專利名稱：三孢布拉霉菌中類胡蘿卜素的高效提取新工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化工程領(lǐng)域，更具體涉及一種以微生物生物質(zhì)為原料的類胡蘿卜素的提取與純化工藝。
背景技術(shù)：
類胡蘿卜素是廣泛地存在于植物、動物、微生物及藻類中的一類含蓋了由黃到暗紅的多烯類物質(zhì)，具有很多功能，如能夠抗氧化、防癌癥、預(yù)防夜盲癥、著色力強等。類胡蘿卜素作為食品添加劑和營養(yǎng)增補劑，已經(jīng)得到FDA、歐洲共同體、WHO等國際組織的認可。近
年來更是被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健品及化妝品等領(lǐng)域中。
番茄紅素和β -胡蘿卜素是類胡蘿卜素中非常重要的兩種，它們具有很強的抗氧化能力和著色功能。植物是獲取番茄紅素和β_胡蘿卜素的重要來源之一，如番茄、胡蘿
卜，但植物中的類胡蘿卜素含量非常低，難于滿足日益增長的市場需求。微生物具有生長繁殖快、營養(yǎng)需求少、生長條件不苛刻等優(yōu)點，所以，利用微生物來生產(chǎn)天然的類胡蘿卜素，t匕用體積大、質(zhì)量重、生長周期長的水果、蔬菜等，更能節(jié)約成本、提高效率。三孢布拉霉菌是目前研究最廣泛的生產(chǎn)番茄紅素和胡蘿卜素重要菌株。由微生物中提取類胡蘿卜素通常首先獲得粗提物，一般為油樹脂，而后再進行粗提物的分離純化，以獲得高含量的晶體。高含量的晶體可以很容易的制成各種制劑類型的產(chǎn)品，如微膠囊、油溶液產(chǎn)品、水可分散產(chǎn)品、乳劑產(chǎn)品等。專利W02011/145113A2將酸化醇預(yù)處理后的菌絲體采用溶劑萃取，萃取液經(jīng)一定濃縮后低溫結(jié)晶，晶體過濾后干燥，母液則進一步濃縮成油樹脂，該法所得番茄紅素晶體或β -胡蘿卜素晶體含量可達99%以上，但破壁率較低，提取后的菌絲體殘渣中仍剩余10%以上的類胡蘿卜素，且提取溶劑用量大。專利W02002/0025548A1、CN1472183A、CN101417917A 公布了一種從菌絲體中制備含量大于90%的β-胡蘿卜素晶體的方法。該方法采用溶劑萃取，萃取液經(jīng)水洗后，濃縮結(jié)晶獲得粗晶體，再經(jīng)多次不同溶劑的洗滌得到高含量的晶體。該法純化工藝繁瑣，損失大，通過實例看，收率僅有 30% 40%ο 專利 CN1472183A、CN101417917A、CN10187 0668Α 也采用低溫結(jié)晶方法，雖然晶體純度可達95%以上，但收率都較低。專利US5858700、CN1363554A采用皂化方法，堿處理類胡蘿卜素油樹脂以獲得晶體。皂化方法需較劇烈的反應(yīng)條件和長時間的高溫，在這一過程中會造成類胡蘿卜素的大量損失，所得晶體還需進一步的洗滌純化等，工藝步驟繁瑣。添加反溶劑促結(jié)晶的方法是菌絲體中類胡蘿卜素提取常用的一種方法。專利 W001/12832A1(CN1370241A)、W003/056028A1 (CN1617934Α)US2005106657Α1、AU2011253728A1、US2004067550A1將干燥菌絲體破壁后進行溶劑萃取，萃取液濃縮后添加反溶劑結(jié)晶，最終獲得95%以上含量的類胡蘿卜素晶體。CN1528906A也采用在萃取液中添加反溶劑促結(jié)晶的方法獲得番茄紅素晶體，并包含多次重結(jié)晶步驟。專利US2010/0145116Α1先用混合食品級溶劑提取菌絲體中的類胡蘿卜素，然后再用親脂性混合溶劑通過液一液萃取提取溶劑中的類胡蘿卜素，而后在類胡蘿卜素萃取液中添加反溶劑結(jié)晶。添加反溶劑促結(jié)晶的工藝復(fù)雜，形成的大量混合溶劑不利于溶劑回收再利用，收率也較低。專利CN1760282A以菌絲體為原料，采用超臨界CO2流體萃取得到大于3%的番茄紅素油樹脂，然后溶于乙酸乙酯中，通過添加反溶劑低溫結(jié)晶得到含量大于60%的結(jié)晶番茄紅素制品，該工藝所需設(shè)備昂貴，形成大量混合溶劑，且獲得的產(chǎn)品純度低。專利US2OO2OO55I35AU WO98Z5O574AU W003/038064A2、US2OO3I3948OAUCN1396911A(W001/55100)以三孢布拉霉菌發(fā)酵液為原料，將破壁后的菌體通過離心獲得油狀結(jié)晶類胡蘿卜素懸浮液，此油狀結(jié)晶類胡蘿卜素懸浮液經(jīng)去脂、堿性醇洗、酸性水洗及反復(fù)的醇洗得到含量大于90%的晶體，且晶格中基本不含溶劑。該方法步驟繁瑣冗長，消耗大量溶劑，收率低，在β -胡蘿卜素菌絲體的提取中，晶體收率僅有35%。專利CN101838667A將預(yù)處理后的發(fā)酵產(chǎn)物進行三次循環(huán)提取，而后又經(jīng)濃縮、結(jié) 晶后又經(jīng)三步脫溶獲得番茄紅素油樹脂，步驟冗長，提取率低。CN10212691IA所述一種高效生產(chǎn)番茄紅素晶體的工業(yè)化方法中，番茄紅素油樹脂經(jīng)多次與烷烴類溶劑混合、溶解、離心得到含量大于90%的晶體，在這一過程中烷烴類溶劑溶解了大量番茄紅素，使晶體收率降低，并最終得到含量約5%副產(chǎn)品油樹脂。以發(fā)酵產(chǎn)物為原料制備高純度類胡蘿卜素晶體目前主要存在工藝復(fù)雜、溶劑用量大、收率低、晶體純度和質(zhì)量難以保證等問題，無論從效率方面還是成本方面都不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種高效的、低成本的、更適合于工業(yè)化生產(chǎn)的高含量類胡蘿卜素晶體的制備方法。本發(fā)明所述類胡蘿卜素晶體的制備方法包括如下步驟①在三孢布拉霉菌菌絲體中加入溶劑A進行細胞破壁，過濾，收集濾液；②將步驟①的濾液真空濃縮，回收溶劑得油樹脂；③在步驟②的油樹脂中加入溶劑B進行洗滌，過濾得粗晶體；④粗晶體干燥除去殘留溶劑后得高含量類胡蘿卜素晶體；其中所述溶劑A為乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷中的一種；所述溶劑B為乙酸乙酯、乙醇、甲醇中的一種。本發(fā)明所述的三孢布拉霉菌菌絲體是三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)干燥后獲得的生物質(zhì)，所述三孢布拉霉菌是一種產(chǎn)β_胡蘿卜素的高產(chǎn)菌，該菌具有獨特的代謝過程，番茄紅素是其代謝途徑中的一個中間產(chǎn)物，通過添加阻斷劑來抑制
胡蘿卜素生物合成途徑中番茄紅素環(huán)化酶的活性，從而積累番茄紅素。本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述的三孢布拉霉菌菌絲體為干番茄紅素菌絲體，所述干番茄紅素菌絲體為在三孢布拉霉菌培養(yǎng)過程中添加阻斷劑抑制β_胡蘿卜素生物合成途徑中番茄紅素環(huán)化酶的活性，從而積累番茄紅素，高產(chǎn)番茄紅素的三孢布拉霉菌發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)干燥后獲得的生物質(zhì)，富含番茄紅素。在此技術(shù)方案中獲得的晶體產(chǎn)品，其番茄紅素為80%以上，其它類胡蘿卜素含量小于3%。本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述的三孢布拉霉菌菌絲體為β_胡蘿卜素菌絲體，所述β-胡蘿卜素菌絲體為三孢布拉霉菌在培養(yǎng)過程中未添加阻斷劑，從而高產(chǎn)β-胡蘿卜素的三孢布拉霉菌發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)干燥后獲得的生物質(zhì)，富含β-胡蘿卜素。在此技術(shù)方案中獲得的晶體產(chǎn)品，其β_胡蘿卜素含量為80%以上，其它類胡蘿卜素含量小于3%。以上所述的技術(shù)方案中，步驟①所述的細胞破壁溫度優(yōu)選為10_50°C，細胞破壁時間優(yōu)選為O. 5-6小時，細胞破壁次數(shù)優(yōu)選為1-3次。以上所述的技術(shù)方案中，步驟①所述的三孢布拉霉菌菌絲體與溶劑A的質(zhì)量體積比(g:ml)優(yōu)選為1:1_10。以上所述的技術(shù)方案中，步驟②所述真空濃縮溫度優(yōu)選為40_50°C，真空濃縮時間優(yōu)選為O. 5-6小時。以上所述的技術(shù)方案中，步驟③所述油樹脂與溶劑B的質(zhì)量體積比(g:ml)優(yōu)選為1:1-10。 以上所述的技術(shù)方案中，步驟③所述洗滌溫度優(yōu)選為10-50°C，洗滌時間優(yōu)選為5-90分鐘，洗滌次數(shù)為1-5次。以上所述的技術(shù)方案中，步驟④所述粗晶體干燥溫度優(yōu)選為20_50°C，干燥至粗晶體中有機溶劑B的揮發(fā)份小于O. 5%。所述揮發(fā)份是指在晶體中殘留的有機溶劑的質(zhì)量百分比。以上所述的技術(shù)方案中，步驟①所述細胞破壁采用剪切、高壓均質(zhì)、研磨中的一種。本發(fā)明的整個步驟均在50°C以下的溫度條件下進行，有效防止在高溫中番茄紅素或β_胡蘿卜素發(fā)生降解或異構(gòu)化，最大程度上保證了產(chǎn)品的穩(wěn)定性。三孢布拉霉菌菌絲體含有豐富的類胡蘿卜素，但類胡蘿卜素大多存在于菌體內(nèi)部，用常用溶劑提取方法，不易提取，提取率很低，本發(fā)明采用在有機溶劑中進行細胞破壁的方法，提高菌絲體中類胡蘿卜素的溶出率，達到了提高提取效率的技術(shù)效果；另一方面，本發(fā)明在細胞破壁時使用對目標類胡蘿卜素溶解度大并且滲透力強的溶劑，達到了細胞破壁的同時對目標類胡蘿卜素進行提取的技術(shù)效果，在提高提取效率的同時，簡化了提取工藝，有益于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的類胡蘿卜素晶體制備方法中，將菌絲體提取液真空濃縮得到的油樹脂，采用有機溶劑洗滌后得到高含量的類胡蘿卜素晶體。目前對油樹脂的純化方法常用重結(jié)晶或皂化方法。重結(jié)晶通常得到的晶體純度較高，但這種方法采用的溶劑量大，需反復(fù)結(jié)晶，步驟復(fù)雜，收率很低；皂化方法需要較苛刻的皂化條件，如高溫，而類胡蘿卜素對高溫不穩(wěn)定，造成收率也較低，而且皂化后還需洗滌才能獲得晶體。本發(fā)明采用的油樹脂用有機溶劑洗滌的方法，操作簡單，使用有機溶劑量少，而且保證晶體的高純度，用本發(fā)明方法得到的晶體中總類胡蘿卜素含量高達80%以上。本發(fā)明的有益效果是( I)在有機溶劑中進行破壁，破壁的同時進行提取，破壁效果好，提取率高，簡化生產(chǎn)工藝，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。(2)所用溶劑種類少、用量小。(3)用本發(fā)明的制備方法，獲得含量大于80%的番茄紅素或β_胡蘿卜素晶體，其中其它類胡蘿卜素的含量低于3%。
(4)本發(fā)明的制備方法，相對于現(xiàn)有技術(shù)工藝簡單、流程短、損失少、成本低，易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。(5)實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的制備方法中步驟③中油樹脂用洗滌溶劑洗滌后得到的洗滌溶液，濃縮后可以得到含有1%以上的類胡蘿卜素的產(chǎn)品，類胡蘿卜素含量較高，可以作為本發(fā)明的副產(chǎn)品，應(yīng)用于飼料，這是現(xiàn)有技術(shù)未能達到的有益效果。
具體實施例方式下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規(guī)方法，所用材料、試劑等均可從生物或化學(xué)公司購買。本發(fā)明所用有機溶劑均為分析純。本發(fā)明所述三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)隸屬于毛霉目(Mucorales),棄 霉科(Choanephoraceae),布拉霉菌屬(Blakeslea),購于烏克蘭的Vitan公司。干番茄紅素菌絲體高產(chǎn)番茄紅素的三孢布拉霉菌發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)干燥后獲得的生物質(zhì)，購于烏克蘭的Vitan公司。干β -胡蘿卜素菌絲體高產(chǎn)β -胡蘿卜素的三孢布拉霉菌發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)干燥后獲得的生物質(zhì)，購于烏克蘭的Vitan公司。本發(fā)明用干番茄紅素菌絲體為原料時，菌絲體或晶體中總類胡蘿卜素的含量測定方法參照GB 28316-2012中所記載的方法；用干β_胡蘿卜素菌絲體為原料時，菌絲體或晶體中總類胡蘿卜素的含量測定方法參照GB 28310-2012中所記載的方法。菌絲體或晶體中總類胡蘿卜素的組成為用HPLC法測定，測定方法參照GB28316-2012中所記載的方法。所述提取率是指菌絲體中總類胡蘿卜素的提取率，用如下公式來計算
^油樹脂質(zhì)量X油樹脂總類胡蘿卜素含量
提取率(％) = - X100%
菌絲體質(zhì)量X菌絲體總類胡蘿卜素含量所述晶體收率是指獲得晶體中的總類胡蘿卜素所占原料總類胡蘿卜素的質(zhì)量百分比，用如下公式來計算
Q/t晶體質(zhì)量X晶體總類胡蘿卜素含量
晶體收率(％) = - X 100%
菌絲體質(zhì)量X菌絲體總類胡蘿卜素含量實施例1①取40g干番茄紅素菌絲體，其中總類胡蘿卜素含量為5. 1%，經(jīng)HPLC檢測其中番茄紅素與胡蘿卜素分別占80%、20%，菌絲體中加入200ml乙酸乙酯，在25°C用球磨機研磨30min，進行細胞破壁的同時提取菌絲體中類胡蘿卜素，過濾，收集濾液；②步驟①的濾洛中再加入200ml乙酸乙酯,在25°C球磨機研磨30min,過濾,收集濾液；濾渣中再加入200ml乙酸乙酯，在25°C球磨機研磨30min，過濾，收集濾液；③合并步驟①和②中得到的濾液，在50°C下經(jīng)真空濃縮得總類胡蘿卜素含量為5.12%的油樹脂39. 4g ;提取率為98. 9% ；④步驟③的油樹脂中加入400ml乙醇，在50°C下攪拌洗滌30min，過濾除去溶液，于40°C干燥2h，得總類胡蘿卜素含量為90. 6%的類胡蘿卜素晶體，晶體質(zhì)量為1. 88g ;晶體經(jīng)HPLC檢測總類胡蘿卜素，其中不含β-胡蘿卜素，番茄紅素含量為100%，晶體收率為83. 5%。所得晶體中番茄紅素含量為90. 6%，獲得的晶體分散性好，顯微鏡下觀察晶體呈規(guī)則的針狀，雜質(zhì)少，無油圈，吸光值A(chǔ)476A5tl8符合USP標準。實施例2①取40g干番茄紅素菌絲體，其中總類胡蘿卜素含量為5. 3%，經(jīng)HPLC檢測其中番茄紅素與胡蘿卜素分別占79%、21%，菌絲體中加入400ml 二氯甲烷，在25°C下高壓均質(zhì)30min，進行細胞破壁的同時提取菌絲體中類胡蘿卜素，過濾，收集濾液； ②步驟①的濾渣中再加入200ml 二氯甲烷，在室溫下高壓均質(zhì)30min，過濾，收集濾液；濾渣中再加入IOOml 二氯甲燒，在25°C下高壓均質(zhì)30min，過濾，收集濾液；③合并步驟①和②中得到的濾液，在50°C下經(jīng)真空濃縮得總類胡蘿卜素含量為
6.79%的油樹脂28. 6g，提取率為91. 6% ；④步驟③的油樹脂中加入400ml乙醇，在50°C下攪拌洗滌30min，過濾除去溶液，于40°C干燥此，得總類胡蘿卜素含量為97. 5%的類胡蘿卜素晶體，晶體質(zhì)量為1. 69g ;晶體經(jīng)HPLC檢測總類胡蘿卜素，其中β-胡蘿卜素含量為2. 5%，番茄紅素含量為97. 5%，晶體收率為77. 7%。所得晶體中番茄紅素含量為95%，獲得的晶體分散性好，顯微鏡下觀察晶體呈規(guī)則的針狀，雜質(zhì)少，無油圈，吸光值A(chǔ)476A5tl8符合USP標準。實施例3①取40g干β-胡蘿卜素菌絲體，其中總類胡蘿卜素含量為6.5%，經(jīng)HPLC檢測其中胡蘿卜素與番茄紅素分別占98%、2%，菌絲體中加入400ml正己烷，在25°C下剪切30min，進行細胞破壁的同時提取菌絲體中類胡蘿卜素，過濾，收集濾液；②步驟①的濾渣中再加入120ml正己烷，在25°C下剪切l(wèi)Omin，過濾，收集濾液；濾渣中再加入40ml正己烷，在25°C下剪切l(wèi)Omin，過濾，收集濾液；③合并步驟①和②中得到的濾液，在50°C下經(jīng)真空濃縮得總類胡蘿卜素含量為5. 67%的油樹脂44. 9g，提取率為97. 9% ；④步驟③的油樹脂中加入300ml乙醇，在50°C下攪拌洗滌lOmin，過濾除去溶液，于40°C干燥2h，得總類胡蘿卜素含量為87. 5%的類胡蘿卜素晶體，晶體質(zhì)量為2. 62g ;晶體經(jīng)HPLC檢測總類胡蘿卜素，其中β-胡蘿卜素含量為100%，不含番茄紅素，晶體收率為88. 2%。所得晶體中β-胡蘿卜素含量為87.5%，獲得的晶體分散性好，有金屬光澤，顯微鏡下觀察晶體呈規(guī)則的正方體，雜質(zhì)少，無油圈，吸光值A(chǔ)455A34tl、A455A483符合USP標準。實施例4①取60kg干β-胡蘿卜素菌絲體，其中總類胡蘿卜素含量為6. 5%，經(jīng)HPLC檢測其中β -胡蘿卜素與番茄紅素分別占98%、2%，菌絲體中加入600L正己烷，在25°C下剪切l(wèi)h，進行細胞破壁的同時提取菌絲體中類胡蘿卜素，過濾，收集濾液；②步驟①的濾渣中再加入300L正己烷，在25°C下剪切l(wèi)h，過濾，收集濾液；濾渣中再加入60L正己烷，在25°C下剪切l(wèi)h，過濾，收集濾液；③合并步驟①和②中得到的濾液，在50°C下經(jīng)真空濃縮得總類胡蘿卜素含量為12. 0%的油樹脂31. 5kg，提取率為96. 9% ；④步驟③的油樹脂中加入31. 5L乙酸乙酯，在50°C下攪拌洗滌O. 5h，過濾除去溶液，在40°C干燥4h，得總類胡蘿卜素含量為81. 5%的類胡蘿卜素晶體3. 85kg ;晶體經(jīng)HPLC檢測總類胡蘿卜素，其中β_胡蘿卜素含量為99.0%，番茄紅素含量為1.0%，晶體收率為80. 5%。所得晶體中β_胡蘿卜素含量為80.7%，獲得的 晶體分散性好，有金屬光澤，顯微鏡下觀察晶體呈規(guī)則的正方體，雜質(zhì)少，無油圈，吸光值A(chǔ)455A34tl、A455A483符合USP標準。
權(quán)利要求
1.一種天然類胡蘿卜素晶體的制備方法，其特征在于該制備方法包括以下步驟①在三孢布拉霉菌菌絲體中加入溶劑A進行細胞破壁，過濾，收集濾液；②將步驟①的濾液真空濃縮，回收溶劑得油樹脂；③在步驟②的油樹脂中加入溶劑B進行洗滌，過濾得粗晶體；④粗晶體干燥除去殘留溶劑后得高含量類胡蘿卜素晶體；其中所述溶劑A為乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷中的一種；所述溶劑B為乙酸乙酯、乙醇、甲醇中的一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然類胡蘿卜素晶體的制備方法，其特征在于所述三孢布拉霉菌菌絲體為干番茄紅素菌絲體或干β-胡蘿卜素菌絲體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然類胡蘿卜素晶體的制備方法，其特征在于步驟①所述的三孢布拉霉菌菌絲體與溶劑A的質(zhì)量體積比(g:ml)為1:1-10。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然類胡蘿卜素晶體的制備方法，其特征在于步驟①所述的細胞破壁溫度為10-50°C，細胞破壁時間為O. 5-6小時，細胞破壁次數(shù)為1-3次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然類胡蘿卜素晶體的制備方法，其特征在于步驟②所述的真空濃縮溫度為40-50°C，真空濃縮時間為O. 5-6小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然類胡蘿卜素晶體的制備方法，其特征在于步驟③所述的油樹脂與溶劑B的質(zhì)量體積比(g:ml)為1:1-10。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然類胡蘿卜素晶體的制備方法，其特征在于步驟③所述洗滌溫度10-50°C，洗滌時間為5-90分鐘，洗滌次數(shù)為1-5次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然類胡蘿卜素晶體的制備方法，其特征在于步驟④所述的粗晶體干燥溫度為20-50°C，干燥至粗晶體中有機溶劑B的揮發(fā)份小于O. 5%。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然類胡蘿卜素晶體的制備方法，其特征在于細胞破壁采用剪切、高壓均質(zhì)、研磨中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以微生物生物質(zhì)為原料，制備天然類胡蘿卜素晶體，特別是番茄紅素和β-胡蘿卜素的方法。該方法包括以下步驟在三孢布拉霉菌菌絲體中加入提取溶劑進行細胞破壁，過濾，收集濾液；將濾液真空濃縮，回收溶劑得油樹脂；油樹脂中加入洗滌溶劑進行洗滌，過濾得粗晶體；粗晶體干燥除去殘留溶劑后得高含量類胡蘿卜素晶體。本發(fā)明的方法所用溶劑種類少、用量小，提取純化工藝簡單，收率高，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，得到的類胡蘿卜素晶體產(chǎn)品含量高、質(zhì)量好，可廣泛應(yīng)用于功能食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。
文檔編號C07C11/21GK103012230SQ201310003309
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月6日
發(fā)明者吳文忠, 王建華, 徐維鋒, 張顯仁 申請人:大連醫(yī)諾生物有限公司