專利名稱：5′-核苷酸的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改進的核苷磷酸化的方法，更具體地講，涉及核苷磷酸化的方法，其中將核苷在有機溶劑中加熱以改變其晶形，然后用其留下的未保護的羥基基團磷酸化。
本發(fā)明方法提供經(jīng)濟地工業(yè)規(guī)模地生產(chǎn)5′-核苷酸(或其混合物)的途徑;5′-核苷酸，特別是作為單體物質(zhì)或包括次黃苷酸，鳥苷酸或胞苷酸或其它物質(zhì)的混合物可用在調(diào)味品和藥品中。
常規(guī)核苷磷酸化的化學方法包括1)核苷與三氯氧化磷在磷酸三烷基酯中反應(yīng)的方法(美國專利3413282)。
2)用鳥苷和次黃苷混晶的方法(日本公開特許公報第167599/1984)。
3)用鳥苷和次黃苷的混合磷酸化的方法(EPA-453597)。
4)在磷酸化中使用礦化劑(metallizing agent)的方法(日本公開特許公報第80694/1984)。
5)在磷酸化中使用鋁化劑的方法(日本公開特許公報第163397/1984)。
以下被認為是與本發(fā)明目的有關(guān)的核苷的化學磷酸化。
當將核苷如次黃苷和鳥苷的混晶用三氯氧化磷在磷酸三乙酯存在下磷酸化時，在得到所需的5′-單核苷酸混合物的同時會產(chǎn)生二磷酸酯、次黃嘌呤、鳥嘌呤和其它的副產(chǎn)物，這是因為次黃苷和鳥苷的磷酸化的速度不同;具體來說，鳥苷的磷酸化速度約為次黃苷的1/3。
抑制該副產(chǎn)物產(chǎn)生的途徑是在磷酸化中使用鳥苷和次黃苷的混晶，如上述方法2。
在另外的次黃苷或鳥苷的堿金屬鹽的磷酸化的方法如上述方法3中，后者的磷酸化繼之以前者的添加以達到連續(xù)磷酸化。
在核苷磷酸化的另一方法中，用礦化劑或鋁化劑活化核苷的羥基基團然后磷酸化，如上述方法4和方法5。
但從工業(yè)的角度就收率、副產(chǎn)物的產(chǎn)生、操作以及其它細節(jié)而論，還沒有基于例如含給定比率的次黃苷和鳥苷的混合物或次黃苷和鳥苷的混晶的化學磷酸化從核苷生產(chǎn)核苷酸的令人滿意的方法。因此，有必要開發(fā)出生產(chǎn)高純度，高收率和最少副產(chǎn)物的5′-核苷酸的生產(chǎn)方法，并縮短反應(yīng)時間。
本發(fā)明提供5′-核苷酸的生產(chǎn)方法，它包括將核苷在有機溶劑中的懸浮液置于不低于約20℃的溫度保存，然后將該得到的懸浮液進行核苷的磷酸化。
在本發(fā)明中，核苷定義為通過糖苷鍵與嘌呤堿或嘧啶堿相連的糖，具體來講是核糖核苷或脫氧核糖核苷。核糖核苷的例子包括次黃苷、鳥苷、胞苷、腺苷和尿苷。脫氧核糖核苷的例子包括脫氧次黃苷、脫氧鳥苷、脫氧胞苷和脫氧尿苷。最好使用核糖核苷，優(yōu)先選擇次黃苷和鳥苷。
作為原料核苷，可以使用上述核苷的單體或混合物?？梢允褂眠@些核苷的鹽。核苷鹽的例子包括與無機堿(例如堿金屬如鈉和鉀，堿土金屬如鈣和鎂，以及氨)形成的鹽;與有機堿(例如三烷基胺如三甲胺和三乙胺，以及吡啶)形成的鹽;與無機酸(例如鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)形成的鹽以及與有機酸(例如乙酸、甲酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的鹽。
優(yōu)先選用次黃苷和鳥苷的混晶作原料核苷。該混晶可按公知方法制得。例如可用從含次黃苷和鳥苷的水溶液中結(jié)晶溶質(zhì)的方法制得混晶(見日本特許公報第38199/1972)。如果這樣，可以通過冷卻、濃縮、加入晶種、加入不溶解核苷的親水性溶劑(例如丙酮)、調(diào)節(jié)pH(從核苷溶解性強的pH3或pH3以下的酸性范圍或pH9或pH9以上的堿性范圍調(diào)至pH3-9之間)，或?qū)⑦@些方法結(jié)合起來制得結(jié)晶。最好是，用這樣的方法使混合的核苷結(jié)晶從含核苷的溶液中結(jié)晶析出后，用通常所用的方法如真空抽吸、加壓過濾、離心過濾或離心沉淀分出混晶，隨后經(jīng)例如減壓加熱干燥除去溶劑(例如水)，然后進行磷酸化。
只要不干擾該反應(yīng)，任何有機溶劑都可以用于本發(fā)明。該有機溶劑最好是極性溶劑例如磷酸三低級(C1-6)烷基酯如磷酸三甲酯或磷酸三乙酯，磷酸三低級(C1-6)烷氧基低級(C1-6)烷基酯如磷酸三甲氧乙酯或磷酸三乙氧乙酯，亞砜如二甲亞砜，或酰胺如二甲基甲酰胺或N-二甲基乙酰胺。這些有機溶劑可以單獨使用或配合使用。在這些溶劑中，優(yōu)先選用磷酸三低級(C1-6)烷基酯，磷酸三乙酯和磷酸三甲酯最好。
盡管所用有機溶劑的重量依其類型變動，但宜選擇在約為核苷重量的5-20倍、最好在約8-17倍之間。
在本發(fā)明中，磷酸化按下述方法進行首先將核苷或其鹽懸浮于有機溶劑中，然后將得到的懸浮液保持于不低于約20℃的溫度。所述溫度在約20-100℃為佳，約30-80℃更好，約40-60℃最好。該懸浮液在不低于20℃的溫度的放置時間取決于該溫度和上述原料核苷的重量。所述放置時間在約10-120分鐘為佳，約10-60分鐘更好，約10-20分鐘最好。一般來講，由于磷酸化是伴隨核苷溶解的液-液反應(yīng)。因此反應(yīng)速度隨用于該反應(yīng)的核苷晶體的晶粒大小和晶形而變動。由于核苷晶粒越細，表面積越大，因此可以通過使核苷晶粒變小來增加表觀反應(yīng)速度。該核苷晶粒約1-1000μm為佳，約20-500μm更好。
然而在本發(fā)明中，核苷晶體可以具任何的晶粒大小和晶形并以在有機溶劑中的核苷懸浮液的形式于不低于20℃的溫度保存。因為在加熱時，核苷晶體表面上變成無定形晶體。因為，類似于晶體轉(zhuǎn)變，所以該核苷晶體的表面積增加并且與磷酸化劑的反應(yīng)速度增加。
隨后，對得到的懸浮液進行核苷磷酸化。核苷磷酸化用磷酸化劑來完成。反應(yīng)溫度在約-30-10℃為佳，約0-10℃最好。
用于本發(fā)明的磷酸化劑為磷酸化中常用的磷酸化劑，最好是三囟氧化磷(phosphorus oxyhalogenide)如三氯氧化磷或三溴氧化磷。
在磷酸化時，最好使用轉(zhuǎn)變成部分水合物的三鹵氧化磷，而不直接用三囟氧化磷，因為轉(zhuǎn)變成部分水合物的三鹵氧化磷通常能對5′-單核苷酸的制備提供較高的選擇性并減少如2′-或3′-磷酸酯和二磷酸酯這樣的副產(chǎn)物的產(chǎn)生。
為制得三鹵氧化磷的水合物，將三鹵氧化磷溶于上述的反應(yīng)溶劑中，然后與少量水或醇如甲醇、乙醇或叔丁醇反應(yīng)。
所用的三鹵氧化磷的摩爾量通常約為核苷的1-5倍，最好是約1.5-4倍。在該范圍以外的用量一般不合乎需要，因為過小量會導(dǎo)致留有未反應(yīng)的核苷，而過大量會導(dǎo)致二磷酸酯副產(chǎn)物產(chǎn)生并且降低所需的5′-單核苷酸的收率。通常根據(jù)磷酸化劑的類型或溶劑以及其它因素將加入量選在上述范圍之內(nèi)為宜。
盡管反應(yīng)時間隨溶劑的種類、反應(yīng)加速劑(例如極少量氫氧化鈉等)的存在與否以及其它因素而改變，但一般約在30分鐘到10小時之間。在本發(fā)明磷酸化的方法中，與常規(guī)磷酸化的方法相比，反應(yīng)可以在較短的時間內(nèi)完成。
將如此得到的反應(yīng)產(chǎn)物按常規(guī)方法與冷水(例如不高于約10℃，最好不高于約5℃)混合以水解未反應(yīng)的磷酸化劑和得到的磷酰鹵核苷(nucleoside phosphohalogenate)，得含5-核苷酸的溶液(水解液)。
如此得到的5′-核苷酸可按常規(guī)方法純化1)將水解液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH約1.5，然后用活性炭處理的方法，2)用另外的有機溶劑提取分離反應(yīng)溶劑，然后用堿如氫氧化鈉中和殘留物，然后用樹脂吸附或結(jié)晶法純化的方法，以及3)用另外的有機溶劑提取分離反應(yīng)溶劑，然后用活性炭處理殘留物，然后用這些純化方法中的任何一個進行純化，可按常規(guī)方法獲得5′-磷酸核苷二鈉的混晶。
按照本發(fā)明，可以從核苷制得高純度和高收率的5′-核苷酸，縮短了核苷磷酸化的時間而且使在核苷酸純化過程中的雜質(zhì)去除容易進行，三鹵氧化磷的用量大大低于常規(guī)用量。
下面將用以下實施例更詳細的描述本發(fā)明。
在下面的實施例中，IMPNa2代表次黃苷-5′-一磷酸二鈉;GMPNa2代表鳥苷-5′-一磷酸二鈉;IR代表次黃苷;GR代表鳥苷;TEP代表磷酸三乙酯;HLC代表高效液相色譜法。
實施例1次黃苷-鳥苷混晶的磷酸化將次黃苷和鳥苷的混晶粉末(85.3g次黃苷和103.6g鳥苷)于室溫(約18℃)懸浮于2106.2g磷酸三乙酯中并冷卻至約5℃，然后加入294.3g三氯氧化磷和11.3g水對得到的懸浮液進行核苷磷酸化3.5小時。
分別將另外的次黃苷和鳥苷的混晶粉末(85.3g次黃苷和103.6g鳥苷)于室溫(約18℃)按與上述相同的方法懸浮于2106g磷酸三乙酯中。將得到的懸浮液加熱至50℃并攪拌15分鐘，然后在冷卻至約5℃的條件下加入294.3g三氯氧化磷和11.3g水對該懸浮液進行核苷磷酸化。
其后，將每個反應(yīng)混合物加到3211g水中進行水解。得到的水解液用HLP測定，結(jié)果見表1。
用HLC定量分析的條件如下(下面的實施例應(yīng)用相同的條件)1)IMPNa2和GMPNa2的定量分析儀器HPLC(LC-4A，Shimadzu Corporation，日本)柱陰離子交換樹脂(CDR10，Mitsubishi Chemical，日本)，4.5mm直徑×25mm長度洗脫劑含0.3mol/升乙酸和0.2mol/升乙酸銨的0.5mol/升乙酸鹽緩沖液流速1.8ml/分2)未反應(yīng)的IR和未反應(yīng)的GR的定量分析儀器HPLC(LC-6A，Shimadzu Corporation，日本)柱陽離子交換樹脂(CK-10U，Mitsubishi Chemical，日本)，4.5mm直徑×25mm長度洗脫劑含0.15mol/升乙酸銨的0.15mol/升乙酸鹽緩沖液流速0.45ml/分表1
實施例2次黃苷或鳥苷單一晶體的磷酸化將次黃苷和鳥苷各自的晶體粉末(85.3g次黃苷和103.6g鳥苷)于室溫(約18℃)按與實施例1相同的方法懸浮于磷酸三乙酯中，將經(jīng)加熱或沒加熱得到的反應(yīng)混合物分別用HLC測定，結(jié)果見表2。
表2
實施例3在TEP存在下加熱條件(加熱溫度)的比較將次黃苷和鳥苷的混晶粉末(85.3g次黃苷和103.6g鳥苷)于室溫(約18℃)懸浮于2106.2g磷酸三乙酯中并于25、50或100℃加熱15分鐘。然后將得到的懸浮液冷卻至約5℃，隨后加入294.3g三氯氧化磷和11.3g水進行核苷磷酸化3.5小時。
隨后將每個反應(yīng)混合物加到3211g水中進行水解。得到的水解液用HLC測定，結(jié)果見表3。
實施例4在TEP存在下加熱條件(加熱時間)的比較依照實施例3操作，但在磷酸三乙酯存在下的加熱于50℃進行15、30或60分鐘。得到的反應(yīng)混合物用HLC測定，結(jié)果見表4。
表4在TEP存在下加熱時間的比較(加熱溫度50℃)
實施例5三鹵氧化磷加入量的比較將次黃苷和鳥苷的混晶粉末(85.3g次黃苷和103.6g鳥苷)于室溫(約18℃)懸浮于2106.2g磷酸三乙酯中并加熱至50℃攪拌15分鐘，隨后將得到的懸浮液冷卻至約0℃，然后各加入1.4、1.6、1.8、2.0或2.75倍摩爾量的三氯氧化磷并各加入5.4、7.2、7.2、9、11.3g水進行核苷磷酸化3.5小時。
隨后，將各反應(yīng)混合物加到3211g水中進行水解。得到的水解液用HLC測定，結(jié)果見表5。
表5
實施例6磷酸化條件的比較將次黃苷和鳥苷的混晶粉末(85.3g次黃苷和103.6g鳥苷)于室溫(約18℃)懸浮于磷酸三乙酯中并加熱至50℃攪拌15分鐘。然后將該得到的懸浮液冷卻至約-5、0或5℃，然后加入1.8倍摩爾量的三氯氧化磷和7.2g水進行核苷磷酸化3.5小時。
隨后，將各反應(yīng)混合物加到3211g水中水解。得到的水解液用HLC測定，結(jié)果見表6。
表權(quán)利要求
1.生產(chǎn)5′-核苷酸的方法，它包括將核苷在有機溶劑中的懸浮液放置于不低于約20℃的溫度保存，然后對該得到的懸浮液進行核苷磷酸化。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中該核苷在有機溶劑中的懸浮液被放置于約30-80℃保存。
3.按照權(quán)利要求1的方法，其中該核苷在有機溶劑中的懸浮液于不低于約20℃的溫度放置約10-120分鐘。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其中磷酸化于約-30-10℃進行。
5.按照權(quán)利要求1的方法，其中有機溶劑是磷酸三低級(C1-6)烷基酯。
6.按照權(quán)利要求5的方法，其中磷酸三低級(C1-6)烷基酯是磷酸三乙酯。
7.按照權(quán)利要求1的方法，其中磷酸化用三鹵氧化磷來完成。
8.按照權(quán)利要求1的方法，其中三鹵氧化磷是三氯氧化磷。
9.按照權(quán)利要求7的方法，其中三鹵氧化磷的用量為約每摩爾核苷1-5摩爾。
10.按照權(quán)利要求1的方法，其中核苷是次黃苷。
11.按照權(quán)利要求1的方法，其中核苷是鳥苷。
12.按照權(quán)利要求1的方法，其中核苷是次黃苷和鳥苷的混晶。
13.按照權(quán)利要求1的方法，其中核苷是胞苷。
全文摘要
生產(chǎn)5′-核苷酸的方法，它包括將核苷在有機溶劑中的懸浮液放置于不低于約20℃的溫度保存，然后對該得到的懸浮液進行核苷磷酸化。按照本發(fā)明，可以生產(chǎn)出高純度、高收率的5′-核苷酸并能縮短反應(yīng)時間，而且使核苷純化過程中的雜質(zhì)去除容易進行。
文檔編號C07H19/04GK1086219SQ93108510
公開日1994年5月4日 申請日期1993年7月8日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月8日
發(fā)明者土師晃, 波多野廣行, 池本朋已, 北本芳文 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社