專利名稱：在酶催?；磻?yīng)后分離頭孢克羅的改進(jìn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由酶催酰化反應(yīng)混合物中分離頭孢克羅的工業(yè)便利方法，其是通過使頭孢克羅與蒽醌二磺酸以2∶1鹽的形式從混合物中沉淀出來。發(fā)明背景在美國專利3,816,253中公開了一種通過將氨基酸衍生物與7-氨基頭孢菌素核縮合制備頭孢菌素類化合物的酶催方法。在美國專利申請?zhí)?7/874,257(1992年4月24日提交)(X-8505)中公開了一種制備頭孢菌素類的改進(jìn)的酶催方法，特別涉及的是將相應(yīng)的7-氨基頭孢菌素核與氨基酸縮合制備頭孢菌素的改進(jìn)的酶催方法。迄今，在這種酶催酰化反應(yīng)之后，有價值的化合物，即頭孢克羅是處于復(fù)雜的環(huán)境中，該環(huán)境中不僅含有頭孢菌素核而且含有苯基甘氨酸、D-苯基甘氨酸甲酯及其鹽。根據(jù)這種混合物的復(fù)雜性，采用了一系列分離柱來分離頭孢克羅，當(dāng)然，這既造成產(chǎn)物損失也花費(fèi)時間。
由以上看出，在本技術(shù)領(lǐng)域中需要的是從復(fù)雜的?；磻?yīng)混合物中選擇性分離頭孢克羅的方法。本發(fā)明概述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)通過將酶催?；磻?yīng)混合物用蒽醌-1，5-二磺酸或其堿金屬鹽處理，可以從該酶催?；磻?yīng)混合物中選擇性分離頭孢克羅或其鹽，該酶催酰化反應(yīng)混合物包括頭孢菌素核、苯基甘氨酸和D-苯基甘氨酸甲酯和其鹽。當(dāng)蒽醌二磺酸與以上所列的其他化合物形成鹽的同時，該酸的加入選擇性地從酶催反應(yīng)混合物中沉淀出頭孢克羅與蒽醌-1，5-二磺酸生成的2∶1的鹽，這樣就提供了一種有效的、花時間少的從酶催?；磻?yīng)混合物中分離頭孢克羅的方法。令人驚奇的是，從該混合物中沉淀出頭孢克羅/酸鹽具有高的選擇性。在1989年11月15日公開的歐洲專利申請341,991中描述了頭孢克羅/酸鹽本身。本發(fā)明的描述本發(fā)明的方法可用于分離下式(I)的頭孢克羅或其鹽 該酶催方法按流程I所概括的方式進(jìn)行 用于該酶催方法中的酰基轉(zhuǎn)移酶可以從任何已知的微生物源衍生得到，其中，有如下的微生物黃單胞菌屬(Xanthomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)和桿菌屬(Bacillus genera)。優(yōu)選的是使用從大腸埃希氏桿菌(EscherichiaColi)ATCC9637衍生得到的青霉素?；D(zhuǎn)移酶。
酶催酰化反應(yīng)和其后的分離是在一個含水的體系中進(jìn)行的。然而，可以使用適宜的有機(jī)溶劑，它們包括乙二醇、低級醇(例如甲醇、乙醇、異丙醇、2-丁醇)、丙酮等。酶催酰化反應(yīng)可以在本技術(shù)領(lǐng)域中所述的溫度下進(jìn)行，其后的沉淀/分離步驟可以在約0°-約25℃的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選的溫度范圍是0°-10℃。
以每摩爾待分離的頭孢克羅需要約0.5摩爾-約2摩爾的量將蒽醌-1，5-二磺酸加入到?；磻?yīng)混合物中。該酸的優(yōu)選摩爾用量是每摩爾待分離的頭孢克羅需要0.5-0.7摩爾。該酸可以是堿金屬鹽(鈉或鉀)的形式。
沉淀/分離步驟可以在pH約1.0-約4.0的條件下進(jìn)行，優(yōu)選的pH范圍為約1.3-約1.7。該pH可以通過加入適宜的酸如鹽酸和/或堿如三乙胺來控制。
在頭孢克羅/酸鹽分離之后，可以用已知方法形成頭孢克羅一水合物。例如，可以將該鹽溶解在DMF/水混合物中，該混合物的pH可以提高到約5.7，從中結(jié)晶出頭孢克羅DMF溶劑化物。然后，可將該DMF溶劑化物加入低pH(0.5-1.0)的水中，以溶解該混合物，在pH3.5時頭孢克羅一水合物從中結(jié)晶出來。
下面舉例說明本發(fā)明。
制備例17-(D-2-銨-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-頭孢烯-4-羧酸鹽，內(nèi)鹽 在燒杯中，將7-ACCA(1)(0.9388g，4.0007m mol)和96.0ml水混合，pH是4.12。將3mol NH3(1.78ml)加到該燒杯中，pH是7.57。將D-苯基甘氨酸甲酯鹽酸鹽(2)(4.7594g，23.602m mol)加到該燒杯中，pH是5.68。把該混合物冷卻到5℃，向該混合物中加入3mol NH3(1.90ml)使pH升到7.00。加入酶(6.1442g，940IU/g的核)。由HPLC分析，得到下面的反應(yīng)速度數(shù)據(jù)時間pH溫度化合物化合物化合物1 2 3(分鐘) (℃) 剩余的％ 剩余的％ 形成的％07.00 6 100 100 -856.28 5 9.2 67.1 91.41206.16 4 9.1 64.3 91.51805.974.5 8.9 63.7 91.82005.914.5 8.8 65.3 93.0
在時間＝200分鐘時，過濾該混合物(除去固定化酶)，就地得產(chǎn)率為93％的標(biāo)題產(chǎn)物。
實(shí)施例17-(D-2-銨-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-頭孢烯-4-羧酸鹽，內(nèi)鹽 A.?；磻?yīng)(1)將7-ACCA(1)(4.8338g，20m mol)和150ml水在燒杯中混合，pH是3.67。把3mol NH3(8.40ml)加入該燒杯中，pH是8.20。把D-苯基甘氨酸甲酯鹽酸鹽(2)(23.0g，114m mol)加到該燒杯中，pH是5.29。用白色硅藻土載體過濾器(hyflofilter)過濾該混合物，并用10.0ml水洗滌。該混合物的體積是310ml。將該混合物轉(zhuǎn)移到較大的燒杯中，并用5ml水沖洗。把該混合物冷卻到1℃，向該混合物中加入3mol NH3(16.6ml)，使pH升到7.28。加入酶(15.34g，500IU/g的核)。145分鐘后過濾該反應(yīng)混合物除去酶，就地得到(3)的產(chǎn)率是89.8％。
B.分離將該反應(yīng)混合物冷卻到5℃，其pH是6.65。把蒽醌-1，5-二磺酸2Na(純度72.3％，10m mol)加入，并攪拌該混合物5分鐘，該混合物的溫度是4℃，pH是6.72。加濃鹽酸(2.3ml)使pH為2.4，并用頭孢克羅/蒽醌-1，5-二磺酸鹽接種該混合物，再攪拌該混合物2分鐘，其pH是3.3。加入濃鹽酸(3.9ml)，混合物的pH是1.5，再攪拌該混合物30分鐘，混合物的溫度是1℃，pH是1.4。過濾出該固體沉淀物并用75ml水洗滌，然后用50ml丙酮洗滌。濾液中含有苯基甘氨酸和化合物(1)和(2)。該沉淀物即(3)和蒽醌-1，5-二磺酸的2∶1鹽含就地產(chǎn)生的(3)量為99.8％。
實(shí)施例2以DMF溶劑化物形式的頭孢克羅的分離把頭孢克羅/蒽醌-1，5-二磺酸鹽(11.06/18.5m mol)放入250ml燒杯中，并加123ml為85/15的DMF/水溶液，其pH是3.85。用頭孢克羅/酸鹽接種該混合物，并在15分鐘內(nèi)加入三乙胺，使pH約為5.7。把該混合物冷卻到18℃，加入三乙胺，攪拌混合物，溫度保持在約20℃。過濾混合物，用35ml為85/15的DMF/水溶液洗滌固體，然后用20ml丙酮洗滌，接著在30℃真空下干燥該固體。
實(shí)施例3頭孢克羅一水合物的形成把實(shí)施例2的頭孢克羅溶劑化物加到含有39ml水、0.07g乙二胺四乙酸鈉的1.88ml濃鹽酸的溶液中，該溶液預(yù)先被冷卻到15-20℃的溫度。加入濃鹽酸，接著加入三乙胺。用頭孢克羅一水合物接種該混合物并攪拌。如果需要，加入三乙胺，把混合物冷卻到0-5℃并攪拌。然后過濾混合物，并用20ml冷水洗滌固體，在通風(fēng)櫥中，使該固體經(jīng)空氣干燥，得到頭孢克羅一水合物。
權(quán)利要求
1.一種從?；磻?yīng)混合物中分離頭孢克羅或其鹽的方法，該方法包括把蒽醌-1，5-二磺酸或其堿金屬鹽加到所述混合物中以形成2∶1頭孢克羅/蒽醌-1，5-二磺酸鹽的步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的?；磻?yīng)混合物包括下式的化合物
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的酰化反應(yīng)混合物包括苯基甘氨酸或其鹽。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的酰化反應(yīng)混合物包括D-苯基甘氨酸甲酯或其鹽。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的蒽醌-1，5-二磺酸的加入量為每摩爾頭孢克羅需要約0.5mol-約2mol。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中加入步驟是在pH約為1.0-4.0，溫度約為0°-約25℃的條件下進(jìn)行的。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括分離所述的頭孢克羅/蒽醌二磺酸鹽的步驟。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其中酸的加入量為每摩爾頭孢克羅需要約0.5-約0.7mol。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中pH約為1.3-約1.7，溫度為0°-10℃。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種通過把蒽醌-1，5-二磺酸加到酰化反應(yīng)混合物中以從該?；磻?yīng)混合物中分離頭孢克羅的方法。該酸與頭孢克羅高選擇性地形成沉淀，所以簡化了分離和回收步驟。
文檔編號C07D501/00GK1119439SQ94191513
公開日1996年3月27日 申請日期1994年2月7日 優(yōu)先權(quán)日1993年2月5日
發(fā)明者J·P·加德納 申請人:伊萊利利公司