專利名稱：修飾的血纖維蛋白溶酶原激活劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)由類生長因子區(qū)域(GFD)改變的，單鏈尿激酶(scuPA)所衍生的糖基化的血纖維蛋白溶酶原激活劑(以下亦稱為GASGAs)的方法。更為具體地說，本發(fā)明涉及生產(chǎn)GASGAs的方法，包括將uPA基因從人類基因庫中取出，插入到一個表達載體，修飾質粒并改變uPA基因的GFD，將由此獲得的質粒載體引入動物細胞以產(chǎn)生轉化體，并且從該轉化的動物細胞中重獲經(jīng)GFD改變、scuPA衍生的糖基化的血纖維蛋白溶酶原激活劑。
本發(fā)明的另一個目的是生產(chǎn)具有經(jīng)類生長因子區(qū)域(GFD)改變的人尿血纖維蛋白溶酶原激活劑衍生物。更為具體地說，本發(fā)明所產(chǎn)生的為具有人類scu-PA序列，(參照例如EP-A-92182中所公開的uPA序列)中的第9至50氨基酸之間的區(qū)域的，特別是具有第9至45氨基酸的，尤其為第19至32氨基酸之間的區(qū)域的，經(jīng)改變的單鏈或雙鏈的人類尿血纖維蛋白溶酶原激活劑衍生物。
尿激酶(uPA)為一種血纖維蛋白溶酶原激活劑，可從人尿中獲得，用于治療多種血栓形成或栓塞疾病。尿激酶的生產(chǎn)主要是基于從人尿中提純酶的方法。隨著細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展，及專一性的抗尿激酶抗體(單克隆以及多克隆抗體)的獲得而成為現(xiàn)實，從而明確了uPA為細胞產(chǎn)生的pro-uPA的激活產(chǎn)物(參見Wun等著，J.Biol.Chem.257，7262-7268(1982);Nielsen等著，Biochemi-stry21，6410-6415(1982))。Pro-uPA為單鏈蛋白質，而uPA為雙鏈蛋白質。將pro-uPA轉變成為uPA需要將pro-uPA的一根單肽鏈劈開(參見Verde等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81;4727-4731(1984);Günzler等著，HoppeS.Zschrp.physiol.Chem.363，1155-1165，1982)。單鏈pro-uPA的專一性斷開使其專一性活性提高50倍，該斷開需要蛋白水解酶，諸如胰蛋白酶或血纖維蛋白酶的作用。尤其是血纖維蛋白溶酶即使在體內也顯示出與此轉化具有相關性。
非活性形式的血纖維蛋白溶酶原激活劑已由C.Nolan等于1977年證實存在于胚胎腎細胞培養(yǎng)物中(參見BiochimBiophysActa1977;496∶384-400)。該種物質已被該文作者認為是尿激酶的前激活劑形式，可被胰蛋白酶激活而不改變其分子量，而且一旦被激活后，又可被抗人尿激酶的兔抗體所抑制。利用苯甲脒葡聚糖親和層析可將該非活性的“前激活劑”與活性的形式分離開。StoppelliM.P.等人對跨越自氨基酸殘基1位至135位的uPA氨基末端片段(ATF)的分離及定性記述進行了描述(參見Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985，82，4939-4943)。如歐洲專利40238所述，單鏈的血纖維蛋白溶酶原激活劑的分子量大約為56，000，在血纖維蛋白平板上顯示的專一活性為40，000-50，000CTA單位/毫克，并對血纖維蛋白具有高親和性。公開號為92182的歐洲專利申請涉及用DNA重組技術制備尿激酶衍生物的方法。該歐洲專利揭示，特別地對由原核生物宿主(大腸桿菌)中的DNA重組技術而獲得的低分子量的尿激酶(30，000道爾頓左右)的提純及定性進行了記述。
公開號為154272的歐洲專利申請揭示了一種從動物細胞中生產(chǎn)糖基化的單鏈尿激酶的方法，該方法采用從已建立的人類腎細胞衍生系的mRNA獲得的cDNA，通過cDNA重組技術以實現(xiàn)。Riccio等人(參見Nucl.AcidRes.，1985，13，2759-2771)對人類uPA基因的克隆進行了描述。該編碼區(qū)域可細分為由十個內含了分隔成的十一個外顯子。他們曾報導，在該蛋白質中的功能區(qū)域可經(jīng)重新處理得到不同的外顯子，或外顯子群。更為重要的是，他們發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)由外顯子IV合成的10位至50位的氨基酸序列與表皮生長因子(EGF)及α型轉化因子之間存在某種程度的同源性。
該類生長因子區(qū)域似乎包含在蛋白質(uPA/scu-PA)的識別中，并與細胞膜專一性受體相連結(參見Stoppelli等著，Proc.Natl.Acad.Sci，USA(1985)82，4939-4943及Appella等著，J.Biol.Chem.，1987，262，4437-4440)。
類似于本發(fā)明(GASGAs)衍生物的GFD改變的尿激酶為scu-PA/uPA衍生物，其中的蛋白質GFD已通過閻姆椒ǘ謀浯傭竦帽萿PA具有延長持續(xù)作用的新的衍生物。該延長作用既可通過體外測試也可通過體內實驗而被證實(尤其是可推測在人體內活性的常用動物體中進行實驗)?？紤]到uPA在體內的短暫的半衰期，對具有本發(fā)明的化合物性質的需要，對于本技術領域的人員是顯而易見的。
本發(fā)明的另一類化合物，特征在于在這類化合物中，特別是在“天然”GFD的靠近上游處或上游處插入了一個或多個GFD序列的拷貝。
目前所知的，在某個專一的序列中對蛋白質進行修飾的方法，包括“直接”蛋白質修飾法，例如通過化學手段，及“間接”蛋白質修飾法，例如通過基因工程對蛋白質的編碼區(qū)域進行處理?；瘜W修飾法包括對“天然”scu-PA或u-PA使用衍化劑對9位至50位氨基酸，特別是9位至45位的氨基酸，尤其是10位至32位氨基酸之間的區(qū)域中的一個或多個氨基酸功能進行衍生化。這些衍生劑本身則為已知的，例如，對于堿性氨基酸，如賴氨酸或精氨酸，可采用與氨基形成酰胺鍵或其它有機鍵的試劑，諸如乙酸酐，1，2-環(huán)己二酮及苯甲酰甲醛(phenylglioxal)，而對于酸性氨基酸，諸如天冬氨酸，酯化反應可作為最慣常使用的衍生化方法。在必要的情況下，應同時用已知的保護劑對蛋白質上的不穩(wěn)定功能團進行保護，和選擇性反應一起結合進行。
然而，一個十分優(yōu)越的修飾法則為對蛋白編碼區(qū)域的基團工程的方法，特別是編碼蛋白質GF區(qū)域的DNA及/或mRNA編碼區(qū)域，即編碼9至50位氨基酸、特別是9至45位氨基酸，尤其是19至32位氨基酸之間氨基酸序列的編碼區(qū)域，進行的基團工程方法，以對最終蛋白質進行修飾，使之不與其專一受體諸如，單核細胞u937上的細胞受體相連(參見StoppelliM.P.等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，4939-4943，1985)。
優(yōu)化的修飾方法是使uPA編碼基因組DNA的1027堿基對與1784堿基對之間的部分進行的基因工程修飾(假定mRNA轉錄起始位點為堿基對1)。
對“天然”蛋白質的聯(lián)結區(qū)域的編碼區(qū)域基團工程修飾法可在基因組DNA或cDNA中進行。這些方法包括使核酸序列發(fā)生定位缺失、突變及插入至核酸順序。這些修飾法的主要結果為導致scu-PA或uPA的受體連結能力的減弱，同時保持其酶作用能力不變。有時，甚而常常修飾作用的結果是在經(jīng)修飾的蛋白的順序中出現(xiàn)一個新的氨基酸。比如，當缺失發(fā)生在內含子C(即，uPA基因的外顯子Ⅲ及Ⅳ之間的內含子)中PstⅠ位點和內含子D(即，外顯子Ⅳ及Ⅴ之間的內含子)中的BglⅡ位點之間時，得到的GASGA中缺失了自Ser9至Asp45的氨基酸序列，同時，在該位置導入了一個新的氨基酸，即酪氨酸，在氨基酸缺少之后，經(jīng)三聯(lián)體編碼而引起了一個結接過程。
本發(fā)明的一個優(yōu)化的實施例，該修飾方法的特征為一個包括使相應于uPA基因組或cDNA或雜交的uPA基因組DNA-cDNA中的外顯子Ⅳ所相應的區(qū)域發(fā)生缺失的方法。當在基因組序列上完成該步驟時，有可能，有時甚至很容易將內含子區(qū)域上相對地靠近外顯子Ⅳ的DNA序列切掉?？捎萌舾煞N已知的方法使之實現(xiàn)。其中的一個優(yōu)選的方法的特征為，在含有位于啟動子下游整個的uPAORF的載體中，將單一的限制性位點導入圍繞外顯子Ⅳ兩旁的內含子中，從而獲得兩個載體衍生物，它們的區(qū)別僅在于新的位點出現(xiàn)于內含子C或內含子D中。在這兩個新位點，同樣也在該區(qū)域中的第三個位點(這對于兩個質粒是常見的)進行限制性消化，并重新連結得到的質粒片段，在各其它質粒中產(chǎn)生一種新的質粒，其中內含子C中新位點的上游區(qū)域已經(jīng)與內含子D中的新位點下游的區(qū)域相熔合，也就是說，獲得了相應于uPAGFD的全部區(qū)域實際上已經(jīng)失去的序列。另外，更為優(yōu)化的方法包括，用已知的技術，將uPA編碼區(qū)域的內含子C中的PstⅠ位點轉化成SalⅠ位點，并將內含子D中的BglⅡ位點轉化成為XhoⅠ，用合適的限制性酶使這兩個位點之間的區(qū)域缺失，并將兩片段互相連接而產(chǎn)生一個新的uPA編碼序列，可編碼成GASGA衍生物，其中絲氨酸9至天冬氨酸45之間的氨基酸序列之間被一個酪氨酸單元所取代。進一步敘述則為，產(chǎn)生的質粒失去絲氨酸至賴氨酸23之間的氨基酸序列，及Phe25至Asp45之間的序列，而原先由密碼子TAC編碼的Tyr24則由因ORF上的外顯子Ⅲ與外顯子Ⅴ的熔合而產(chǎn)生的TAT密碼子編碼的Tyr酪氨酸殘基所取代。上述的步驟最好在含有uPAORF(開放的閱讀框架)的載體上進行，以便直接獲得GASGA的表達載體?；蛘?，也可以通過使含有在外顯子Ⅳ下游按上述方法導入的單一位點(例如XhoⅠ位點)的編碼uPA的質粒，諭庀宰英艫納嫌魏拖掠畏⑸洗蟮腄NA部分在缺失，然后，將重新導入了一部分缺失序列而不含有外顯子Ⅳ的片段進行置換而與這些序列重聯(lián)而獲得缺失突變體。更為具體地敘述則為，將含uPAORF及如上述的單一限制位點的載體用專一于導入在外顯子Ⅳ下游的單一位點(例如XhoⅠ)的酶進行處理，并用另一種專一于另一個位于外顯子Ⅳ上游的獨特位點(例如，已存在于內含子B，即位于外顯子Ⅳ之前的內含子中的HindⅢ位點)的酶進行處理。所獲得的失去了外顯子Ⅲ和Ⅳ的質粒片段，通過合適的粘性末端或平頭末端相連接成以一個片段，并以專屬的定位只含有外顯子Ⅲ(但不含外顯子Ⅳ)以保持閱讀框架的正確。所獲得的載體為GASGA表達載體，編碼本發(fā)明的GASGA衍生物的蛋白質。在該方法的一個優(yōu)化的實施例中，從uPA基因中衍生的含有ORF的uPA表達載體，通過在位于內含子D(圖3)的BglⅡ位點處插入XhoⅠ位點而將之置換，接著用XhoⅠ及HindⅢ進行消化的方法進行修飾。得到并分離了含有原有質粒的絕大部分但又缺少相應于外顯子Ⅲ及Ⅳ的序列的DNA片段。
該片段與自內含子B跨躍至內含子C的HindⅢ-SalⅠ片段相連(因而含有外顯子Ⅲ)，而獲得一個GASGA表達載體。
本發(fā)明的uPA編碼序列在正確的定向碼上缺乏相應于外顯子Ⅳ的DNA序列，因而可以編碼本發(fā)明的GASGA蛋白質。上述的該HindⅢ-SalⅠ片段是通過在將一個SalⅠ連接于含有外顯子Ⅲ的由PstⅠ處理含基因源的uPA編碼序列的載體而獲得的一個PstⅠ碎片的末端上后，用HindⅢ消化而得到。所獲得的表達載體所編碼的GASGA，失去自Ser9至Lys23及自Phe25至Asp45的氨基酸，且其中由TAC密碼子編碼的Tyr24已經(jīng)被來源于外顯子Ⅲ與外顯子Ⅴ的ORF的融合的TAT密碼子編碼的Tyr所代替。
如上所述，也可通過在“天然”uPA的GFD中進行插入，使uPA受體的連續(xù)能力顯著下降或徹底喪失，從而獲得本發(fā)明的uPA衍生物。其中較為優(yōu)化的方法，包括通過基因工程的方法對uPA編碼基因或cDNA或uPA基因/cDNA雜交體進行修飾。事實上。眾所周知基因誘變可利用多種物理及化學試劑而實現(xiàn)，例如采用電離射線，紫外線或DNA前體類似物。不過，較佳的方法是采用基因工程的方法，直接對編碼序列進行修飾，例如在M13-衍生載體中進行定位誘變(參見P.Carter著《用M13載體進行的改進的寡核苷酸定位誘變》，Nucl.AcidResearch1985，13，4431)或用多聚酶鏈反應的方法(PCR)。編碼序列既可在將被轉染的同一個載體或在不同的載體上進行修飾，隨后將一個適合的片段轉移至轉染載體中。這些操作的具體安排取決于所涉及的特定的酶作用底物以及本領域技術人員的慣常的實踐。
在與uPA受體連結包含的uPA編碼的有關的部分的DNA序列中存在有限制性位點(ScaⅠ)。在既不中止蛋白轉譯也不改變閱讀框架的情況下，有可能使之打開并插入一段延伸的DNA。最好在該DNA延伸部分中包含一個新的限制性位點以加強對所獲得的突變體的鑒別。
加入的堿基對數(shù)可為3對，或其幾倍數(shù)。既可一步地將所需長度的DNA延伸部分直接插入，也可以采用多步驟方法例如首先插入一段較長的延伸部分，然后用限制性酶切減短至所需的長度。
得到的編碼序列可以編碼帶有改變了的uPA受體的連結區(qū)域的蛋白質，例如這是因為諸如在與連結有關的那段氨基酸殘基的間隔中引入拐彎、或其積水性(hydropaticityprofile)的改變或同時借助這兩種作用，使“原始”uPA二級結構的β片、α螺旋發(fā)生變化。
概要地說，采取了以下的步驟-用ScaⅠ進行部分或全部消化，使含有人類uPA基因的表達載體開鏈;
-用已知序列的DNA聯(lián)結子插入一個新的限制性位點-修飾該限制性位點以獲得一個具有3對或幾倍于3對的堿基對插入物;
-在攜帶對選擇劑的抗性的質粒存在下，將該載體轉染哺乳動物細胞;
-選擇抗性克隆，并使這些細胞在培養(yǎng)基中產(chǎn)生GASGAs;
-收集培養(yǎng)基、并從中提純蛋白質。
按照本發(fā)明的方法，可以通過在uPA編碼序列中將在1027堿基對與1784堿基對之間的uPADNA區(qū)域的一個、二個或多個復制物(replica)插入，最好采用原來的1027至1784堿基對的GFD編碼區(qū)域(實際上即為外顯子Ⅳ)，從而在“天然”scu-PA或uPA中插入多個GF區(qū)域。我們期望這些具有多GF區(qū)域的GASGAs衍生物比天然分子具有更強的uPA受體連結的選擇能力。
編碼具有改變的GF區(qū)域的GASGAs的載體(不再具有與uPA受體連結的能力)屬于以下稱之為“EO”的系列之中，而含有多個GFD的GASGAs表達載體屬于按含有的GFD單位的數(shù)目而區(qū)別的在以下為“E2”、“E3”、“E4”等系列之中。在以下還要對GASGAs相應地進行定名。本發(fā)明包含了GASGAs衍生物及其喪失了或顯著減弱了與uPA受體連結能力的等位基因形式。可以通過對“天然”scu-PA及/或PA，或最好對uPA編碼區(qū)域進行修飾，并將此經(jīng)修飾的序列在哺乳動物細胞中表達，從而獲得所述的等位基因形式。此外，本發(fā)明的GF區(qū)域改變的血纖維蛋白溶酶原激活劑，具有其他的經(jīng)修飾的區(qū)域，這些區(qū)域最好能用血纖維蛋白溶酶劈開。具有一個被修飾區(qū)域以使之更難以轉換成uPA的scu-PA衍生血纖維蛋白溶酶原激活劑的例子，如歐洲專利申請200451號所述的Lys135、Lys136及Arg156、Lys158經(jīng)修飾的衍生物，或如歐洲專利申請第210279號所述的Lys137、Phe157經(jīng)修飾的衍生物。
這些化合物借助在cDNA序列或相應DNA順序上進行定位突變而得以修飾，被修飾的區(qū)域位于9至50位氨基酸之間，較理想為9至45位氨基酸之間，而最理想為19至32位氨基酸之間。將得到的編碼序列插入一個表達載體中，并用之轉化合適的動物細胞，以產(chǎn)生所需的GFD改變的血纖維蛋白溶酶原衍生物。
這些也具有通常用血纖維蛋白溶酶型酶進行酶切的區(qū)域的經(jīng)修飾的，產(chǎn)生一定的抵抗蛋白酶切的抵抗力的GFD改變的、scu-PA衍化的血纖維蛋白溶酶原激活劑，與GFD未經(jīng)改變的原始化合物具有增長的作用期，及/或在較低劑量給藥時達到同等效果。
這種改變的方法和次序可能不是決定性的，它保持著使uPA接受體不被結合的面貌。特別是，在血纖維蛋白溶酶敏感區(qū)域發(fā)生突變后，可以引入GFD突變，反之亦然，GFD突變體亦可在血纖維蛋白溶酶敏感區(qū)域的突變之前引入GFD突變。本發(fā)明的一個實施例中采用的含uPA編碼區(qū)域的人類基因組源的DNA片段，是在合適載體中自人類基因庫獲得，諸如按照已知的技術，先用該基因本身的一部分所代表的合適的DNA探針，或根據(jù)已知編碼序列而制成的具有適當長度的合成DNA片段所代表的合適的DNA探針或cDNA或mRNA衍生化探針對基因庫進行篩選，而后在噬菌體λ或裝備型質粒(cosmid)中制備該基因庫。
通常情況下，該uPA編碼片段是由克降DNA經(jīng)部分SmaⅠ消化而獲得的7.3千對堿基的片段。這類DNA片段在以下的說明書及權利要求書中將被稱作“開放的閱讀框架”(ORF)，即指包括uPAmRNA的轉錄-轉譯單元的，可以被內含子隔斷的，最好包括5′及3′非轉譯區(qū)域或其與轉譯效率或mRNA穩(wěn)定性相關的部分的基因組DNA序列。ORF的較理想的例子為上述的被10個內含子隔斷的序列。
本發(fā)明的方法所采用的表達載體可為用轉染真核細胞特別是哺乳動物細胞的任何已知載體。然而，它們必須包含一個可以調節(jié)mRNA轉譯的序列，諸如，一個啟動區(qū)及多腺苷酸化的位點。有時，還包括復制的真核細胞源。特別是，啟動區(qū)域可以是已知的可用于動物細胞基因工程任何啟動子區(qū)域。異源啟動子可以取自哺乳動物細胞的病毒，諸如還原病毒(例如RSV)、SV40(早晚可行)及腺病毒(早晚可行)。另一方面，采用動物或人類來源可調節(jié)的啟動區(qū)，通過物理、化學或生物學誘導物對之誘導使轉錄超過一般的水平。這些可調節(jié)的啟動子取自于小鼠或人類。金屬硫因(metallothioneins)Ⅰ及Ⅱ。
熱震蕩(heatshock)蛋白質等等，可參閱諸如Hamer等著《真核病毒載體》Y.Gluzman出版，1983，7-12，Mayo等著《細胞》(cell)29，99-108(1982)及Korin等著《自然》(Nature)，308，513-519(1984)。
除那些可調節(jié)啟動子之外，還發(fā)現(xiàn)人類uPA啟動子區(qū)域或其衍生物，在哺乳動物細胞中，可用作有效的啟動子來表達處于其控制之下的基因。該人類的uPA啟動區(qū)域，系借助SmaⅠ消化而取自于人類基因庫(見上文)，并且包括人類uPA基因上的大約自-2353堿基對至大約+29堿基對之間的大約2.38千對堿基。不僅該“天然”人類uPA啟動子可用于在合適的哺乳動物細胞系統(tǒng)中進行基因表達，而且按照本發(fā)明，由缺失、插入、取代或混碼(shuffling)而得到的保持或甚而至于具有更佳的調節(jié)功能的其它任何衍生物也可適用。尤其是uPA啟動子區(qū)域的缺失衍生物，至少在某些例子中是被優(yōu)先采用的。取得缺失衍生物的代表性的例子，系用OxaNⅠ或EcoRⅤ處理uPA啟動子之后，接著將所獲片段連接起來。具體而言，如用OxaNⅠ消化所得的缺失衍生物失去了大約在-1827堿基對至大約-1202堿基對之間的0.6干對堿基片段(其中+1為uPAmRNA中轉錄的第一個堿基)，而如用OxaNⅠ及EcoRⅤ進行消化，所得衍生物失去了自大約-1827堿基對至-537堿基對之間的1.29千堿基對片段?，F(xiàn)已證實，即使與公認為很有效的啟動子系統(tǒng)的，諸如RSV等常用病毒啟動子，如采用uPA啟動子缺失衍生物則具有引導調節(jié)基因的表達，以得到相近的甚或比一般病毒啟動子有更高的產(chǎn)量。作為多腺苷酸作用位點，已知的任何一種均可適用，諸如對uPA基因為天然的與啟動子區(qū)域相聯(lián)結的，或取自于真核細胞或病毒的。一旦含有啟動子、轉錄起始子及(通常含有的)多聯(lián)結子的表達盒制備好之后，所選的基因序列便可插入使之轉化入動物細胞中。
一般而言，將上述各個部分相接起來的順序并不是不可更動的，從而使得在該基因的插入過程之前，側翼區(qū)域可先與包括選擇性標記或其它區(qū)域，諸如強化因子、轉錄調節(jié)區(qū)域之類的復制系統(tǒng)相結合。將這些片段連接到一塊的方式，取決于許多因素，如組建的難易、限制性位點的選擇、各個片段獲取的可行性等等，然而，所有這些均是本技術領域人員有能力作出選擇的。
復制系統(tǒng)的選擇，在某種程度上講取決于究竟需要穩(wěn)定的表達，還是過渡性的表達。對于過渡性表達，基于含有一個復制源的病毒序列，(諸如SV40)，的游離基因元件被采用。對于穩(wěn)定的表達，則采用其它的游離基因元件(例如，基于牛乳頭瘤病毒的載體)或所有程序集中于基因組中的序列。許多這樣的病毒序列已經(jīng)被連接至可選擇的標記中，諸如基因gpt、neo及dhfr。這些標記可用于對含載體的細胞的選擇，其中一些則可用于整合的外源序列的放大作用。
為了盡可能增進所需物質的生產(chǎn)，可通過向細胞作共轉化而方便地實現(xiàn)，即首先轉化含GASGA表達盒的組建，而后組建第二個含選擇標記的獨立的結構。另一方面，可以通過制備一個銜接結構來放大基因，在其中GASGA盒與諸如dhfr或金屬硫因等基因的表達盒。宿主細胞為用GASGA表達載體轉化后，產(chǎn)生可回收數(shù)量的GASGA的任何動物細胞，優(yōu)先采用哺乳動物或禽類的細胞。這些細胞的例子(其中顯然包括人類細胞)，包括那些在轉化之前能夠或不能夠產(chǎn)生可回收數(shù)量的pro-uPA的已知的及已建立的細胞系，諸如LB6(一種自親代L細胞衍化的小鼠成纖維的細胞的(fibroblastoid)細胞系(CorsaroC.M.及PearsonL.M.等著，《促進DNA媒介基因在哺乳動物中的轉化》、《體細胞遺傳》(Somaticcellgenetics)7，603-616，1981);CHO(中國倉鼠卵巢)(KaoF.T.，PuckF.等著，Proc.Natl.Acad.Sci.，60，1275-1281，1968)及人類表皮癌細胞系A431(FabricantR.N.，DeLarcoJ.E.，及TodaroG.F.等著《培養(yǎng)的人類黑瘤上的神經(jīng)生長因子受體》，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，565-569，1977)。上述的頭兩個細胞系(LB6及CHO)不產(chǎn)生Pro-uPA，而最后提到的那個(A431)則能?？墒?，一般地講，已建立的細胞系，諸如CHO、COS、LTK、Hela及CN-1均可適用于本發(fā)明的方法。
對產(chǎn)生GASGA的單層CHO細胞系的反復再克隆，可從培養(yǎng)基中分離出保持了產(chǎn)生uPA能力而同時又具有在懸濁液中進行自我復制能力的衍化細胞系。由于易于培養(yǎng)并且在每次發(fā)酵物中的單位產(chǎn)率較高，因而對本技術領域中人員這類細胞系的優(yōu)點是顯而易見的。本發(fā)明的一個較理想的實施例，是這些能產(chǎn)生GASGA的CHO細胞能在在培養(yǎng)基懸浮液中生長?？捎萌魏螒T常的方式將表達載體引入宿主細胞中，例如用微注射、DEAE-葡聚糖媒介轉染、磷酸鈣沉淀的DNA轉染及電極化處理(electroporation)(參見BonerjiJ.等著，(cell)《細胞》33，729-740(1983);GrahamF.L.及VanderEbA.J.著《病毒學》(Virology)52，456-467(1983)及PotterH.等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，7161-7165(1984))。轉染之后，使細胞生長合適的培養(yǎng)基中，諸如在(Dulbecco'smodifiedEagle)培養(yǎng)基(DMEM)中(其中含10%至20%失活胎牛血清，細胞可以穩(wěn)定地維持于其中，隨后將合適的選擇劑例如抗生素引入)。將選擇的細胞反復克隆，并用通常的測定法對它們的GASGAs產(chǎn)量進行測定，例如用血纖維蛋白裂解測定或免疫氨基裂解測定(IAA)。該測定法必須借助于不與蛋白質GFD發(fā)生專一性識別或連接的而對scu-PA及/或uPA具有專一性的單克隆抗體。適合的單克隆抗體為那些可識別uPAB-鏈而不識別A鏈的單克隆抗體，如以下文獻所描述。HerionP.等發(fā)表于《生物科學報導1》885-892(1981)，SalernoM.G.等著，Proc，Natl.Acad.Sci，USA，1984，81，110-114，或Kaltoft等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1982，79，3720-3723或MAB5B4(如Nolli等人在(Haemostas)(1986，56，214-218)所述，可與uPA的“Kringle”區(qū)域連續(xù)，而不與GFD區(qū)域連結)。
此后，將分離的產(chǎn)生GASGA的克隆進行大量培養(yǎng)以產(chǎn)生相當數(shù)量的GASGAs。在大量培養(yǎng)方面，本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例是以加入抑肽酶(aprotinin)為特征的。在原始培養(yǎng)基中，或在培養(yǎng)過程中加入這種物質的效果在于使pro-uPA的回收數(shù)量增多。普通采用的抑肽酶(aprotinin)的加入濃度為10-50IU/ml，而最好為20-25IU/ml。
根據(jù)引導序列是否保持以及產(chǎn)物是否可以分泌的區(qū)別，可區(qū)別采用連續(xù)或重復調換培養(yǎng)基的方法，并將GASGAs從培養(yǎng)基中分離。如果引導物喪失，且產(chǎn)物仍留在細胞內，細胞在豐獲后，被殺死并且溶胞而分離出該產(chǎn)物。常用的技術，諸如離子交換或親和層析、高效液相色譜及反相高效液相色譜可用于分離及純化操作中。合適的親和層析純化方法包括采用不與蛋白質GFD識別或結合的抗scu-PA或uPA的單克隆抗體，諸如與uPAB-鏈結合而不與A-鏈結合，或僅與A-鏈上“Kringle”區(qū)域結合(見上文)的單克隆抗體。可以方便地使用，HerionP.及BollenA.在《生物科學》(1983，3，373-379)上描述的免疫吸收劑，同樣也可采用MAB5B4(參見Nolli等人著作，見上文)。
一個方便地確證所獲化合物的確沒有與uPA GFD相結合的方法，是以采用免疫酰氨基裂解測定(參見Corti等著，《(Thromb·Heamostas)》(1986，56，407-410，及1.6.2)該方法采用不與包括GFD的蛋白質區(qū)域發(fā)生識別或結合的單克隆抗體(參見上文關于此類抗體的若干特例)，以區(qū)別于采用可與蛋白質區(qū)域(諸如MAB CD6或DC1，見下文詳述)相識別或相結合的單克隆抗體的免疫氨基裂解測定法。平行地或連續(xù)地進行。
具有該特殊性能的單克隆抗體可以按照應用合適的選擇方法的已知的細胞融合技術而制備。免疫劑可以為scuPA、tcu-PA、ATF或其混合物，可按以下的常用方法進行免疫操作?？乖惺荏w可為本技術所用的任何一種實驗動物，但其中優(yōu)先選用嚙齒動物，諸如，大鼠、小鼠或免子。用于與經(jīng)處理的動物脾藏細胞相融合的穩(wěn)定的細胞系，可以為任何一種已知的及易獲的細胞系，諸如，可優(yōu)先選用的腫瘤細胞系，例如，小鼠骨髓瘤NSO(P3/NS1/1Ag-4.1的亞系)(ATCC保藏號TIB18)。優(yōu)選的用所需特性對MABs進行選擇的探針，為分子量約為6，000的相應于uPA序列中大致跨躍自第4位的亮氨酸至位于第43位的谷氨酸殘基的，亦即相應于(為其相關部分或包括)uPA的所謂的GFD的氨基酸序列的一個肽片段(稱為F6)。這種片段是用可以切除與谷氨酸殘基相近的蛋白序列的酶，諸如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)衍化的蛋白酶V8，對ATF進行控制處理而獲得的。作為該選擇系統(tǒng)中的陰性對照物(positive control)，有時可以方便地再引入一個用V8處理ATF而得的片段，即稱為B11的分子量大致為11，000的，必定相應于uPA(Kringle)區(qū)域的片段，并且還可隨機地引入第三個片段，即由同一步驟中得到稱為F12的必須相應于uPA(Kringle)區(qū)域的但須切斷氨基酸52及53的片段。與片段F6也與uPA(scu PA及/或tcu PA)結合而不與(Kringle)區(qū)域(片段B11)或催化區(qū)域(B-鏈)相結合的MABs，例如利用諸如親和層析或離子交換層析，采納諸如免疫親和性或免疫斑吸等試驗而進一步提純并分離。從而獲得所需的對uPA GFD區(qū)域選擇性地識別或結合的特性。
為演示本發(fā)明的GASGAs衍生物不與uPA受體(諸如U937單細胞上受體;參見StoppelliMP等著，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，1985，82，4939-4943)相結合，可以用一種測定法來表演，該測定法包括，用本發(fā)明的GASGA衍生物取代uPA之后，重復本文所敘述的實驗，該物僅作為正對照而被引入本實施例。在該測定法中，EO系列的GASGAs衍生物結合力很低。一般低于uPA結合力的10%。
除采用U397單細胞之外，上述試驗還可以采用人類臍靜脈內皮細胞進行演示，(參見AjjarKA等著，J.Biol.Chem.1986，261，11656-11662)。
本發(fā)明化合物的體內活性，可通過對實驗動物進行的試驗來證實，諸如，對麻醉兔進行的凝血溶解試驗(參見CollenD.等著，J.Clin.Invest.1983，73，368-376)。
本發(fā)明的GASGAs衍生物因此可用以取代scu-PA或uPA而應用于采用溶解血栓等物質進行的治療應用中。為此，本發(fā)明化合物既可就此施用，然而最好按照本技術領域的已知技術配成配方后施用，參考書目諸如，瑞明頓氏(Remington's)PharmaceuticalScience《藥物科學》，第17版，麥克(Mack)出版有限公司出版于1985年。本發(fā)明GASGAs衍生物可用與目前的uPA或scu-PA相似的常用配方配制。
因而較為合適的治療用途為溶解血栓，可以在梗塞或栓塞發(fā)生的早期加以應用，諸如用于心臟梗塞、肺栓塞或外周動脈栓塞的治療。給藥途徑優(yōu)先選用靜脈注射，施用形式可以為濃縮藥團或用灌注的形式。如有必要，最好在以溶解血柱有效數(shù)量的本發(fā)明化合物通過靜脈注射藥團施藥后，再加一個比較短期的以較低劑量靜脈注射灌注施藥。每天的劑量因病人的年齡，身材及身體狀況而有很大的變動，然而一般的范圍為2-30毫克/每次，其中較佳為2-20毫克/每次，最佳為2-10毫克/每次。如本技術領域所公知，在此特定的治療領域，可由內科醫(yī)師根據(jù)具體的病例來決定合適的施用劑量及施用方案。
含有如已被描述過的uPA、scu-PA或t-PA的常用穩(wěn)定劑的劑量單元中，GASGAs含量范圍為每單元0.5-2毫克，相當于每單元含uPA為50，000-200，000國際單位。
用于配制于2毫升滅菌鹽水以供靜脈(e.v.)注射用的凍干藥物配方的例子如下所示GASGA-EO(凍干)1毫克甘露醇20毫克乙二胺四乙酸2毫克磷酸緩沖劑(適量)本發(fā)明的化合物可單獨給藥或與諸如肝素、阿司匹林等抗凝劑聯(lián)用，或與其他PA的其它任何形式，諸如scu-PA、uPA、t-PA或其修飾形式，諸如歐洲專利申請第231883及236040號所描述的鏈激酶或它們的混合物聯(lián)用。
附圖簡要說明以下附圖旨在進一步對本發(fā)明進行說明，說明書、權利要求書及參照附圖，主要用于說明而不對本發(fā)明的范圍產(chǎn)生限制。以下附圖的簡要說明為使附圖及作為本發(fā)明的整體更為易于理解。


圖1uPA基因、mRNA及蛋白質的結構。
由上至下-插入在噬菌體λ-uPA2中的uPA基因限制性圖譜;
-插入在噬菌體λ-uPAⅠ中的uPA基因限制性圖譜;
-uPA開放的閱讀框架(BaBamHⅠ;EⅠEcoRⅠ;SSmaⅠ;HIIIHindⅢ)的限制性圖譜;
-人類uPA基因外顯子/內含子結構黑框(blackboxes)不轉譯5′及3′區(qū)域;陰影框轉譯的外顯子;線條內含子;
-部分末拼結的cDNA克隆pHUK1的外顯子/內含子結構;
-外顯子及氨基酸在pro-uPAmRNA中的相應性;
-蛋白區(qū)域與pro-uPA中的氨基酸南嚶π浴 圖2RSV-uPA的組建將從λ-uPA1制得的含uPAmRNA的完全的ORF的SmaⅠDNA片段(參見該圖上部)插入框架中，該框架系通過用HindⅢ及HpaⅠ消化帶有細菌質粒功能及RSV的LTR的質粒RSV-Neo獲得的(見該圖左部)。RSV-uPA具有在啟動子控制下uPAORA，啟動子包含于RsVLTR之中，并且當插入適合的真核宿主時可以表達蛋白質(見該圖下部)。
圖3;GASGAs表達載體的組建詳細的限制性圖譜及外顯子/內含子結構A)人類uPAORF(框外顯子;線條內含子);
B)質粒RSVuPA中外顯子Ⅳ兩旁的區(qū)域的擴展部分，它顯示了如同相應的氨基酸一樣在兩個相鄰的外顯子中分裂開的密碼子中的核苷酸;
C)RSVuPAP＞S(左)及RSVuPAB＞X(右)中的如上所述的相同區(qū)域(圖3);
D)在RSVuPA-E0(左)及RSVuPA-E2(右)的ORF中的GFD區(qū)域的結構;嵌合質粒中的新的密碼子及創(chuàng)造的氨基酸示于圖譜之下;來自RSVuPAP＞S的外顯子稱為“Ⅰ”，而來自RSVuPAB＞X的稱為“2”。
圖4pBPV-230.8的限制性圖譜pBP322衍生物pML2dx被插入在BPV-1基因組的獨特的BamHⅠ位點(參見Saver等著，Mol，Cell.Biol.5，3507;1985)鄰近轉化區(qū)域的3′端的BamHⅠ位點被修飾為SalⅠ。
圖5人類uPA表達盒的組建質粒RSVuPA有兩個獨特的限制性位點，NdeⅠ及ApaⅠ，由XhoⅠ修飾，連接而獲得質粒p71。從后者，uPA表達盒(見該圖下部)可由XhoⅠ消化而獲得。適合于插入兩個XhoⅠ及/或SalⅠ位點的片段可以驅使人類uPA基因的轉錄。
圖6;在附加體的載體中RSV-uPA結構的插入質粒pBPV230.8經(jīng)通過置換BamHⅠ、HindⅢ及SalⅠ三個病毒位點中的一個，經(jīng)修飾而分別獲得pBB、pBH及pBS。每個衍生載體中的新的XhoⅠ位點用框線標出。因XhoⅠ連接子的插入及在pBB及pBS中的XhoⅠ位點的側翼連接而獲得的新的BamHⅠ及SalⅠ位點示于圖中。
在三個質粒中，RSV/uPA結構(見圖3)以兩個方向被插入XhoⅠ位點，得到以下質粒-pBBuPAa、pBHuPAa及pBSuPAa，其中uPA及BPVmRNAs在同樣意義下被轉錄。
-pBBuPAb、pBHuPAb及pBSuPAb，其中uPAmRNA及BPVmRNAs以相反的方向轉錄。
圖7在BPV衍化載體中的uPAORF的修飾表達uPA(A)、GASGA-E0(B)及GASGA-E2(C)的BVP衍生載體的操作步驟圖。上部所示的為pBPV230.8XhoⅠ衍生物，左部為貢獻出RSV/uPA盒(uPA表達盒)的RSV-Neo-衍化表達載體(圖7A)或分別由RSVuPA-E0及RSVuPA-E2衍化而得的BssHⅠ/SacⅠ片段(GASGAs表達載體，圖7B及C)。
圖8puPA2的結構質粒pEMBL8-CAT通過用載有細菌CAT基因的片段取代位于ClaⅠ及HindⅢ之間的片段，得到pEMBL8再經(jīng)衍生而得到(參見Dente等著，Nucl.Acid Res.，1645-1655;1983)。含有uPA啟動子的SmaⅠ片段被插入CAT基因上游而產(chǎn)生質粒pupA2，質粒pupA3(見該圖右部)在正確定向架上有啟動子。
圖9人類uPA啟動子的序列圖中顯示含有mRNA起始點、TATA框(box)及uPA啟動子的上游調節(jié)區(qū)域的來自于λ-uPA1噬菌體DNA的一段2.38千堿基對SmaⅠ片段的序列。如Riccio等人應用的引物延伸分析，圖譜中核苷酸+1相應于uPAmRNA中的第一個核苷酸。
圖10uPA啟動子的限制性圖譜及其衍生物表明其中的uPA啟動子已經(jīng)被修飾的區(qū)域的puPA2修飾質粒的限制性圖譜如圖所示;
-puPA2/41，其中啟動子的5′端的SmaⅠ位點轉化成為XhoⅠ;
-puPA2/17，其中位于兩個OxaNⅠ位點之間的區(qū)域已缺失;
-puPA2/254，其中位于5′OxaNⅠ位點及EcoRⅤ位點之間的區(qū)域已缺失。
圖11uPA啟動子衍生的載體圖11A描繪了質粒puPA2/41、puPA2/17及puPA2/254的限制性圖譜。
圖11B通過用SalⅠ/XbaⅠ消化而將CAT基因刪去及SalⅠ連接，而分別地從puPA2/41、pupA2/17及puPA/254得到pPP17及pPP254。
這些含有uPA啟動子(或其衍生物)、TATA框(box)及mRNA起始點的載體，可用于表達基因或cDNA，例如，在平頭端SmaⅠ位點或BamHⅠ位點將有MboⅠ、XhoⅡ、BglⅡ、BclⅠ及BamHⅠ端的片段插入其中來實現(xiàn)。這些結構可采用XhoⅠ及SalⅠ雙消化被切割。同樣的雙消化可用于切開啟動子結構，并將在基因或被表達的cDNA的另一個質粒5′端插入作為一個“表達盒”插入。
被填充的圓表示復制的質粒源。
圖11C描繪了質粒pPP41×S，pPP17×S及pPP254×S，系將-7.3千堿基對，并在質粒SMaⅠ位點上含有upAORF的SMaⅠ片段插入至pPP41，pPP17及pPP254而衍生得到的相應產(chǎn)物。
圖12小基因衍化的GASGAs表達載體的結構。
在uPAORF中刪去外顯子Ⅳ(pPPXS-EO，圖12B)或使之加倍(pPPXS-E2，圖12C)以使uPA表達載體(pPPXS，圖12A)修飾。
圖13uPA受體連接分析該圖顯示，當用GASGA-EO載體轉化的CHO細胞的培養(yǎng)上清液加入時，對125I-DFP-UK與U937細胞上的uPA受體的結合力的抑制作用。未標記的uPA用作正對照。
圖14RSVuPA-EO-49的結構RSV-uPA-EO-49是一表達載體它含有存在一個相當程度上與外顯子Ⅳ(即GFD的編碼區(qū)域)相應缺失部分的uPA ORF的表達載體(參見該圖右下方)。這是通過將含有質粒的大部分但缺少外顯子Ⅲ及Ⅳ(參見該圖右上方)的RSV-uPAB＞X片段與一個自內含子B的3′部分跨越至內含子C的5′部分的HindⅢ-SalⅠ質粒片段(見圖下部中央)相連結而獲得的。
上述的RSV-uPAB＞X片段通過用HindⅢ及XhoⅠ消化RSV-uPAB＞X(圖2)而獲得，而HindⅢ-SalⅠ片段(相當部分僅對應于外顯子Ⅲ)通過用HindⅢ消化一個用P71(見圖5)(其末端已被SalⅠ連接子修飾)經(jīng)PstⅠ消化而衍生的質粒片段而獲得。
圖15RSV-G-Asp的組建質粒RSV-G-Asp(見圖底部)，經(jīng)用ScaⅠ部分消化RSVuPA(見圖上部)而組建，并用Asp718連接子修飾末端，選擇合適的限制型式。該載體在位于譯碼(frame)之外的插入部份的下游具有uPAORF。
圖16RSVuPA-Tet的組建質粒pBR13Tet示于圖(d)的底部。這是通過用PstⅠ及HindⅢ消化，使pBR322中的大多數(shù)的氨芐青霉素抗性基因被刪去，并在把突出的末端切平之后使質粒重新循環(huán)。
將從該質粒(pBR13Tet見b)上取出的含有四環(huán)素抗性基因及復制源的NdeⅠ/PvuⅡ片段，與取自于RSVuPA(見C)含有RSV啟動子及人類uPA基因及其自身的多腺苷酸化位點(PAS)的NdeⅠ/HpaⅠ片段相連結。
圖17連接子修飾的RSVuPA-Tet衍生物組建用ScaⅠ消化使含有一個獨特的于uPA外顯子Ⅳ中含ScaⅠ位點的質粒RSVuPA-Tet(見圖的上方)成為線狀，并分別用Asp718連接子、ClaⅠ連接子及XhoⅠ連接子進行連接而使之修飾，分別得到稱為RSVuPA-Tet-Asp(底部左方)、稱為RSVuPA-Tet-Cla的質粒(底部中央)及稱為RSVuPA-Tet-XhoⅠ的質粒(底部右方)。這些質粒在已不位于讀碼(frame)中的插入部分的下游具有uPA編碼區(qū)域。
圖18DNA及打斷的GASGAs的氨基酸序列含有位于讀碼外的插入部分的下游的uPA編碼區(qū)域的質粒RSV-uPA-Tet-Asp、RSV-uPA-Tet-Cla、RSV-uPA-Tet-XhoⅠ，被分別地用專一于多連結子衍化位點的酶消化而修飾，使部分或全部地填補突出的末端，而重新恢復正確的閱讀框架、圖中也示出了接近于該修飾相關的DNA及氨基酸序列。
在豎行所稱“修飾位點”指起始質粒的修飾位點(例如，Asp718指用作起始材料以獲得圖中所示的修飾的質粒即RSV-uPA-Tet-Asp的獨特的位點，當部分填入時所得的修飾質粒稱為RSV-SAD，當全部填入時所得的修飾質粒稱為RSV-SVRTD)。該圖也示出由填入而引起的限制性位點。
實施例以下的各實施例皆以便于實施的方式對本發(fā)明作說明，而無意對其范圍加以限制。為了使以下各實施例便于理解，在各實施例(自1.1至1.6.5)之前的段落中，對基本以相同的方式用于不同實施例的技術及方法(諸如DNA酶修飾法、DNA沉淀、蛋白質提純等等)進行敘述。為了避免重復完全的步驟，在各個實施例中常常引用對應于已作過敘述的該段落。
1.1細胞可由商業(yè)途徑或科學團體或公認的保藏機構獲得。
1.2細胞生長在合適的培養(yǎng)基中，諸如，含有10%熱失活胎牛血清的Dubecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)。
1.3分子生物學上適用的培養(yǎng)基、緩沖液及溶液。
以能得到為前提，在其它的所有情況下，試劑為“DNA/RNA級”及“分析純級”。如不特別指明，細菌及噬菌體生長用的液態(tài)及固態(tài)培養(yǎng)劑、緩沖液及各種溶液均按ManiatisT.，F(xiàn)ritschE.F.，SambrookJ.，等編《冷泉港實驗室手冊-分子克隆》(1982年)中的方法制備、貯存及使用。如不作特別說明，也按上述同一參考書對玻璃器皿、塑料物品及五金工具制作、保存及使用。采用去離子/蒸餾水，如果用于酶緩沖液中需作熱壓處理。
1.4分子生物學上使用的酶限制性的核苷酸內切酶、DNA修飾酶及RNase均可以購買到。這些藥品是購自Boehringer、Bethesda研究實驗室(BRL)、Pharmacia;溶菌酶及牛血清白蛋白(BSA)同樣可買到。這里使用的溶菌酶購自Sigma，BSA及購自Boehringer。常用的緩沖劑溶液用于各個酶反應。它們的組成及制備為普通公知的，并可按照各個不同酶相關的信息方便地進行制備，制備物經(jīng)過濾滅菌后分成幾份于-20℃進行保藏。許多現(xiàn)用的緩沖劑也以濃縮液的形式購買到合成DNA連接子及t-RNA、鯡魚精DNA易于獲得。這里所用的合成DNA連接子購自P-LPharmacia或新英格蘭生物實驗室，而tRNA及鯡魚精DNA則購自Boehringer。
1.5.rDNA技術如在以下的各實施例中不作特別的說明，按照Maniatis等人所述的方式，并參照其中的原有參考來進行rDNA技術。
1.5.1限制性消化及DNA的酶修飾本領域中，單一及多次限制性消化及DNA酶修飾的操作已眾所周知，而對之所作的報導是普通可獲得的。在生產(chǎn)者的小冊子(manufacturers'booklets)以及Maniatis等人(第4章)所稱“熱失活”是指在70℃下維持10-15分鐘使酶失活，然后在室溫下放置該混合物10至15分鐘，并用Eppendorf離心機離心2分鐘。對限制性消化及酶DNA修飾的結果的檢測，擇優(yōu)在含0.5毫克/毫升溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的1%瓊脂糖凝膠上，在100伏電壓下電泳1-2小時來進行(也請參見Maniatis等人的文獻，第五章)1.5.2苯酚/氯仿抽提擇優(yōu)按Maniatis等人文獻中458頁所描述的方式用苯酚/氯仿從核酸水溶液中抽提蛋白質;當反應體積少于200毫升時對DNA進行“反抽提”。
1.5.3DNA沉淀DNA沉淀在進行時，最好加入0.1份的體積的3M乙酸鈉(pH5.2)及3份體積的乙醇(于-20℃)。僅當以下實施例指明時才加入20至40微克tRNA。將混合物在干冰/乙醇浴中放置15至30分鐘或在-20℃保持過夜，然后用Eppendorf微型離心機或Sorvall離心機以1000G在4℃下離心15分鐘。DNA沉淀物顆粒用70%乙醇洗一次，再立即用100%乙醇洗一次，最后在(Savant)真空離心機中干燥。
1.5.4-5′脫磷酸化作用5′DNA末端的脫磷酸化最好用購到的腓腸磷酸酯酶(CIP)(購自Boehringer)于37℃進行1小時。CIP用酚/氯仿抽提而除去，或加入最終濃度約為50mM的亞乙基雙(氧亞乙基次氮基)四乙酸(EGTA)，并在68℃下加熱45分鐘。
1.5.5DNA連結按本領域已知方式進行DNA連接。
可以方便地按照T4 DNA連接酶生產(chǎn)者的指導進行。當使用合成連接子時連接酶反應在8℃下進行，而在所有其它的情況下在14至16℃下進行。當鈍端DNA需要連接時，加入PEG1500或PEG4000至最終濃度為10%?？煞奖愕夭捎靡韵碌慕M成物的10×連結緩沖劑0.66M Tris-HCL pH7.6，50mM MgCl2，50mM二硫蘇糖醇，及5mMATP。
1.5.6DNA連結子最好采用連結子DNAs，磷酸化后按Maniatis等人于125-126頁中方法進行復核，并按392頁及其之后的方法使用的。激酶反應、連結作用及連接子單獨及被連結的DNA片段的限制性作用的檢測，是在2%瓊脂糖凝膠上使連結子電泳10至20分鐘，而在連結片段的情況下電泳1至2小時，并按Maniatis等人于172頁介紹的自動射線照相后目測DNA。
1.5.7制備型凝膠電泳制備型凝膠電泳最好在含有0.5微克/毫升的溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的1×TBE緩沖液(0.089MTris，0.089M硼酸及0.002MDTA，Maniatis等人，于156頁中介紹)的0.7%至0.8%瓊脂糖上進行。DNA先于25伏下電泳2小時，而后于50伏電壓下電泳16至20小時。用305mm紫外透射器使DNA片段顯現(xiàn)，將DNA帶切下用電洗脫系統(tǒng)(ISCO)在0.1XTBE(見上)于400伏下進行10至15分鐘電洗脫。用已制備的并經(jīng)低鹽緩沖液淋洗的(Elutip)-D柱(Schleicher&Schuell)，用高鹽緩沖液進行洗脫以純化DNA。典型的情況為，將含有0.2MNaCl、20mMTRIS-HClpH7.3-7.5(TRIS即2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇)及1.0mMEDTA用于柱的制備。該緩沖液也用于淋洗，而洗脫緩沖液含有1.0MNaCl，20mMTRIS-HClpH7.3-7.5，及1.0mMEDTA。最后按1.5.3的方法沉淀DNA。
1.5.8大腸桿菌的轉化大腸桿菌的轉化(參見HanahanD.，《用質粒轉化大腸桿菌的研究》，J.Mol.Biol.(1983)155557-580)最好根據(jù)本領域的技術(《生產(chǎn)者小冊子》亦對此作了概要說明)采用商業(yè)或其它形式得到的感受態(tài)細胞(諸如DH1、HD5或BRL的HB101菌株(Bethesda研究實驗室))來進行。當DNA片段欲插入一個不同的質粒時采納100微升(BRL)的草案，而當用DNA連接子改變限制性位點時則采納一個小規(guī)模的20微升(BRL)的草案。在沒有抗生素的情況下進行的保溫之后細胞在瓊脂LB平板上，鋪成平板。細胞在存在合適的抗生素的情況下鋪于瓊脂LB平板上(參見Maniatis等人的文獻，440-444頁)在37℃下保溫過夜。
1.5.9轉化細胞的篩選(miniprep分析)從DNA轉化的感受態(tài)大腸桿菌細胞的抗性菌落，最好通過把分離出來菌落在5毫升的LB及合適的抗生素(參見Maniatis等人文獻，440頁)存在下進行篩選，于37℃下生長過夜，并按Maniatis等人的報導(366-367頁)用沸騰法分析培養(yǎng)液的樣品(1.5毫升)?？梢苑奖愕夭捎靡韵碌母鞣N變動-反應體積放大1.5倍;
-大腸桿菌DH1及DH5菌株沸騰60秒;
-DNA沉淀在不加入鹽的情況下進行，加入1份體積的異丙醇，并把各個試管置于-20℃下20至25分鐘;
-分別用1毫升70%乙醇及1毫升100%乙醇洗滌沉淀DNA各一次;
-以10毫克/毫升的濃度加入無DNase的RNase，并在70℃將DNA培養(yǎng)20分鐘。
1.5.10質粒的大規(guī)模制備最好按Maniatis等人所述方法(第三章)進行質粒的大規(guī)模制備。最好采用堿性溶胞方法來重獲質粒DNA(參見Maniatis等人的方法，90-91頁)在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓氯化銫(CsCl)梯度中提純質粒DNA兩次，然后用異戊醇抽提該混合物，分離含DNA的水相，并對TEpH8進行透析(Maniatis等)并貯存在4℃。
1.6對所獲得GASGAs進行提純及定性1.6.1化學藥品采用的所用化學藥品要則廣泛地由商業(yè)途徑而得到，或從商業(yè)途徑可得到的產(chǎn)品方便地制得。以下列舉的為用于以下的實施例的若干化學藥品及其來源親和凝膠10(活化瓊脂糖)、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、考馬斯亮藍(均購自BioRad，Richmond，USA);CNBr-活化葡聚糖、用于低分子量蛋白質的電泳校正儀(均購自Pharmacia，Uppsala，Sweden)。兩性電解質(購自LKBAB，Bromma，Sweden);牛血清白蛋白(BSA)、ChonfractionV、豬胰蛋白酶、豬的血纖維蛋白溶酶、血纖維蛋白原Ⅰ級fractionⅠ型Ⅳ、苯甲脒(均購自SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO63178，USA);抑肽酶(aprotinin)(購自Bayer，Leverkusen)，GFR、糖肽酶F(購自BoehringerMannheimGmbH，F(xiàn)RG);S-2444(購自KabiAB，Stockolm，Sweden)。高分子量的尿激酶(HMW-uPA)及所謂的氨基末端片段(ATF)(均由LepetitResearchLaboratoriesSpAMilano，Italy)。Scu-PA(前uPA)大部分可按照以下的文獻所敘述的方法來制備，StumpD.C.，ThienpointM.，CollenD.，J.Biol.Chem.261，1267-1273，1986。A431scu-uPA可按CortiA.，NolliM.L.，SoffientiniA.在《血栓(Haemostas)》(1986)中的56，219-224頁中所描述的方法來制得。其余各種試劑為分析級產(chǎn)品(均購自MerckDarmstad，GFR或CarloErba，Italy)。
1.6.2-免疫學及活性測試血纖維蛋白水解測試是用血纖維蛋白平板法(參見AstrupT.，MullertzS.，著《用于測定血纖維蛋白水解活性的血纖維蛋白平板法》ArchBiochemBiophys1952，40∶346-351)。用尿激酶參考標準逐在每一測試值中進行校正?；钚杂孟鄬τ谧鳛槌跫墭藴实膰H參考制備，來測定其國際單位。sc-uPA(細胞產(chǎn)生的單鏈尿激酶)潛在的血纖維蛋白水解活性，在以下的活化之后進行測定用0.5M碳酸鈉緩沖液作為偶聯(lián)劑緩沖劑將血纖維蛋白溶酶(10毫克)與CNBr-活化葡聚糖(交聯(lián)瓊脂糖)(2.5毫升)偶聯(lián)。將以一份血纖維蛋白溶酶-瓊脂糖(0.9毫升)與十份0.15M氯化鈉、0.05M磷酸鈉緩沖液(pH7.4)配成的懸濁液混以sc-uPA樣品(0.1毫升)，然后于20℃下緩慢轉動1小時。在1000g下離心2分鐘除去血纖維蛋白溶酶-瓊脂糖，然后用血纖維蛋白平板測定法對上清液進行測定。
用Lowey的方法測定蛋白質的濃度(參見LowryO.，RosebroughH.，ParrA.，RandallR.，《用福林苯酚試劑械鞍字什舛ā罰琂.Biol.Chem.1951，193，265-275)。通過測定合成底物pyro-Glu-Gly-Arg-pNA，S-2444的水解速率來進行酰胺分解測定(ClaesonG.，F(xiàn)ribergerP.，KnosM.，ErikssonE.，《測定血漿中前激肽釋放酶、腺的激肽釋放酶(glandular)激肽釋放酶及尿激酶的方法》《(Haemostasis)》1978;7∶76-78)。按CortiA.，NolliML.，CassaniG.，等人描述的方法進行免疫吸收劑酰胺分解測定(IAA)。用一種新的免疫吸收劑酰胺分解測定法(IAA)(參見Thromb.Haemostas1986，56∶407-410)對單鏈及雙鏈的尿激酶型血纖維蛋白溶酶原激活劑進行區(qū)分檢測。該方法開發(fā)了利用兩種蛋白質的抗原及酶的性質，在分析中將免疫測定選擇性與酶活性的專一性結合起來。
在各自的測試中采用了兩種類型的單克隆抗體a)一個識別包括GFD區(qū)域的蛋白質區(qū)域，而不識別蛋白質的催化部分，或不識別(Kringle)(諸如MAB CD6或DC1)的單克隆抗體。
b)一個識別蛋白催化區(qū)域而不干擾酶的活性，并且不識別包括GF區(qū)(諸如在說明書的前面部分所述)的區(qū)域的單克隆抗體。
GASGAs與上述中的單克隆抗體的a點結合而不與MABs的b點結合，而與此相反，scuPA/tcuPA與兩種系列的MABs均結合。GASGAs、ATF及scuPA/tcuPA與識別Kringle的MABs(諸如MAB5B4)連接。
1.6.3反相FPLC用FPLC(快速蛋白質液相層析)系統(tǒng)(PharmaciaFineChemicals)進行反相層析，采用一個前-RPCHR5/10反相層析柱(大孔型、小顆粒的帶有C1/C8基團的二氧化硅)，洗脫用緩沖劑緩沖劑A，0.1%三氟乙酸水溶液，及緩沖劑B，0.1%三氟乙酸的乙腈溶液;洗脫方式100%A;洗脫20分鐘，以A中B的含量自0至60%的線性梯度洗脫65分鐘，100%B洗脫25分鐘;流速為0.3毫升/小時。
1.6.4電泳步驟按照LaemmliUK的方法(《在噬菌體T4的頭部組裝的過程中劈開結構蛋白質》Nature1970，227∶680-685)在凝膠板上進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。(可方便地采用1.5×120×150毫米的凝膠板)。聚集膠與分離凝膠分別含有3%及12.5%丙烯酰胺。用于分子量測定的商業(yè)途徑可以獲得的電泳儀的標記蛋白質(兩性電解質)在兩種凝膠中電泳。2-巰基乙醇被用作還原劑，考馬斯亮藍用于凝膠染色。當采用不同含量的丙烯酰胺凝膠時，常常在括號中注明。免疫斑點吸印法按已知技術進行(參見SalernoG.，VerdeP.，NolliML.，CortiA.，SzotsH.，MeoT.，JohnsonJ.，BullokS.，CassaniG.，BlasiF.，《用人類尿激酶單克隆抗體識別單鏈前尿激酶前體》，ProcNatlAcadSciUSA1984，&1∶110-114)采用純化的單克隆抗體，不識別或不給合含uPAGFD區(qū)諸如能識別uPAB-鏈而不識別A-鏈(參見Herion等人，在《生物科學報導1》，885-892頁(1981)，SalernoM.G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci，USA1984，81，110-114頁，或Kaltoft等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1982，79，3720-3723頁)或采用僅在“Kringle”區(qū)域諸如MAB5B4(見上文，Nolli等)與A鏈相結合的單克隆抗體。
1.6.5GASGAs的純化用與上述的將A431-uPA從A431腫瘤細胞上清液提純的同樣方法，用免疫層析及離子交換FPLC將GASGA從細胞培養(yǎng)上清液中提純(參見Corti A.，NolliM.L.，Soffientini A.，Cassani G.《來源于人類A431細胞的單鏈尿激酶類血纖維蛋白溶酶原激活劑(前尿激酶)，Throm Haemostas 1986;56219-224頁)。
將含1%聚乙二醇(PEG)6000的，0.15M氯化鈉及0.05M磷酸鈉的緩沖液(pH7.4)用于平衡負載有那些與uPAB一鏈結合而不與A鏈結合的單克隆抗體(諸如MABAAU2，見HerionP.及BollenA.《生物科學報導3》373-379頁，1983)的改變的瓊脂糖基質。
在4℃下以50毫升/小時的流速將2升細胞上清液上柱，隨后用平衡緩沖劑洗滌。用含1%PEG6000的1M氯化鈉及0.1M乙酸的混合液進行洗脫。對各組份用IAA法測試(見1.6.2)并收集那些含GASGA的組份，收集的各個組份的存在含量高低的分布，然后，采用經(jīng)0.05M乙酸鈉緩沖劑(pH4)預平衡的單SHR5/5柱(以具有窄小的顆粒大小分布范圍的珠狀樹脂為基的親水性強陽離子交換劑;帶電荷基團為-CH2SO3H)，通過FPLC(快速蛋白液相層析)系統(tǒng)(Pharmacia Fine Chemicals，Sweden)中進行的離子交換層析，使收集物進一步純化及濃縮。樣品通常用蒸餾水稀釋兩倍，使離子強度減弱后再上柱。當用平衡緩沖劑洗滌之后，以60毫升/小時的流速，用緩沖劑A(0.05M乙酸鈉緩沖劑，pH4)及緩沖劑B(1M氯化鈉，0.05乙酸鈉，pH5)混合物的鹽/pH線性梯度，自A中含B30%至70%(50分鐘)，然后100%B(20分鐘)對被結合的蛋白質進行洗脫。用免疫吸收劑一酰胺解測定法(IAA)(見1.6.2.)測定具有酶活性的GASGA及酶學上失活的血纖維蛋白溶酶可活化GASGA抗原的在細胞上清液中的含量。酶學上有活力的GASGA及酶學上無活力，可用血纖維蛋白溶酶原活化的GASGAs抗原可用免疫吸收一酰胺分解法(IAA)測定，酶學上有活力的GASGAs據(jù)測占最終產(chǎn)物的95%左右。GASGA的反相FPLC分析在280mm獲得一個單一的峰。
或者，上述步驟亦可用Corti等人敘述的方法(見上文)所制備葡聚糖-MAB5B4親和性基質上進行。純化效力與上面報導的相似。
實施例EO人類基因庫用本領域已知技術(參見P.H.Hieter等Cell，Vol.22，197-207(1980)及Maniatis等)制備噬菌體入(Charon)28中的人類基因組DNA庫。將重組體入溶解產(chǎn)物在大腸桿菌K12株LE392上滴定(Maniatis等，504頁)。噬菌體滴定技術，如同用缺口轉譯探針篩選噬菌體庫技術一樣，在本技術領域中已為人熟知(Maniatis等)，在本發(fā)明中大量地應用于下面的實驗中。在篩選時，將10微升溶解產(chǎn)物的一千倍稀釋液吸附于0.3毫升濃縮2.5倍的10mM Mg SO4中的大腸桿菌K12LE392培養(yǎng)液上，然后在37℃下保溫20分鐘。加入7ml 0.7%瓊脂糖，并將所有的混合物平鋪在含NZYMC瓊脂的150毫米的塑料平板上。(見Maniatis等人的方法)。總共采用0.41毫升溶解產(chǎn)物的一千倍稀釋液，共用了41塊板。保溫一天之后，每塊板平均顯現(xiàn)出1.5×104個噬菌斑。作為一個良好的例子，在41塊板上總共觀察到6×105個噬菌斑。
將從每塊板上取下的噬菌斑轉移至兩個硝基纖維素過濾片上(Schleicher及SchuellCo.)將過濾片干燥、洗滌后在真空中烘焙，然后按所述方式(見Maniatis等)進行預雜交。用分離自人類尿激酶cDNA的DNA片段組成的缺口轉譯探針進行雜交(VerdeA.等，.Proc，Natl.Acad.Sci.，81，4727-4731，1984)。
E0.1-缺口轉譯質粒pHUK-I(Verde等.，Proc.Natl，Acad.Sci.81，4727-4731，1984)含有與人類尿激酶mRNA互補的重組插入體。用限制性核酸內切酶Pst-Ⅰ處理以切下大約1.5千對堿基的片段，用瓊脂糖凝膠電泳進行分離，切下相應的凝膠區(qū)域，然后用電洗脫(參見1.5.7)重獲該DNA片段。該1.5千對堿基的PstⅠ片段含有人類尿激酶mRNA(Verde等.，Proc.Natl.Acad.Sci.，81，4727-4731，1984)的大約75%的編碼區(qū)域。該PstⅠ片段(5.0毫克)的統(tǒng)一標記是在每個α32P-dCTP及α32P-dGTP(參見Maniatis等人方法)有200微居理(microCi)存在的情況下，用Bethesda研究實驗室出品的缺口轉譯儀來進行的。標記DNA的產(chǎn)率為1.8-2.9×108cpm/mg。
E0.2-uPA基因陽性(positive)噬菌體的分離用缺口轉譯Pst-Ⅰ片段對、41對過濾片進行雜交。在一個有大約為108cpm的標記DNA的塑料殼中，將8個過濾片組成的各個組在40毫升雜交溶液中進行雜交。雜交是在2×SSC、0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)(Maniatis等)中，在42℃溫度下，在17個小時的時期內進行的。過濾片在15分鐘內，室溫下，于2×SSC、0.1%SDS中洗滌四次，然后在68℃下，在2小時內于1×SSC、0.1%SDS中洗滌一次。干燥之后，過濾片暴露于X射線膠片(Kodak)達12至24小時，隨后沖洗。在篩選中，將在兩個復制過濾片(三個)的識別位點上被發(fā)現(xiàn)給出一個正的雜交點的噬菌斑將噬菌斑用小體積的NZYMC肉湯(Maniatis等)取出，并在不同的稀釋度下，用于感染大腸桿菌K12L392，并播在10厘米的NZYMC-瓊脂板上。選出顯現(xiàn)500至5000個噬菌斑的平板，并進行再篩選。這些噬菌斑被轉移至兩塊硝基纖維素濾片(Schleicher及Schuell Co.)上，并用上述的人類uPA cDNA的缺口轉譯的1.5千對堿基的Pst-Ⅰ片段處理并雜交。結果所有噬菌斑都顯出一個正的雜交信號，富集倍數(shù)為105左右。從三個正噬菌斑中分離的單噬菌斑分離物稱為λ-uPA-1。λ-uPA-2及λ-uPA-3。
E0.3-大規(guī)模噬菌體制備用大規(guī)模的培養(yǎng)溶解產(chǎn)物，將噬菌斑在大腸桿菌K12LE392上進行放大，噬菌體通過在氯化銫中反復進行分帶而分離，先后用含酚的水相及氯仿/異戊醇(24∶1)進行抽提而提純，并按照Maniatis等人于第3章中敘述的方法使DNA自水相中用乙醇沉淀出來。
實施例E1uPA-編碼基因在哺乳動物細胞中的表達E1.1-uPAORF的分離將200微克基本上按E0.3的方法得到的λ-uPA1，在25℃下用80微升含30單位的SmaⅠ消化1小時;用EDTA(最終濃度為50mM)中止反應，并使用一個10厘米的刷子(Comb)于100伏電壓下，在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的0.8%瓊脂糖凝膠上對DNA進行電泳。然后，在紫外線下對凝膠進行分析，將走速為第二慢的含有大約為7.3千對堿基的人類uPA基因的開放的閱讀框架(ORF)的區(qū)帶從凝膠上切下。按1.5.7敘述的方法將所含的DNA進行電洗脫而提純。
E1.2-載體DNA的制備含RSV啟動子RSV-neo衍化片段及pBR322衍化的對芐氨青霉素抗性及復制源通過HindⅢ消化、充填(fillingin)、HpaⅠ消化、CIP處理及在瓊脂糖凝膠上進行片段分離而制備。
以下對RSV-neo載體的修飾作更具體地敘述(見圖2)E1.2.1-HindⅢ消化在37℃下于1小時內用200微升單位的HindⅢ對20微克RSV-neo質粒DNA進行完全消化。限制性酶熱失活后，用等體積的酚∶氯仿對混合液進行抽提，DNA的沉淀也是通過50微克tRNA(1.5.3)進行的，隨后使之重新溶解于20微升TE(Maniatis等)。
E1.2.2-充填(Fillingin)及HpaⅠ消化以上制備的打開的載體的突出的末端，在37℃下，通過將DNA與25毫升含1單位的DNA聚合酶的(Klenow)片段共同保溫1小時(Maniatis等，113頁)而使之變平，并按1.5.2及1.5.3所述方法進行提純。接著，在37℃下，用40毫升80單位的HpaⅠ在1小時之內將線性的鈍端載體DNA劈開，隨后用相同的方式進行提純。這些操作劈去新霉素抗性基因，留下了含有復制源及自質粒pBR322衍化而獲的芐氨青霉素抗性基因(見圖2)的，具有自啟動子至聚腺苷酸化位點之間有開口的RSV-LTR的具有平齊的末端的3.5千對堿基長度的DNA線性片段。
E1.2.3-CIP處理用1.5單位在50微升反應基質(最終體積)中的腓腸磷酸脂酶(CIP)處理DNA，以從DNA末端上除去5′磷酸鹽殘基;然后加入亞乙基雙(氧亞乙基次氮基)四乙酸(EGTA)(最終濃度為10mM)并在68℃下進行處理(見1.5.4)，使酶失活。
E1.2.4-片段純化用如1.5.7所述的0.6%瓊脂糖制備型凝膠分離DNA片段。將含3.5千對堿基片段的色帶的那部分凝膠切下，對DNA片段進行電洗脫(1.5.7)，將獲得的混合物調至合適的鹽濃度，并用(Elutip-D)柱(Schleicher及SchuellCo.)進行提純。洗脫之后，將乙醇、乙酸鈉、及載運子tRNA加入DNA溶液中，按1.5.3所述方法使DNA沉淀并使之重新溶解于20微升TE中。
E1.3-受控于RSV-LTR啟動子下的uPA基因的克隆將3單位的T4DNA連結酶及2.5微升10×緩沖劑(Maniatis等，246頁)加至3微克脫磷酸化DNA載體(按上述E1.2方法制備)及7.5微克7.3千對堿基的uPA片段(如上述E1.1所述方法制備)。將25微升反應混合物于14℃保溫16小時(見1.5.5)，并用于轉化100微升HB101大腸桿菌感受態(tài)細胞(見1.5.8)。于37℃下，在含有50毫克/毫升的芐氨青霉素的LB瓊脂平板上對細菌進行過夜培養(yǎng)篩選。將被分離的菌落挑出，生長于5毫升含芐氨青霉素的LB上，并按微型制劑(miniprep)分析法(1.5.9)進行操作。對提純的質粒DNAs的限制性類型進行研究以確定載體譯碼中uPA基因的正確定向。這些質粒中其中具有正確定向的一個稱為RSV-uPA，經(jīng)分離后被用于接下的實施例(圖2)。
E1.4.1-轉染以上所獲之RSP-uPA被用于轉染哺乳動物細胞。所用的該方法將在涉及用GASGAs載體進行轉染的實施例2中更為詳細地加以提供。
E.1.4.2-大量培養(yǎng)為最大程度生產(chǎn)以上所得的轉化細胞，進一步進行再克隆并按實施例2的相應段落所報導的技術在較大的發(fā)醇罐中進行大量培養(yǎng)。
E1.5-uPA的定量上述的培養(yǎng)細胞系的uPA的產(chǎn)量，可直接地在以上獲得的G418抗性克隆上進行定量，或者照該技術領域中已知的方法通過將一系列不同稀釋度的G418抗性細胞的上清液點在酪蛋白/瓊脂糖/血纖維蛋白溶酶原平板上，在遇到單鏈的情況下，經(jīng)纖維蛋白溶酶原活化測定pA的輻射狀的擴散度。
含酪蛋白/瓊脂糖/血纖維蛋白溶原的瓊脂凝膠基本上按SchumakerGFB及SchillW.B.在anal.Biochem.48，9，1972及BjevumOJ等在QuantitativeImmunoelectro-phresis，Scandi-navianJ.Immunoi.Suppl2，N.H.Axelsened.，AasandWahlOslo，1975，82-83所述的方法，另外，生產(chǎn)可用IAA法測定(見1.6.2)對應于單鏈形式的活化雙鏈uPA的分析可用IAA(見1.6.2)實施例2GASGAs表達載體的組建為獲得表達EO或E2GASGAs的轉錄單元，我們通過插入一個獨特位點于內含子C(位于外顯子Ⅳ的5′處，含有類EGF區(qū)域編碼的絕大部分)或在內含子D(位于外顯子Ⅳ的3′處)(圖3B)而改變質粒RSVuPA(見E.1.1.3)。獲得的質粒，RSVuPAP＞S及RSVuPAB＞X(圖3C)，通過外顯子改組(Shuffling)，用于致變人類uPAORF，而獲得兩個GASGAs表達載體(圖3D)RSVuPA-EO，其中含外顯子Ⅳ的類EGF區(qū)域被刪去;
RSVuPA-E2，其中外顯子Ⅳ被重復。
E2.1-RSVuPAB＞X的組建在37℃下，用12.5微升(最終體積)分別含10至0.12酶單位的BglⅡ緩沖液，分別在各自的反應容器中在30分鐘內部分消化5微克RSVuPADNA，從而尋找最為合適的反應條件。將反應試管置于干冰/乙醇浴中，加入EDTA至10mM(最終濃度)，最后在70℃下加熱20分鐘以使酶失活。在微型凝膠上對每一試管中的樣品進行分析。當用3.33單位及1.11單位的酶進行消化時發(fā)現(xiàn)良好的結果。
選擇這些反應條件并應用于5微克RSV-uPADNA。在37℃下，于15分鐘內，存在20微升(最終體積)dNTPs(最終濃度各為1mM)的條件下，用2單位T4 DNA聚合酶將由此得到的5′突出末端分別充填(fill in)。然后，在70℃下加熱20分鐘使聚合酶失活。加入2微克磷酸化XhoⅠ連接子，并且在8℃下，于含有10%PEG1500及1個單位的T4 DNA連接酶的80微升緩沖劑(最終體積)中，在16小時內使之與質粒連接。熱失活之后，加入8毫升XhoⅠ緩沖液、1微升XhoⅠ(含80單位)及11微升水，并在37℃下對DNA消化3小時。然后使酶加熱失活，使DNA沉淀，隨之重新懸浮于5微升TE中，在15℃下用50微升緩沖劑中所含的1單位的T4 DNA連接酶，用3小時使之連接。用2.5微升該混合物用于轉化大腸桿菌HB101感受態(tài)細胞，用微型制備分析(1.5.9)對芐氨青霉素抗性菌落進行篩選。一個含有位于外顯子Ⅳ及Ⅴ之間的轉化成一個獨特的XhoⅠ位點的BglⅡ位點(該修飾的DNA片段如圖3C右部所示)的質粒被分離，并稱為RSVuPAB＞X(以下亦稱為pB＞X)。
E2.2-RSVuPAP＞S的組建用PstⅠ部分消化RSVuPA而獲得質粒RSVuPAP＞X。限制性條件大約為，在37℃下1小時之后留下50%DNA未劈開，隨后將之放大至50微克/50微升消化(0.0625單位/微克)，在DNA沉淀之后，在37℃下，50毫升(最終體積)溶液中在10分鐘內用2單位T4 DNA聚合酶使5′突出末端鈍化。然后，加入5毫克磷酸化SalⅠ連接子DNA，用2單位T4 DNA連接酶及10%PEG1500于100微升(最終體積)體積中，用16小時進行連接。連接酶被熱滅活后，在37℃下，于3小時內，用80單位SalⅠ對DNA進行消化(最終的緩沖劑體積為300微升)。最后將所獲DNA對0.75%瓊脂糖凝膠進行上柱，并用未消化的及線性質粒DNAs(各為500微克)作為對比。含與線性標記物接近的區(qū)帶的部分凝膠被切下，進行電洗脫并提純(1.5.7)，然后使之重新懸浮于5毫升TE中，隨后于15℃下，在10毫升體積中，在4小時內用2單位T4 DNA連接酶(見Mania-tis等)使之自我連接。用2.5微升對大腸桿菌HB101感受態(tài)細胞進行轉化，用微型制備分析(1.5.9)對芐氨青霉素抗性菌落進行篩選。含有位于外顯子Ⅲ及Ⅳ(該修飾片段示于圖3C的左部)之間的PstⅠ位點上的獨特SalⅠ位點的質粒被分離，稱為質粒RSVu PAP＞S，以下亦稱為pP＞S。
E2.3-自RSVuPAB＞X制備NdeⅠ/XhoⅠDNA片段在37℃下，在3小時內用40微升(最終體積)內所含的40單位NdeⅠ對15微克RSVuPAB＞XDNA進行完全消化。加入5微升含1單位CIP的10X緩沖劑(Maniatis等)的水溶液，使體積增加至50微升。在37℃下用60分鐘進行DNA脫磷酸化，用酚∶氯仿抽提一次，沉淀后重新使之懸浮于20毫升TE(見Maniatis等)中。用25微升40單位的XhoⅠ對線性質粒進行完全消化，并在0.75%的制備型膠上分離法(1.5.7)。分離形成的兩個區(qū)帶，按1.5.7所述方法進行電洗脫及提純，然后重新懸浮于5微升TE中。
E2.4-自RSVuPAP＞S制備NdeⅠ/SalⅠDNA片段在37℃于60分鐘內(40微升，最終體積)用40單位SalⅠ使15微克RSVuPAP＞SDNA消化至完全。加入5微升含1單位CIP的10X緩沖劑的水溶液使反應體積增至50微升，在37℃下于60分鐘內使DNA脫磷酸化，按以前的段落所述進行提純，在37℃在5小時內，用25微升40單位的NdeⅠ使之消化完全，隨后按1.5.7的方法將獲得的DNA片段分離并提純。
E2.5-RSVuPA-EO的組建將1微克以上所得的來自RSVu PAP＞S的1.7千堿基對的NdeⅠ/SalⅠ片段與2.5微克來自RSVuPAB＞X的8.6千堿基對的XhoⅠ/NdeⅠ片段，于15℃下，在20毫升2單位連接酶中連接16小時。用5微升該混合物轉化大腸桿菌HB101感受態(tài)細胞，在這些芐氨青霉素抗性克隆中分離出RSVuPA-EO質粒，其中uPA外顯子Ⅳ，經(jīng)內含子C及D融合而被刪去，且其中經(jīng)相對于Ser9及Asp45的密碼子的殘基堿基對的融合而產(chǎn)生的一個酪氨酸單元被插入至Pro8及Lys46之間(見圖3D，左部)。
E2.6-RSVuPA-E2的組建將1毫克來自RSVuPAB＞X的2.2千堿基對的NdeⅠ/XhoⅠ片段與2毫克來自RSVuPAP＞S的9.1千堿基對的SalⅠ/NdeⅠ片段在15℃下，加入20微升2單位連接酶進行保溫，使之相連接。用微型制備劑分析對用5毫升該混合物轉化大腸桿菌HB101感受態(tài)細胞而得的芐氨青霉素抗性菌落進行篩選，以分離質粒RSVuPA-E2(其中外顯子Ⅳ及側接內含子部分被重復，且兩個類EGF區(qū)域被融合密碼子而產(chǎn)生的一個蘇氨酸相連接(圖3D，左部))。
E2.7另一種組建RSVuPA-EO的方法另一種組建RSVuPA-EO的方法是先用HindⅢ和HhoⅠ對RSVuPAB＞X之類的質粒進行兩次消化，以從該質粒中截取外顯子Ⅲ和Ⅳ;然后用僅僅包含外顯子Ⅲ的HindⅢ-PstⅠ片段取而代之，其中PstⅠ位點被合適地修飾，而聯(lián)結到XhoⅠ的末端(參見圖14)。簡言之，275個堿基對的片段通過下列步驟從質粒p71(圖5)中得到(1)PstⅠ的完全消化;
(2)用T4DNA聚合酶修飾其末端，并加入SalⅠ聯(lián)結子;
(3)經(jīng)HindⅢ消化和CIP處理后，再用SalⅠ消化;
(4)對片段進行凝膠提純。
該片段通過下述步驟插入從RSVuPAB＞X所得的載體中;
(1)XhoⅠ消化和CIP處理;
(2)HindⅢ消化;
(3)凝膠提純。
E2.7.1含有外顯子Ⅲ的275個堿基對片段的制備在37℃下，400微克質粒p71在350微升緩沖液(參見1.5.1)中用800單位的PstⅠ消化1小時，然后萃取和沉淀出DNA部分(參見1.5.2和1.5.3)。分離出0.69千對堿基片段，并在1.2%瓊脂糖制備型凝膠上進行提純(參見1.5.7)。在37℃下，該片段用T4DNA聚合酶處理45分鐘，然后對酶進行熱滅活，并將反應條件調節(jié)至在100微升中進行CIP處理的狀態(tài)(參見1.5.4)，接著用11單位的CIP在37℃下對DNA進行30分鐘的脫磷酸化處理后，再依次對其進行萃取和沉淀，并在12℃的溫度下，將其聯(lián)結到SalⅠ8個鏈節(jié)的聯(lián)結子上，處理時間為16小時。此后，在37℃下，DNA部分在200微升緩沖液中用400單位HindⅢ進行HindⅡ消化，時間為30分鐘。然后再加入50單位的酶，使反應再繼續(xù)進行30分鐘。接著，對酶進行熱滅活，并將反應條件調節(jié)至在含有11單位CIP的400毫升緩沖液中的CIP狀態(tài)后，對DNA在37℃下進行90分鐘的脫磷酸化處理。最后，在37℃下，用含有180單位SalⅠ的200微升緩沖液(最終體積)對DNA消化16小時，所得的275堿基對DNA片段在2%瓊脂糖凝膠上進行分離和提純。
E.2.7.2 從RSVuPAB＞X中制備XhoⅠ-HindⅢ片段在37℃溫度下，50微克RSVuPAB＞X質粒在350微升緩沖液中用200單位的XhoⅠ消化2小時30分鐘(參見1.5.1)，然后在同樣溫度下，在800微升緩沖液中用11單位的CIP進行30分鐘脫磷酸化處理，接著再在50℃下處理60分鐘(參見1.5.4)，最后，經(jīng)萃取和沉淀(參見1.5.2和1.5.3)后，用HindⅢ在37℃下，充分消化1小時。所形成的9.9千對堿基DNA片段用0.8%制備型瓊脂糖凝膠法(參見1.5.7)進行分離和提純。
E2.7.3RSVuPA-EO-49的組建按E2.7.1中所述方法制備得到的275個堿基對片段，與按E2.7.2中所述方法制備得到的載體DNA，兩者以2∶1的摩爾比，在不同濃度(分別約為600毫微克/毫升和60毫微克/毫升)下進行混合，接著在16℃的溫度下，用5單位的T4DNA連接酶在100微升溶液中連接65小時，然后使DNA部分沉淀析出，并使之再懸浮在20微升水中。從上述溶液中取出等分試樣，用于轉化大腸桿菌DH5感受態(tài)細胞(參見1.5.8)。通過微量制劑(minprep)分析，從耐氨芐青霉素的菌落中選出一種具有預期限制圖譜的菌落，稱之為RSVuPA-EO-49(參見圖14)。
E2.8GASGAs在哺乳動物細胞中的表達用磷酸鈣沉淀技術使GASGAs表達載體在小鼠LB6細胞中轉染，并通過下述方法分析產(chǎn)生GASGAs的克隆(1)酪蛋白溶解測定法(參見Piperno-GranelliandReich，J.Exp.Med.148∶223-234，1987)，以選出產(chǎn)生PA的克隆，并定量測定在培養(yǎng)基中選出的PA的量;
(2)血纖維蛋白平板法(參見AstrupT.，MullertzS.，Arch.Biochem.Bhiphys.1952，40，346-351);
(3)IAA法(參見1.6.2)，以確定單鏈PAs與活化的雙鏈PAs的相對量;
(4)受體結合測定法(參見M.P.Stoppelliet.al.，Proc.Nath.Acad.Sci.USA，82，4939-4943，1985)，以驗證GASGAs與U937細胞上的uPA相結合的能力，所說的uPA受體被認為與內冬孢子(endotelial)uPA受體相同或非常相似。
E2.8.1GASGAs表達載體的轉化轉化前一天，在補充以青霉素(50單位/毫升)、鏈霉素(50微克/毫升)、2mM谷氨酰胺、和10%熱滅活的小牛胎血清(FCS)的Dulbecco改性Eagle培養(yǎng)基(DMEM，F(xiàn)low Laboratories Inc.出品)中，將細胞(murine LB6，參見“Corsaro C.M.and Pearson L.M.in Somatic Cell Genetics，7，603，1981)以約104微升/平方厘米的濃度鋪展成平板。此后基本上采用磷酸鈣-DNA共沉淀法進行轉染(Graham and Van der Eb，Virology 52，456，1983)。通過將DNA(在這一情況下，是由GASGAs表達載體(參見上文)和RSV-Neo(參見E1.2)以大致為1∶1的比例混合而成)在2MCo Cl(0.25毫升，系最終體積)中的溶液加到2X HBS緩沖液(137mM NaCl、0.7mM Na2HPO4、21mM HEPES、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸，pH7.1，共計0.25毫升]中，以制備磷酸鈣DNA沉淀。然后將此DNA共沉淀混合物加到上述細胞中。在37℃下停留3小時，從細胞中移去沉淀物，用DMEM(不含小牛胎血清)對細胞洗滌二次，接著加入1.5毫升的15%丙三醇的HBS溶液，再將細胞在37℃下培養(yǎng)1-2分鐘后，用DMEM(不含小牛胎血清)洗滌，以除去丙三醇。此后，用全部DMEM(參見上文有關細胞培養(yǎng)的內容)供以細胞養(yǎng)分，并在37℃下放置約48小時，經(jīng)非常溫和的胰酶消化后，涂敷在平板上，其濃度為每塊平板上含有105個細胞(置于含有下列成分的介質中，即DMEM，10%熱滅活的ECS，50單位/毫升的青霉素50微克/毫升的鏈霉素，2mM谷氨酰胺和0.8微克/毫升的G418(Geneticin)]。然后再將細胞培養(yǎng)二至三周左右，并每隔3天更換一次培養(yǎng)基。
E2.8.2產(chǎn)生GASGAs的克隆之選擇用上述酪蛋白或血纖維蛋白測定法(參見E2.8)選出GASGAs克隆。酪蛋白溶解測定法系用酪蛋白-血纖維蛋白溶酶原-瓊脂糖涂復層復蓋培養(yǎng)基而進行的，每一塊平板的復蓋層系按下述方法制備(1)0.25毫升不含脂肪的干牛奶[8%W/V(即單位容積中重量百分比)，在沸水浴中加熱30分鐘];
(2)0.50毫升2XDME培養(yǎng)基;
(3)50微升7.5單位/毫升的血纖維蛋白溶酶原，在0.22微米的過濾器上過濾滅菌;
(4)0.2毫升的5%瓊酯糖溶液(經(jīng)高壓滅菌)。
將上述這些組分加到置于48℃水浴內的瓊脂糖溶液中，除去培養(yǎng)基后，將其在培養(yǎng)細胞上鋪展成層。然后將細胞置于含有5%CO2的增濕培養(yǎng)器中，在37℃下進行培養(yǎng)，經(jīng)2、4和8小時，分別檢查一下不透明層中是否出現(xiàn)透明區(qū)。用預先充有約0.5%DME的巴斯德(Pasteur)移液吸管抽吸出顯示最高PA活性的克隆，用力攪拌，使其重新懸浮，然后再涂敷在24個井型平板上。然后，使細胞生長至匯合，進行胰酶消化，并取出五分之一在同樣類型的培養(yǎng)平板上再鋪展成層。48小時后，對上清液進行檢測(以下將作較為詳細的描述)。
血纖維平板測試系用類似的方法進行，但在100毫米平板上涂敷2.5毫升血纖維蛋白-瓊脂糖(參見AstrupT.，引用的參考文獻)在1XDME(參見上文)中的溶液，以此代替以上所列的試劑。
E2.8.3GASGAs定量測定a)為了定量測定PA的含量，將GASGAs表達克隆上清液，以及A431細胞(陽性對照物)的上清液與標準濃度的uPA稀釋液在酪蛋白-血纖維蛋白溶酶原-瓊酯糖平板上進行比較，其中酪蛋白-血纖維蛋白溶酶原-瓊脂糖平板系按前面所述的方法制備，但最終的瓊酯糖濃度為1.8%，而且每塊100毫米平板的用量為5毫升。每隔一定間隔時間打孔，用巴斯德移液吸管抽出。匯集的上清液逐次用緩沖液以1∶2的比例稀釋，再從每一稀釋度上清液中取出10微升加到平板中。uPA標準溶液先用2倍水配制，然而用2倍DME以1∶1的比例稀釋至最終濃度約為4000單位/毫升。所得的溶液用DME以1∶2的比例逐次稀釋，從各稀釋液中取出10微升加到平板上。將產(chǎn)生GASGAs的克隆分成三個不同的級，通過與標準uPA制劑的系列稀釋液作比較，可推知GASGAs的濃度。
b)另外，對G418抗性克隆計數(shù)，然后移入24井型微滴板上，在對上清液測定前使之生長至飽和。顯示出有效的GASGAs生產(chǎn)水平(大于0.5微克/毫升)的克隆，在補給熱滅活小牛血清與10%DMSO的混合物后，以冷凍貯備物的形式貯存在液氮中。以后再使這些細胞克隆，以選出高生產(chǎn)率的細胞，也如上所述的方式進行冷凍貯藏。
使GASGAs產(chǎn)率最高的克隆再進行克隆，并大量培養(yǎng)。用CHO(中國倉鼠卵巢)或鼠的LB6細胞所進行的實驗結果示于下表1。
表1
E2.8.4大批培養(yǎng)將一只能自動控制濃解氧濃度、pH和溫度的4升細胞反應器用來培養(yǎng)按照上述例子所述的方法得到的產(chǎn)率最高的克隆的接種物。培養(yǎng)用的介質是含有5%熱滅活的FCS，1mM谷氨酰胺、25單位/毫升青霉素、25微克/毫升鏈霉素和400微克/毫升的G418的DMEM，或者是一種無血清的配方，以DMEM作為基本組分，補充以白蛋白、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺、膽堿、維生素和微量金屬。細胞接種物系在一只150cm的燒瓶內生長，瓶內盛有DMEM及10%熱滅活的FCS、2mM谷氨酰胺、50單位/毫升的青霉素、50微克/毫升的鏈霉素和400微克/毫升的G418，該細胞在Cytodex微型載體(Pharmacia)上進行培養(yǎng)。
細胞達到的最大群體密度為2.5×106個/毫升，在整個培養(yǎng)期間GASGAs被合成，并由已知的方法，如血纖維蛋白測定法或IAA法(參見1.6.2)進行測定。由IAA法測定得的最大濃度達20微克/毫升。
E2.8.5活化GASGAs的定量測定為了定量測定地生產(chǎn)GASGAs克隆或生產(chǎn)uPA的A431(細胞(陽性對照物)的培養(yǎng)物中活性雙鏈PAs的相對量，用小鼠單克隆抗體和IAA測試法(1.6.1)對所說培養(yǎng)物的上清液進行測定，該小鼠單克隆抗體能夠識別uPA催化結構域或Kringle，而不會干擾酶活性，亦不會結合GFD。
結果表明，雙鏈活化PA的量一般在PA總量的20%-50%的范圍內，若將蛋白酶抑制劑加到正在生長的培養(yǎng)物中，則該量小于5%。
E2.9受體結合測定法對生產(chǎn)GASGAs的克隆的上清液或A431細胞的上清液，檢驗其與放射性標記的125I-DFP-UK對U937細胞上的uPA受體的結合進行競爭的能力(Stoppelli M.P.et al.Proc，Natl.Acad.Sci，U.S.A，1985，82，4939-4943)。
如E2.8.2中所述的方法，收集那些分泌類似PA活性物質的克隆，并使之生長至匯合，然后按照上述方法對上清液進行檢驗。高產(chǎn)率的克隆(見表1)和A431細胞分別在105細胞/毫升的濃度下涂敷成層。采用IAA法，并使用上述E2.8.5中所述的單克隆抗體，測定上清液試樣中的PAs濃度。以用于培養(yǎng)物的同樣培養(yǎng)基制備1∶2稀釋液，以進行受體結合測定，測定方法基本上如Cubellis等人所描述的方法(J.Biolog，Chem261∶15819-15822，1986)。概括地說，每一種稀釋液取200微升，用來使1-2×106個937細胞(參見上文)重新懸浮在其內，并在各細胞懸浮液中添加125I-DFP-UK，添加量的活性約相當于20000-80000計數(shù)/分(最終的scu-PA濃度為50pM)。
一個典型的實驗結果示于圖13，它表明，PSVuPA-EO轉染克隆的上清液不能與碘化tcuPA爭奪與uPA受體的結合。
E2.10GASGA-EO產(chǎn)物的純化收集在抑肽酶存在下進行生長的生產(chǎn)GASGA-EO的CHO細胞的上清液，并按1.6.5中所述的方法，用免疫色層分離法、離子交換色層分離法和逆相液相色譜法(1.6.3)對GASGA-EO進行提純(由SDS-PAGE電泳法測得的純度高于95%)。
E2.11GASGAs生物化學和免疫特性提純后的GASGA-EO在還原和非還原條件(參見1.6.4)下，顯示出的表觀分子量約為50KD。被血纖維蛋白溶酶活化后(參見1.6.2)，經(jīng)還原的蛋白質是一種雙鏈蛋白質，由一個30KD鏈和一個20KD鏈構成，前者的移動方式與tcu PA的B鏈相同，而后者的移動速率較之tcu PA的A鏈快。如同預期的那樣，用免疫污斑法分析時，在全部的小鼠抗uPA血清條件下，GASGA-EO蛋白質與mAB5B4(識別“Kringle”區(qū))反應，但不與識別GFD區(qū)的mABsDC1或CD6反應(參見“制備”)E2.12N-末端氨基酸順序分析使用一個應用生物系統(tǒng)470型氣相蛋白質順序分析儀完成N-末端氨基酸順序分析，結果如下GASGA-EO1510a.a.SerAsnGluLeuHisGlnValProTyrLysSerLysuPA158(24)46GASGA-EO152024a.a.Thr-TyrGluGlyAsnGly？HisPheTyrArgGlyuPA505560數(shù)字代表GASGA-EO和uPA順序，通過密碼子被RSVuPA-EO重組體質粒中的外顯子Ⅲ和Ⅴ之間共用(參見圖3)，在uPA中Tyr24被GASGA-EO中的Tyr9取代，而且該Tyr24將外顯子Ⅲ(uPA Pro8)上最后一個完全編碼的氨基酸與外顯子V(uPA Lys46)上最后一個完全編碼的氨基酸相連結。在循環(huán)19處的氨基酸身分不確知，因此打有問號。循環(huán)14并不表明有任何可檢測到的氨基酸存在，而如預期的那樣，意味著存在一種Cys殘基[除非預先用羰甲基化(carbomethylation)保護，該殘基不能被此分析中所用的順序器檢出]。
例E3用RSV-uPA-BPV載體生產(chǎn)GASGAs在RSVuPA質粒DNA中，限制核酸內切酶NdeⅠ和ApaⅠ各自僅切割一次(參見圖5)，第一次在靠近RSV啟動區(qū)的pBR322衍生區(qū)，第二次在靠近uPA多聚腺苷酸位點的SV40區(qū)3′處。這兩個位點能通過XhoⅠ連接而被修飾，經(jīng)XhoⅠ消化后，得到一種含有RSV啟動區(qū)/uPA密碼區(qū)的片段，后者適合于在含有XhoⅠ位點和/或SalⅠ位點的載體中進行克隆。
E3.1.1 在37℃下，70微克RSV-uPA-DNA用含有420單位NdeⅠ的300微升溶液消化完全，時間為24小時[測定條件150mM NaCl，10mM三羥基氨基甲烷·鹽酸(即Tris·HCl)，pH7.8，7mM MgCl2，6mM2-巰基乙醇，100微克/毫升BSA]。經(jīng)熱滅活后，將氯化鈉濃度調節(jié)罙paⅠ條件(6mM NaCl、6mMTris·HCl pH7.4、6mM MgCl2、6mM2-巰基乙醇、100微克/毫升BSA)，在30℃下，DNA在400微升(最終體積)溶液中用160單位的ApaⅠ完全切開，時間為4小時。然后按1.5.3中所述的方法，對DNA進行提純和沉淀，并使之再溶解在20微升TE中，通過在37℃下用5單位的大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ對DNA(最終反應體積為25微升)培養(yǎng)1小時，然后對酶進行熱滅活(Maniatis等人，113頁);由此使NdeⅠ突出端充填。
E3.1.2將如上所得的NaeⅠ/ApaⅠ消化的圓端RSV-uPA質粒與磷酸化XhoⅠ聯(lián)結子DNA(摩爾比約1∶15)混合后，在8℃下培養(yǎng)18小時(最終體積為50微升)，然后如1.5.5所指出的，用連接酶熱滅活。接著，在37℃下，用120單位的XhoⅠ，在200微升溶液中對DNA消化4小時，并對XhoⅠ進行熱滅活。
E3.1.3將以上所得的DNA片段在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁的0.75%瓊脂糖凝膠上電泳分離，電泳時間為20小時，電壓35伏(詳見1.5.7)所得的帶在紫外透射照明器上檢測，最寬的帶相應于8.35千對堿基RSV啟動區(qū)/uPA密碼區(qū)片段;而最狹的帶相應于2.45千對堿基耐氨芐青霉素的，含有復制源的片段。切出這二個帶，并按1.5.7中所述的方法提純。最狹的帶最后用3單位的CIP在37℃下處理30分鐘，接著再在56℃下處理30分鐘，以后按1.5.2和1.5.3中所述的方法進行提純和沉淀。將最大和最小的片段大致以1∶4至4∶1范圍內的不同摩爾比進行混合，在14℃下連接3小時，從各反應混合物中取出一部分，用于按1.5.8中所述的方法對大腸桿菌DHI感受細胞進行轉化。使細菌在含有氨芐青霉素的瓊脂平板上生長過夜，對來自分離后菌落的質粒進行分析，查明其是否存在合適的限制片段圖譜，選出一種作為質粒p71，其中，置于RSV啟動區(qū)轉譯控制下的人類uPA基因，通過用XhoⅠ的切割，使之從其余質粒中切除(圖5底部)。
E3.4.1BPV限制性位點的修飾通過插入一個單一的XhoⅠ位點，對pBPV230.8(參見圖4)在三個不同位點處(分別為BamHⅠ、HindⅢ或SalⅠ)進行修飾，使RSV啟動區(qū)/uPA密碼區(qū)(RSVuPA)的插入較為容易。在37℃下，用過量的合適限制酶(BamHⅠ或HindⅢ或SalⅠ)在100微升(最終體積)溶液中，將10微克BPV230.8DNA消化完全，時間3小時。對酶進行熱滅活后，按1.5.3中所述的方法提純DNA，然后再將其重新溶解在10微升緩沖液中(Maniatis等，113頁)，接著在37℃下，用5單位的大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段處理2小時，使之成為平端。聚合酶經(jīng)熱滅活后，先在37℃和50微升(最終體積)溶液中，用5單位的CIP進行30分鐘的脫磷酸化處理，接著再在56℃下處理30分鐘。最后，在EGTA存在下，通過加熱對酶進行滅活處理，并按1.5.2和1.5.3所述的方法，對DNA進行提純。向再度溶解的平端線性BPV230.8DNA中加入標記的XhoⅠ聯(lián)結子DNA(摩爾比為100∶1)，在2.5單位T4DNA連接酶(1.5.4)存在下，在溫度為8℃的50微升(最終體積)溶液中連接15小時。在連接酶經(jīng)熱滅活后，含有約1%連接DNA的試樣用8單位XhoⅠ消化，在其連接前后，對等分量的DNA進行電泳處理，并按1.5.6中所述的方法進行分析。然后，將鹽濃度調節(jié)至100mMNaCl，而pH值調節(jié)至7.5左右(Maniatisetal，pag.104andBiochemicalsforMolecularBiology;BoehringerMannheim，Munich1985)，在37℃的200微升溶液中，全部用DNA用XhoⅠ切割，時間為1小時，然后將其載在0.6%瓊脂糖凝膠上，進行電泳處理，切出相應于線狀質粒的帶，然后按1.5.7中所述的方法進行電洗脫和提純。通過連接使線性DNA自行對合，并用于轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5細胞(BRL)(參見1.5.8)。在含有氨芐青霉素的瓊脂平板上培養(yǎng)過液的分離菌落中的質粒用微量制劑分析法(參見1.5.9)篩選，以檢查其內是否存在新的XhoⅠ位點。由此得到下述pBPV230.8衍生質粒(圖6中間)(1)pBB，其中XhoⅠ位點系在BamHⅠ位置處產(chǎn)生，兩側翼與兩個BamHⅠ位點相接;
(2)pBS，其中XhoⅠ位點系在SalⅠ位置處產(chǎn)生，兩側翼與兩個SalⅠ位點相接;
(3)pBH，其中XhoⅠ位點系在Hind笪恢么Σ E3.1.5 在一系列不同的實驗中，各取50微克的pBB DNA、pBH DNA和pBS DNA，在37℃和50微升溶液中用過量XhoⅠ(在pBS的情況下用SalⅠ)消化至完全，時間2小時，然后對酶進行熱滅活，用濃緩沖液(參見1.5.1)按要求調整反應條件，使反應體積增加一倍，接著再按1.5.4中所述的方法，用1單位CIP對線性質粒DNA進行脫磷酸化處理。酶經(jīng)熱滅活后，將DNA載在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的0.6%瓊酯糖凝膠上，在30伏下電泳16小時。按1.5.7中所述的方法，對相應于單節(jié)顯性的線性質粒的主要DNA帶進行電洗脫、提純后，再進行溶解。同樣，50微克p71質粒DNA用80單位XhoⅠ消化至完全，對酶進行熱滅活，然后將混合物載在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的0.6%瓊脂糖凝膠上，在30伏下電泳16小時。具有8.35千對堿基帶的凝膠部分含有RSV啟動區(qū)/uPA密碼區(qū)結構，按1.5.7中所述方法對該凝膠部分進行電洗脫和提純后，再予以溶解。將BPV載體DNA(圖6中間)和插入體DNA(圖5底部)以2∶1至1∶4范圍內比例進行混合，接著在150℃和DNA濃度大致為0.2微克/微升的條件下，用2單位的T4 DNA連接酶樣品進行連接，時間24小時。用緩沖液對反應介質進行調節(jié)，連接的DNA在37℃和15微升(最終體積)溶液中，用20單位的XbaⅠ消化1小時(測定條件50mM NaCl、6mM Tris-HCl pH7.9、6mM MgCl2、100微克/毫升BSA)粒。此種酶不切割RSV/uPA結構，僅對BPV230.8衍生載體切割一次。XbaⅠ經(jīng)熱滅活后，所得的DNA混合物用水稀釋1-5倍，加入10X連結緩沖液，然后在14℃下用2.5單位的T4 DNA連接酶培養(yǎng)2小時。從各反應實驗中取出5微升樣品，用于轉化大腸桿菌DH5感受態(tài)細胞(參見1.5.8)。這些細菌在37℃的溫度下，在含有氨芐青霉素的瓊脂板上生長過夜，所產(chǎn)生的菌落樣品用微量制劑分析法(參見1.5.9)進行分析。最后，選出具有合適限制圖譜的分離出來的菌落(參見1.5.9，圖6底部)。
E3.2在BPV衍生的表達載體中uPA轉錄單元的修飾在含有uPA ORF的7.3千對堿基的SmaⅠ片段中，限制酶BssHⅠ和SacⅠ僅僅切割一次，每一次切割分別在nt413處產(chǎn)生一個5′突出端，而在nt4344處產(chǎn)生一個3′突出端。該片端包含uPA的GED密碼區(qū)，而在RSVuPA衍生GASGAs質粒(參見圖3)中的相應片段含有GFD0和GFD2區(qū)。
因此，所有BPV載體中的BssHⅠ/SacⅠ片段均被RSVuPA-EO或RSVuPA-E2中的BssHⅠ/SacⅠ片段取代，由此得到(1)具有外顯子Ⅳ-缺失ORF的EO系列的載體;
(2)具有外顯子Ⅳ-重復ORF的E2系列載體;
概括地說，上述兩種系列的制備方法如下(a)來自RSVuPA-EO或RSVuPA-E2中的DNA，先用BssHⅠ完全消化后，用CIP處理，接著再用SacⅠ完全消化，而最小的DNA片段在凝膠上進行提純;
(b)來自BPV衍生uPA表達載體的DNA，先用SacⅠ進行類似的完全消化，然后用CIP處理，接著再用BssHⅠ完全消化，而最大的片段在凝膠上進行提純;
(c)將外顯子Ⅳ-缺失BssHⅠ/SacⅠ片段或外顯子Ⅳ-復制BssHⅠ/SacⅠ片段插在以上所得的每個游離基因載體DNAs中。
E3.2.1制備“EO”或“E2”BssHⅠ/SacⅠ盒將50微克取自RSVuPA-EO或RSVuPA-E2(參見圖3)的質粒DNA，在37℃和75微升(最終體積)溶液中，用64單位的BssHⅠ消化至完全(消化2小時)。然后對酶進行熱滅活，并在150微升(最終體積)溶液中用2.5單位的CIP對DNA進行脫磷酸反應。接著用酚/氯仿對DNA進行提純(參見1.5.2)，經(jīng)沉淀(參見1.5.3)后，使之再懸浮在100微升緩沖液中，并在37℃下用80單位的SacⅠ消化3小時。由此分別得到含有“EO”盒的片段或含有“E2”盒的片段，以后再在瓊脂糖凝膠(參見1.5.8)上提純。
E3.2.2BssHⅠ/SacⅠBPV-衍生載體框架(frame)的制備取自各個pBPV230.8衍生物uPA表達載體(參見圖6底部)的20微克DNA，在37℃和50微升溶液(最終體積)中用40單位的SacⅠ完全消化，時間3小時，然后對酶進行熱滅活，接著在100微升(最終體積)溶液中用2單位CIP(參見1.5.4)進行脫磷酸化處理。經(jīng)萃取和沉淀(參見1.5.2，1.5.3)后，將DNA再溶解在100微升緩沖液中，并在37℃下用40單位的BssHⅠ消化2小時。瓊脂糖凝膠(參見1.5.8)上分離出在含有BssHⅠ/SacⅠEGF的區(qū)中缺失的最大片段。
E3.2.3“ED”或“E2”盒在BPV/RSV/uPA框架中的插入這種方法用于在BPV衍生uPA表達載體中產(chǎn)生GFD0(“0”)或GFD2(“2”)系列(a)含有如上所述方法(參見E3.2.1)制備的GFD0或GFD2盒的1微克BssHⅠ膠磷酸的/SacⅠDNA片段，在15℃和20微升溶液(最終體積)中，用2單位DNA連接酶使之連結到含有BPV/RSV/uPA框架(參見E3.2.2)的4微克ScaⅠ脫磷酸的/BssHⅠ載體DNA上，反應時間為16小時;
(b)將5微升上述混合物用于轉化DH5大腸桿菌感受態(tài)細胞;
(c)用微量制劑分析法(參見1.5.9)篩選耐氨芐青霉素的菌落，并分離出顯示預期限制圖譜的質粒。
從產(chǎn)生pBPV230.8-衍生scu-PA的各質粒(圖7A)系列開始，重復上述方法，由此得到二個系列的BPV-衍生GASGA表達載體(1)系列“0”，其中至少一部分EGF狀的結構域已被刪除(后綴EO，參見圖7B);
(2)系列“2”，其中大部分EGF狀結構域已被復制(后綴E2，參見呼7C)。
E3.3GASGA產(chǎn)物的表達和分析上述所得的BPV衍生GASGA表達載體在LB6小鼠細胞或CHO細胞(參見E1.4)中用RSV-Neo并發(fā)轉染(cotransfected)選出G418抗性克隆，并按E2.8中所述的方法進行分析。所得蛋白質的PA酶性能，免疫特性、以及uPA受體結合性能反映了用RSVuPA-EO和RSVuPA-E2(參見上文)所得的蛋白質的有關性能。
例E4人類uPA啟動區(qū)的改性衍生物的組建E4.1puPA2質粒的組建按E0.3中所述方法制備的50微克λ-uPA1DNA，在30℃和100微升(最終體積)溶液中，并有合適緩沖液的情況下，用30單位的SmaⅠ消化60分鐘。所得的DNA中取出500毫微克，在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的1%瓊脂糖凝膠上進行分析，而將余下的DNA貯存在-20℃溫度下。然后在68℃下對酶進行熱滅活(10分鐘)，并將所產(chǎn)生的DNA制劑載在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的0.8%制備型瓊酯糖凝膠上。電泳分離系在50伏和TBE緩沖液(Maniatisetal，ch.5)中進行20小時，然后在中等長度的紫外透射照明器上用肉眼觀察DNA帶。切出含有前uPA啟動區(qū)的約2.38千對堿基的帶，并按1.5.7中所述的方法，對DNA進行電洗脫和提純。50微克pEMBL8CATDNA(圖8)在30℃下，用含有30單位SmaⅠ的25微升(最終體積)溶液同樣地消化1小時。然后加入64微升水、10微升CIP10X緩沖液和含有1單位CIP的1微升(最終體積)溶液，再將反應混合物在37℃下培養(yǎng)60分鐘。按照1.5.4中所述的方法加入EGTA和加熱，以對CIP滅活，然后在1.5.7中所述的同樣條件下，在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的0.8%瓊脂糖凝膠上對DNA進行提純。此后將1.5微克的2.38千對堿基λ-uPA1衍生片段和如上制備的500毫微克線狀脫磷酸的pEMBL8CATDNA混合在一起，在14℃的溫度下，在含有10%PEG和2單位T4DNA連接酶的20微升合適緩沖液中進行連接，時間為20小時。然后按1.5.8中所述的方法，將5微升上述反應混合液用于轉化感受態(tài)HB101大腸桿菌細胞。分析耐氨芐青霉素的菌落，在含有合適定位插入體的菌落中，選出一種，稱之為puPA2(圖8的右邊)。
E4.2puPA2/41質粒的組建用下述方式來研究用于獲得上述制備的SmaⅠ部分消化的線狀puPA2DNA的最佳條件即在10微升(最終體積)合適的緩沖液中，分別用1.0、2.0、3.0和4.0單位的SmaⅠ消化250毫微克的此種質粒。各反應混合物中取出50%的量(體積比)，將其轉移至不同的試管內，在30℃下反應6分鐘后，置于干冰/乙醇浴中冷凍，而其余部分再培養(yǎng)9分鐘后，進行冷凍。然后，每一種冷凍試樣用EDTA配制成10mM的濃度，酶經(jīng)熱滅活后，在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的1%瓊脂糖小型凝膠上對DNA進行分析。用2單位的上述物質培養(yǎng)15分鐘，和用3單位的該物質培養(yǎng)6分鐘，可獲得良好結果。然后，以如下方式產(chǎn)生制備型消化5微克puPA2DNA在50微升合適的緩沖液中用50單位的SmaⅠ消化，然后加入1微升500mMEDTA和冷凍，使反應終止。對所加的酶進行熱滅活后，將此種puPA2DNA制劑與2.25微克XhoⅠ聯(lián)接子混合，然后按1.5.6中所述的方法進行磷酸化處理，接著再在含有10%PEG1500和2.5單位T4DNA連接酶的86微升反應混合物中進行連接，先在7℃下培養(yǎng)6小時，然后慢慢地將溫度增加到17℃，并再培養(yǎng)10小時。10%的連接DNA在37℃下，用含有55單位XhoⅠ的20微升，(最終體積)溶液消化2小時，對酶進行熱滅活后，按1.5.3中所示的方法沉淀DNA。將沉淀出的DNA再溶解于4微升TE(Maniatis等)中，加入1微升含有1單位T4DNA連接酶的5X連接緩沖液(Maniatis等)，將混合物在15℃下放置2小時30分鐘，使其自行連結，然后用來轉化HB101感受態(tài)大腸桿菌細胞(參見1.5.8)。用微型制劑分析法篩選耐氨芐青霉素的菌落。其中一種菌落稱為puPA2/41，它具有SmaⅠ位點，該位點與含有2.38千對堿基插入體的uPA啟動區(qū)的5′末端的一側翼相接，轉化成XhoⅠ位點(圖10)。
E4.3CAT分析對puPA2及其衍生物puPA2/41和RSV-CAT引起CAT基因轉錄的能力進行測試。質粒DNAs被轉染到人類A1251細胞系(參見1.1)中，后者是通過磷酸鈣沉淀法，從腎癌細胞(StoppelliM.P.，VerdeP.，GrimaldiG.，LocatelliE.K.，BlasiF.，J.CellBiol.1986，102，1231-1241)衍生得到，經(jīng)64±4小時后，測定轉染細胞中可能產(chǎn)生的CAT蛋白質的量。E4.3.1質粒DNA的提純采用文獻“Birnboim H.C.and Doly J.1979，Nucleic Acid Res.7，1513”(在Maniatis等人著作的第90頁中也作了報道)中所述的堿溶解法，從各細菌克隆培養(yǎng)過夜的400毫升LB液體培養(yǎng)物中提純質粒DNAs。由此得到的質粒DNA在溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓氯化銫梯度上提純2次，通過刺孔法收集含有質粒DNA的帶，并用含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的異戊醇(參見Maniatis等，93-94頁)充分萃取。然后以1∶4的比例，用水稀釋含有DNA的CsCl水溶液，接著加入0.1倍體積的3M乙酸鈉(pH5.2)和3倍體積的乙醇，以沉淀出DNA。將上述混合的在-20℃下放置30分鐘后，在4℃和10000XG的條件下，旋轉15分鐘，將DNA部分甩下，再相繼用70%乙醇和100%乙醇分別洗滌一次，干燥后再繼續(xù)溶解在2毫升TE中，并以同樣的方法再進行沉淀和洗滌，最后使之再溶解在1毫升TE(參見Maniatis等人的文獻)中。測定光密度260(O.D.260)，將濃度調節(jié)至500毫微克/微升左右，然后在小型凝膠上檢驗，并再用分光光度測定法進行測定。最后，用無水乙醇以1∶1的稀釋比將質粒DNAs稀釋，并貯存在-20℃的溫度下。
E4.3.2用磷酸鈣法沉淀每只欲被轉染的60毫米陪替氏培養(yǎng)皿上盛有40微升DNA乙醇/TE溶液(相當于10微克DNA)，使之在Savant真空離心機中干燥后，再溶于220微升水中。然后加入30微升2MCa Cl2(Mallinkrodt or Merck出品)，并進行快速混合。另外，將250微升的2XHBS[10克/升HEPES，4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸，16克/升 NaCl，pH7.1±0.05，無菌]與5微升的100XPO4(70mM Na2HPO4和70mMNa H2PO4，無菌)進行混合后，慢慢地滴加DNA/CaCl2溶液，同時用巴斯德(Pasteur)移液吸管充分鼓泡。此后將該混合物在室溫下放置30分鐘(Graham and Van der Eb，Virology，52，456;1984)。
E4.3.3A1251細胞的轉染在37℃和5%CO2增濕培養(yǎng)箱中，使A1251細胞在完全培養(yǎng)基[DNA培養(yǎng)基(Gibco)，并在該培養(yǎng)基中補充10%的小牛胎血清(Hyclone)和1%抗菌素溶液(Gibco)]中生長至接近匯合。在轉染前24小時，使細胞在60毫米陪替氏培養(yǎng)皿(每只培養(yǎng)皿有105個細胞)中裂解，在轉染前4至6小時，再供給新鮮培養(yǎng)基。在t0時，加入沉淀DNA，并使混合物在培養(yǎng)器中放置16-18小時。培養(yǎng)過夜后，細胞用DME(參見7.2)洗滌一次，然后再補充以完全培養(yǎng)基，并使其留在培養(yǎng)器中，直至培養(yǎng)完畢，予以收集。在實驗中，一式三份進行試驗，對于每一份試樣來說，干燥的DNA溶解后的所有步驟均分開進行。所得細胞用于以后步驟中。
E4.3.4細胞溶解產(chǎn)物的制備加入沉淀DNA后的64±4小時，細胞(在E3.3.3中制備的)用無Ca++的磷酸鹽-緩沖鹽水(PBS)(1升蒸餾水中含有80克NaCl、2克KCl、11.5克NaHPO4·2H2O、2克KH2PO4，pH調節(jié)至7.2)洗滌三次，然后加入1毫升STE(100mM NaCl、10mMTris、1mM EDTA)，并使混合物在室溫下放置5分鐘。此后用橡皮淀帚刮下細胞，并將其放在Eppendorf管中，在4℃，置于微型離心機中旋轉3分鐘，將其甩至底部，然后再懸浮在pH值為7.8的100微升250mM的三羥甲基氨基甲烷中。細胞懸浮液在干冰/乙醇浴中放置15分鐘后，移入37℃水浴中;這一凍結/融化循環(huán)重復二次后，在4℃下，置于微型離心機中旋轉5分鐘，使細胞核甩至底部，而上清液則移入一只新試管中。為了克服因板與板之間細胞數(shù)可能出現(xiàn)的微小差異而引起的各試樣中蛋白質含量的微小差異，按照Lowry法(參見E1.6)，對各試樣中取出的10微升溶液進行測定，以確定蛋白質濃度。溶解產(chǎn)物的其余部分被貯存在-20℃溫度下，直至用于CAT測定。
E4.3.5CAT測定來自各溶解產(chǎn)物的100微克蛋白質，用水稀釋至133.5微升的體積，然后加入44微升含有下列成份的預先混合好的溶液，這些成份是22.5微升2M三羥甲基氨基甲烷(pH7.8)、20微升新鮮配制的3毫克/毫升乙酰Co A(acetylc Co A)(Sigma)和1.5微升放射性14C-氯霉素(50-60毫居/毫摩爾，Amersham出品)。上述混合物在37℃下培養(yǎng)1小時后，加入1毫升乙酸乙酯和進行旋轉，使反應終止。由此形成的二相在Fppendorf微型離心機中分離(5分鐘)后，將有機相移入一只新的Eppendorf試管中，在Savant真空離心機中干燥后，再溶于20微升乙酸乙酯中，并在0.25-1毫米硅膠板(Kodak)上用(TLC)薄層層析測定。用氯仿-甲醇(HPLC級，二者之比為95∶5)作為流動相，進行色層分離2-3小時，相應于標記抗菌素的放射性斑點通過放射性自顯影儀進行顯象。切出相應于放射性斑點的色層分離譜的區(qū)域，置于盛有5毫升諸如Econofluor(New Egland Nuclear)之類的合適閃爍溶液的小玻璃瓶中，在β計數(shù)器中測定放射性。結果表示表2中(參見E4.4.3)。
E4.4.1質粒puPA2/17的組建在37℃和合適的緩沖液(100mM NaCl、10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸(pH7.5)、10mM MgCl2、10mM2-巰基乙醇、100微克/毫升的BSA)中，300毫微克puPA2/41 DNA(參見3.2)中，用4.2單位的OxaNⅠ完全消化，時間為4小時。在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的小型凝膠(參見1.5.1)上檢驗DNA限制，通過加熱，在68℃溫度下，對酶進行10分鐘的熱滅活。然后加入2微升水、1.5微升10X緩沖液和1.5微升的T4DNA連接酶，并將混合物在15℃下培養(yǎng)18小時。將2.5微升此種混合物用于轉化大腸桿菌HB101感受態(tài)細胞(參見1.5.8)。用微量制劑分析(參見1.5.9)對耐氨芐青霉素的菌落進行分析。選出具有合適限制圖譜的菌落，其中之一稱為puPA2/17(參見圖10)。
E4.4.2質粒puPA2/254的組建在37℃和10微升合適的緩沖液(Maniatis等)中，4微克puPA2/41DNA(參見圖10)用5單位EcoRV消化完全，時間2小時，然后加入由7微升水、2微升10X緩沖液和含有1單位CIP的1微升緩沖液(Manitis等)槌傻幕旌弦?。甚r齷旌銜鐫 7℃下培養(yǎng)1小時后，加入EGTA至最終濃度為10mM，并使該混合物在68℃下再培養(yǎng)45分鐘。按1.5.3所述的方法，使DNA沉淀析出，并進行洗滌和干燥，最后再使之溶解在7.5微升TE(Maniatis等)中。在37℃下，用4.2單位DxaNⅠ在10微升(最終體積)溶液中對DNA進行完全消化，時間4小時，然后在37℃下，用1單位DNAPolⅠ的Klenow片段(20微升，最終體積)處理1小時，以充填5′末端。然后沉淀出DNA(參見1.5.3)，并使之再懸浮在7.5微升的TE(參見Maniatis等人的文獻)中。接著加入0.5微升的100mMATP、1微升10X緩沖液(參見Maniatis等人的文獻)和2.5單位的T4DNA連接酶(1微升)，將混合物在15℃下培養(yǎng)18小時。然后用2.5微升此種混合物來轉化大腸桿菌HB101感受態(tài)細胞(參見1.5.8)，并將細菌涂敷在含有氨芐青霉素的LB平板(參見Maniatis等人的文獻)上。選出具有合適限制圖譜的菌落，其中之一般稱之為puPA2/254(參見圖10)。
E4.4.3CAT分析對puPA2/41及其缺失衍生物puPA2/17，以及puPA2/254和RSV-CAT檢驗其促使CAT基因轉錄的能力。用磷酸鈣沉淀技術，使質粒DNA在A1251和Heka細胞系(參見1.1)中進行轉染，64±4小時后，測定CAT的胞內濃度?；旧习碋3.3中所述的方法，對質粒DNA依次進行提純、磷酸鈣沉淀、細胞轉染、細胞溶解產(chǎn)物制備，以及CAT測定。結果示于表2。
表2Al251HelaRSV-CAT100100puPA2/4112832.3puPA2/17303.874.3puPA2/254378.5174.3E4.5uPA衍生物表達載體的組建可從質粒puPA2/41、puPA2/17和puPA2/254中切出細菌CAT基因，以將它們用作表達載體。飾變將優(yōu)先保存uPA啟動區(qū)衍生順序、uPATATA箱(box)、mRNA起始點和pEMBL8衍生多聯(lián)結子。包括這些區(qū)的DNA片段可從載體中切除，插入不同基因的上游，作為“表達盒”。從上述質粒中切除細菌CAT基因，由此得到三種uPA衍生表達載體，即來自puPA2/41的pPP41，來自puPA2/17的pPP17，以及來自puPA2/254的pPP254。
E4.5.1pPP41的組建在37℃下，25微克的puPA2/41DNA用4單位的XbaⅠ進行部分消化，時間45分鐘，加入EDTA(達到50mM)使反應終止，然后進行熱滅活。沉淀后(參見1.5.3)，在37℃下，用2.5單位DNAPolⅠ的Klenow片段(最終體積為20微升)處理1小時，以充填DNA。然后在8℃下，用2單位連接酶處理16小時，使DNA連接到50摩爾過量的SalⅠ聯(lián)結子(參見1.5.5和1.5.6)上，對酶進行熱滅活后，在37℃下用過量SalⅠ完全消化2小時。在0.75瓊脂糖凝膠(參見1.5.7)上處理DNA片段，切出含有5-6千對堿基范圍內的DNA片段的凝膠部分。然后按1.5.7中所述的方法，對這部分DNA進行萃取和提純，并使之再懸浮在10微升TE中，接著在16℃下，用2單位連結酶(最終體積為10微升)使上述2微升溶液自行連接4小時。然后，將2.5微升的此種DNA制劑用于轉化DH5大腸桿菌感受態(tài)細胞(參見1.5.8-1.5.9)。通過微量制劑分析，在耐氨芐青霉素的菌落中，選出質粒pPP41，亦即這是一種具有包含在多聯(lián)結子的SalⅠ位點和缺失CAT基因下游XbaⅠ位點之間區(qū)域的質粒(圖11B)。
E4.5.2pPP/17和pPP254的組建大致按照以上所述的方法，在37℃下，用24單位的XbaⅠ分別將10微克puPA2/17DNA或10微克puPA2/254DNA完全消化2小時，由此得到二種表達載體。在37℃下，用DNAPolⅠ(2.5單位)的Klenow片段充填線狀質粒的5′突出端，處理時間為1小時，然后在8℃下，用2單位連結酶使之連結到50摩爾的過量SalⅠ聯(lián)結子(參見1.5.5和1.5.6)上，處理時間為16小時，對酶進行熱滅活后，在37℃下，用過量SalⅠ對DNA完全消化2小時。然后再對酶進行熱滅活，沉淀出DNA(參見1.5.3)后，再使之懸浮在10微升TE中。2微升此種DNA溶液在15℃下，用2單位DNA連接酶(最終體積為10微升)連結16小時，然后用2.5微升該溶液轉化DH5大腸桿菌感受態(tài)細胞。在耐氨芐青霉素的菌落中，選出質粒pPP17和pPP254，這兩種質粒攜帶uPA衍生缺失啟動區(qū)，并具有對E4.5.1中pPP41(圖11B)所述的相同的一般特性。
例E5E5用uPA衍生GFD改性小基因生產(chǎn)GASGAsE5.1提純含有uPA的SmaⅠ片段如E1.1(參見圖1)所述，從λ-uPA1相得到一種含有uPA密碼區(qū)的7.3千堿基對的SmaⅠ片段。
E5.2載體DNA的制備在25℃下，用50單位的SmaⅠ分別消化pPP41XS、pPP17XS和pPP254XS(最終體積為50微升)，以得到相應的質粒DNA各20微克，然后，在37℃下，用1單位CIP對線狀質粒進行1小時的脫磷酸化處理(最終體積為150微升)，接著再按1.5.3中所述的方法，在0.8%瓊脂糖凝膠上進行凝膠提純。將分離出的DNA制劑再懸浮在20微升TE中，并貯存在4℃溫度下。
E5.3uPA衍生小基因的組建將以上得到的每一種線狀脫磷酸質粒DNA(參見E5.1)(3微克)與1微克uPA-ORF(亦即如E1.1中所述方法得到的含有7.3千對堿基的uPA密碼區(qū)的SmaⅠ片段)混合，并在15℃下，在10%PEG1500中用2單位連接酶(最終體積為10微升)處理16小時。
從每一種反應混合物中取出2.5微升，用于轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5細胞(參見1.5.8)。用微量制劑分析法(參見1.5.9)，在耐氨芐青霉素的菌落中，選出質粒pPP41XS、pPP17XS和pPP254XS，它分別從pPP41、pPP17和pPP254中衍生得到，并具有下述特性(參見圖11C)(1)uPA密碼區(qū)被插入至含有uPA啟動區(qū)的載體中的SmaⅠ位點;
(2)uPA信使RNA起始位點與人類uPA基因相同;
(3)它含有一種pEMBL8衍生順序;
(4)通過用XhaⅠ和SalⅠ消化，uPA衍生小基因能從載體中切除，并插入不同載體中;
(5)切除的小基因能被插入具有SalⅠ或XhoⅠ位點的載體中;
(6)切除的小基因能被插入載體中，當插入合適的宿主時，則能使它們保持附加體的形狀;
(7)pPP41XS具有處在來自uPA啟動區(qū)的一個2.35千對堿基片段控制下的uPA密碼區(qū);
(8)pPP17X具有處在與包含在pPP41XS是相同的啟動區(qū)片段控制下的uPA密碼區(qū)，但其中在兩個OxaNⅠ位點之間已產(chǎn)生了缺失;
(9)pPP254XS具有處在與包含在pPP41XS中相同的啟動區(qū)片段控制下的uPA密碼區(qū)，但在5′OxaNⅠ位點和EcoRⅤ位點之間已產(chǎn)生缺失。
E5.4GASGAs表達小基因的組建基本上按照實施例E3中所述的產(chǎn)生表達BPV衍生質粒的GASGAs的方法，以進行在pPP衍生表達載體中含有從外顯子Ⅱ至內含子J(參見圖3A)的uPAORF的BssHⅠ/SacⅠDNA片段的取代。
E5.4.1載體DNA的提純按E3.4.3中所述的方法，對來自質粒pPP41XS、pPP17XS或pPP254XS的20微克DNA依次用SacⅠ消化，用CIP處理，以及用BssHⅠ限制。含有pEMBL8區(qū)，uPA啟動區(qū)的載體架(Vectorframe)或其衍生物，以及uPAORF的5′和3′末端(參見圖12A)均在瓊脂糖凝膠(參見1.5.8)上進行提純，并使DNA片段再次懸浮在10微升TE中。
E5.4.2插入體DNA的提純按E3.4.1中所述的方法，對來自質粒RSVuPA-EO或質粒RSVuPA-E2的50微克DNA依次用BssHⅠ消化，用CIP脫磷酸化處理，以及用SacⅠ限制。將含“EO”或“E2”密碼區(qū)的兩種片段在瓊脂糖凝膠(參見1.5.8)上提純后，再使之懸浮在20微升TE中。
E5.4.3GASGSs表達小基因的組建對于每一種衍生質粒均采用下述相同的方法(a)將載體DNA(按E5.4.1中所述的方法制備)與插入體DNA(按E5.4.2中所述的方法制備)以1∶2的摩爾比進行混合(10微升的最終體積中含有0.3微克DNA)，并在16℃下，用2單位的T4DNA連接酶連接16小時;
(b)從以上所得的各混合物中取出2.5微升，用于轉化DH5大腸桿菌感受態(tài)細胞(參見1.5.8);
(c)分析耐氨芐青霉素菌落中(參見1.5.9)是否具有BssHⅠ/SacⅠ插入體，得到各由3種質粒組成的二個系列(圖12B和12C)。
E5.5GASGA產(chǎn)物有表達和分析按上述方式所得的uPA小基因衍生GASGA表達載體在LB6小鼠細胞和CHO細胞中用RSV-Neo并發(fā)轉染，并按E2.8中所述的方法選出耐G418的克隆，并進行分析。
PA酶性質、免疫特性和uPA受體結合性質均類似于用RSVuPA-EO和RSVuPA-E2所得產(chǎn)物的性質。
例E6間斷的GASGAs的產(chǎn)生E6.1限制位點飾變部分消化質粒RSVuPA具有兩個XcaⅠ位點，第一個位點在pBR322衍生的耐氨芐青霉素基因中，而第二位點在GFD中，后者系包含在uPA基因的外顯子Ⅳ中(參見圖2)。
為找出使RSVuPA線性化的最佳條件，特進行下述試驗在37℃下，用ScaⅠ在10微升緩沖液中對100毫微克質粒消化1小時(參見1.5.1)。酶的添加量在10單位-0.3單位的范圍內。結果表明，對于100毫微克質粒，用5單位或2.5單位的ScaⅠ消化可獲得最佳結果。在上這二種濃度下，將反應按比例擴大至1微克，加入EDTA，使最終濃度達到10mM，匯集反應混合物，萃取和沉淀出DNA(參見1.5.2和1.5.3)。在20微升緩沖液(最終體積)中，用5單位的T4DNA連接酶(參見1.5.5)，以質粒與聯(lián)結子的摩爾比為1∶100的條件下，將質粒DNA連結到8鏈節(jié)的脫磷酸KpnⅠ/Asp718聯(lián)結子(參見1.5.6)(Boehringer;CGGTACCG順序)上，處理時間48小時。然后對酶進行熱滅活，接著在400微升緩沖液中，用360單位的Asp718(參見1.5.1)消化DNA，沉淀(參見1.5.3)后，將其載在0.8%制備電泳凝膠上，電壓40V，處理時間16小時。按1.5.7中所述的方法，對相應于質粒線性大小(10.8千對堿基)的DNA色帶進行電洗脫和提純后，在小型凝膠上進行定量測定，然后取出50毫微克，在24微升緩沖液中，用2.5單位連接酶使其自行連接，沉淀后，用于轉化100微升感受大腸桿菌DH5細胞(參見1.5.8)。在耐氨芐青霉素的克隆中，選出具有預期限制圖譜的克隆，稱之為RSV-G-Asp(參見圖15)。
為了獲得間斷GASGAs，按照下述對于質粒RSV-uPA-Tet-Asp(圖6.2)所述的方法，通過完全充填Asp718位點(如E6.3.1中所述的方法)，或使之成圓頭(blunting)后(如E6.3.2中所述)再進行部分充填，由此得到兩種載體表達的GASGAs產(chǎn)物，這些產(chǎn)物相當于用表達RSV-SVRTD(參見E6.3.1)或RSV-SAD(參見E6.3.2)可得到的物質。
E6.2限制位點飾變全部消化為了獲得一種攜帶獨特ScaⅠ位點的質粒，通過下述方式，用氨芐青霉素抗性來代替四環(huán)素抗性(參見圖16)(1)刪除pBR322中的大部分抗氨芐青霉素的基因，得到AsmS，TetR質粒pBR13Tet;
(2)用來自缺失pBR322的NdeⅠ-PvuⅡ片段替代RSVuPA中的HpaⅠ-NdeⅠ片段。
在所得的質粒中，ScaⅠ位點僅僅存在于外顯子Ⅳ的uPA密碼區(qū)，并通過一些聯(lián)結子的插入而發(fā)生突變。
E6.2.1缺失pBR322(pBR13Tet)的組建在37℃和50微升緩沖液(最終體積)中，用10個單位的PstⅠ(參見1.5.1)對100毫微克的pBR322DNA消化1小時，然后對酶進行熱滅活，并將反應條件調節(jié)至在37℃的400微升緩沖液(最終體積)的狀態(tài)，用50單位HindⅢ消化，消化時間為1小時。對DNA部分進行萃取和沉淀(參見1.5.2和1.5.3)后，再進行溶解，并用在37℃下，用4單位的T4DNA聚合酶(參見Maniatis等人的文獻)使之成為圓端，處理時間為30分鐘。經(jīng)萃取和沉淀后，用2.5單位的T4DNA連接酶(最終體積為100微升)使DNA自行連接，再經(jīng)沉淀后，用于轉化大腸桿菌DH5感受態(tài)細胞。通過微量制劑分析，從四環(huán)素陽性菌落中選出一種具有正確限制圖譜的菌落，稱之為pBR13Tet(圖16b)。
E6.2.2 AmpR對TetR的取代a)在37℃下，用12單位的NdeⅠ在50微升緩沖液(最終體積)中對2微克pBR13Tet消化1小時，然后將反應條件調整至在37℃和200微升溶液中，用2單位CIP處理的狀態(tài)(參見1.5.4)，處理時間為30分鐘，加入EGTA，使之最終濃度為10mM，DNA部分經(jīng)萃取、沉淀后，在37℃和100微升緩沖液(最終體積)中，用20單位的PvuⅡ消化1小時，再經(jīng)萃取和沉淀后，最終使之再溶解在10微升TE中。
b)在37℃下，20微克RSVuPA在150微升溶液中，用100單位的HpaⅠ消化1小時后，將反應條件調至在37℃和300微升緩沖液中，用22單位CIP處理(參見1.5.4)的狀態(tài)，處理時間為30分鐘，加入EGTA，使之最終濃度為10mM，DNA部經(jīng)萃取、沉淀后，在37℃和200微升溶液中，用60單位NdeⅠ消化1小時，再經(jīng)萃取和沉淀后，最終使之再溶于20微升TE中。
c)將不同量的消化RSVuPA(參見E4.4b)加到2.5微升限制pBR13Tet(參見E4.4a)中，使之摩爾比為1∶1，1∶2和1∶4，以進行三種不同的連結反應(參見1.5.5)。在50微升緩沖液中，用5單位的T4DNA連接酶進行連接，反應過夜。對酶進行熱滅活后，沉淀出DNA部分，并使之再溶解在10微升水中，將5微升此種混合物用于轉化大腸桿菌DH5感受態(tài)細胞。用微用制劑分析法，在四環(huán)素陽性菌落中選出一種具有正確限制圖譜的菌落，稱之為RSVuPA-Tet(圖16d)。
E6.2.3ScaⅠ位點的飾變在37℃和200微升溶液中，將1微克RSVuPA-Tet用100單位ScaⅠ完全消化3小時(參見1.5.1)。對DNA進行萃取和沉淀后，使之再溶解在20微升TE中(參見1.5.2和1.5.3)。在另外的反應器中，使由此得到的2微升線狀RSVuPA-Tet連接到50摩爾過量的下列聯(lián)結子中，這些聯(lián)結子不含有處理前存在于質粒中的任何位點，所說的聯(lián)結子為(1)Asp7188個鏈節(jié)(CGGTACCG順序，由Boehringer提供);
(2)ClaⅠ8個鏈節(jié)(CATCGATG順序，由NewEnglandBiolabs提供);
(3)XhoⅠ8個鏈節(jié)(CCTCGAGG順序，由NewEnglandBiolabs提供)。
按1.5.5所述的方法，在10微升緩沖液中，用12單位T4DNA接酶進行連接反應，萃取和沉淀出DNA部分后，使之在37℃下，重新溶解在分別含有360單位Asp718、200單位ClaⅠ或240單位XhoⅠ的300微升合適的緩沖液中，處理時間為16小時。對三種反應混合物中的DNA部分分別進行萃取、沉淀，并在100微升緩沖液中，用1單位連結酶使DNA自行對合16小時。經(jīng)萃取和沉淀后，使各個DNA部分再溶解在5微升水中，并用于轉化100微升感受態(tài)DH5大腸桿菌細胞。用微量制劑分析法，從每一種轉化系列的四環(huán)素陽性菌落中，就各系列選出一種具有正確限制圖譜的菌落，分別稱為RSVuPA-Tet-Asp，RSVuPA-Tet-Cla和RSVuPA-Tet-XhoⅠ(參見17)。
E6.3GASGAs表達載體的制備通過在新引入的位點打開E6.1和E6.2所述的質粒，并充填所產(chǎn)生的突出端，以破壞人類uPA的uPA受體結合區(qū)(GFD)。所得結果或者是12堿基對插入體[當全部核苷酸均被加入(參見E6.3.1)]或是6堿基對插入體[若僅僅加入第一個核苷酸，而其余突出端用大腸桿菌DNA聚合酶(參見圖6.3.2)消化]，取決于充填反應期間所加的核苷酸。這些GASGAs載體保持uPA讀碼，但表達的蛋白質喪失與其細胞受體結合的能力。
E6.3.1完全充填E3.2中所述的Asp718或XhoⅠ改性質粒1微克，在37℃和50微升溶液中，用5單位合適的酶消化(參見1.5.1)，使它們在插入聯(lián)結子處線性化，使之得以進一步修飾，由此得到每一側4個核苷酸的突出端?？蓪NA進行萃取和沉淀(參見1.5.2和1.5.3)，并使之再溶解在含有所有4個核苷酸的50微升合適緩沖液(參見Maniatis等人的文獻)中，并用5單位的DNA聚合酶，Klenow片段，在室溫下處理30分鐘。所得的平端DNA能按通常方法進行萃取和沉淀。相應于10%沉淀物的部分，在100微升溶液(參見1.5.5)中，用6單位DNA連接酶自行連接16小時。
萃取和沉淀后，各個DNA部分可被再溶解在5微升水中，并用于轉化100微升感受態(tài)EH5大腸桿菌細胞，就每一轉化而言，可通過微量制劑分析，從四環(huán)素陽性菌落中，選出一種具有預期限制圖譜的菌落，分別稱為(參見圖18)(1)RSV-SVRTD，系來自在RSVuPA-Tet-Asp中的Asp718位點的完全充填，其中，新的SnaBⅠ位點已被引入;
(2)RSV-SSIED，系來自RSVuPA-Tet-Xho中的XhoⅠ位點的完全充填，其中新的PvuⅠ位點已被引入。
E6.3.2部分充填和/或末端平整化E6.2.3中所述的Asp718或ClaⅠ的聯(lián)結子改性質粒1微克(RSVuPA-Tet-Asp和RSVuPA-Tet-Cla)，在37℃和50微升緩沖液(最終體積)中，用5單位合適的酶消化(參見1.5.1)，使它們在插入聯(lián)結子處線性化，以使之進一步修飾，由此得到4或2個核苷酸突出端?？蓪NA進行萃取和沉淀(參見1.5.2和1.5.3)，然后再使之溶解在50微升僅含有2mMdGTP(在Asp718充填的情況下)或僅含有2mMdATP和2mMdTTP[在ClaⅠ末端平整化的情況下]的合適緩沖液(參見Maniatis等人的文獻)中，并在室溫下，用12單位的大腸桿菌DNA聚合酶[無DNA酶;(Boerhinger)]處理30分鐘。所得的平端DNA能按通常方法進行萃取和沉淀，所得沉淀的10%的量，用6單位DNA連接酶在100微升合適的緩沖劑(參見1.5.5)中自行連接16小時。經(jīng)萃取和沉淀后，將各DNA制劑重新溶解在5微升水中，并用于轉化100微升感受態(tài)DH5大腸桿菌細胞。通過微量制劑分析，在四環(huán)素陽性菌落中，就各轉化系列選出一種具有預期限制圖譜的克隆，分別稱為(參見圖18)(1)RSV-SAD，系由RSVuPA-Tet-Asp中Asp718位點的部分充填而產(chǎn)生，其中一個新的EagⅠ位點已被引入;
(2)RSV-SYD，系使RSVuPA-Tet-Cla中的ClaⅠ位點成為圓端而產(chǎn)生，其中一個新的NdeⅠ位點已被引入。
E6.4“間斷”GASGAs的表達和分析間斷GASGAs表達載體(例如在E6.3中所述的那些載體)可在CHO細胞中，用RSV-Neo進行并發(fā)轉染，再按E2.8中所述的方法，選出RSV-Neo抗性克隆，并進行分析。由“間斷”GASGAs所產(chǎn)生的血纖維蛋白溶酶原的活化，免疫特性，以及uPA受體結合性能均類似于用RSVuPA-EO所得產(chǎn)物的性能。被選克隆可被分離，并在保持選定壓力下，可在發(fā)酵罐中生長(參見E2.8)。
E6.5“間斷”GASGAs在附加體載體中的表達大致按照E3中所述的表達BPV衍生質粒的GASGAs的制備方法，用E6.3中所述的GASGAs表達載體衍生得到的結構類似物片段，替代含有從外顯子Ⅱ至內含子J(參見圖3A)的uPAORF的BssHⅠ/SacⅠ片段，由此可產(chǎn)生表達附加體的載體(例如以BPV為基的表達載體(參見E3)的“間斷”GASGAs。這類附加體的載體可按E6.4中所述的方法進行表達和分析。
E6.6“間斷”GASGAs表達小基因的組建組建“間斷”GASGAs表達小基因的方法系按E5.4中所述的方式進行，在所說的小基因中，對GASGA編碼的轉錄單元系置于uPA啟動區(qū)或其衍生物的轉錄控制下。例如，基本上可按照E5中所述的方法，制備GASGAs表達的pXS衍生質粒(參見E4)。這類小基因uPA衍生載體可按E6.4中所述的方法予以表達分析。
制備P1.抗GFD單克隆抗體的制備通過適當選擇來自雜種瘤的抗uPA MABs，可得到tcuPA/scuPA的GFD區(qū)特有的單克隆抗體(MABs)，該雜種瘤的脾細胞先祖來自用scuPA、tcuPA或ATF，或者其混合物免疫的動物。對于這一用于選擇的合適探查物是稱作F6的肽片段，它的表觀分子量約為6KD，并具有一個氨基酸順序，后者相應于從4號位處亮氨酸殘基至43號位處谷氨酸殘基的uPA順序，而且，所述的肽片段相應于(包括或是下述有關部分)uPA的所謂GFD(類似生長因子的結構域)，亦即與表皮生長因子特性順序有高度對應性的氨基酸順序。該區(qū)域被認為對uPA與其細胞表面受體的結合起主要作用。
P1.1單克隆抗體的產(chǎn)生將高純度的54，000道爾頓尿激酶120，000單位/毫克(PERSOLVRLepetit)用于免疫7周令的雌性Balb/c小鼠。將置于弗(羅因德)氏完全佐劑中的此尿激酶注射到融合前60天的動物腹膜中。
另外，10微克尿激酶在30天后再給予小鼠。在融合前10天，用常規(guī)ELISA法測定取自尾靜脈血樣中抗尿激酶抗體的效價，在融合前5天，通過靜脈內注射的方式，僅僅給于那些抗體效價大于1∶10，000的動物10微克尿激酶的最終的加強劑量。在融合的當天，摘除脾，并用置于50%PEG6000中的約5×107小鼠骨髓瘤細胞NSO(P3/NS1/1Ag4.1的亞系，ATCC登綠號為TIB18)與脾細胞(約1×108)融合。
大致按照C.Milstein和G.Koehler的方法進行融合后，將細胞重新懸浮在補充以10%小牛胎血清和HAT培養(yǎng)基(0.1mM次黃嘌呤、0.25mM氨基嘌呤、0.017mM胸腺嘧啶核苷，F(xiàn)low室驗室)的Dulbecco改性Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中，并施加到含有小鼠巨噬細胞(飼養(yǎng)層)的不同Costar板上。
每隔3天更換一次HAT培養(yǎng)基，而自融合后10天起，則每隔2-3天，用ELISA免疫測定法，檢驗上清液中是否存在抗尿激酶的單克隆抗體。
P1.2用ELISA法篩選產(chǎn)生抗尿激酶單克隆抗體的雜種瘤按照一種改進型Perlman法[Immunochemistry，8，873(1971)]，將通用96井型軟微滴板(Dynatech)涂復含有尿激酶(每毫升溶液的含量為20微克)的磷酸鹽緩沖鹽水，pH值為7.2(0.05M磷酸鈉，pH7.2，其中含有0.5M氯化鈉)，使每個井的量為50微升，并在室溫下培養(yǎng)1小時。用0.05%Tween20充分洗滌所含的磷酸鹽緩沖鹽水后，在室溫下，用3%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水將井浸泡3小時，以避免非專一性的結合。仔細洗滌后，將50微升雜種瘤培養(yǎng)物的上清液(或者相同體積的腹水)加到井中，使之在室溫下反應2小時。對板進行洗滌后，在室溫下，用辣根過氧化物酶(P161，DAKO)配制成的兔一抗一鼠國際單位(Ig)的1∶1000稀釋液在室溫下培養(yǎng)90分鐘。徹底洗滌后，該板用1毫克/毫升的色素原，鄰位苯基亞乙基二胺(SIGMA)在0.1M檸檬酸緩沖液(pH6)和1.7mMH2O2中的溶液進行培養(yǎng)，每個井中溶液量為200微升。20分鐘內顯色，對照既無抗原又無抗體的空白樣品，在492毫微米處讀出光密度。較之空白樣品色度深4倍的井視作陽性。
P1.3用免疫污斑法篩選抗GFD的單克隆抗體在scuPA、uPA、ATF和uPA片段F12、B11以及F6(由下述P2中所述的方法得到)存在下，用免疫污斑測定法(Western blot)進一步分析在上述篩選(P1.2)中呈陽性的克隆。按類似于SDS-PAGE(含有20%丙烯酰胺)實驗(參見1.5.7)的方式，對這些參照化合物進行試驗，然后在硝基纖維素膜上滲開，并對照在上述ELISA測定中呈陽性的克隆上清液進行分析。
分離出與scuPA/tcuPA、ATF和uPA片段F6相結合，但不與片段F12或B11相結合的那些MABS，進一步培養(yǎng)所產(chǎn)生的克隆，以使它們產(chǎn)生顯著的量。分離出二種能生產(chǎn)具有GFD專一性(亦即不具備與其他uPA區(qū)結合的能力)的MABS，并稱之為CD1和CD6(參見表3)。
P1.4大批培養(yǎng)產(chǎn)生抗尿激酶的雜種瘤選出能產(chǎn)生抗尿激酶抗體的雜種瘤，使之通過限制稀釋進行克隆，并在大量培養(yǎng)物中生長，然后注入事先經(jīng)0.5毫升Pristane(2，6，10，14-四甲基十五碳烷;Aldrich)處理的Balb/c小鼠的腹膜中。15天后收集腹水?？鼓蚣っ竼慰寺】贵w的濃度在10-20毫克/毫升范圍內。用蛋白質-A瓊脂糖或尿激酶-瓊脂糖的親和性色層分離法對上述產(chǎn)物進行提純。
P1.5用親和性色層分離法在瓊脂糖-尿激酶上提純抗尿激酶的單克隆抗體使CNBr-活性瓊脂糖4b(Pharmacia)與高分子量尿激(120，000國際單位/毫克)反應，以制備瓊脂糖-尿激酶結合體。結合效率約為20毫克(尿激酶)/毫升(膨脹凝膠)。將如上所得的腹水(由生產(chǎn)雜種瘤產(chǎn)生1毫升腹水)施加到事先與0.01M磷酸鈉緩沖液(pH8.0)平衡的瓊脂糖-尿激酶親和性柱(1.6厘米×15厘米)中。用同樣的緩沖液淋洗后，用0.1M乙酸(pH3.0)洗提選擇性吸附的抗尿激酶單克隆抗體。匯集含有抗體的級分，在PSDE09005微孔膜上進行超濾濃縮，然后冷凍貯存，直至提供使用。
P1.6由凝膠電泳產(chǎn)生的單克隆抗體制劑的純度和均勻性的測定按照“W.K.LaemmliinNature227，680(1970)”中所述的方法，將以上所得的單克隆抗體用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)電泳。僅僅相應于IgG重鏈和輕鏈的帶是明顯的，這表明上述洗提液含有純免疫球蛋白。
P2 uPA片段F6、B11和F12的制備a)ATF的酶裂解和所產(chǎn)生的片段(F6、B11和F12)的測定。
在37℃下，按照“StoppelliM.P.etal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985，82，4939-4943”中所述的方法制備的uPA氨基末端片段(ATF)(1.1毫克);用金黃色葡萄球菌衍生蛋白酶V8(0.32毫克;Boehringer)在磷酸鈉緩沖液(50mM，pH7.8)中處理90分鐘。在這些條件下，蛋白酶V8切割谷氨酸殘基的羧基側的ATF。將混合物沸騰2分鐘，以中斷酶反應，由此得到的蛋白片段在SDS-PAGE(20%丙烯酰胺)上進行分析，并與初始的ATF進行比較。相應于ATF的色帶不再存在，但觀察到表觀分子量分別為12，000、11，000和6000的三個色帶，系由與已知分子量的標準物進行比較而確定。
b)片段F6、B11和F12的親和性色層分離將以上所得的混合物載在5B4-瓊脂糖基質(一種含有稱為5B4的單克隆抗體的瓊脂糖改性基質)上，后者結合高分子量的尿激酶，但不與由常規(guī)方法，從MAB5B4與瓊脂糖(Pharmacia)相連接(參見CortiA.，NolliML.，SoffientiniA.andCassaniG.inThromHaemostas1986;56，219-224)而制備的低分子量尿激酶相結合。該柱預先已與含有0.15M氯化鈉和0.05M磷酸鈉緩沖液(pH7.4)的1%聚乙二醇(PEG)6000達到平衡。
c)未結合的片段的回收將平衡緩沖液通過柱，收集級分，進行等外線監(jiān)測(280毫微米)，并按其含量予以匯集。得到二份主要的匯集級分，其中一份級分含有表觀分子量為12，000(稱之為F12)膗PA片段，另一級分的表觀分子量為6000(稱為F6)。用離子交換色層分離法對這些片段進行提純，然后按下述(e)中所述的方法，用逆相色層分離法脫鹽。
d)回收結合的級分與基質相結合的級分，然后用含有1M氯化鈉和1M乙酸的1%PEG6000洗提。收集級分，用紫外線(280毫微米)監(jiān)測，并根據(jù)其含量予以匯集。由此得到單獨一份主要級分，該級分含有表觀分子量為11，000的uPA片段，稱之為B11，并按下述方法提純。
e)片段B11，F(xiàn)16和F12的提純分別含有以上得到的片段B11、F12或F6的匯集級分，用離子交換色層分離純化及濃縮，在使用預先與0.05M乙酸鈉緩沖液(pH4.8)達到平衡的Mono S HR5/5柱(以球狀親水性樹脂為基的強陽離子交換劑，其中樹脂粒經(jīng)的分布范圍窄;帶電基團是-CH2SO3)的FPLC(快速蛋白質液相色層分離)系統(tǒng)中進一步進行提純和濃縮。
以0-1M氯化鈉水溶液的純性梯度進行洗提，流量為60毫升/小時，時間45分鐘。將分別含有B11、F6和F12片段的級分供給1、6、3中所述的逆相色層分離柱，以進行脫鹽。通過在減壓下蒸出溶劑，使純片段從相應級分中分離出來。
f)對F6、B11和F12的氨基酸定序用自動順序儀(AppliedBiosystem，氣相470A型)測定片段F和B的N-末端順序，所產(chǎn)生的每一個峰是由含有少量污染物的一個主要片段組成，而所產(chǎn)生的片段F6是單肽(表4)。片段順序表明，在谷氨酸殘基的羧基側，被V8優(yōu)先切割。片段F12和片段B11的差別僅在于在52號位和53號位之間的切去。片段F6的分子量相當于在位置GLu3和GLu43處切去ATF而產(chǎn)生的肽類。因此，V8切割GFD區(qū)的肽，兩種肽基本上對應于所謂的“Kringle”區(qū)(僅在切割位點上不同)。
表3mABscuPALMWATFB11F12F65B4+-++--DC1+-+--+CD6+-+--+用單克隆抗體(mAB)識別uPA的不同部分5B4識別Kringle區(qū)的相應表位，DC1和CD6識別GFD區(qū)。低分子量(LMW)系指含有136-411氨基酸的uPA的33KD降解產(chǎn)物。
表4F6151014a.a. Leu His Gln Val Pro SerAsn-Asp -Leu Asn Gly GlyuPA481317表4片段F6的N-末端氨基酸順序，uPA表示在uPA分子中的相應位置;(循環(huán)8和10)未檢出任何氨基酸，這被介釋為Cys殘基的出現(xiàn)，因為這些殘基不能直接被所用的HPLC系統(tǒng)檢出。
權利要求
1.人類尿血纖維蛋白溶酶原激活劑衍生物，其特征在于所說的衍生物具有包含改變的類似生長因子的結構域。
2.根據(jù)權利要求1所述的人類尿血纖維蛋白溶酶原激活劑衍生物，其特征在于氨基酸9和氨基酸50之間的區(qū)業(yè)已被改變。
3.根據(jù)權利要求1所述的人類尿血纖維蛋白溶酶原激活劑衍生物，其特征在于氨基酸9和氨基酸45之間的區(qū)業(yè)已被改變。
4.根據(jù)權利要求1所述的人類尿血纖維蛋白溶酶原激活劑衍生物，其特征在于氨基酸19和氨基酸32之間的區(qū)業(yè)已被改變。
5.根據(jù)權利要求1、2、3或4所述的人類尿血纖維蛋白溶酶原激活劑衍生物，其特征在于所說的衍生物是天然scu-PA的缺失衍生物。
6.根據(jù)權利要求1所述的化合物，其特征在于氨基酸9至氨基酸45的氨基酸順序被酪氨酸單元取代。
7.一種制備權利要求1、2、3、4、5或6所述化合物的方法，它包括a)對GFD區(qū)的天然scu-PA或uPA進行化學修飾，或b)由缺失、插入或位點定向突變而改變對GFD編碼的uPA區(qū)。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于它包括a)將含有基因組源的uPA密碼區(qū)，并在對蛋白質GFD編碼的區(qū)域具有一個缺失體的表達載體插入至合適的動物細胞中;b)在轉化細胞培養(yǎng)后，回收權利要求1、2、3、4、5或6的人類尿纖維蛋白溶酶原激活劑。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于所說的缺失體是在對9至50的氨基酸順序編碼的DNA區(qū)。
10.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于所說的缺失體是在對9至45的氨基酸順序編碼的DNA區(qū)。
11.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于所說的缺失體是在對19至32的氨基酸順序編碼的DNA區(qū)。
12.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于所說的缺失體是在基因組DNA編碼順序的1027堿基對與1784堿基對之間。
13.一種藥劑，其特征在于它含有權利要求1、2、3、4、5或6中所說的化合物，且該化合物與藥學上可接受的載體相混合。
14.一種如權利要求1、2、3、4、5或6所述的化合物，它用作藥物。
15.根據(jù)權利要求1、2、3、4、5或6所述的化合物的用途，其特征是用于制備一種可供抗血栓形成治療用的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)類似生長因子的業(yè)已改變的結構域(GFD)，以及單鏈尿激酶(scu PA)衍生物糖基化血纖維蛋白溶酶原激活劑(以下也稱為GASGAs)的方法。本發(fā)明的化合物最好由uPA編碼DNA按遺傳工程方法制備，并具有改良的藥理學性質。
文檔編號C07K1/22GK1033070SQ8810660
公開日1989年5月24日 申請日期1988年9月7日 優(yōu)先權日1987年9月7日
發(fā)明者加爾凡尼卡薩尼, 弗朗西斯哥·布蘭凡德瑞克馬利亞·羅勃特, 馬瑞爾露易薩·諾利 申請人:格路普萊布蒂特有限公司