一種提取和初步純化河豚毒素的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從河豚魚內(nèi)臟組織中提取及初步純化河豚毒素的方法。該方法使用勻漿、透析、反相+弱陰離子層析吸附除去雜質(zhì)、弱陽離子交換濃縮純化河豚毒素,然后冷凍干燥獲得80％純度河豚毒素干粉。這種新的方法和工藝使用LC-MS或LC-MS/MS檢測(cè)每一步河豚毒素濃度，確保無河豚毒素的損失和拋棄。使用本發(fā)明的方法,河豚毒素產(chǎn)量是現(xiàn)有專利和文獻(xiàn)產(chǎn)量的10-100倍。使用本發(fā)明的工藝，尤其是連續(xù)流色譜和特別的弱陽離子交換材料，可以一次性處理10kg河豚魚的卵巢，獲得10-20g純度80％-90％的河豚毒素干粉。
【專利說明】一種提取和初步純化河豚毒素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及色譜柱【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種提取和初步純化河豚毒素的方法，尤 其涉及一種使用弱陽離子交換色譜柱進(jìn)行的提取和初步純化河豚毒素的方法

【背景技術(shù)】
[0002] 河豚毒素（tetrodotoxin, TTX)是飩魚類（俗稱河豚魚）及其它生物體內(nèi)含有的 一種生物堿。其分子式為C11H17O 8N3，分子量為319,其為氨基全氫喹唑啉型化合物，是自然界 中所發(fā)現(xiàn)的毒性最大的神經(jīng)毒素之一，可高選擇性和高親和性地阻斷神經(jīng)興奮膜上的鈉離 子通道。河豚毒素是小分子量、非蛋白質(zhì)的神經(jīng)性毒素，其毒性比劇毒氰化鈉還要高1250 多倍，0. 5mg即可致死。河豚毒素與鈉通道的SS1/SS2亞基具有高特異性和高親和力的結(jié) 合，過去幾十年已作為一種工具藥物廣泛用于藥理學(xué)研究，特別是在神經(jīng)和肌肉生理領(lǐng)域。 TTX具有鎮(zhèn)痛、降壓、抗心律失常、局麻、戒毒及抑瘤的功效。將河豚毒素應(yīng)用于制藥領(lǐng)域的 先決條件是制備足量高純度、高質(zhì)量的河豚毒素。
[0003] 對(duì)河豚毒素的提取一般分為兩步，包括從河豚魚組織中提取河豚毒素粗品，即提 取步驟，和從河豚毒素粗品中精制高純度河豚毒素，即純化精制步驟。
[0004] 1950年，Yokoo成功獲得了最小致死劑量（MLD)為0. Olgamma的結(jié)晶河豚毒素。 (J. Chem. Soc. Japan71，590 (1950))。他從河豚魚獲得卵巢組織，用水浸出河豚毒素，蒸干， 獲得MLD為40. ga_a的干物質(zhì)。接著他用醋酸鉛和氨沉淀毒素，然后用磷酸鎢酸和汞苦味 酸鹽除去雜質(zhì)，用苯肼除糖。再次使用汞苦味酸鹽以沉淀毒素，接著用苦酮酸-甲醇-苦酮 酸處理獲得結(jié)晶毒。但該提取方法用20公斤卵巢，只獲得13毫克的結(jié)晶河豚毒素。
[0005] 在 1951 年，Nagai (Fukuoka Ishi45,1 (1954))使用離子交換樹脂（Amberlite IRC-50)吸附毒素，用鹽酸溶液洗脫，然后用Amberlite IR-4B處理該洗脫液以除去鹽酸。 濃縮后，用無水乙醇來提取毒素。該提取方法用20公斤河豚魚的卵巢只得到2. 5毫克毒素 晶體。
[0006] 1952 年，Tsuda 和 Kawamura 使用圓形濾紙色譜法（K. Tsuda 等人，J. Pharm. Soc. Japan72, 187, 771 (1952))獲得MLD = 10 μ g/公斤毒素。后來他們通過活性炭柱層析發(fā)展 了大規(guī)模生產(chǎn)的方法（Tsuda, Kagaku no Ryouiki, supplement, 80, 9(1967))，能夠處理千 公斤豚魚卵巢，并取得10克MLD= 10. μ g/公斤毒素。同時(shí)，Woodward (R.B. Boodward, Pure Appl. Chem. 9, 49-74(1964)取得了類似的結(jié)果。
[0007] 1964 年，Goto Toshio 等人（Goto Toshio and Takahashi 等人，J. Chem. Soc. Japan85, 508 (1964))簡(jiǎn)化了工藝流程，采用離子交換和活性炭吸附，從百公斤河豚卵巢只 得到1-2克所謂的粗毒素。
[0008] 1980年后，一些改進(jìn)的方法不時(shí)被報(bào)道，但普遍跟進(jìn)Goto Toshio等人的方法，產(chǎn) 量沒有增加。值得指出的是，廣西和加拿大Wex Medical Instrumentation Co. ,Ltd.發(fā)表 的2003年美國專利US6, 552, 191中提供的提取方法是迄今為止最好的，產(chǎn)量比其他方法增 加了 3倍，處理20公斤河豚卵巢，取得1克80-90%純度的河豚毒素。
[0009] 然而，所有這些方法都包含一些讓河豚毒素大量損失的步驟，例如：（1)醋酸提取 液加熱脫脂；(2)使用離子交換樹脂和活性炭吸附；（3)調(diào)節(jié)pH到堿性條件，沉淀河豚毒素 重結(jié)晶等等。此外，從河豚卵巢等組織樣品提取河豚毒素是一個(gè)緩慢的過程，是整個(gè)工藝中 的限速步驟，需要重復(fù)8-20次醋酸提取，同時(shí)伴有河豚毒素的大量損失和失活。
[0010] 專利 CN1470514A、 CN101391999A、 CN102584843A、 CN101367821A 以及 CN102584843A都公開了使用高效液相進(jìn)行河豚毒素的提取和純化，但本領(lǐng)域的研究依然進(jìn) 展緩慢。河豚毒素不溶于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑，在強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性條件下的水相中非常不穩(wěn) 定，即使是在弱酸性條件下LC-MS或LC-MS/MS分析表明，河豚毒素8小時(shí)后也失去5-30% 活性。這些特點(diǎn)讓河豚毒素純化精制充滿技術(shù)挑戰(zhàn)。
[0011] 綜上所述，本領(lǐng)域急需尋找一種方法以應(yīng)用于從河豚魚組織中提取和初步純化河 豚毒素粗品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的在于提供一種提取和初步純化河豚毒素的方法，其可應(yīng)用于包括從 河豚魚組織中高產(chǎn)率提取河豚毒素粗品。
[0013] 為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0014] 本發(fā)明的目的在于提供一種從河豚魚內(nèi)臟組織中提取粗品河豚毒素的方法，其通 過使用本發(fā)明的連續(xù)流動(dòng)色譜工藝來完成，包括勻漿、透析、反相層析吸附除去雜質(zhì)、弱陽 離子交換濃縮純化和凍干。
[0015] 具體地，所述從河豚魚內(nèi)臟組織中提取河豚毒素方法的步驟為：
[0016] (1)勻漿：將河豚魚內(nèi)臟組織進(jìn)行勻漿，制得勻漿液；
[0017] (2)透析：將所述勻漿液放入透析袋中使用醋酸水溶液浸提，反復(fù)浸提，制得透析 液；
[0018] (3)反向+弱陰離子液相色譜分離：使用反向+弱陰離子交換雙層柱層析液相色 譜法吸附除去雜質(zhì)，收集包含所有河豚毒素及其類似物的第一洗脫液；
[0019] (4)弱陽離子色譜柱提取：將所述第一洗脫液通過弱陽離子交換色譜柱，河豚毒 素保留濃縮到弱陽離子色譜柱上，使用流動(dòng)相醋酸溶液洗脫，制得第二洗脫液；
[0020] (5)凍干：將所述第二洗脫液冷凍干燥，制得粗品河豚毒素干粉。
[0021] 所述河豚魚內(nèi)臟組織為卵巢、血液和/或任何河豚毒素富集的組織，優(yōu)選卵巢。所 述勻楽使用 Polytron、Robot Coupe、Tissumizer、Tissue Tearor 或 Powergen 勻楽儀，優(yōu) 選Polytron或Robot Coupe勻楽儀，所述勻楽儀依靠聲音或旋轉(zhuǎn)刀板的機(jī)械力破開細(xì)胞組 織，將堅(jiān)硬組織（包括優(yōu)選卵巢、肌肉）轉(zhuǎn)化為勻漿液，使河豚毒素在從細(xì)胞中釋放，以游離 的形式存在于所述勻漿液中以便透析提取。
[0022] 所述透析使用濃度為0. 1% -1%的醋酸溶液，例如0. 1%、0. 4%、0. 6%、0. 8%和 1%，透析袋內(nèi)外使用濃度相同的的醋酸水溶液，反復(fù)透析直至使用LC-MS/MS檢測(cè)到最后 醋酸透析液河豚毒素濃度低于〇. 1 μ g/L，原料中河豚毒素含量和實(shí)際重復(fù)醋酸透析次數(shù)由 LC-MS/MS分析來準(zhǔn)確。所述反復(fù)浸提的次數(shù)可為8-20次，例如8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19或20次。重復(fù)浸提透析確保完整提取和回收河豚毒素。
[0023] 中規(guī)?；蚬I(yè)規(guī)模生產(chǎn)時(shí)使用陶瓷膜專業(yè)生產(chǎn)設(shè)備或橫向流納濾膜儀器替換透 析袋。勻漿液使用醋酸溶液浸泡后500g離心力下離心3分鐘，上清液放入陶瓷膜專業(yè)生產(chǎn) 設(shè)備中進(jìn)行透析，沉積物重復(fù)使用1 %醋酸浸泡離心，直到LC-MS/MS分析表明醋酸上清液 河豚毒素濃度低于〇. 1 μ g/L。
[0024] LC-MS/MS檢測(cè)表明透析袋外部河豚毒素醋酸水溶液在4°C存儲(chǔ)8小時(shí)后失去 20-30%的活性，所以透析獲得的河豚毒素透析液需要立即作進(jìn)一步處理。
[0025] 所述透析液立即通過反向+弱陰離子交換雙層柱層析液相色譜法除去疏水性雜 質(zhì)，酸性雜質(zhì)和色素：利用C18+弱陰離子交換雙層柱層析液相色譜法保留除去疏水性雜 質(zhì)、酸性雜質(zhì)和色素。疏水性雜質(zhì)、酸性雜質(zhì)和色素可保留吸附在C18+弱陰離子交換雙層 層析柱上，而河豚毒素是堿性化合物，親水性強(qiáng)故不保留，收集制得包含所有河豚毒素及 其類似物的第一洗脫液。通過此步驟，可除去大量雜質(zhì)，并得到含有河豚毒素且雜質(zhì)量大大 減少的第一洗脫液。
[0026] 具體地，所述步驟3)的操作可為：50升河豚毒素醋酸透析液使用平流泵用IOOmL/ min的流速流過反向C18+弱陰離子交換（200克/200克/50mm 口徑）低壓雙層層析柱 (flash cartridge)。疏水性雜質(zhì)、酸性雜質(zhì)和色素保留吸附在C18+弱陰離子交換雙層層 析柱上，河豚毒素不保留，進(jìn)一步使用5升1%醋酸洗滌，收集得包含所有河豚毒素及其類 似物的55升第一洗脫液。
[0027] 經(jīng)反向C18+弱陰離子交換雙層柱層析液相色譜法進(jìn)行分離后，進(jìn)行弱陽離子色 譜柱提取制備第二洗脫液。所述流動(dòng)相醋酸溶液為2M醋酸水溶液。
[0028] 所述透析液經(jīng)C18+WAX混合床除去大量雜質(zhì)后，所得的第一洗脫液立即穿過本發(fā) 明的弱陽離子交換色譜柱，河豚毒素及其類似物保留在色譜柱上，然后使用2M醋酸洗脫。 河豚毒素及其類似物被濃縮50-1000倍。
[0029] 所述C18+WAX混合床和弱陽離子交換色譜柱可重復(fù)再生使用半年甚至更長的時(shí) 間，且所述C18+WAX混合床和弱陽離子交換色譜柱可以用作連續(xù)色譜流的模式，24小時(shí)連 續(xù)自動(dòng)操作。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可以采用連續(xù)流動(dòng)色譜模式或膨脹床吸附模式。
[0030] 所述從河豚魚內(nèi)臟組織中提取河豚毒素的方法中各個(gè)步驟都使用LC-MS/MS檢測(cè) 河豚毒素的濃度，這保證各個(gè)步驟的提取和回收完整，避免了活性損失，河豚毒素產(chǎn)量是現(xiàn) 有專利和文獻(xiàn)產(chǎn)量的10倍至100倍。
[0031] 由此可見，本發(fā)明提供的從河豚魚內(nèi)臟組織中提取粗品河豚毒素的方法，避免使 用加熱、活性炭吸附、重結(jié)晶等許多讓河豚毒素大量損失、降解和/或失活的工藝，使用勻 漿、透析、反相+弱陰離子交換色譜柱吸附雜質(zhì)、弱陽離子交換色譜柱吸附目標(biāo)化合物，實(shí) 現(xiàn)高回收率的河豚毒素提取，并使用LC-MS或LC-MS/MS檢測(cè)各個(gè)步驟中河豚毒素的濃度， 跟蹤河豚毒素，確保無損失、無目標(biāo)毒素丟棄、無有毒廢棄物對(duì)環(huán)境的污染，并可實(shí)現(xiàn)工藝 連續(xù)化和半自動(dòng)化。最后使用冷凍干燥技術(shù)，獲得純度為80%以上的河豚毒素干粉粗品。
[0032] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用高效液相色譜檢測(cè)所提取的河豚毒素粗品的質(zhì) 量，從該粗品的高效液相色譜圖可知，使用本發(fā)明的提取方法制備的河豚毒素粗品純度為 88. 7%。
[0033] 本發(fā)明所用的弱陽離子交換色譜柱為通過Schiff堿反應(yīng)將谷氨酸和/或聚谷氨 酸鍵合至醛基色譜硅膠制得的色譜柱，其中所述聚谷氨酸的聚合度為2-10 ;所述醛基色譜 硅膠是以醛基為鍵合官能團(tuán)，平均顆粒直徑為20-75 μ m的球形低壓或中壓色譜硅膠。所述 低壓指壓力為O-lObar，中壓是指10-50bar。
[0034] 本發(fā)明的弱陽離子交換色譜的制備方法可使用領(lǐng)域內(nèi)公開的制備方法，包括如下 步驟：
[0035] (1)合成聚谷氨酸：此制備方法無特殊限制，可通過已公開的方法進(jìn)行，如文獻(xiàn) J. Amer. Chem. Soc. 80, 3361etssq.，1958 所報(bào)道的制備方法；
[0036] (2)合成醛基色譜硅膠：此步驟將領(lǐng)域內(nèi)已知的色譜硅膠骨架改性成醛基色譜硅 膠，可通過已公開的方法實(shí)現(xiàn)；
[0037] (3)鍵合反應(yīng)：通過Schiff堿反應(yīng)將谷氨酸和/或聚谷氨酸鍵合至醛基色譜硅 膠，制得弱陽離子交換色譜柱。
[0038] 為了確保谷氨酸或聚谷氨酸可高密度化學(xué)鍵合到平均顆粒直徑為20-75 μ m的低 壓或中壓色譜硅膠上，聚谷氨酸的聚合度小于10。
[0039] 所述色譜填料還包括核-殼硅膠、球形剛性聚合物。
[0040] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述色譜硅膠骨架為球形B型硅膠，其特征參數(shù)為： 平均顆粒直徑20 μ m ;孔徑70 A;表面積480-530m2/g ;pH6-7 ;孔體積0. 8mL/g ;Si02純度 >99.95 ;重金屬含量〈lOppm。所述色譜硅膠骨架改性的一個(gè)實(shí)施方案為使用高碘酸鈉將平 均顆粒直徑為20-75 μ m的低壓或中壓二醇色譜硅鍵合相氧化，以產(chǎn)生醛基色譜硅膠鍵合 相。
[0041] 本發(fā)明所述的弱陽離子交換色譜柱具有高離子交換容量，用于提取和純化河豚毒 素及其類似物，取得了較高的TTX回收率。
[0042] 優(yōu)選地，中規(guī)模或工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)時(shí)C18+WAX混合床低壓色譜柱及弱陽離子交換低 壓色譜柱經(jīng)過優(yōu)化作為連續(xù)流色譜模式。
[0043] 優(yōu)選地，大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)使用連續(xù)流動(dòng)色譜模式或膨脹床吸附模式代替所述弱陽離 子交換色譜柱。
[0044] 本發(fā)明的目的還在于提供所述方法在提取和初步純化河豚毒素中的應(yīng)用。
[0045] 綜上所述，本發(fā)明的弱陽離子交換色譜、從河豚魚內(nèi)臟組織中提取河豚毒素的方 法和純化河豚毒素的方法明顯優(yōu)于領(lǐng)域內(nèi)已知技術(shù)，具有以下有益效果：
[0046] (1)本發(fā)明提供的從河豚魚內(nèi)臟組織中提取粗品河豚毒素的方法，避免使用加熱、 活性炭吸附、重結(jié)晶等許多讓河豚毒素大量損失、降解和/或失活的工藝，使用勻漿、透析、 反相色譜柱吸附雜質(zhì)、弱陽離子交換色譜柱吸附目標(biāo)化合物，實(shí)現(xiàn)高回收率的河豚毒素提 取，并使用LC-MS或LC-MS/MS檢測(cè)各個(gè)步驟中河豚毒素的濃度，跟蹤河豚毒素，確保無毒性 產(chǎn)物的拋棄、無有毒廢棄物對(duì)環(huán)境的污染，并可實(shí)現(xiàn)工藝連續(xù)化和半自動(dòng)化。最后使用冷凍 干燥技術(shù)，獲得純度為80%以上的粗品河豚毒素干粉。
[0047] (2)使用本發(fā)明的工藝，尤其是連續(xù)流色譜和特別的弱陽離子交換材料，可以一 次性處理IOkg河豚魚的卵巢，獲得10-20克80% -90%純度河豚毒素干粉。
[0048] (3)本發(fā)明提供的方法融合多種工藝，在保存河豚毒素活性的情況下可實(shí)現(xiàn)90% 以上的回收率，而現(xiàn)有專利的回收率不超過10%，還伴隨嚴(yán)重的活性損失。因而本發(fā)明在 提取和純化河豚毒素中取得了顯著進(jìn)步。河豚毒素產(chǎn)量是現(xiàn)有專利和文獻(xiàn)產(chǎn)量的10倍至 100 倍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0049] 圖1為本發(fā)明提取的粗品河豚毒素干粉的高效液相色譜圖。
[0050] 圖2為河豚毒素的的LC-MS/MS圖。

【具體實(shí)施方式】
[0051] 下面結(jié)合附圖并通過【具體實(shí)施方式】來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0052] 實(shí)施例1 :鍵合谷氨酸和/或聚谷氨酸的弱陽離子交換色譜柱的制備方法
[0053] 本發(fā)明的弱陽離子交換色譜柱的制備方法可使用領(lǐng)域內(nèi)公開的制備方法，其中一 種制備方法為：
[0054] (1)依據(jù)文獻(xiàn) J. Amer. Chem. Soc.，80, 3361etssq.，1958 合成聚合度為 8 的聚谷氨 酸；
[0055] (2)選用球形B型二醇硅膠作為色譜硅膠骨架，用高碘酸鈉處理所述骨架，制備 20 μ m的醛基色譜硅膠。所述B型二醇硅膠的參數(shù)示于表1 ;
[0056] (3)將所述聚合度為8的聚谷氨酸通過Schiff堿反應(yīng)鍵合到上述醛基色譜骨架， 制得本發(fā)明所述的弱陽離子交換色譜柱。
[0057] 表1球形B型硅膠的技術(shù)參數(shù)

【權(quán)利要求】
1. 一種從河豚魚內(nèi)臟組織中提取并初步純化河豚毒素的方法，其特征在于，所述方法 包括如下步驟： (1) 勻漿：將河豚魚內(nèi)臟組織進(jìn)行勻漿，制得勻漿液； (2) 透析：將所述勻漿液放入透析袋中，使用醋酸水溶液反復(fù)浸提，制得透析液； (3) 反向+弱陰離子液相色譜分離：使用反向+弱陰離子交換雙層柱層析液相色譜法 吸附除去雜質(zhì)，收集包含所有河豚毒素及其類似物的第一洗脫液； (4) 弱陽離子色譜柱提取：將所述第一洗脫液通過弱陽離子交換色譜柱，河豚毒素保 留濃縮到弱陽離子色譜柱上，使用流動(dòng)相醋酸溶液洗脫，制得第二洗脫液； (5) 凍干：將所述第二洗脫液冷凍干燥，制得河豚毒素干粉粗品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)所述的河豚魚內(nèi)臟組織為卵巢和 /或血液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述勻楽使用Polytron、Robot Coupe、Tissumizer、Tissue Tearor 或 Powergen 勻楽儀，優(yōu)選為 Polytron 或 Robot Coupe 勻漿儀。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)所述的透析使用濃 度為0. 1% -1%的醋酸溶液，透析袋內(nèi)外使用濃度相同的的醋酸水溶液； 優(yōu)選地，所述反復(fù)浸提的次數(shù)為8-20次； 優(yōu)選地，中規(guī)?；蚬I(yè)規(guī)模生產(chǎn)時(shí)使用陶瓷膜專業(yè)生產(chǎn)設(shè)備或橫向流納濾膜儀器替換 透析袋。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟（3)調(diào)節(jié)所述透析液的 pH值至4-5。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟（4)所述的流動(dòng)相醋酸 溶液為2M醋酸水溶液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法中各個(gè)步驟都使用 LC-MS/MS檢測(cè)河豚毒素的濃度以確保無河豚毒素的損失和拋棄。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述弱陽離子交換色譜柱為通 過SchifT堿反應(yīng)將谷氨酸和/或聚谷氨酸鍵合至醛基色譜硅膠而制得的色譜柱； 優(yōu)選地，中規(guī)模或工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)時(shí)C18+WAX混合床低壓色譜柱及弱陽離子交換低壓色 譜柱經(jīng)過優(yōu)化作為連續(xù)流色譜模式。 優(yōu)選地，大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)使用連續(xù)流動(dòng)色譜模式或膨脹床吸附模式代替所述弱陽離子交 換色譜柱。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述聚谷氨酸的聚合度為2-10 ;所述醛基 色譜硅膠是以醛基為鍵合官能團(tuán)，平均顆粒直徑為20-75 的球形低壓或中壓色譜硅膠。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9所述的方法在提取或初步純化河豚毒素中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07D491/22GK104311569SQ201410453916
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】楊育暉 申請(qǐng)人:無錫科奧美萃生物科技有限公司