種子和全植物組織內(nèi)的CP4烯醇丙酮基-莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)進(jìn)行定量。該規(guī)程所描述的測定是一種可對玉米植物組織提取物中CP4 EPSPS蛋白質(zhì)的存在水平進(jìn)行定量的直接ELISA。將玉米組織置于Brinkmannpolytron機(jī)械勻漿器中以17,500rpm勻漿30秒，使其按20∶1的體積/重量提取至緩沖液中。6,660g下單次離心8分鐘將可溶提取物中的不溶碎片分離。將植物樣品中的CP4 EPSPS含量與分離自大腸桿菌的純化CP4 EPSPS參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比。簡單地說，即利用純化的山羊抗-CP4包被96孔聚苯乙烯板(2μg/孔)，然后于30℃下用脫脂奶粉(以1％濃度溶于1×PBST緩沖液，磷酸緩沖鹽溶液pH7.4,0.05％吐溫-20)阻斷30分鐘，再用1×PBST清洗3次。在經(jīng)抗體包被的孔中每孔加入250μl可溶植物組織提取物(如需要可用1×PBST稀釋提取物)，旁邊則為一定濃度范圍的純CP4 EPSPS標(biāo)準(zhǔn)蛋白。將板保溫使抗原被表面結(jié)合的抗體捕獲。用緩沖液洗掉未結(jié)合的樣品，并加入與辣根過氧化物酶結(jié)合的兔抗-CP4 EPSPS(1∶170溶于1×PBST)，使之與CP4 EPSPS抗原結(jié)合。保溫并清洗，然后在各孔內(nèi)加入過氧化物酶底物。由于孔內(nèi)含有CP4 EPSPS，因此夾層狀抗體(山羊抗CP4 EPSPS+植物CP4 EPSPS+兔抗CP4 EPSPS辣根過氧化物酶)將變?yōu)樗{(lán)色。過氧化物酶TMB底物和過氧化氫緩沖液(目錄號50-76-02,Kirkegaard& Perry Labs)反應(yīng)產(chǎn)生可溶性藍(lán)色產(chǎn)物，并且用3M磷酸終止反應(yīng)時產(chǎn)物將變?yōu)辄S色。樣品中CP4 EPSPS濃度的定量是由(0.1ng-2.0ngCP4/孔)或(0.4ng-8.0ng CP4/毫升)范圍內(nèi)的CP4 EPSPS標(biāo)準(zhǔn)曲線得出log-log二次回歸擬合曲線并外推(以ELISA板讀數(shù)儀在450nm下所得樣品吸光度值為根據(jù)，參比波長為655nm)而實(shí)現(xiàn)。
表2及圖5所示結(jié)果表明，通過使用與植物表達(dá)載體pMON25235、pMON25232、pMON25233和pMON25234所表達(dá)的遺傳因子的反義，可以在小麥原生質(zhì)體中抑制pMON19340的草甘膦耐受性基因的表達(dá)。植物表達(dá)載體pMON19340以組成型方式轉(zhuǎn)錄出一種RNA分子，該RNA分子含有一段5’前導(dǎo)序列、一段內(nèi)含子、一段包含CTP和草甘膦耐受性基因RNA編碼序列的外顯子序列，以及一段3’非翻譯區(qū)。在小麥原生質(zhì)體測定中，與內(nèi)含子/外顯子序列反義的序列對CP4 EPSPS蛋白表達(dá)的抑制產(chǎn)生了意想不到的協(xié)同作用。
表2．反義構(gòu)建體對小麥原生質(zhì)體中CP4 EPSPS表達(dá)的影響 實(shí)施例2含有花藥特異啟動子構(gòu)建體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化玉米植株的產(chǎn)生A. pMON25258、pMON25259和pMON25260的制備玉米基因組克隆由S.Goff,USDA,Albany,CA提供，該克隆含有玉米花藥特異性基因(SGB6)的編碼序列和該基因2,719個核苷酸堿基對(pSGB6)的5’上游啟動子區(qū)域。根據(jù)廠商說明(New EnglandBioLabs)用限制性核酸內(nèi)切酶NheⅠ消化包含SGB6啟動子區(qū)域(pSGB6)的DNA，按照Maniatis等1982所述方法利用互補(bǔ)核苷酸由Klenow聚合酶(New England BioLabs)將NheⅠ3’突出端補(bǔ)平。將包含pSGB6啟動子區(qū)域的DNA片段用HindⅢ進(jìn)一步消化，以產(chǎn)生2,656個堿基對的SGB6上游啟動子區(qū)域片段。該2,656個核苷酸堿基對的SGB6啟動子片段稱為P-Ztap，表示玉米絨氈層啟動子。然后將P-Ztap啟動子插入已用核酸內(nèi)切酶BglⅡ消化、用互補(bǔ)核苷酸由Klenow聚合酶補(bǔ)平DNA突出端、然后用核酸內(nèi)切酶HindⅢ進(jìn)一步消化的pMON19648中。按照Maniatis等1982所述方法利用T4 DNA連接酶(New England BioLabs)將P-Ztap啟動子片段與消化的pMON19648載體片段連接。將該質(zhì)粒的E35S啟動子區(qū)域用P-Ztap啟動子替代則得到pMON25258(P-Ztap/HSP70內(nèi)含子/GUS/NOS 3’)(圖11)。GUS基因和GUS1指β-葡糖苷酸酶(β-gluc)，一種常用于轉(zhuǎn)基因植物以確定組織特異性表達(dá)的可計(jì)數(shù)標(biāo)記(Jefferson等1987)。與此類似，將P-Ztap啟動子插入已用BglⅡ消化、用互補(bǔ)核苷酸由Klenow聚合酶補(bǔ)平突出端、然后將質(zhì)粒用HindⅢ消化的pMON25235中。P-Ztap啟動子替代E35S啟動子區(qū)域則得到pMON25259(P-Ztap/HSP70內(nèi)含子/抗CP4 EPSPS/NOS 3’)(圖12)。由pMON25259的KpnⅠ/PvuⅡDNA片段分離出5.4Kb的表達(dá)盒。然后用T4 DNA連接酶將該DNA片段連接于已預(yù)先用HindⅢ消化、用互補(bǔ)核苷酸由Klenow聚合酶補(bǔ)平末端、然后將質(zhì)粒用KpnⅠ消化的pMON25258中。所得質(zhì)粒為包含P-Ztap/HSP70內(nèi)含子/GUS/NOS 3’::P-Ztap/HSP70內(nèi)含子/抗CP4EPSPS/NOS 3’的pMON25260(圖13)。
B．轉(zhuǎn)化玉米植株的產(chǎn)生與鑒定按Brown等(美國專利號5,424,412)所述利用生物基因槍轟擊胚胎性玉米組織培養(yǎng)細(xì)胞而將pMON25260 DNA與pMON19653 DNA(E35S/Zmhsp70內(nèi)含子/PetCTP2/CP4 EPSPS/NOS 3’)共轉(zhuǎn)化入Hi-Ⅱ玉米植株內(nèi)。選擇具有草甘膦耐受性的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并在溫室條件下再生出完整植株并使其生長。
利用快速聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)篩選方法檢測含有CP4 EPSPS反義基因的轉(zhuǎn)基因植株。在1.5毫升(mL)微離心管中收集20毫克(mg)幼齡玉米苗的葉片組織，在干冰上冷凍，然后用木制敷藥棒研磨成粉。管中加入500微升(μl)提取緩沖液(100mM Tris緩沖液，pH8.0；50mM EDTA；500mM NaCl；10mM 2-巰基乙醇)并在水浴中煮10分鐘。用桌面微離心機(jī)將提取物離心(12,000rpm,10分鐘)并將上清液轉(zhuǎn)至新管，然后加入50μl 10M醋酸銨和1ml 95％乙醇。室溫放置5分鐘，再將管于室溫12,000rpm下離心10分鐘以沉淀DNA。加入25μl TE緩沖液(10mM Tris緩沖液，pH8.0；1mM EDTA)使DNA沉淀重懸。在DNA溶液中加入0.5μl 10mg/ml的RNAse A并將管于37℃保溫5分鐘以破壞RNA污染物。利用PCR Core試劑盒(Boehringer Mannheim,目錄號1578553)并根據(jù)該試劑盒中所述方法對1μl提取物實(shí)施PCR反應(yīng)。在PCR中用于檢測CP4 EPSPS反義表達(dá)盒的DNA引物為位于P-Ztap啟動子內(nèi)的序列標(biāo)號5(5’-GAACAAGTTCATGAGCAAGGACCCTG-3’)和位于CP4 EPSPS反義基因內(nèi)的序列標(biāo)號6(5’-CAAGCTCAATGGCGTGGATTGCG-3’)。反應(yīng)采用Perkin Elmer熱循環(huán)控制儀并符合以下條件1個循環(huán)94℃,3分鐘；64℃,1分鐘；72℃,3分鐘40個循環(huán)94℃,1分鐘；64℃,30秒；72℃,3分鐘若按照Maniatis等(1982)方法在瓊脂糖凝膠中檢測出玉米品系內(nèi)確實(shí)存在～1.3千堿基(kb)的DNA片段，則對其CP4 EPSPS表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因情況進(jìn)行檢測。在單獨(dú)進(jìn)行的反應(yīng)中使用特定引物來檢測pMON25260的GUS(β-gluc)表達(dá)盒區(qū)域。檢測GUS表達(dá)盒的引物為位于P-Ztap啟動子序列內(nèi)的序列標(biāo)號5(5’-GAACAAGTTCATGAGCAAGGACCCTG-3’)和位于β-gluc編碼區(qū)中部的序列標(biāo)號7(5’-GTAGAGCATTACGCTGCGATGG-3’)。利用瓊脂糖凝膠電泳在接收pMON25260的該區(qū)域的玉米品系中檢測出～1.5kb的DNA片段。經(jīng)檢測有17株玉米品系呈反義CP4 EPSPS基因PCR陽性(表3)。
實(shí)施例3pZtap啟動子的表達(dá)評定對pZtap啟動子表達(dá)模式的評估采用GUS活性組化定位。該方法基本上按照Van der Krol等(1991)的描述進(jìn)行。在染色前用刀片將花藥、子房和其它植物組織切為兩半，使X-gluc底物能夠穿透組織。為排除可能由細(xì)胞大小差異、底物對組織的穿透以及背景活性所造成的假象，對轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株的花藥均進(jìn)行了若干次獨(dú)立的組化測定。
經(jīng)組化染色在43個轉(zhuǎn)基因Hi-Ⅱ品系中發(fā)現(xiàn)有16個品系在花藥中具有高水平的GUS活性。在GUS陽性品系中有5個品系僅在花藥中顯示出GUS特異染色。有7個品系除花藥染色外還在穎殼、鞘皮、內(nèi)稃及花粉粒等其它雄花穗組織中顯示出GUS雄性特異性染色。有4個品系顯示出在子房和葉片中的表達(dá)，但其染色明顯弱于雄花穗組織。
利用RT-PCR測定法檢測Hi-Ⅱ品系中由pMON25260產(chǎn)生的抗-CP4EPSPS RNA。按上文所述從雄花穗組織中提取總RNA。根據(jù)廠商說明利用Stratagene RT-PCR試劑盒(編號#200420)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)以產(chǎn)生第一鏈cDNA。在各20μl的反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)中使用1μg的總RNA和2.5pmol如序列標(biāo)號8(CP425’-CGA GGA CGT CAT CAA TAC GGG CAAGGC-3’)的引物。然后用PCR Core試劑盒(Boehringer Mannheim，目錄號1578553)對1μl的cDNA樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，在100μl的反應(yīng)體積中使用序列標(biāo)號8和序列標(biāo)號9(5’-CAC GTC GAT GAC TTG GCC GGTGAG C-3’)各300nM作為引物，并采用如下熱循環(huán)條件1個循環(huán)94℃,3分鐘；64℃,1分鐘；72℃,3分鐘；30個循環(huán)94℃,1分鐘；64℃,30秒；72℃,3分鐘利用該技術(shù)，在30個評估的轉(zhuǎn)基因Hi-Ⅱ品系中發(fā)現(xiàn)有17個品系在雄花穗組織中顯示出可檢測的反義CP4 EPSPS表達(dá)。
實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因玉米植株的草甘膦耐受性RO植株利用基因槍轟擊法創(chuàng)建含有pMON25260的轉(zhuǎn)基因Hi-Ⅱ玉米植株，用草甘膦對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行篩選，并按照描述再生出植株。利用上述的PCR測定法證實(shí)轉(zhuǎn)基因植株中含有CP4基因。RO愈傷組織各獨(dú)立再生出約5個植株，轉(zhuǎn)至土壤營養(yǎng)缽中并溫室保存。在第五個葉片出現(xiàn)時每種品系取3個植株用最多32盎司/英畝(2.23kg/ha)的Roundup_進(jìn)行噴灑。剩余兩個植株作為未噴灑對照。
如表3所示，圖中采用相對于同品系未噴灑RO植株的0-100的營養(yǎng)比數(shù)(生長減緩百分率)。比數(shù)100表示植株由于噴灑Roundup而被殺死，0則表示噴灑與未噴灑植株間沒有可見差異。葉片畸形百分率也被用作草甘膦營養(yǎng)耐受性的度量方法。開花和雄性不育的評估則采用0-5的評分體系。0分表示無雄花穗出現(xiàn)，1分表示植株有不能開花的雄花穗，5分表示植株完全可育。未噴灑植株亦在相同評分體系下評定。
利用RT-PCR篩選在雄花穗中表達(dá)反義CP4基因的品系。以32盎司/英畝(2.23kg/ha；品系1的噴灑為8盎司/英畝(0.56kg/ha))的比率噴灑草甘膦后，有8個轉(zhuǎn)基因品系顯示出具有極佳的營養(yǎng)耐受性(生長減緩百分率評分低)和高水平的雄性不育性(開花-雄性不育評分為1)。將噴灑植株與未噴灑植株的開花-雄性不育評分進(jìn)行比較，選出7個品系用于進(jìn)一步的特征鑒定。它們是品系1、2、3、6、11、13和14。表3．RO系玉米的草甘膦植物抗性的溫室評定及噴灑后的繁殖力評定pMON 19653/pMON252605-6葉期時用3202/ac(2.23kg/ha)噴霧的Ro
選定品系的噴灑與未噴灑植株均用非轉(zhuǎn)基因玉米品系(B73)的花粉雜交，以產(chǎn)生F1種子。由噴灑而導(dǎo)致不育的植株所產(chǎn)生的穗在數(shù)量和種子形狀上與未噴灑植株所產(chǎn)生的穗相似，表明植株在所用的草甘膦噴灑條件下完全為雌性可育。
F1后代分析將三個草甘膦誘導(dǎo)的雄性不育品系的F1后代置小土壤營養(yǎng)缽中生長，并按上文所述通過幼苗葉片的PCR確定繼承了轉(zhuǎn)基因的品系。在5葉期時用32盎司/英畝(2.23kg/ha)的Roundup_噴灑PCR陽性F1植株，以此來評估對草甘膦的營養(yǎng)耐受性和生殖耐受性。營養(yǎng)耐受性和生殖耐受性的評分如上文所述。結(jié)果顯示于表4。
表4．草甘膦誘導(dǎo)的雄性不育系玉米品系的R1后代溫室評定F1數(shù)據(jù)，在5-6葉期用32盎司/英畝(2.23kg/ha)噴霧(用8盎司/英畝(0.56kg/ha))噴霧一個品系，RTPCT陽性F1后代
三種品系均顯示出極佳的營養(yǎng)耐受性評分(0-10的生長減緩)。所有三種品系的可育性評分均為1(完全不育)。據(jù)觀察，噴灑的植株產(chǎn)生緊密合攏的花藥，而相比之下，未噴灑對照的花藥開放且開裂出大量花粉。解剖已噴灑植株的花藥并在解剖鏡下觀察花粉粒。雄性不育花藥所產(chǎn)生的花粉粒明顯少于可育對照，并且出現(xiàn)的花粉粒均呈皺縮和異常狀態(tài)。
用非轉(zhuǎn)基因B73玉米花粉對這些品系及其它品系進(jìn)行授粉，以產(chǎn)生用于田間試驗(yàn)評定的種子。
田間條件下的品系評定利用與CP4 EPSPS草甘膦耐受性基因反義的RNA的P-Ztap調(diào)控表達(dá)來誘導(dǎo)具有草甘膦營養(yǎng)耐受性和雄性不育性的轉(zhuǎn)基因玉米品系，并對此進(jìn)行溫室篩選，選定品系經(jīng)草甘膦處理后的田間試驗(yàn)結(jié)果顯示于表5。田間試驗(yàn)植株的篩選是以此前的營養(yǎng)耐受性、草甘膦誘導(dǎo)的雄性不育性、基因表達(dá)以及可用種子供應(yīng)的評分為根據(jù)。田間測試植株系的譜系為〔(Ro×B73)×B73〕或(B73×Ro)。依據(jù)這些譜系，預(yù)計(jì)一個地塊上將有一半的植株由于不包含轉(zhuǎn)基因而在施加草甘膦(Roundup_)后被殺死。
場地設(shè)為兩個區(qū)；每個區(qū)包括四組預(yù)定接受獨(dú)立噴灑處理的地塊。其處理為1)不噴灑，2)于12葉期噴灑32盎司/英畝(2.23kg/ha)的Roundup_,3)于4-5葉期噴灑32盎司/英畝(2.23kg/ha)的Roundup,4)于6-8葉期噴灑32盎司/英畝(2.23kg/ha)的Roundup_。對照包括兩種此前顯示出對Roundup_的極佳營養(yǎng)耐受性但極小生殖耐受性的品系(pMON19653，只含CP4 EPSPS)。
當(dāng)植物已開始開花時評定其雄性不育性，并每1-2天重復(fù)評定一次，持續(xù)約8天。觀測的數(shù)據(jù)包括一個地塊上植株最先及最后形成花藥的日期，以及這些花藥中花粉的可育性(利用手持顯微鏡判斷)。
對產(chǎn)生雄性不育性而言，在6-8葉期噴灑Roundup_最為有效。有四個品系在噴灑后存活并產(chǎn)生雄花穗。但當(dāng)各自的未噴灑地塊上的所有植株均已開始開花時，這四個于6-8葉期噴灑的植株品系中仍未出現(xiàn)可見的花藥。據(jù)觀察，在對照地塊已完成脫落后約10天，才發(fā)現(xiàn)初期未產(chǎn)生花藥的植株上伸出一些花藥。但除一例之外，其余所有情況下的花藥數(shù)與正常情況相比均明顯減小(例如，有一個品系每個植株具有5個或更少的花藥)，而且這些晚期出現(xiàn)且定位異常的花藥被認(rèn)為不合有可育的花粉。將Roundup_處理后顯示出雄性不育性的植株用B73花粉授粉。如前所述，已處理植株上ears borne的種子形狀十分正常，表明其完全具有雌性可育性。
表5．在6-8葉期以32盎司/英畝(2.23kg/ha)的比例噴灑草甘膦(Roundup_)的轉(zhuǎn)基因玉米植株的可育性田間評定
1相同品系未噴灑植株的花粉正在脫落時噴灑植株上的花藥外露百分率2未噴灑植株的花粉脫落后10天時噴灑植株的可育性評定。評分體系0為完全不育，無花藥形成，1為有一些花藥形成，2為有一些花藥形成并有一些花粉脫落，3為形成花藥并有一些花粉脫落，4為形成花藥并有花粉脫落但少于完全可育植株，5為完全可育。所有未噴灑植株的可育性評分均為5。
實(shí)施例5F1植株中的CP4表達(dá)利用CP4 ELISA測定法(收集20mg葉片和花藥組織并快速冷凍于液氮中)對非轉(zhuǎn)基因B73花粉與雄性不育Hi-Ⅱ Ro植株雜交的F1后代進(jìn)行評估，以確定葉片和花藥組織中的CP4 EPSPS表達(dá)。提取總蛋白并利用Bio-Rad蛋白測定(Bio-Rad Laboratories，目錄號500-0006)進(jìn)行定量。利用大腸桿菌表達(dá)的CP4 EPSPS的標(biāo)準(zhǔn)曲線對葉片和花藥組織提取物中的CP4 EPSPS蛋白進(jìn)行定量。分別將野生型植株的葉片和花藥蛋白提取物加到葉片和花藥CP4 EPSPS測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線中。在所有測試植株中，葉片組織內(nèi)的CP4 EPSPS水平均大大高于花藥組織內(nèi)的水平。測定玉米品系號1、3和6中CP4 EPSPS蛋白表達(dá)的葉片/花藥比率，其單位為ng CP4 EPSPS/μg可溶蛋白。CP4 EPSPS表達(dá)的抑制范圍為1.76×-14.87×，花藥組織相對于葉片組織的平均CP4 EPSPS抑制為7.34×。
實(shí)施例6利用可選的反義構(gòu)建體產(chǎn)生Roundup_Ready F1植株植株的產(chǎn)生采用的是諸如實(shí)施例1所述的構(gòu)建體(如pMON25235、pMON23232、pMON23233)，這些構(gòu)建體用花藥或花粉特異性啟動子以及可提供草甘膦營養(yǎng)耐受性和雌性耐受性的組成型啟動子替代了原組成型啟動子。選擇顯示出良好營養(yǎng)耐受性和雌性耐受性但具有草甘膦雄性生殖敏感性的轉(zhuǎn)基因品系。將該性狀與近交系回交，近交系在雜交中作為母本。
具有完全草甘膦耐受性(Roundup Ready_)的玉米品系作為父本。這些品系包含諸如植物EPSPS基因等非同源草甘膦耐受性基因，或包含不同的葉綠體定向肽和/或內(nèi)含子序列。因此，用于產(chǎn)生雄性不育性雌性植株的反義構(gòu)建體對從父本引入的草甘膦耐受性基因無效，并且由所得F1種子產(chǎn)生的植株當(dāng)噴灑草甘膦時完全可育。
實(shí)施例7花期延長提高花期的長度對園藝行業(yè)而言是一個重要的領(lǐng)域。矮牽?；ㄎ锓N的受精通常為自交不親和性。這使我們能夠?qū)Π珷颗；ㄎ锓N的花期進(jìn)行溫室觀測。對矮牽?；ㄗ凅wV26和Mitchell的觀測結(jié)果顯示，開放后未授粉的花可在植株上保持4-6天，平均為5天。開花時進(jìn)行手工雜交授粉的花的花期范圍為1.5-3天，平均2.25天。
所有在此公開并要求專利保護(hù)的組合物和方法均能夠在沒有進(jìn)行過度實(shí)驗(yàn)的情況下按照本公開內(nèi)容進(jìn)行制造和實(shí)施。盡管本發(fā)明的組合物和方法是利用優(yōu)選實(shí)施方案來加以描述，但該領(lǐng)域的技術(shù)人員均明白，在不脫離本發(fā)明的思想和范圍的情況下存在適用于文中所述DNA分子和方法步驟或步驟順序的變化。更明確而言，顯然可利用在化學(xué)和生理學(xué)上均相關(guān)的一些制劑來替代文中所述制劑，同時又獲得相同或相似的結(jié)果。對該領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然所有這些類似的替代和修改均應(yīng)被認(rèn)為處于附加權(quán)利要求所規(guī)定的本發(fā)明的思想和范圍之內(nèi)。
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1．一種產(chǎn)生雄性不育植株的方法，該方法的步驟包括在植物細(xì)胞基因組中插入一種第一DNA分子，該分子包含經(jīng)操作按5’-3’方向連接的一種能夠在植物細(xì)胞中促使第一RNA序列產(chǎn)生的第一啟動子；一種編碼第一RNA序列的第一DNA序列，該RNA序列編碼一種可導(dǎo)致草甘膦耐受性的蛋白；一種能夠在植物細(xì)胞中促使第一RNA序列3’端多腺苷酸化的第一3’非翻譯區(qū)；以及一種第二DNA分子，該分子包含經(jīng)操作按5’-3’方向連接的一種能夠在植物細(xì)胞中促使雄性生殖組織產(chǎn)生第二RNA序列的第二啟動子；一種編碼與第一RNA序列互補(bǔ)的第二RNA序列的第二DNA序列；一種能夠在植物細(xì)胞中促使第二RNA序列3’端多腺苷酸化的第二3’非翻譯區(qū)；獲得含有第一和第二DNA分子的植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞；由植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)化植株；以及將轉(zhuǎn)化植株暴露于草甘膦。
2．權(quán)利要求1的方法，其中第一啟動子選自花椰菜花葉病毒19S啟動子、花椰菜花葉病毒35S啟動子、玄參花葉病毒35S啟動子、甘蔗桿狀病毒啟動子、鴨跖草黃色斑點(diǎn)病毒啟動子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亞基啟動子、稻胞質(zhì)性丙糖磷酸異構(gòu)酶啟動子、腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶啟動子、稻肌動蛋白1啟動子、甘露堿合酶啟動子，以及章魚堿合酶啟動子。
3．權(quán)利要求1的方法，其中第一DNA序列編碼一種天然EPSPS酶、突變EPSPS酶，或一種草甘膦降解酶。
4．權(quán)利要求1的方法，其中第二啟動子選自TA29煙草絨氈層特異啟動子、PA1苯基苯乙烯酮二氫黃酮異構(gòu)酶啟動子、PA2苯基苯乙烯酮二氫黃酮異構(gòu)酶啟動子、SLG啟動子、LAT啟動子、聚半乳糖醛酸外切酶啟動子、Zmc13啟動子、LAT52啟動子、LAT59啟動子，以及psgB6-1啟動子。
5．權(quán)利要求1的方法，其中第二RNA序列與第一RNA序列的蛋白編碼區(qū)互補(bǔ)。
6．權(quán)利要求1的方法，其中第二RNA序列與第一RNA序列的非翻譯區(qū)互補(bǔ)。
7．權(quán)利要求1的方法，其中所述植物選自玉米、小麥、稻、蕓苔、燕麥、大麥、紫苜蓿、胡蘿卜、棉花、油籽油菜、甜菜、向日葵、大豆、番茄、黃瓜，以及南瓜。
8．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括用一種雄性可育供體的花粉使雄性不育植株雜交可育化。
9．權(quán)利要求8的方法，進(jìn)一步包括收集雜交可育后代的種子。
10．一種由權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的雄性不育植株。
11．一種植物細(xì)胞，該細(xì)胞的基因組包含一種第一DNA分子，該分子包含經(jīng)操作按5’-3’方向連接的一種能夠在植物細(xì)胞中促使第一RNA序列產(chǎn)生的第一啟動子；一種編碼第一RNA序列的第一DNA序列，該RNA序列編碼一種可導(dǎo)致草甘膦耐受性的蛋白；一種能夠在植物細(xì)胞中促使第一RNA序列3’端多腺苷酸化的第一3’非翻譯區(qū)；以及一種第二DNA分子，該分子包含經(jīng)操作按5’-3’方向連接的一種能夠在植物細(xì)胞中促使雄性生殖組織產(chǎn)生第二RNA序列的第二啟動子；一種編碼與第一RNA序列互補(bǔ)的第二RNA序列的第二DNA序列；一種能夠在植物細(xì)胞中促使第二RNA序列3’端多腺苷酸化的第二3’非翻譯區(qū)。
12．權(quán)利要求11的植物細(xì)胞，其中第一啟動子選自花椰菜花葉病毒19S啟動子、花椰菜花葉病毒35S啟動子、花葉病毒35S啟動子、甘蔗桿狀病毒啟動子、鴨跖草黃色斑點(diǎn)病毒啟動子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亞基啟動子、稻胞質(zhì)性丙糖磷酸異構(gòu)酶啟動子、腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶啟動子、稻肌動蛋白1啟動子、甘露堿合酶啟動子，以及章魚堿合酶啟動子。
13．權(quán)利要求11的植物細(xì)胞，其中第一DNA序列編碼一種天然EPSPS酶、突變EPSPS酶，或一種草甘膦降解酶。
14．權(quán)利要求11的植物細(xì)胞，其中第二啟動子選自TA29煙草絨氈層特異啟動子、PA1苯基苯乙烯酮二氫黃酮異構(gòu)酶啟動子、PA2苯基苯乙烯酮二氫黃酮異構(gòu)酶啟動子、SLG啟動子、LAT啟動子、聚半乳糖醛酸外切酶啟動子、Zmc13啟動子、LAT52啟動子、LAT59啟動子，以及psgB6-1啟動子。
15．權(quán)利要求11的植物細(xì)胞，其中第二RNA序列與第一RNA序列的蛋白編碼區(qū)互補(bǔ)。
16．權(quán)利要求11的植物細(xì)胞，其中第二RNA序列與第一RNA序列的非翻譯區(qū)互補(bǔ)。
17．權(quán)利要求11的植物細(xì)胞，其中所述植物選自玉米、小麥、稻、蕓苔、燕麥、大麥、紫苜蓿、胡蘿卜、棉花、油籽油菜、甜菜、向日葵、大豆、番茄、黃瓜，以及南瓜。
18．一種植株，該植株包含權(quán)利要求11的植物細(xì)胞。
19．包含權(quán)利要求11的植物細(xì)胞的種子。
20．一種產(chǎn)生雜交種子的方法，該方法的步驟包括產(chǎn)生雄性不育植株，其方法是通過在植物細(xì)胞基因組中插入一種第一DNA分子，該分子包含經(jīng)操作按5’-3’方向連接的一種能夠在植物細(xì)胞中促使第一RNA序列產(chǎn)生的第一啟動子；一種編碼第一RNA序列的第一DNA序列，該RNA序列編碼一種可導(dǎo)致草甘膦耐受性的蛋白；一種能夠在植物細(xì)胞中促使第一RNA序列3’端多腺苷酸化的第一3’非翻譯區(qū)；以及一種第二DNA分子，該分子包含經(jīng)操作按5’-3’方向連接的一種能夠在植物細(xì)胞中促使雄性生殖組織產(chǎn)生第二RNA序列的第二啟動子；一種編碼與第一RNA序列互補(bǔ)的第二RNA序列的第二DNA序列；一種能夠在植物細(xì)胞中促使第二RNA序列3’端多腺苷酸化的第二3’非翻譯區(qū)；獲得含有第一和第二DNA分子的植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞；由植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)化植株；通過在不施加草甘膦的情況下栽培轉(zhuǎn)化植株來增加轉(zhuǎn)化植株的數(shù)量；允許自身受精；以及在不施加草甘膦的情況下將所述轉(zhuǎn)化植株的種子栽培多代；將轉(zhuǎn)化植株暴露于草甘膦以產(chǎn)生雄性不育植株；用雄性可育供體的花粉實(shí)現(xiàn)雄性不育植株的異體受精，其中供體的基因組中含有一種第三DNA分子，該分子包含經(jīng)操作按5’-3’方向連接的一種能夠在植物細(xì)胞中促使第三RNA序列產(chǎn)生的第三啟動子；一種編碼第三RNA序列的第三DNA序列，該RNA序列編碼一種導(dǎo)致草甘膦耐受性的蛋白；一種能夠在植物細(xì)胞中促使第三RNA序列3’端添加多腺苷酸核苷酸的第三3’非翻譯區(qū)；其中該第三DNA分子與第一DNA分子不同；以及收集所述異體受精后代的種子。
21．權(quán)利要求20的方法，其中第一啟動子選自花椰菜花葉病毒19S啟動子、花椰菜花葉病毒35S啟動子、玄參花葉病毒35S啟動子、甘蔗桿狀病毒啟動子、鴨跖草黃色斑點(diǎn)病毒啟動子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亞基啟動子、稻胞質(zhì)性丙糖磷酸異構(gòu)酶啟動子、腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶啟動子、稻肌動蛋白1啟動子、甘露堿合酶啟動子，以及章魚堿合酶啟動子。
22．權(quán)利要求20的方法，其中第一DNA序列編碼一種天然EPSPS酶、突變EPSPS酶，或一種草甘膦降解酶。
23．權(quán)利要求20的方法，其中第二啟動子選自TA29煙草絨氈層特異啟動子、PA1苯基苯乙烯酮二氫黃酮異構(gòu)酶啟動子、PA2苯基苯乙烯酮二氫黃酮異構(gòu)酶啟動子、SLG啟動子、LAT啟動子、聚半乳糖醛酸外切酶啟動子、Zmc13啟動子、LAT52啟動子、LAT59啟動子，以及psgB6-1啟動子。
24．權(quán)利要求20的方法，其中第二RNA序列與第一RNA序列的蛋白編碼區(qū)互補(bǔ)。
25．權(quán)利要求20的方法，其中第二RNA序列與第一RNA序列的非翻譯區(qū)互補(bǔ)。
26．權(quán)利要求20的方法，其中第三DNA的第三啟動子選自花椰菜花葉病毒19S啟動子、花椰菜花葉病毒35S啟動子、玄參花葉病毒35S啟動子、甘蔗桿狀病毒啟動子、鴨跖草黃色斑點(diǎn)病毒啟動子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亞基啟動子、稻胞質(zhì)性丙糖磷酸異構(gòu)酶啟動子、腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶啟動子、稻肌動蛋白1啟動子、甘露堿合酶啟動子，以及章魚堿合酶啟動子。
27．權(quán)利要求20的方法，其中所述植物選自玉米、小麥、稻、蕓苔、燕麥、大麥、紫苜蓿、胡蘿卜、棉花、油籽油菜、甜菜、向日葵、大豆、番茄、黃瓜，以及南瓜。
28．由權(quán)利要求20的方法產(chǎn)生的種子。
29．由權(quán)利要求28的種子產(chǎn)生的植株。
30．一種植物細(xì)胞，該細(xì)胞的基因組中包含一種第一DNA分子，該分子包含經(jīng)操作按5’-3’方向連接的一種能夠在植物細(xì)胞中促使第一RNA序列產(chǎn)生的第一啟動子；一種編碼第一RNA序列的第一DNA序列，該RNA序列編碼一種導(dǎo)致草甘膦耐受性的蛋白；一種能夠在植物細(xì)胞中促使第一RNA序列3’端多腺苷酸化的第一3’非翻譯區(qū)；一種第二DNA分子，該分子包含經(jīng)操作按5’-3’方向連接的一種能夠在植物細(xì)胞中促使雄性生殖組織產(chǎn)生第二RNA的第二啟動子；一種編碼與第一RNA序列互補(bǔ)的第二RNA序列的第二DNA序列；一種能夠在植物細(xì)胞中促使第二RNA序列3’端多腺苷酸化的第二3’非翻譯區(qū)；一種第三DNA分子，該分子包含經(jīng)操作按5’-3’方向連接的一種能夠在植物細(xì)胞中促使第三RNA序列產(chǎn)生的第三啟動子；一種編碼第三RNA序列的第三DNA序列，該RNA序列編碼一種導(dǎo)致草甘膦耐受性的蛋白；一種能夠在植物細(xì)胞中促使第三RNA序列3’端添加多腺苷酸核苷酸的第三3’非翻譯區(qū)；其中該第三DNA分子與第一DNA分子不同。
31．權(quán)利要求30的植物細(xì)胞，其中第一啟動子選自花椰菜花葉病毒19S啟動子、花椰菜花葉病毒35S啟動子、玄參花葉病毒35S啟動子、甘蔗桿狀病毒啟動子、鴨跖草黃色斑點(diǎn)病毒啟動子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亞基啟動子、稻胞質(zhì)性丙糖磷酸異構(gòu)酶啟動子、腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶啟動子、稻肌動蛋白1啟動子、甘露堿合酶啟動子，以及章魚堿合酶啟動子。
32．權(quán)利要求30的植物細(xì)胞，其中第一DNA序列編碼一種天然EPSPS酶、突變EPSPS酶，或一種草甘膦降解酶。
33．權(quán)利要求30的植物細(xì)胞，其中第二啟動子選自TA29煙草絨氈層特異啟動子、PA1苯基苯乙烯酮二氫黃酮異構(gòu)酶啟動子、PA2苯基苯乙烯酮二氫黃酮異構(gòu)酶啟動子、SLG啟動子、LAT啟動子、聚半乳糖醛酸外切酶啟動子、Zmc13啟動子、LAT52啟動子、LAT59啟動子，以及psgB6-1啟動子。
34．權(quán)利要求30的植物細(xì)胞，其中第二RNA序列與第一RNA序列的蛋白編碼區(qū)互補(bǔ)。
35．權(quán)利要求30的植物細(xì)胞，其中第二RNA序列與第一RNA序列的非翻譯區(qū)互補(bǔ)。
36．權(quán)利要求30的植物細(xì)胞，其中第三啟動子選自花椰菜花葉病毒19S啟動子、花椰菜花葉病毒35S啟動子、玄參花葉病毒35S啟動子、甘蔗桿狀病毒啟動子、鴨跖草黃色斑點(diǎn)病毒啟動子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亞基啟動子、稻胞質(zhì)性丙糖磷酸異構(gòu)酶啟動子、腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶啟動子、稻肌動蛋白1啟動子、甘露堿合酶啟動子，以及章魚堿合酶啟動子。
37．權(quán)利要求30的植物細(xì)胞，其中所述植物選自玉米、小麥、稻、蕓苔、燕麥、大麥、紫苜蓿、胡蘿卜、棉花、油籽油菜、甜菜、向日葵、大豆、番茄、黃瓜，以及南瓜。
38．一種轉(zhuǎn)基因植株，該植株包含權(quán)利要求30的植物細(xì)胞。
39．包含權(quán)利要求30的植物細(xì)胞的種子。
全文摘要
草甘膦被用作對植株的高選擇性殺配子劑,所述植株基因組中包含帶來組成型草甘膦耐受性的一種第一DNA分子和在雄性生殖組織中特異抑制所述草甘膦耐受性的一種第二DNA分子。通過暴露給草甘膦使得包含第一和第二DNA分子的植株雄性不育。本發(fā)明的方法和組分物有利于在雜交種子的產(chǎn)生中使用,用于限制異型雜交和用于延長花期。
文檔編號C07K14/415GK1300324SQ99806006
公開日2001年6月20日 申請日期1999年3月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月9日
發(fā)明者S·M·布朗, M·E·弗洛姆 申請人:孟山都公司