非天然雙功能糖及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種式I的非天然雙功能糖9-AzSiaDAz和/或式Ⅱ的非天然雙功能糖9-AzSiaNAl及其制備方法與應(yīng)用。所述非天然雙功能糖9-AzSiaDAz和9-AzSiaNAl能夠作為探針用于細(xì)胞標(biāo)記。單一的功能團(tuán)無法實(shí)現(xiàn)糖與糖結(jié)合蛋白之間相互作用的高通量、實(shí)時(shí)的捕捉和進(jìn)行雙色成像。而本發(fā)明所開發(fā)的含有正交反應(yīng)基團(tuán)和光交聯(lián)基團(tuán)的雙功能非天然糖探針，在不需要對蛋白進(jìn)行修飾的條件下，通過UV光照使得糖蛋白共價(jià)交聯(lián)在非天然雙功能糖上，再通過親和捕獲純化出蛋白。本發(fā)明所開發(fā)的含有兩個(gè)不同正交反應(yīng)基團(tuán)的雙功能非天然糖探針，可以通過發(fā)生兩步Click反應(yīng)進(jìn)行雙色成像。
【專利說明】非天然雙功能糖及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化學(xué)糖生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及非天然雙功能糖的合成及其在細(xì)胞表面標(biāo)記中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]唾液酸具有重要的生物學(xué)功能，在抗炎、抗腫瘤、抗病毒治療等方面發(fā)揮著極為重要的作用，但是由于傳統(tǒng)的生化手段及基因技術(shù)的局限性，人們對唾液酸在細(xì)胞層面的研究相對滯后。近年來，通過糖的生物代謝途徑引入化學(xué)探針的策略備受科學(xué)家們的青睞。其以化學(xué)生物學(xué)方法為切入點(diǎn)，通過對非天然基團(tuán)的設(shè)計(jì)可以在細(xì)胞表面引入生物正交反應(yīng)基團(tuán)，并通過生物正交反應(yīng)在活細(xì)胞條件下引入探針分子，進(jìn)而在活細(xì)胞的生理?xiàng)l件下從分子水平揭示特定糖基化功能的機(jī)理。唾液酸的N-Acetyl和9號位可以進(jìn)行化學(xué)修飾，而唾液酸的生物合成前體ManNAc (N-乙酰-D-甘露糖胺)的N-Acetyl類似物也可通過代謝途徑轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的唾液酸表達(dá)在細(xì)胞表面。這些修飾基團(tuán)包括正交反應(yīng)基團(tuán)以及光交聯(lián)基團(tuán)等，其中疊氮和端炔為最重要的兩個(gè)生物正交反應(yīng)基團(tuán)。這兩個(gè)基團(tuán)可以進(jìn)行點(diǎn)擊化學(xué)、Staudinger Ligat1n等生物正交反應(yīng),從而偶聯(lián)上一系列探針。含有diazirine (雙吖丙啶)等光交聯(lián)基團(tuán)的非天然糖探針最近也被發(fā)展出來用于捕獲蛋白與唾液酸之間的相互作用。但是這種僅含有一個(gè)基團(tuán)的非天然糖無法實(shí)現(xiàn)糖與糖結(jié)合蛋白之間相互作用的高通量、實(shí)時(shí)的捕捉，也無法實(shí)現(xiàn)高通量無偏差地分離鑒定糖結(jié)合蛋白的問題。
[0003]基于在唾液酸N-AcetyKN-乙酰基)上和9號位上均有成功修飾的非天然糖探針，可以在這兩個(gè)位置同時(shí)引入不同的基團(tuán)，如在這兩個(gè)位置同時(shí)引入兩個(gè)不同的生物正交反應(yīng)基團(tuán)，就可以通過生物正交反應(yīng)引入兩個(gè)具有不同顏色的熒光分子，用于雙色成像；還可以分別引入一個(gè)生物正交反應(yīng)基團(tuán)和一個(gè)光交聯(lián)基團(tuán)，同時(shí)進(jìn)行成像和富集提純。這些雙功能修飾在研究聚糖一聚糖、聚糖一蛋白相互作用中有重要的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種式I所示的非天然雙功能糖9-疊氮-N_(4-雙吖丙唳)戍?；窠?jīng)氨酸(9-AzSiaDAz)
[0005]

【權(quán)利要求】
1.一種式I所示的非天然雙功能糖9-疊氮-N-(4-雙吖丙啶)戊?；窠?jīng)氨酸
2.—種權(quán)利要求1所述的非天然雙功能糖的制備方法，其特征在于，包含步驟: 步驟一在避光的反應(yīng)容器中加入Ν-(4-雙吖丙啶)戊?；窠?jīng)氨酸和甲醇，然后向其中加入三氟乙酸使其反應(yīng)，反應(yīng)完成后濃縮、洗滌、分離，制得式III的Ν-(4-雙卩丫丙啶)戊酰基神經(jīng)氨酸-1-甲酯:
步驟二冰浴及惰性氣體保護(hù)下，將步驟一制備的式III的N- (4-雙吖丙啶)戊?；窠?jīng)氨酸-1-甲酯溶于干燥吡啶，攪拌，然后向其中加入對甲基苯磺酰氯，攪拌，經(jīng)濃縮、分離，制得式IV的9-對甲苯磺酰基-N-(4-雙吖丙啶)戊?；窠?jīng)氨酸-1-甲酯:
步驟三將步驟二制得的式IV的9-對甲苯磺酰基-N-(4-雙吖丙啶)戊?；窠?jīng)氨酸-1-甲酯與疊氮化鈉一起溶于丙酮和水，加熱回流，經(jīng)濃縮、分離即得所述式I的9-疊氮-N-(4-雙吖丙啶)戊?；窠?jīng)氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所有的反應(yīng)步驟均需在避光的條件下進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟一至步驟三中均以二氯甲烷和甲醇為洗脫劑過色譜柱分離殘余物。
5.一種式II所示的非天然雙功能糖9-疊氮-N-(4-炔基)戊?；窠?jīng)氨酸
6.一種權(quán)利要求5所述的非天然雙功能糖的制備方法，其特征在于，包含步驟: 步驟一在反應(yīng)容器中加入N- (4-炔基)戊酰神經(jīng)氨酸、甲醇和三氟乙酸，攪拌，濃縮，制得式V的N-(4-炔基)戊?；窠?jīng)氨酸-1-甲酯:
步驟二冰浴及惰性氣體保護(hù)下將步驟一制得的式V的N-(4-炔基)戊酰基神經(jīng)氨酸-1-甲酯)溶于干燥吡啶，攪拌，向其中加入對甲基苯磺酰氯，攪拌，經(jīng)濃縮、分離，制得式VI的9-對甲苯磺?；?N-(4-炔基)戊?；窠?jīng)氨酸-1-甲酯:
步驟三將步驟二制得的式VI的9-對甲苯磺?；?N-(4-炔基)戊?；窠?jīng)氨酸-1-甲酯和疊氮化鈉一起溶于丙酮和水，加熱回流，濃縮、分離即得所述式II的9-疊氮-N-(4-炔基)戊?；窠?jīng)氨酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟一至步驟三中均以二氯甲烷和甲醇為洗脫劑過色譜柱分離殘余物。
8.權(quán)利要求1和/或5所述的非天然雙功能糖作為探針在細(xì)胞標(biāo)記中的應(yīng)用。
9.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的非天然雙功能糖實(shí)現(xiàn)對糖的結(jié)合蛋白捕捉的方法，其特征在于，包含步驟: 步驟一采用含有權(quán)利要求1所述的非天然雙功能糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞； 步驟二通過UV光照，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜上與唾液酸相互作用的蛋白質(zhì)的光交聯(lián)； 步驟三應(yīng)用唾液酸苷酶從唾液酸上切掉細(xì)胞裂解液中唾液酸修飾的蛋白質(zhì)； 步驟四通過非天然雙功能糖的生物正交反應(yīng)，使非天然唾液酸上疊氮與帶有炔基的生物素反應(yīng)，生物素則與親和素結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對與糖相互作用蛋白質(zhì)的捕捉； 步驟五通過膠內(nèi)酶切和液相色譜-二級質(zhì)譜鑒定捕捉的蛋白。
10.一種應(yīng)用權(quán)利要求5所述的非天然雙功能糖實(shí)現(xiàn)雙色成像，其特征在于，包含步驟: 步驟一采用含有權(quán)利要求5所述的非天然雙功能糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞； 步驟二將洗凈的細(xì)胞與DBCO-Alexa Fluor488進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)； 步驟三用TECP溶液淬滅細(xì)胞上未反應(yīng)疊氮基團(tuán)； 步驟四向細(xì)胞加入預(yù)混疊氮熒光647探針的PBS反應(yīng)液進(jìn)行熒光標(biāo)記； 步驟五共聚焦熒光顯微鏡成像。
【文檔編號】C07H7/027GK104177451SQ201310195243
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月23日
【發(fā)明者】陳興, 馮連順 申請人:北京大學(xué)