專利名稱：通過分級洗脫從陰離子交換材料中純化批量凝血因子vii多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用包括特定濃度鈣離子的洗脫緩沖液通過分級洗脫從陰離子交換材料中根據(jù)所需糖型從批量凝血因子VII多肽中純化凝血因子VII多肽。本發(fā)明使得能夠根據(jù)所需糖型來富集批量凝血因子VII多 肽。本發(fā)明還使得能夠利用具有相對低豐度的所需糖型的凝血因子VII多肽的批量凝血因子VII多肽。
背景技術(shù)：
在凝血級聯(lián)中涉及的蛋白質(zhì),包括例如凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X和蛋白質(zhì)C，證明是治療各種病理狀態(tài)的有用治療劑。相應(yīng)地，對于包括這些蛋白質(zhì)的制劑的需要在不斷上升，所述蛋白質(zhì)是藥學(xué)上可接受的并顯示一致且預(yù)定的臨床效果。因?yàn)槭褂萌搜獫{作為藥物產(chǎn)物來源的諸多不便，所以優(yōu)選在重組系統(tǒng)中生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)。然而，對凝血蛋白實(shí)施各種共翻譯修飾和翻譯后修飾，包括，例如天門冬酰胺-連接的(N-連接的)糖基化；O-連接的糖基化；和Glu殘基的Y-羧化作用。當(dāng)使用異源細(xì)胞作為蛋白質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)的宿主時，這些修飾在性質(zhì)上或數(shù)量上可能是不同的。特別地，在異源細(xì)胞中的生產(chǎn)通常產(chǎn)生不同排列的糖型，所述糖型代表具有不同共價連接的寡糖結(jié)構(gòu)的相同多肽。在不同系統(tǒng)中，治療蛋白質(zhì)寡糖結(jié)構(gòu)中的變化與例如免疫原性和體內(nèi)清除率的變化相關(guān)。因此，本領(lǐng)域需要商品化的、包含預(yù)定的糖型模式(或至少對于某種所需糖型是富集的)的凝血因子VII多肽組合物，特別是具有所需高含量的唾液酸化凝血因子VII多肽結(jié)構(gòu)的純化的批量(bulk)凝血因子VII多肽。發(fā)明概述本發(fā)明解決了通過從陰離子交換材料中分級洗脫批量凝血因子VII多肽來提供純化的批量凝血因子VII多肽的問題，所述批量凝血因子VII多肽具有所需高含量的唾液酸化的凝血因子VII多肽結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明的第一個方面涉及用于純化批量凝血因子VII多肽的工業(yè)規(guī)模方法，所述方法包括下列步驟(a)在有利于所述批量凝血因子VII多肽的一部分與所述陰離子交換材料結(jié)合的條件下，使批量凝血因子VII多肽與陰離子交換材料接觸；(b)用包括濃度至I閾值X mM的Ca2+的第一種洗脫緩沖液洗脫所述陰離子交換材料；和(C)用包括濃度超過閾值X mM的Ca2+的第二種洗脫緩沖液洗脫所述陰離子交換材料，并收集作為洗出液的純化的批量凝血因子VII多肽；其中選擇閾值X從而使得在第一個洗脫步驟(b)中從所述陰離子交換材料中去除至少5wt%的批量凝血因子VII多肽，并且在所述第二個洗脫步驟(c)中可以收集作為純化的批量凝血因子VII多肽的至少50wt%的批量凝血因子VII多肽。
在本發(fā)明的第二個方面，以絕對值表示，閾值為3-12mM，例如4_llmM，例如5-lOmM。新型工業(yè)規(guī)模方法使得能夠根據(jù)所需糖型來純化粗制的批量凝血因子VII多肽，特別是——但不是唯一的——具有很低豐度所需糖型的粗制的批量凝血因子VII多肽。因此，本發(fā)明的第三個方面涉及用于生產(chǎn)并純化批量凝血因子VII多肽的工業(yè)規(guī)模方法，所述方法包括下列步驟(i)在細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)粗制的批量凝血因子VII多肽，和(ii)通過純化順序利用一種或多種陰離子純化方法來純化所述粗制的批量凝血因子VII多肽，其中至少一種此類陰離子交換純化方法如上文限定的進(jìn)行。發(fā)明詳述·如上所述，本發(fā)明提供了用于純化批量凝血因子VII多肽的工業(yè)規(guī)模方法，所述方法包括下列步驟(a)在有利于所述批量凝血因子VII多肽的一部分與所述陰離子交換材料結(jié)合的條件下，使批量凝血因子VII多肽與陰離子交換材料接觸；(b)用包括濃度至I閾值X mM的Ca2+的第一種洗脫緩沖液洗脫所述陰離子交換材料；和(c)用包括濃度超過閾值X mM的Ca2+的第二種洗脫緩沖液洗脫所述陰離子交換材料，并收集作為洗出液的純化的批量凝血因子VII多肽；其中選擇閾值X從而使得在第一個洗脫步驟(b)中從所述陰離子交換材料中去除至少5wt%的批量凝血因子VII多肽，并且在所述第二個洗脫步驟(c)中可以收集作為純化的批量凝血因子VII多肽的至少50wt%的批量凝血因子VII多肽。在本發(fā)明方法的一個可替代的變化方案中，閾值以絕對值進(jìn)行限定，即本發(fā)明還提供了用于純化批量凝血因子VII多肽的工業(yè)規(guī)模方法，所述方法包括下列步驟(a)在有利于所述批量凝血因子VII多肽的一部分與所述陰離子交換材料結(jié)合的條件下，使所述批量凝血因子VII多肽與陰離子交換材料接觸；(b)用包括濃度至多閾倌X mM的Ca2+的第一種洗脫緩沖液洗脫所述陰離子交換材料；和(c)用包括濃度超過閾值X mM的Ca2+的第二種洗脫緩沖液洗脫所述陰離子交換材料，并收集作為洗出液的純化的批量凝血因子VII多肽；其中閾值X為3_12mM。本發(fā)明方法特別適合于“工業(yè)規(guī)?！?或“大規(guī)?！?的批量凝血因子VII多肽。術(shù)語“工業(yè)規(guī)?！币话阒赶率龇椒ǎ渲幸后w凝血因子VII多肽組合物的體積為至少100L，例如至少500L，例如至少1000L，或至少5000L，或其中組合物的重量為至少100kg，例如至少500kg，例如至少1000kg，或至少5000kg，或其中產(chǎn)物重量為至少Ig (干物質(zhì))，例如至少10g，例如至少 50g，例如 I-IOOOg 或 l-500g 或 l-100g。在本上下文中，術(shù)語“糖型(glycoform) ”指具有不同共價連接的寡糖結(jié)構(gòu),特別是唾液酸(sialyl)基團(tuán)的存在或缺乏，但在其他方面序列相同的凝血因子VII多肽。在本上下文中，術(shù)語“純化”指去除具有不合需要的糖型的凝血因子VII多肽，所述不合需要的糖型即具有不完全的唾液酸模式的糖型(例如，沒有或數(shù)目不完全的唾液酸基團(tuán))。已發(fā)現(xiàn)當(dāng)含鈣(Ca2+)緩沖液與陰離子交換色譜法組合使用時，此類不合需要的糖型(具有不完全的唾液酸模式)在“需要的糖型”(即，具有“完全”的唾液酸模式的糖型)前洗脫。因此，通過本文所限定的分級洗脫，可以獲得所需糖型富集的純化的批量凝血因子VII多肽。本文所使用的“批量”的表達(dá)意指固體物質(zhì)和液體物質(zhì)，例如包括凝血因子VII多肽的溶液或懸浮液?！芭俊钡谋磉_(dá)特指“大的”體積或量，即，指已知來自大規(guī)模和工業(yè)規(guī)模方法的體積和量。術(shù)語“凝血因子VII多肽”在下文中進(jìn)一步限定?！伴撝怠痹诒旧舷挛闹惺亲钪匾?，因?yàn)樗薅死肅a2+洗脫緩沖液分級洗脫的重要參數(shù)。閾值限定了形成純化的批量凝血因子VII多肽的被收集部分和被拋棄、處理或 再循環(huán)/再使用的先前部分之間的界線。對于柱(最普遍和最有用的排列)中排列的陰離子交換材料，閾值對應(yīng)柱入口處的緩沖液中的Ca2+濃度，并且應(yīng)當(dāng)理解延遲時間收集相應(yīng)的洗出液，所述延遲的時間對應(yīng)洗脫緩沖液的“前面部分”通過柱所需要的時間。步驟(a)-使批量與陰離子交換材料接觸在本方法的第一個步驟中，批量凝血因子VII多肽與陰離子交換材料接觸。目的是促進(jìn)所述批量凝血因子VII多肽的一部分與所述陰離子交換材料結(jié)合。步驟(a)中的術(shù)語“部分”指批量凝血因子VII多肽中存在的至少30% (即30-100%)的凝血因子VII多肽量。應(yīng)當(dāng)理解在大多數(shù)情況下希望結(jié)合遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過30%的凝血因子VII多肽量，例如至少50%，或至少70%，或主要的部分。術(shù)語“主要的部分”指批量凝血因子VII多肽中存在的至少90%的凝血因子VII多肽量。優(yōu)選甚至更高的部分與陰離子交換材料結(jié)合，例如至少95%的量,或至少98%的量,或至少99%的量,或甚至批量凝血因子VII多肽中存在的基本上所有的凝血因子VII多肽量。批量凝血因子VII多肽一般來源于工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)方法，例如細(xì)胞培養(yǎng)、克隆動物(例如，牛、豬、綿羊、山羊和魚)或昆蟲等，特別是來自細(xì)胞培養(yǎng)。陰離子交換材料優(yōu)選強(qiáng)陰離子交換材料，例如含有季銨基團(tuán)的陰離子交換材料。此類材料的商品化例子有來自Amersham Biosciences的Q-Sepharose Fast Flow,和來自Tosohaas 的 POROS HQ 50。陰離子交換材料的最普遍排列是柱的形式。分批容器中的排列當(dāng)然也可以。批量凝血因子VII多肽一般直接得自前面的純化步驟，或得自在必要時后來調(diào)整了 pH、離子強(qiáng)度等的前面的純化步驟。一般地，批量凝血因子VII多肽的pH為7. 5-9. 5，例如8. 0-9. O,并且傳導(dǎo)率一般為5-30mS/cm，例如10-20mS/cm。批量的溫度一般為，但不限于，0_15°C，例如約2_10°C。批量凝血因子VII多肽的接觸一般根據(jù)常規(guī)方案來進(jìn)行，即批量的濃度、溫度、pH、離子強(qiáng)度等可以照常，并且陰離子交換材料可以照常進(jìn)行洗滌和達(dá)到平衡。凝血因子VII多肽的裝載量一般為10_40g，例如15_30g凝血因子VII多肽/升基質(zhì)(濕潤形式的陰離子交換材料)，并且批量一般應(yīng)用的流速為3-200柱體積/小時(CV/h)，例如至少10CV/h，例如至少20CV/h，或至少40CV/h，或至少80CV/h，例如80_120CV/h。
凝血因子VII多肽與陰離子交換材料接觸和結(jié)合后，在洗脫步驟(b)和(C)前可以進(jìn)行一個或多個洗滌步驟。步驟(b)-第一個洗脫步驟批量凝血因子VII多肽與陰離子交換材料結(jié)合后，進(jìn)行第一個洗脫步驟(b)以去除部分批量凝血因子VII多肽，其中所述被去除的部分含有比原始批量含量更低的唾液酸化的凝血因子VII多肽結(jié)構(gòu)。通過這個步驟，陰離子交換材料上剩余(結(jié)合)部分的凝血因子VII多肽將含有比原始批量含量更高的唾液酸化的凝血因子VII多肽結(jié)構(gòu)。洗脫步驟(b)通過使用包括濃度至多閾倌X mM的Ca2+的第一種洗脫緩沖液來進(jìn)行。第一種洗脫緩沖液包括Ca2+(例如氯化鈣)和可能與其他鹽(例如鈉鹽、鉀鹽和鎂鹽，例如氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、乙酸鎂、葡萄糖酸鎂和乙酰丙酸鎂(laevulate)組合的緩
沖劑。緩沖劑一般是至少一種選自下列的酸和鹽的組分MES、PIPES、ACES、BES、TES、HEPES、TRIS、組氨酸、咪唑、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰胺、磷酸、乙酸(例如乙酸鈉)、乳酸、戊二酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、馬來酸和琥珀酸。應(yīng)當(dāng)理解緩沖劑可以包括兩種或多種組分的混合物，其中所述混合物能夠提供指定范圍內(nèi)的PH值。作為例子可以被提及的是乙酸和乙酸鈉等。選擇關(guān)鍵的Ca2+閾值濃度X，從而使得在第一個洗脫步驟(b)中從所述陰離子交換材料中去除至少5wt%,例如至少10wt%,或至少15wt%的批量凝血因子VII多肽(同樣參見進(jìn)一步的下文)。因此被去除的部分代表相當(dāng)高比例的不合需要的糖型。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，閾值X為3-12mM，例如4-llmM，例如5-lOmM。結(jié)合了凝血因子VII多肽的陰離子交換材料的溫度一般為0_15°C，例如約2-10°C，例如通過使用冷卻套管維持在特定范圍內(nèi)。應(yīng)當(dāng)理解為了使不合需要的糖型通過第一個洗脫步驟(b)去除，第一種洗脫緩沖液中的Ca2+濃度必須超過O (零)，例如至少ImM。當(dāng)使用梯度緩沖液時，第一種洗脫緩沖液中的平均Ca2+濃度必須超過O (零)，例如至少ImM。在一個實(shí)施方案中，第一種洗脫緩沖液是(恒定的)Ca2+濃度為l_8mM，例如2_7mM的一批緩沖液。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一個洗脫步驟(b)通過使用梯度緩沖液，特別是Ca2+最終濃度等于X的梯度緩沖液來進(jìn)行。Ca2+初始濃度一般為0-8mM，例如0_5mM。步驟(c)-第二個洗脫步驟在第一個洗脫步驟(b)后，用包括濃度超過閾倌X mM的Ca2+的第二種洗脫緩沖液洗脫陰離子交換材料，并可以收集作為洗出液的對于所需糖型的凝血因子VII多肽富集的純化的批量凝血因子VII多肽。第二種洗脫緩沖液包括Ca2+(盡管濃度高于第一種洗脫緩沖液)和可能與其他鹽(例如鈉鹽、鉀鹽和鎂鹽，例如氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、乙酸鎂、葡萄糖酸鎂和乙酰丙酸鎂)組合的緩沖劑。緩沖劑一般根據(jù)上文列舉的適合于第一種洗脫緩沖液的進(jìn)行選擇。選擇關(guān)鍵的Ca2+閾值濃度X，從而使得在第二個洗脫步驟(C)中可以收集作為純化的批量凝血因子VII多肽的至少50wt%、例如至少60wt%、或70 丨％的批量凝血因子VII多肽。
如上，閾值X優(yōu)選為3-12mM，例如4-llmM，例如5-lOmM。在一個實(shí)施方案中，第二種洗脫緩沖液是(恒定的)Ca2+濃度為8_25mM，例如9-20mM的一批緩沖液。在其一個變化方案中，第一個洗脫步驟(b)通過使用(恒定的)Ca2+濃度為l_8mM，例如l-7mM、2-7mM、或2_8mM的批緩沖液形式的第一種洗脫緩沖液來進(jìn)行，和第二個洗脫步驟(c)通過使用(恒定的)Ca2+濃度為8-25mM，例如9-25mM、8-20mM、或9_20mM的批緩沖液形式的第二種洗脫緩沖液來進(jìn)行。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二個洗脫步驟(C)通過使用梯度緩沖液，特別是Ca2+初始濃度剛超過X的梯度緩沖液來進(jìn)行。Ca2+最終濃度一般為10-25mM，例如12—20mMo
在一個非常有趣的實(shí)施方案中，第一個洗脫步驟(b)和第二個洗脫步驟(C)都利用梯度緩沖液，例如連續(xù)梯度緩沖液來進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，Ca2+初始濃度為0-5mM，例如0-3mM，例如約OmM，和Ca2+最終濃度為10_25mM，例如12_20mM，例如約15mM。如上，閾值X—般為 3-12mM，例如 4-llmM，例如 5-lOmM。整個洗脫過程(步驟(b)和步驟(C)) 一般在3-200柱體積/小時(CV/h)的流速下進(jìn)行，例如至少10CV/h，例如至少20CV/h，或至少40CV/h，或至少80CV/h，例如20-120CV/h，20-80CV/h，20-60CV/h，或80-120CV/h。由于凝血因子VII多肽在鈣濃度為中間范圍的溶液中存在的時間非常有限，所以產(chǎn)物降解的風(fēng)險被降到最低。因此，本發(fā)明人沒有發(fā)現(xiàn)與本文所限定的方法有關(guān)的任何穩(wěn)定性的問題。第二個洗脫步驟(C)的另一特征是在許多情況下凝血因子VII多肽將在洗脫條件下完全活化。這是有利的，因?yàn)榉珠_的活化步驟變得不必要。術(shù)語“純化的批量”指所得到的批量，即在步驟(C)中所收集的批量，含有比步驟(a)中應(yīng)用的批量更低含量的不合需要糖型的凝血因子VII多肽。術(shù)語“純化”指其中可以得到純化的批量的方法，即本發(fā)明的方法。通常，為了后續(xù)使用通過一系列步驟使陰離子交換材料再生。工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)和純化本發(fā)明對于批量凝血因子VII多肽的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)和純化特別有用。在此類方法中，凝血因子VII多肽一般通過細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行生產(chǎn)。因此，本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)并純化批量凝血因子VII多肽的工業(yè)規(guī)模方法，所述方法包括下列步驟(i)在細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)粗制的批量凝血因子VII多肽，和(ii)通過純化順序利用一種或多種陰離子純化方法來純化所述粗制的批量凝血因子VII多肽，其中至少一種此類陰離子交換純化方法如上文限定的進(jìn)行。優(yōu)選地，如上文限定的陰離子交換純化方法是一個或多個陰離子交換純化方法中的最后一個。—個引起興趣的可能性是生產(chǎn)步驟(i)無需相對于所需糖型的凝血因子VII多肽進(jìn)行優(yōu)化。因此，在一個有趣的實(shí)施方案中，生產(chǎn)步驟(i)相對于粗制的批量凝血因子VII多肽的質(zhì)量得率進(jìn)行優(yōu)化。在這種情況下，所需糖型的凝血因子VII多肽的含量可以是80%或更低，并且由于分離不合需要的糖型的困難，此類“質(zhì)量-優(yōu)化”的批量至今對于工業(yè)生產(chǎn)凝血因子VII多肽產(chǎn)物用途有限。然而，本發(fā)明同樣提供了針對這個問題的良好解決方法。因此，在其一個變化方案中，粗制的批量凝血因子VII多肽中唾液酸化的凝血因子VII多肽結(jié)構(gòu)的質(zhì)量含量為至多80%，并且純化的批量凝血因子VII多肽中唾液酸化的凝血因子VII多肽結(jié)構(gòu)的質(zhì)量含量為至少90%。因此，在其一個變化方案中，粗制的批量凝血因子VII多肽中唾液酸化的凝血因子VII多肽結(jié)構(gòu)的質(zhì)量含量為至多90%，并且純化的批量凝血因子VII多肽中唾液酸化的凝血因子VII多肽結(jié)構(gòu)的質(zhì)量含量為至少95%。因此，在其一個更進(jìn)一步的變化方案中，粗制的批量凝血因子VII多肽中唾液酸化的凝血因子VII多肽結(jié)構(gòu)的質(zhì)量含量為至多93%，并且純化的批量凝血因子VII多肽中唾液酸化的凝血因子VII多肽結(jié)構(gòu)的質(zhì)量含量為至少96%。
在其另一變化方案中，粗制批量在細(xì)胞培養(yǎng)中的生產(chǎn)在7. 0-7. 6的pH值下進(jìn)行。一般地，粗制批量的生產(chǎn)在宿主細(xì)胞，例如真核宿主細(xì)胞，例如哺乳動物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，哺乳動物細(xì)胞選自HEK細(xì)胞、BHK細(xì)胞、CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、和骨髓瘤細(xì)胞例如SP2-0。這就是說，生產(chǎn)和純化(除了本發(fā)明的分級洗脫純化步驟)可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的進(jìn)行。因此，粗制的批量凝血因子VII多肽的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)可以如本申請人早期申請例如 WO 04/027072 A2、WO 02/29083 A2、TO 02/29025 A2、TO 00/28065 AU WO02/77218 Al等中所公開的進(jìn)行。凝血因子VII多肽如本文所使用的，術(shù)語“凝血因子VII多肽”涵蓋了野生型凝血因子VII (即具有美國專利號4，784，950中所公開的氨基酸序列的多肽)，以及顯示出相對于野生型凝血因子VII基本上相同或改進(jìn)的生物活性的凝血因子VII的變異體。術(shù)語“凝血因子VII”意欲涵蓋未切割(酶原)形式的凝血因子VII多肽，以及已用蛋白水解處理以產(chǎn)生其分別的生物活性形式的那些，它們可以被稱為凝血因子Vila。一般地，凝血因子VII在殘基152和153之間切割以產(chǎn)生凝血因子Vila。術(shù)語“凝血因子VII多肽”還涵蓋了其中凝血因子VIIa的生物活性相對于野生型凝血因子VIIa已基本上修飾或略微減少的多肽，包括變異體。這些多肽包括，但不限于，其中已導(dǎo)入修飾或破壞多肽生物活性的特定氨基酸序列改變的凝血因子VII或凝血因子Vila。凝血因子Vila在血液凝固中的生物活性來源于其下列能力(i)結(jié)合組織因子(TF)，和(ii)催化凝血因子IX或凝血因子X蛋白水解切割以產(chǎn)生活化凝血因子IX或X(分別為凝血因子IXa或Xa)。對本發(fā)明來說，凝血因子VII多肽的生物活性(“凝血因子VII生物活性”)可以通過測量制劑促進(jìn)血液凝固的能力來量化，參照本文所述的測定法4。在這個測定法中，生物活性表示為相對于對照樣品的凝血時間減少，并通過與包含I單位/mL凝血因子VII活性的混合人血清標(biāo)準(zhǔn)的比較轉(zhuǎn)換為“凝血因子VII單位”?？商娲?，凝血因子VIIa的生物活性可以通過下列方法進(jìn)行量化(i)測量凝血因子VIIa或凝血因子VII相關(guān)多肽在包括嵌入脂質(zhì)膜的TF和凝血因子X的系統(tǒng)中產(chǎn)生活化凝血因子X (凝血因子Xa)的能力(Persson等人，J. Biol. Chem. 272 :19919-19924,1997) ；(ii)測量凝血因子X在含水系統(tǒng)中的水解(“體外蛋白水解測定法”，參見下文的測定法2)利用基于表面等離子體共振的儀
器測量凝血因子VIIa或凝血因子VII相關(guān)多肽與TF的物理結(jié)合(Persson，F(xiàn)EBS Letts.413 :359-363,1997) ； (iv)測量由凝血因子Vila和/或凝血因子VII相關(guān)多肽對合成的基質(zhì)的水解(“體外水解測定法”，參見下文的測定法I);或(V)測量體外系統(tǒng)中不依賴TF的凝血酶的產(chǎn)生(參見下文的測定法3)。 具有相對于野生型凝血因子VIIa基本上相同或改良的生物活性的凝血因子VII變異體涵蓋當(dāng)在一個或多個如上所述的凝集測定法(測定法4)、蛋白水解測定法(測定法2)或TF結(jié)合測定法中測試時，顯示出在相同細(xì)胞類型中產(chǎn)生的至少約25%、優(yōu)選至少約50%、更優(yōu)選至少約75%和最優(yōu)選至少約90%的凝血因子VIIa特異活性的那些。具有相對于野生型凝血因子VIIa基本上減少的生物活性的凝血因子VII變異體是當(dāng)在一個或多個如上所述的凝集測定法(測定法4)、蛋白水解測定法(測定法2)、或TF結(jié)合測定法中測試時，顯示出在相同細(xì)胞類型中產(chǎn)生的野生型凝血因子VIIa的少于約25%、優(yōu)選少于約10%、更優(yōu)選少于約5%和最優(yōu)選少于約1%的凝血因子VIIa特異活性的那些。具有相對于野生型凝血因子VIIa基本上修飾的生物活性的凝血因子VII變異體包括，但不限于，顯示TF不依賴性凝血因子X蛋白水解活性的凝血因子VII變異體以及結(jié)合TF但不切割凝血因子X的那些。無論是顯示基本上相同或比野生型凝血因子VII更佳的生物活性，還是可替代地顯示相對于野生型凝血因子VII基本上修飾或減少的生物活性的凝血因子VII變異體，他們包括，但不限于，具有通過一個或多個氨基酸的插入、刪除或置換而不同于野生型凝血因子VII序列的氨基酸序列的多肽。具有與野生型凝血因子VII基本上相同的生物活性的凝血因子VII變異體的非限制性例子包括 S52A-FVIIa、S60A_FVIIa(Lino 等人，Arch. Biochem. Biophys. 352 182-192，1998);如美國專利號5，580, 560中所公開的顯示增加的蛋白水解穩(wěn)定性的FVIIa變異體；已在殘基290和291之間或殘基315和316之間進(jìn)行蛋白水解切割的凝血因子 Vila(Mollerup 等人，Biotechnol. Bioeng. 48 :501-505, 1995);氧化形式的凝血因子Vila(Kornfelt 等人，Arch. Biochem. Biophys. 363 :43-54,1999)；如 PCT/DK02/00189 中所公開的FVII變異體；和如WO 02/38162 (Scripps Research Institute)中所公開的顯示增加的蛋白水解穩(wěn)定性的FVIIa變異體；如WO 99/20767 (University of Minnesota)中所公開的具有修飾的Gla結(jié)構(gòu)域并顯示增強(qiáng)的膜結(jié)合性的FVII變異體；和如WO01/58935 (Maxygen ApS)中所公開的 FVII 變異體。具有相對于野生型FVIIa增加的生物活性的凝血因子VII變異體的非限制性例子包括如 WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、WO 03/27147、WO 03/37932、WO02/38162 (Scripps Research Institute)所公開的凝血因子 VII 變異體；和如 JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)中所公開的具有增強(qiáng)活性的凝血因子VII變異體。具有相對于野生型凝血因子VII基本上減少或修飾的生物活性的凝血因子VII變異體的非限制性例子包括R152E-FVIIa(WiIdgoose等人，Biochem 29 :3413-3420,1990)、S344A-FVIIa(Kazama 等人，J. Biol. Chem. 270 :66-72,1995)、FFR-FVIIa(Holst等人，Eur. J. Vase. Endovasc. Surg. 15 :515-520,1998)、和缺少 Gla 結(jié)構(gòu)域的凝血因子VIIa(Nicolaisen 等人，F(xiàn)EBS Letts. 317 :245-249,1993)。凝血因子VII多肽的例子包括，但不限于，野生型凝血因子VII，L305V-FVII,L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII,V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, Vl58D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, and S336G-FVII, L305V/K337A-FVII,L305V/V158D-FVII,L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII,L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/ E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/F296V/M298Q/K337A-FVII， L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII， S314E/K316H-FVII，S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII,S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII， K316H/L305V/K337A/E296V-FVII， K316H/L305V/K337A/V158D-FVII，K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII， K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII， K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII,K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, Κ316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, Κ3I6Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII， K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII， K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII， K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII， F374Y/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII, F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII,F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII， F374Y/K337A/V158T-FVII, F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/ S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII, F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/V158T-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S3I4E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII, F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/Vl58T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-因子 VII、S60A-因子VII ；R152E-因子VII、S344A_因子VII、缺少Gla結(jié)構(gòu)域的因子VIIa ;和PllQ/K33E-FVII、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G29IN-FVII、R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ;和在 233Thr_240Asn 的氨基酸序列中有置換、添加或刪除的FVII、在304Arg-329Cys的氨基酸序列中有置換、添加或刪除的FVII、和在Ilel53-Arg223的氨基酸序列中有置換、刪除或添加的FVII。在某些實(shí)施方案中，凝血因子VII多肽是人凝血因子VIIa(hFVIIa)，優(yōu)選重組制·備的人凝血因子Vlla(rhVIIa)?！ぴ谄渌麑?shí)施方案中，凝血因子VII多肽是凝血因子VII序列變異體。在某些實(shí)施方案中，凝血因子VII多肽具有不同于野生型人凝血因子VII的糖基化。在各種實(shí)施方案中，例如其中凝血因子VII多肽是凝血因子VII相關(guān)多肽或凝血因子VII序列變異體的那些，當(dāng)在如本說明書中所述的“體外蛋白水解測定法”(測定法2)中測試時，凝血因子VII多肽的活性和天然的人凝血因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之間的比率為至少約I. 25，優(yōu)選至少約2. O、或4. 0，最優(yōu)選至少約8. O。在某些實(shí)施方案中，凝血因子VII多肽是凝血因子VII相關(guān)多肽，特別是變異體，其中當(dāng)在“體外水解測定法”(參見下文的測定法I)中測試時，所述凝血因子VII多肽的活性和天然的人凝血因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之間的比率為至少約I. 25 ;在其他實(shí)施方案中，該比率為至少約2. O ;在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該比率為至少約4. O。純化的批量凝血因子VII多肽的用途對應(yīng)純化的批量凝血因子VII多肽的部分收集后可以配制為溶液，所述溶液可以分裝到管形瓶中并冷凍干燥。作為對應(yīng)市售、重組制備的FVII多肽組合物l^ovoSeven (Novo Nordisk A/S,Denmark)的最終產(chǎn)物的說明性例子,可以提及的是包含I. 2mg重組人凝血因子 VIIa、5. 84mg NaCl、2.94mg CaCl2,2 Η20、2· 64mg GlyGly.O. 14mg 聚山梨醇酯 80、和60. Omg甘露醇的管形瓶(I. 2mg)。這種產(chǎn)物在使用前用2. OmL注射用水(WFI)復(fù)原至PH5. 5。當(dāng)復(fù)原時，蛋白質(zhì)溶液對于24小時內(nèi)使用是穩(wěn)定的。重組活化凝血因子VII (rFVIIa)的整個生產(chǎn)過程由Jurlander等人在Thrombosis and Hemostasis,第 27 卷，No. 4,2001 中描述。
實(shí)施例適合于確定凝血因子VII多肽生物活性的測定法依照本發(fā)明使用的凝血因子VII多肽可以通過適當(dāng)?shù)臏y定法來選擇，所述測定法可以作為簡單初步的體外測試進(jìn)行。因此，本說明書公開了關(guān)于凝血因子VII多肽活性的簡單測試(命名為“體外水解測定法”)。體外水解測定法(測定法I)可以測定天然的(野生型)凝血因子VIIa和凝血因子VII多肽(這兩種在本文都稱為“凝血因子Vila”)的比活性。它們還可進(jìn)行平行測定以直接比較它們的比活性。該測定法在微量滴定板(MaxiSorp,Nunc,Denmark)中進(jìn)行。將終濃度為ImM的顯色底物D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilide (S-2288, Chromogenix, Sweden)加入在pH 7.4,包含O. IM NaCl>5mM CaCl2和lmg/mL牛血清白蛋白的50mM HEPES中的凝血因子VIIa(終濃度為IOOnM)。在SpectraMax 340讀板儀(Molecular Devices, USA)上連續(xù)測量405nm處的吸光度。在孵育20分鐘后產(chǎn)生的吸光度減去不含酶的空白孔的吸光度后用于計(jì)算凝血因子VII多肽和野生型凝血因子VIIa活性之間的比率 比率=(A405nm凝血因子VII多肽)/(A405nm野生型凝血因子Vila)?；谏鲜娇梢澡b別具有比天然凝血因子Vila更低、相當(dāng)或更高活性的凝血因子VII多肽，例如，其中凝血因子VII多肽的活性與天然凝血因子VII (野生型FVII)的活性之間的比率為約I. O相對大于I. O的凝血因子VII多肽。利用生理學(xué)底物例如IOO-IOOOmM適當(dāng)濃度的凝血因子X( “體外蛋白水解測定法”)也可測量凝血因子VII多肽的活性，其中在加入適當(dāng)顯色底物(例如S-2765)后測量產(chǎn)生的凝血因子Xa。此外，該活性測定法可以在生理學(xué)溫度下進(jìn)行。體外蛋白水解測定法(測定法2)平行測定天然的(野生型)凝血因子VIIa和凝血因子VII多肽(這兩種在本文都稱為“凝血因子Vila”)以直接比較它們的比活性。該測定法在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc, Denmark)上進(jìn)行。將在 pH7. 4,包含 0. IM NaCl>5mM CaCl2 和 lmg/mL 牛血清白蛋白的100 μ L 50mM HEPES中的凝血因子Vila (IOnM)和因子X(0. 8microM)孵育15分鐘。隨后通過加入pH7. 4，包含0. IM NaCl、20mM EDTA和lmg/mL牛血清白蛋白的50 μ L 50mM HEPES來終止凝血因子X切割。通過加入終濃度為0. 5mM的顯色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide (S-2765, Chromogenix, Sweden)來測量所產(chǎn)生的因子 Xa 的量。在 SpectraMax 340讀板儀(Molecular Devices, USA)上連續(xù)測量405nm處的吸光度。在孵育10分鐘時產(chǎn)生的吸光度減去不含F(xiàn)VIIa的空白孔的吸光度后用于計(jì)算凝血因子VII多肽和野生型凝血因子VIIa蛋白水解活性之間的比率比率=(A405nm凝血因子VII多肽)/(A405nm野生型凝血因子Vila)?；谏鲜娇梢澡b別具有比天然凝血因子Vila更低、相當(dāng)或更高活性的凝血因子VII多肽，例如，其中凝血因子VII多肽的活性與天然凝血因子VII (野生型FVII)的活性之間的比率為約I. O相對大于I. O的凝血因子VII多肽。凝血酶產(chǎn)生測定法(測定法3)在包括生理濃度的所有相關(guān)凝血因子和抑制劑(當(dāng)模擬血友病A病狀時，除去凝血因子VIII)和活化血小板的測定法(測定法3)中還可測量凝血因子VIIa或凝血因子VII多肽產(chǎn)生凝血酶的能力(如Monroe等人(1997) Brit. J. Haematol. 99，542-547中第543頁所述，所述文獻(xiàn)據(jù)此引入本文作為參考)。單步凝集測定法(測定法4)
還可使用單步凝集測定法(測定法4)來測量凝血因子VII多肽的生物活性。為此，將待測樣品稀釋于50mM PIPES緩沖液(pH7. 5)和O. I % BSA中，將40 μ I與40 μ I缺乏凝血因子VII的血漿和包含IOmM Ca2+和合成磷脂的80 μ I人重組組織因子一起孵育。在平行線性測定法中測量凝集時間并利用參照標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。凝血因子VII多肽的制備與純化適用于本發(fā)明的純化的人凝血因子VIIa優(yōu)選通過例如，Hagen等人，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 83 :2412_2416，1986 或歐洲專利號 O 200 421 (ZymoGenetics, Inc.)中所述DNA重組技術(shù)來制備。

還可通過Broze and Majerus, J. Biol. Chem. 255 (4) : 1242-1247,1980 和 Hednerand Kisiel, J. Clin. Invest. 71 :1836-1841,1983 所述方法來產(chǎn)生凝血因子 VII。這些方法生成了不含可檢測量的其它凝血因子的凝血因子VII。通過包括作為最后純化步驟的另外的凝膠過濾法可以得到更進(jìn)一步純化的凝血因子VII制劑。隨后通過已知方法將凝血因子VII轉(zhuǎn)化為活化的凝血因子Vila，例如通過幾種不同的血漿蛋白質(zhì)，例如凝血因子Xlla、IXa 或 Xa?？商娲?，如 Bjoern 等人所描述的(Research Disclosure, 269 September1986,第564-565頁)，通過使其經(jīng)過離子交換色譜柱例如Mono Q (PharmaciafineChemicals)等，或通過在溶液中自體活化，可以將凝血因子VII完全激活。通過修飾野生型凝血因子VII或通過重組技術(shù)可以產(chǎn)生凝血因子VII相關(guān)多肽。與野生型凝血因子VII比較時具有改變的氨基酸序列的凝血因子VII相關(guān)多肽可以通過下列方法來產(chǎn)生通過已知方法例如定點(diǎn)誘變改變編碼天然凝血因子VII的核酸中的氨基酸密碼子或通過去除某些氨基酸密碼子來修飾編碼野生型凝血因子VII的核酸序列。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以在凝血因子VIIa分子功能關(guān)鍵區(qū)域之外進(jìn)行置換并仍產(chǎn)生活性多肽。凝血因子VII多肽活性必需并因此優(yōu)選不實(shí)施置換的氨基酸殘基可以根據(jù)本領(lǐng)域已知程序進(jìn)行鑒別，例如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(參見，例如 Cunningham and Wells, 1989, Science 244:1081-1085)。在后一技術(shù)中，在分子中的每個帶正電荷的殘基上導(dǎo)入突變，并測試所得突變體分子的凝集活性、分別的交聯(lián)活性以鑒別對分子活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點(diǎn)還可通過分析三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行確定，所述三維結(jié)構(gòu)根據(jù)技術(shù)例如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標(biāo)記法進(jìn)行確定(參見，例如 de Vos 等人，1992, Science 255 :306-312 ；Smith 等人，1992, Journal of MolecularBiology 224 :899-904 ；fflodaver 等人，1992，F(xiàn)EBS Letters 309 :59-64)。通過定點(diǎn)誘變利用本領(lǐng)域已知的任何方法可以將突變導(dǎo)入核酸序列以使一種核苷酸替換為另一種核苷酸。特別有用的是采用超螺旋雙鏈DNA載體的方法，所述DNA載體含有目的插入片段和包含所需突變的2個合成引物。每一個與載體的相反鏈互補(bǔ)的寡核苷酸引物在溫度循環(huán)過程中通過Pfu DNA聚合酶進(jìn)行延伸。并入引物后，產(chǎn)生包含交錯切口的突變質(zhì)粒。在溫度循環(huán)后，用對甲基化和半甲基化DNA特異的DpnI處理產(chǎn)物以消化親本DNA模板并選擇包含突變的合成DNA。也可使用本領(lǐng)域已知的用于制備、鑒別和分離變異體的其他方法，例如，基因重排或噬菌體展示技術(shù)。通過本領(lǐng)域已知的任何方法可以完成多肽與其來源細(xì)胞的分離，所述方法包括，但不限于，從細(xì)胞附著培養(yǎng)中取下包含所需產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)基；離心或過濾以去除非粘附細(xì)胞；等。
任選地，凝血因子VII多肽可以進(jìn)一步純化。純化可以利用本領(lǐng)域已知的任何方法實(shí)現(xiàn)，所述方法包括，但不限于，親和色譜法，例如，在抗凝血因子VII抗體柱上(參見，例如 Wakabayashi 等人，J. Biol. Chem. 261 :11097,1986 ；和 Thim 等人，Biochem. 27 7785，1988);疏水作用色譜法；離子交換色譜法；大小排阻色譜法；電泳法(例如，制備型等電聚焦(IEF)、差異溶解(例如硫酸銨沉淀)，或提取等。一般參見，Scopes, ProteinPurification, Springer-Verlag, New York,1982 ;和 Protein Purification, J.C. Jansonand Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989。純化后，該制劑優(yōu)選包含少于10wt%、更優(yōu)選少于5%、并最優(yōu)選少于1%的來源于所述宿主細(xì)胞的非凝血因子VII多肽。在本發(fā)明的上下文中，純化包括至少一個陰離子交換色譜步驟。如果未被本發(fā)明方法完全活化，則凝血因子VII多肽可以通過蛋白水解切割來活化，所述蛋白水解切割利用凝血因子XIIa或具有胰蛋白酶樣特異性的其他蛋白酶，例如，凝血因子IXa、激肽釋放酶、凝血因子Xa和凝血酶。參見,例如,Osterud等人,Biochem. 11 2853(1972) ；Thomas,美國專利號 4，456，591 ；和 Hedner 等人，J. Clin. Invest. 71
1836(1983)?？商娲?通過使其經(jīng)過離子交換色譜柱例如Mono Q (Pharmacia)等,或通過在溶液中自體活化，可以將凝血因子VII多肽活化。所得到的活化凝血因子VII多肽隨后可以如本申請中所述進(jìn)行配制和施用。下列實(shí)施例舉例說明了本發(fā)明方法的實(shí)踐。所包括的這些實(shí)施例僅用于舉例說明的目的并不希望在任何方面限制本發(fā)明所要求的范圍。實(shí)施例I-利用Ca2+梯度緩沖液通過分級洗脫從陰離子交換材料中純化批量凝血因子VII多肽本發(fā)明方法可以如下進(jìn)行包括陰離子交換材料(來自Amersham Biosciences的Q-Sepharose FF)的柱用WFI (注射用水)洗滌，并隨后用NaCl/Glygly緩沖液(175mM NaCl和IOmM Glygly)平衡。將來源于細(xì)胞培養(yǎng)的批量rFVII(重組凝血因子VII ;MW約50，000)在pH8. 5下應(yīng)用于柱，由此基本上所有的凝血因子VII多肽批量與柱材料結(jié)合。具有所需糖型(唾液酸化的糖型)的凝血因子VII多肽的含量為約78%。凝血因子VII多肽的裝載量為約20g/升基質(zhì)(濕潤形式的陰離子交換材料)。柱用NaCl/Glygly 緩沖液(175mM NaCl 和 IOmM Glygly)，并隨后用另一種 NaCl/Glygly 緩沖液(50mM NaCl 和 IOmM Glygly)洗漆。分級洗脫用在NaCl/Glygly 緩沖液中的 CaCl2 梯度(0_15mM CaCl2 ；50mM NaCl 和IOmM Glygly)在40柱體積/小時的速率下進(jìn)行。Ca2+濃度閾值X設(shè)定為7. 5mM。收集對應(yīng)Ca2+濃度為7. 5-13. 5mM的部分，并預(yù)期具有所需糖型(唾液酸化的糖型)的凝血因子VII多肽的含量超過90%。
權(quán)利要求
1.一種用于純化批量凝血因子VII多肽的工業(yè)規(guī)模方法，所述方法包括下列步驟 (a)在有利于所述批量凝血因子VII多肽的一部分與陰離子交換材料結(jié)合的條件下，使所述批量凝血因子VII多肽與所述陰離子交換材料接觸； (b)用包括濃度至多閾值XmM的Ca2+的第一種洗脫緩沖液洗脫所述陰離子交換材料；和 (c)用包括濃度超過閾值XmM的Ca2+的第二種洗脫緩沖液洗脫所述陰離子交換材料，并收集作為洗出液的純化的批量凝血因子VII多肽； 其中選擇所述閾值X從而使得在第一個洗脫步驟(b)中從所述陰離子交換材料中去除至少5wt%的批量凝血因子VII多肽，并且在所述第二個洗脫步驟(c)中可以收集至少50被％的批量凝血因子VII多肽作為純化的批量凝血因子VII多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述閾值X為3-12mM。
3.一種用于純化批量凝血因子VII多肽的工業(yè)規(guī)模方法，所述方法包括下列步驟 (a)在有利于所述批量凝血因子VII多肽的一部分與陰離子交換材料結(jié)合的條件下，使所述批量凝血因子VII多肽與所述陰離子交換材料接觸； (b)用包括濃度至多閾值XmM的Ca2+的第一種洗脫緩沖液洗脫所述陰離子交換材料；和 (c)用包括濃度超過閾值XmM的Ca2+的第二種洗脫緩沖液洗脫所述陰離子交換材料，并收集作為洗出液的純化的批量凝血因子VII多肽； 其中所述閾值X為3-12mM。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一個洗脫步驟(b)通過使用梯度緩沖液來進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述梯度緩沖液的Ca2+最終濃度等于X。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二個洗脫步驟(c)通過使用梯度緩沖液來進(jìn)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述梯度緩沖液的Ca2+初始濃度剛大于X。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一個洗脫步驟(b)和所述第二個洗脫步驟(c)都利用梯度緩沖液來進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述梯度的Ca2+初始濃度為0-5mM，和所述梯度的Ca2+最終濃度為10-25mM。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一個洗脫步驟(b)通過使用(恒定的)Ca2+濃度為l-7mM的批緩沖液形式的第一種洗脫緩沖液來進(jìn)行，和所述第二個洗脫步驟(c)通過使用(恒定的)Ca2+濃度為8-25mM的批緩沖液形式的第二種洗脫緩沖液來進(jìn)行。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述陰離子交換材料為強(qiáng)陰離子交換材料。
12.一種用于生產(chǎn)并純化批量凝血因子VII多肽的工業(yè)規(guī)模方法，所述方法包括下列步驟 (i)在細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)粗制的批量凝血因子VII多肽，和 (i i)通過利用一種或多種陰離子交換純化方法的純化順序來純化所述粗制的批量凝血因子VII多肽，其中至少一種此類陰離子交換純化方法如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所限定的進(jìn)行。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述生產(chǎn)步驟(i)相對于所述粗制的批量凝血因子VII多肽的質(zhì)量得率進(jìn)行優(yōu)化。
14.根據(jù)權(quán)利要求12-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述粗制的批量在細(xì)胞培養(yǎng)物中的生產(chǎn)在7. 0-7. 6的pH值下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用包括特定濃度鈣離子的洗脫緩沖液通過分級洗脫從陰離子交換材料中根據(jù)所需糖型從批量凝血因子VII多肽中純化凝血因子VII多肽。本發(fā)明使得能夠根據(jù)所需糖型來富集批量凝血因子VII多肽。
文檔編號C07K1/18GK102718859SQ20121024255
公開日2012年10月10日 申請日期2005年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月29日
發(fā)明者C·范吉爾, U·克勞森 申請人:諾和諾德醫(yī)療保健公司