一種巨細(xì)胞人免疫球蛋白及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種巨細(xì)胞人免疫球蛋白，其巨細(xì)胞病毒中和抗體效價(jià)大于等于1:400，免疫球蛋白純度大于等于總蛋白的96%，本發(fā)明還公開(kāi)了所述巨細(xì)胞人免疫球蛋白的制備方法，包括如下步驟：（1）篩選出巨細(xì)胞病毒中和抗體效價(jià)滴度大于等于1:50的血漿原料；（2）制備混合血漿供試品；（3）將所述混合血漿供試品按低溫乙醇或?qū)游龇ǖ鞍追蛛x方法，分離提取免疫球蛋白組分，經(jīng)過(guò)濾、層析、超濾、病毒滅活、配置后分裝得到產(chǎn)品。本發(fā)明所述巨細(xì)胞人免疫球蛋白可以針對(duì)性的對(duì)巨細(xì)胞病毒進(jìn)行治療，是治療巨細(xì)胞病毒感染癥的有效藥物，具有較大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種巨細(xì)胞人免疫球蛋白及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，特別是涉及一種巨細(xì)胞人免疫球蛋白及其制備方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]巨細(xì)胞病毒CMV (Cytomegalovirus)是皰疹病毒科P屬的DNA病毒，由巨細(xì)胞病毒引起的孕婦、新生兒、器官移植患者、免疫抑制者感染死亡率可達(dá)50~80%。巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白CMV-1gG因能特異中和巨細(xì)胞病毒，臨床上主要用其治療孕婦、新生兒、免疫抑制患者及器官移植手術(shù)印發(fā)的巨細(xì)胞病毒重癥感染。普通人群中的巨細(xì)胞病毒自然感染率可達(dá)80%以上，從健康人群中篩選并采集含高效價(jià)巨細(xì)胞病毒IgG抗體的血漿，采用低溫乙醇工藝分離純化方法制備巨細(xì)胞人免疫球蛋白藥物，對(duì)于治療因巨細(xì)胞病毒引起的重癥感染具有不可替代的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供提供一種有效治療巨細(xì)胞病毒重癥感染的人免疫球蛋白及其制備方法。
[0004]一種巨細(xì)胞人免疫球蛋白，其巨細(xì)胞病毒中和抗體效價(jià)大于等于1:400，免疫球蛋白純度大于等于總蛋白的96%。
[0005]本發(fā)明所述的巨細(xì)胞人免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白與正常人血清相比，主要沉丨疋線為1gG。
[0006]本發(fā)明所述的巨細(xì)胞人免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白的IgG單體及二聚體含量之和大于等于96%。
[0007]本發(fā)明所述的巨細(xì)胞人免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白的劑型為液體制劑或凍干劑型。
[0008]一種巨細(xì)胞人免疫球蛋白的制備方法，包括如下步驟:
[0009](I)用中和試驗(yàn)法篩選出巨細(xì)胞病毒中和抗體效價(jià)滴度大于等于1:50的血漿原料；
[0010](2)以篩選后的所述血漿原料制備混合血漿供試品，所述混合血漿原料由不少于500名供血漿者的所述血漿原料混合而成，所述混合血漿供試品的巨細(xì)胞病毒中和抗體效價(jià)滴度大于等于1:80 ;
[0011](3)將所述混合血漿供試品按低溫乙醇?jí)簽V結(jié)合層析法蛋白分離方法，分離提取免疫球蛋白組分，經(jīng)過(guò)濾、層析、超濾、病毒滅活、配置后分裝得到產(chǎn)品。
[0012]本發(fā)明所述的巨細(xì)胞人免疫球蛋白的制備方法，其中，步驟(1)所述中和試驗(yàn)法具體包括如下步驟:
[0013](A)樣品稀釋:
[0014]血漿樣本用細(xì)胞維持液預(yù)先進(jìn)行1:10稀釋后56°C滅活30分鐘；
[0015]打開(kāi)足夠量的96孔細(xì)胞板，標(biāo)明病毒回滴用板和樣品試驗(yàn)板,并在各樣品試驗(yàn)板上標(biāo)示該板試驗(yàn)樣品的編號(hào)；
[0016]在樣品試驗(yàn)板的各樣品孔中加入40ul細(xì)胞維持液，病毒回滴孔與陰性對(duì)照孔加入50 ill細(xì)胞維持液；
[0017]將預(yù)先滅活的樣品液分別加入到相應(yīng)96孔細(xì)胞板的相應(yīng)位置，每孔加樣品10 yl，每樣品平行做兩孔；
[0018]所述細(xì)胞維持液為體積比為5%的胎牛血清的DMEM液； [0019](B)攻擊病毒
[0020]制備攻擊病毒液:根據(jù)試驗(yàn)的標(biāo)本數(shù)用維持液制備足量的攻擊病毒液，將應(yīng)用病毒要稀釋到100CCID5Q/0.05ml ;除病毒回滴孔與陰性對(duì)照孔外，其余各孔中均加入50 含10ccid50的攻擊病毒液；
[0021]回滴IOOCCID5ci攻擊病毒液:用細(xì)胞維持液將攻擊病毒液作10 — \ 10 —2、10 — 3稀釋?zhuān)瑢⒐舨《疽号c其10 — \ 10 —2、10 —3濃度的病毒液加入到相應(yīng)的病毒回滴用96孔細(xì)胞板孔中，每個(gè)稀釋度加10孔，50 Ul/孔；
[0022]陰性對(duì)照:向陰性對(duì)照各孔中再加入50 Ul細(xì)胞維持液；
[0023]將所有96孔細(xì)胞板放入37°C、含有CO2體積百分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中和培養(yǎng)2小時(shí)；
[0024](C)細(xì)胞懸液的配制與添加
[0025]細(xì)胞懸液的配制:取足夠量的MRC-5細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，試驗(yàn)用細(xì)胞懸液濃度應(yīng)為
IX IO5個(gè)/ml，配好的細(xì)胞液立即使用或置4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0026]細(xì)胞懸加:中和培養(yǎng)后每孔加細(xì)胞懸液100 ill，約I XlO4個(gè)/孔；
[0027](D)培養(yǎng)及觀察統(tǒng)計(jì)
[0028]將完成以上操作的96孔細(xì)胞板放置37°C、含有CO2體積百分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)11天，病毒接種后的第7天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，第9天觀察細(xì)胞病變情況，第11天最終判定結(jié)果，并記錄統(tǒng)計(jì)。
[0029]本發(fā)明所述的巨細(xì)胞人免疫球蛋白的制備方法，其中，步驟(3)具體包括如下步驟:
[0030]a)將所述混合血漿供試品在2V下離心去除冷沉淀；
[0031]b)去除冷沉淀后的血漿用生理鹽水稀釋成反應(yīng)液，用pH值為4.0的醋酸緩沖液調(diào)節(jié)所述反應(yīng)液PH值至6.5，加體積百分比95%乙醇至所述反應(yīng)液中，使最終乙醇體積百分比為20%，使用冷媒控制反應(yīng)液溫度至-4.5°C，板框壓濾分離得沉淀；
[0032]c)將步驟b)獲得的沉淀用0°C、10倍0.01mol/L的NaCl溶液攪拌并溶解；
[0033]d)向步驟c)所得的溶解液中加體積百分比50%乙醇形成反應(yīng)液，使最終乙醇體積百分比為17%，以醋酸緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值至5.1，使用冷媒控制反應(yīng)液溫度至-4.5 °C，板框壓濾分離除去沉淀，收集上清液；
[0034]e)將步驟d)收集的上清液超濾透析四遍后上DEAE-Sepharose-Fast Flow弱陰離子交換層析，反應(yīng)溫度為10°C，收集流出液；
[0035]f)將步驟e)的流出液進(jìn)行再超濾，以醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值至4.0，溫度至10°C ；
[0036]g)透析8遍后濃縮；
[0037]h)將濃縮后獲得的濃縮液用2mol/L的冰醋酸調(diào)pH至3.85，加入質(zhì)量百分比為30%的麥芽糖使最終濃度在10%作為保護(hù)劑，補(bǔ)加生理鹽水使蛋白質(zhì)量百分含量為5.8%，得到原液；
[0038]i)將所述原液在24~25°C下孵放21天后用納米膜過(guò)濾的雙病毒滅活處理；
[0039]j)無(wú)菌分裝后得到產(chǎn)品。 [0040]本發(fā)明所述巨細(xì)胞人免疫球蛋白與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在于:
[0041]本發(fā)明提供的巨細(xì)胞人免疫球蛋白，巨細(xì)胞中和抗體效價(jià)大于等于1:256，可以針對(duì)性的對(duì)巨細(xì)胞病毒進(jìn)行治療，是治療巨細(xì)胞病毒感染癥的有效藥物，具有較大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
[0042]本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)點(diǎn):
[0043](I)采用國(guó)家已有標(biāo)準(zhǔn)的巨細(xì)胞病毒株作為檢測(cè)載體，從健康人群中篩選出具有較高滴度的特異性原料血漿，其標(biāo)準(zhǔn)符合《中華人民共和國(guó)藥典》2010版中“生物制品生產(chǎn)用血漿”規(guī)定，經(jīng)低溫乙醇?jí)簽V工藝結(jié)合柱層析純化制備出高滴度的巨細(xì)胞人免疫球蛋白，特異性高。
[0044](2)采用中和試驗(yàn)法對(duì)原料及產(chǎn)品進(jìn)行抗體效價(jià)的檢測(cè)，該方法具有操作性強(qiáng)，靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。
[0045](3)收集的特異性原料血漿，采用低溫乙醇?jí)簽V工藝結(jié)合柱層析純化制備出的免疫球蛋白制劑，純度高、質(zhì)量穩(wěn)定。
【具體實(shí)施方式】
[0046]實(shí)施例1
[0047]1、供血漿者的血漿篩選采集:
[0048]選擇血漿，所選擇的血漿應(yīng)滿(mǎn)足以下條件:以中和試驗(yàn)法檢測(cè)血漿中的巨細(xì)胞中和抗體，中和效價(jià)滴度大于等于1:50 ;蛋白質(zhì)含量(雙縮脲法檢測(cè))大于等于55g/L ;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(賴(lài)氏法監(jiān)測(cè))不高于35單位；乙型肝炎表面抗原陰性，梅毒陰性，HIV-1/HIV-2抗體陰性，HCV抗體陰性等均合格的巨細(xì)胞人免疫球蛋白原料血漿，低溫冰凍儲(chǔ)存，保存期不超過(guò)2年。
[0049]中和試驗(yàn)法的測(cè)定方法包括如下步驟:
[0050]A)以人胚肺二倍體細(xì)胞MRC-5作為指示細(xì)胞，培養(yǎng)液為含10% (V/V)胎牛血清的DMEM，配制細(xì)胞濃度為I X IO4~I X IO6個(gè)/ml的MRC-5細(xì)胞懸液；
[0051]B)將血漿樣品供試品用細(xì)胞維持液(即為體積百分比5%的胎牛血清的DMEM液，下同)進(jìn)行1:10稀釋后，56°C滅活30分鐘。
[0052]取足夠量的細(xì)胞板，在樣品板中加入40ul/孔細(xì)胞維持液，然后加入相應(yīng)的1:10預(yù)稀釋滅活的各樣品液IOul/孔，每樣品平行2孔。
[0053]C)取巨細(xì)胞病毒CMV以細(xì)胞維持液稀釋至試驗(yàn)用濃度(即100XCCID50/0.05ml)等量加入供試品板孔中，并同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照孔、陰性對(duì)照孔和病毒回滴孔。
[0054]病毒(陽(yáng)性)對(duì)照孔:先在板孔中加入細(xì)胞維持液50ul/孔，然后加入應(yīng)用病毒液50ul/孔，混勻；
[0055]細(xì)胞(陰性)對(duì)照孔:直接加入細(xì)胞維持液IOOul/孔；
[0056]病毒回滴孔:先在板孔中加入細(xì)胞維持液50ul/孔,然后將應(yīng)用病毒液進(jìn)行10倍比稀釋后，分別取10°~10_3濃度的病毒液加至相應(yīng)病毒回滴孔中，50ul/孔；
[0057]D)中和反應(yīng):將各板孔中液體在混勻器上小心混勻后置二氧化碳培養(yǎng)箱中37°C，5%C02孵育進(jìn)行中和反應(yīng)2小時(shí)。
[0058]E)細(xì)胞:
[0059]細(xì)胞懸液的配制:取足夠量的MRC-5細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，用細(xì)胞維持液調(diào)節(jié)試驗(yàn)用細(xì)胞懸液濃度應(yīng)為IX IO5個(gè)/ml，配好的細(xì)胞液立即使用或置4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0060]細(xì)胞懸加:中和反應(yīng)時(shí)間滿(mǎn)后,每孔加細(xì)胞懸液IOOii I,約I X IO4個(gè)/孔。
[0061]F)培養(yǎng):將完成以上操作的細(xì)胞板放置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)11天，于第7天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，第9天觀察細(xì)胞病變情況，第11天最終判定結(jié)果，并記錄統(tǒng)計(jì)。
[0062]每次試驗(yàn)均須有病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照，病毒對(duì)照必須出現(xiàn)病變，細(xì)胞對(duì)照必須正常。結(jié)果判定:以能保護(hù)50%細(xì)胞不出現(xiàn)病變的供試品稀釋度為中和效價(jià)。本發(fā)明中所有提到的中和試驗(yàn)法均是上述相同的方式進(jìn)行，以下簡(jiǎn)稱(chēng)中和試驗(yàn)法。
[0063]含較高滴度的特異性血漿在投產(chǎn)前進(jìn)行混合檢測(cè)，抗體滴度不低于1:80，連續(xù)三批混合血漿檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。
[0064]表1.連續(xù)三批混合血漿檢測(cè)結(jié)果
[0065]第一批
[0066]
【權(quán)利要求】
1.一種巨細(xì)胞人免疫球蛋白，其特征在于:其巨細(xì)胞病毒中和抗體效價(jià)大于等于1:400,免疫球蛋白純度大于等于總蛋白的96%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述 的巨細(xì)胞人免疫球蛋白，其特征在于:所述免疫球蛋白與正常人血清相比，主要沉淀線為IgG。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的巨細(xì)胞人免疫球蛋白，其特征在于:所述免疫球蛋白的IgG單體及二聚體含量之和大于等于96%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巨細(xì)胞人免疫球蛋白，其特征在于:所述免疫球蛋白的劑型為液體制劑或凍干劑型。
5.權(quán)利要求1~4中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述巨細(xì)胞人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: (I)用中和試驗(yàn)法篩選出巨細(xì)胞病毒中和抗體效價(jià)滴度大于等于1:50的血漿原料； (2 )以篩選后的所述血漿原料制備混合血漿供試品，所述混合血漿供試品的巨細(xì)胞病毒中和抗體效價(jià)滴度大于等于1:80 ； (3)將所述混合血漿供試品按低溫乙醇?jí)簽V結(jié)合層析法蛋白分離方法，分離提取免疫球蛋白組分，經(jīng)過(guò)濾、層析、超濾、病毒滅活、配置后分裝得到產(chǎn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的巨細(xì)胞人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于:步驟(1)所述中和試驗(yàn)法具體包括如下步驟: (A)樣品稀釋: 血漿樣本用細(xì)胞維持液預(yù)先進(jìn)行1:10稀釋后56°C滅活30分鐘； 打開(kāi)足夠量的96孔細(xì)胞板，標(biāo)明病毒回滴用板和樣品試驗(yàn)板，并在各樣品試驗(yàn)板上標(biāo)示該板試驗(yàn)樣品的編號(hào)； 在樣品試驗(yàn)板的各樣品孔中加入40ul細(xì)胞維持液，病毒回滴孔與陰性對(duì)照孔加入50 u I細(xì)胞維持液； 將預(yù)先滅活的樣品液分別加入到相應(yīng)96孔細(xì)胞板的相應(yīng)位置，每孔加樣品10iU，每樣品平行做兩孔； 所述細(xì)胞維持液為體積比為5%的胎牛血清的DMEM液； (B)攻擊病毒 制備攻擊病毒液:根據(jù)試驗(yàn)的標(biāo)本數(shù)用維持液制備足量的攻擊病毒液，將應(yīng)用病毒要稀釋到100CCID5(i/0.05ml ;除病毒回滴孔與陰性對(duì)照孔外，其余各孔中均加入50 yl含10ccid50的攻擊病毒液； 回滴IOOCCID5ci攻擊病毒液:用細(xì)胞維持液將攻擊病毒液作10 — \ 10 —2、10 —3稀釋?zhuān)瑢⒐舨《疽号c其10 —\ 10 —2、10 —3濃度的病毒液加入到相應(yīng)的病毒回滴用96孔細(xì)胞板孔中，每個(gè)稀釋度加10孔，50 Ul/孔； 陰性對(duì)照:向陰性對(duì)照各孔中再加入50iU細(xì)胞維持液； 將所有96孔細(xì)胞板放入37°C、含有CO2體積百分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中和培養(yǎng)2小時(shí)； (C)細(xì)胞懸液的配制與添加 細(xì)胞懸液的配制:取足夠量的MRC-5細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，試驗(yàn)用細(xì)胞懸液濃度應(yīng)為I X IO5個(gè)/ml，配好的細(xì)胞液立即使用或置4°C保存?zhèn)溆茫? 細(xì)胞懸加:中和培養(yǎng)后每孔加細(xì)胞懸液100 iil，約I XlO4個(gè)/孔；(D)培養(yǎng)及觀察統(tǒng)計(jì) 將完成以上操作的96孔細(xì)胞板放置37°C、含有CO2體積百分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)11天，病毒接種后的第7天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，第9天觀察細(xì)胞病變情況，第11天最終判定結(jié)果，并記錄統(tǒng)計(jì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的巨細(xì)胞人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于:步驟(3)具體包括如下步驟: a)將所述混合血漿供試品在2°C下離心去除冷沉淀； b)去除冷沉淀后的血漿用生理鹽水稀釋成反應(yīng)液，用pH值為4.0的醋酸緩沖液調(diào)節(jié)所述反應(yīng)液PH值至6.5，加體積百分比95%乙醇至所述反應(yīng)液中，使最終乙醇體積百分比為20%，使用冷媒控制反應(yīng)液溫度至-4.5°C，板框壓濾分離得沉淀； c)將步驟b)獲得的沉淀用0°C、10倍0.01mol/L的NaCl溶液攪拌并溶解； d)向步驟c)所得的溶解液中加體積百分比50%乙醇形成反應(yīng)液，使最終乙醇體積百分比為17%，以醋酸緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值至5.1，使用冷媒控制反應(yīng)液溫度至-4.5°C，板框壓濾分離除去沉淀，收集上清液； e)將步驟d)收集的上清液超濾透析四遍后上DEAE-Sepharose-FastFlow弱陰離子交換層析，反應(yīng)溫度為10°C，收集流出液； f)將步驟e)的流出液進(jìn)行再超濾，以醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值至4.0，溫度至10°C ； g)透析8遍后濃縮； h)將濃縮后獲得的濃`縮液用2mol/L的冰醋酸調(diào)pH至3.85，加入質(zhì)量百分比為30%的麥芽糖使最終濃度在10%作為保護(hù)劑，補(bǔ)加生理鹽水使蛋白質(zhì)量百分含量為5.8%，得到原液； i)將所述原液在24~25°C下孵放21天后用納米膜過(guò)濾的雙病毒滅活處理； j)無(wú)菌分裝后得到產(chǎn)品。
【文檔編號(hào)】C07K1/16GK103554252SQ201310573517
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】鄧?yán)? 胡輝恒, 汪模正, 邵恒波 申請(qǐng)人:同路生物制藥股份有限公司