與免疫性血小板減少癥相關(guān)的膜突蛋白片段的制作方法
【專利摘要】本申請?zhí)峁┝擞糜跈z測和監(jiān)測免疫性血小板減少癥的組合物和方法。
【專利說明】與免疫性血小板減少癥相關(guān)的膜突蛋白片段
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請涉及有關(guān)自身免疫性疾病的分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。更具體地，本申請涉及基于獨(dú)特存在的特定自身抗體的方法和組合物，所述自身抗體與免疫性血小板減少癥相關(guān)。
【背景技術(shù)】
[0002]自身免疫性疾病是由免疫系統(tǒng)對患者自身物質(zhì)和組織的異常應(yīng)答引起的疾病。共有超過80種不同類型的自身免疫性疾病，其總的來說是導(dǎo)致慢性疾病的第二位的原因，在最高達(dá)64歲的所有年齡組中，其是導(dǎo)致女性死亡的前十位的死因之一。
[0003]人們已在醫(yī)學(xué)研究方面投入了大量精力來了解自身免疫性疾病的機(jī)制，并尋找有效的診斷和治療方法。目前多種自身免疫性疾病的特征是自身抗體的存在并且具有不良活性。這些自身抗體通常識別并結(jié)合至正常和健康的自身抗原，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)組織和器官的明顯損傷和衰竭。
[0004]免疫性血小板減少癥是一種自身免疫性血液病，其特征為免疫系統(tǒng)攻擊導(dǎo)致血液中的血小板被破壞，結(jié)果使得血小板計(jì)數(shù)異常降低。血小板被破壞的原因是存在抗血小板自身抗體，其是定向針對患者自身血小板的抗體。血小板計(jì)數(shù)降低會導(dǎo)致容易出現(xiàn)瘀傷、牙齦或鼻出血，以及不太常見的，導(dǎo)致嚴(yán)重的內(nèi)出血。
[0005]在臨床實(shí)踐中，免疫性血小板減少癥很難診斷，因?yàn)槠渑c其他疾病的臨床癥狀相似，如過敏性紫癜、骨髓異常增生綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤和其他非免疫介導(dǎo)的血小板減少癥。通常情況下，免疫性血小板減少癥的診斷是一個(gè)排除過程，在做出免疫性血小板減少癥的診斷之前，需要進(jìn)行多項(xiàng)臨床檢驗(yàn)以排除多種其他疾病(如上文所描述的疾病)。這些臨床檢測可能會耗費(fèi)數(shù)月 甚至更長時(shí)間，這樣會明顯推遲對患者的適宜治療。
[0006]此外，一些疾病，如再生障礙性貧血、急性白血病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、維斯科特-奧爾德里奇綜合癥、伊文思綜合癥，在疾病的發(fā)病和進(jìn)展過程中也可能引起免疫性血小板減少癥。將這種免疫性血小板減少癥稱為繼發(fā)性免疫性血小板減少癥，以便將其與原發(fā)性免疫性血小板減少癥區(qū)別開來，導(dǎo)致后者的根本原因?yàn)獒槍ρ“宓淖陨砻庖邞?yīng)答。在患者中確定繼發(fā)性自身免疫性血小板減少癥的發(fā)病以便及時(shí)治療，這一點(diǎn)也很重要。
[0007]因此，免疫性血小板減少癥臨床治療的挑戰(zhàn)之一是對患者疾病的準(zhǔn)確和早期診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本申請?zhí)峁┝擞糜谠\斷和監(jiān)測免疫性血小板減少癥的組合物和方法，所述組合物和方法至少部分基于特定膜突蛋白功能性結(jié)構(gòu)域形成的膜突蛋白片段及其在檢測特定抗膜突蛋白自身抗體中的用途。這些抗膜突蛋白自身抗體的存在及其數(shù)量相應(yīng)地與免疫性血小板減少癥患者的診斷和預(yù)后相關(guān)。在本申請的定義部分對本章節(jié)下面使用的某些相關(guān)術(shù)語進(jìn)行了定義。[0009]一方面，本申請?zhí)峁┝艘环N診斷免疫性血小板減少癥的方法，包括⑴將來自疑似免疫性血小板減少癥主體的樣品與第一肽接觸，所述第一肽包含能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的膜突蛋白片段，其中所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域或其片段組成；(ii)檢測所述第一肽與抗膜突蛋白自身抗體的結(jié)合。如果樣品中存在的與第一肽結(jié)合的抗膜突蛋白自身抗體的水平高于來自參照樣品的正常水平，則表明所述主體患有免疫性血小板減少癥?？鼓ね坏鞍鬃陨砜贵w的不同水平可能與主體的免疫性血小板減少癥的不同階段和嚴(yán)重程度相關(guān)。
[0010]在某些實(shí)施方式中，第一肽包括人膜突蛋白C-末端尾結(jié)構(gòu)域的至少八個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。在一些實(shí)施方式中，第一肽包括人膜突蛋白C-末端尾結(jié)構(gòu)域的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。在一些實(shí)施方式中，第一肽包括人膜突蛋白 C-末端尾結(jié)構(gòu)域的至少 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。
[0011]在某些實(shí)施方式中，人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域由來自人膜突蛋白氨基酸殘基區(qū)段大約471-577的氨基酸殘基組成。在某些實(shí)施方式中，人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域包含選自以下組的氨基酸殘基:人膜突蛋白氨基酸殘基區(qū)段471-574、471-575、471-576,471-577,472-574,472-575,472-576,472-577,473-574,473-575,473-576,473-577、474-574、474-575、474-576或474-577的氨基酸殘基。在某些實(shí)施方式中，人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域含有選自以下組的氨基酸殘基:人膜突蛋白氨基酸殘基區(qū)段471-487,488-501,502-577和471-577的氨基酸殘基。在某些實(shí)施方式中，第一肽包含人膜突蛋白的整個(gè)C-末端尾結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方式中，第一肽基本上由人膜突蛋白的氨基酸殘基471-577或其片段組成。在某些實(shí)施方式中，第一肽不含有人膜突蛋白N-末端FERM結(jié)構(gòu)域的任何實(shí)質(zhì)性部分。本申請所使用的術(shù)語“實(shí)質(zhì)性部分”指能夠與所述結(jié)構(gòu)域(螺旋結(jié)構(gòu)域或N-末端FERM結(jié)構(gòu)域或C-末端尾結(jié)構(gòu)域)競爭，特異性結(jié)合抗體的所述相關(guān)結(jié)構(gòu)域(螺旋結(jié)構(gòu)域或N-末端FERM結(jié)構(gòu)域或C-末端尾結(jié)構(gòu)域)的部分。所述抗體能夠與所述整個(gè)相關(guān)結(jié)構(gòu)域(螺旋結(jié)構(gòu)域或N-末端FERM結(jié)構(gòu)域或C-末端尾結(jié)構(gòu)域)結(jié)合。
[0012]在一些實(shí)施方 式中，第一肽包含人膜突蛋白氨基酸殘基區(qū)段471-487的至少八個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。在某些實(shí)施方式中，第一肽包含人膜突蛋白氨基酸殘基區(qū)段488-501的至少八個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。在某些實(shí)施方式中，第一肽包含人膜突蛋白氨基酸殘基區(qū)段502-577的至少八個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。
[0013]在某些實(shí)施方式中，第一肽與人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域或其片段具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的氨基酸序列同一性。在一些實(shí)施方式中，第一肽與選自人膜突蛋白的氨基酸殘基471-487、488-501、502-577和471-577之一的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的
氨基酸序列同一性。
[0014]另一方面，本申請?zhí)峁┝艘环N診斷免疫性血小板減少癥的方法，其進(jìn)一步包括將來自疑似患有免疫性血小板減少癥的主體的樣品與能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的第二肽接觸，其中所述第二肽包括基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM結(jié)構(gòu)域或其片段組成的第二膜突蛋白片段；以及檢測所述第二肽與抗膜突蛋白自身抗體的結(jié)合。如果與第二肽結(jié)合的抗膜突蛋白自身抗體的存在水平高于來自參照樣品的正常水平，則表明所述主體患有免疫性血小板減少癥。
[0015]在某些實(shí)施方式中，第二肽包括人膜突蛋白N-末端FERM結(jié)構(gòu)域的至少八個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。在某些實(shí)施方式中，第二肽包含人膜突蛋白N-末端FERM結(jié)構(gòu)域的至少10、
20、30、40、50、60、70、80、90或100個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。在一些實(shí)施方式中，第二肽包括人膜突蛋白 N-末端 FERM 結(jié)構(gòu)域的至少 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。
[0016]在某些實(shí)施方式中，人膜突蛋白的N-末端FERM結(jié)構(gòu)域由人膜突蛋白氨基酸殘基區(qū)段大約1-297的氨基酸殘基組成。在某些實(shí)施方式中，人膜突蛋白的N-末端FERM結(jié)構(gòu)域含有選自以下組的氨基酸殘基:人膜突蛋白氨基酸殘基區(qū)段1-294、1-295、1-296、1-297、2-294、2-295、2-296、2-297、3-294、3-295、3-296、3-297、4-294、4-295、4-296 或 4-297 的氨基酸殘基。在某些實(shí) 施方式中，第二肽包含人膜突蛋白的整個(gè)N-末端FERM結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，第二肽基本上由人膜突蛋白N-末端FERM結(jié)構(gòu)域或其片段的氨基酸殘基組成。在某些實(shí)施方式中，人膜突蛋白的N-末端FERM結(jié)構(gòu)域含有選自以下組的氨基酸殘基:人膜突蛋白氨基酸殘基區(qū)段1-94、95-201、202-297和1-297的氨基酸殘基。在某些實(shí)施方式中，第二肽不含有人膜突蛋白C-末端尾結(jié)構(gòu)域的任何實(shí)質(zhì)性部分。
[0017]在某些實(shí)施方式中，第二肽包括人膜突蛋白氨基酸殘基區(qū)段1-94的至少八個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。在某些實(shí)施方式中，第二肽包含人膜突蛋白氨基酸殘基區(qū)段95-201的至少八個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。在某些實(shí)施方式中，第二肽包含人膜突蛋白氨基酸殘基區(qū)段202-297的至少八個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。
[0018]在某些實(shí)施方式中，第二肽與人膜突蛋白的N-末端FERM結(jié)構(gòu)域或其片段具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% 的氨基酸序列同一性。在某些實(shí)施方式中，第二肽與選自人膜突蛋白的氨基酸殘基1-94、95-201、202-297和1-297之一的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一丨I"生。
[0019]另一方面，本申請所述的第一肽和/或第二肽進(jìn)一步包含載體多肽。術(shù)語“載體多肽”指能夠與本申請的膜突蛋白片段偶聯(lián)的任意肽或多肽。載體多肽對于本申請的肽可能是有益的，例如促進(jìn)其穩(wěn)定性、溶解度、特異性或非特異性結(jié)合親和力和/或本申請肽的功能。但是，載體多肽不必要對本申請的肽提供任何益處或甚至生物學(xué)功能。常用的載體多肽包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、抗體片段如抗體恒定區(qū)。
[0020]另一方面，本申請?zhí)峁┝艘环N診斷免疫性血小板減少癥的方法，包括將來自疑似患有免疫性血小板減少癥主體的樣品與能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的第一肽和第二肽接觸，其中第一肽包含基本上由人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域或其片段組成的第一膜突蛋白片段，第二肽包含基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM結(jié)構(gòu)域或其片段組成的第二膜突蛋白片段，以及檢測第一肽和第二肽與抗膜突蛋白自身抗體的結(jié)合。如果與第一肽和第二肽結(jié)合的抗膜突蛋白自身抗體的存在水平高于來自對照樣品的正常水平，則表明主體患有免疫性血小板減少癥。抗膜突蛋白自身抗體分別與第一肽和第二肽結(jié)合的不同水平可能與主體免疫性血小板減少癥的不同階段和嚴(yán)重程度相關(guān)。在某些實(shí)施方式中，在檢驗(yàn)第一肽與抗膜突蛋白抗體結(jié)合情況之前，先針對第二肽與抗膜突蛋白抗體的結(jié)合對所述樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。在某些實(shí)施方式中，同時(shí)針對第一肽和第二肽與抗膜突蛋白抗體的結(jié)合對所述樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。在某些實(shí)施方式中，在檢驗(yàn)第一肽與抗膜突蛋白抗體結(jié)合情況之后，再針對第二肽與抗膜突蛋白抗體的結(jié)合對所述樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，然后在所述樣品的更高濃度條件下，針對第一肽與抗膜突蛋白抗體的結(jié)合情況再次對所述樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。
[0021]另一方面，本申請?zhí)峁┝四軌蚺c抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的肽在制備診斷組合物中的用途，其中所述的肽基本上由人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域或其片段組成，所述診斷組合物用于在主體中診斷免疫性血小板減少癥。
[0022]另一方面，本申請?zhí)峁┝四軌蚺c抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的肽在制備診斷組合物中的用途，其中所述肽基本上由人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域或其片段組成，并且所述肽包括人膜突蛋白片段C-末端尾結(jié)構(gòu)域的至少八個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，所述診斷組合物用于在主體中診斷免疫性血小板減少癥。
[0023]另一方面，本申請?zhí)峁┝四軌蚺c抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的第一肽和第二肽在制備診斷組合物中的用途，其中所述第一肽基本上由人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域或其片段組成，并且所述第二肽基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM結(jié)構(gòu)域或其片段組成，所述診斷組合物用于在主體中診斷免疫性血小板減少癥。
[0024]另一方面，本申請?zhí)峁┝艘环N用于診斷免疫性血小板減少癥的試劑盒，其包括能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的肽，其中所述肽包含基本上由人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域或其片段組成的膜突蛋白片段，以及檢測試劑。在某些實(shí)施方式中，所述檢測試劑是能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的抗體。在某些實(shí)施方式中，能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的肽與固相結(jié)合。
[0025]另一方面，本申請?zhí)峁┝艘环N用于診斷免疫性血小板減少癥的試劑盒，其包括能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的第一肽，其中第一肽包含基本上由人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域或其片段組成 的第一膜突蛋白片段，能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的第二肽，其中第二肽包含基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM結(jié)構(gòu)域或其片段組成的第二膜突蛋白片段，以及檢測試劑。
[0026]另一方面，本申請?zhí)峁┝艘环N確定患有免疫性血小板減少癥的主體病理狀況的方法，包括下述步驟:
[0027](i)將來自疑似患有免疫性血小板減少癥的主體的樣品與包含能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的肽的組合物接觸，其中所述肽包含基本上由人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域或其片段組成的膜突蛋白片段；
[0028](ii)檢測所述肽與抗膜突蛋白自身抗體的結(jié)合并測量與所述肽結(jié)合的抗膜突蛋白自身抗體的水平；以及
[0029](iii)將所述抗膜突蛋白自身抗體的水平與顯示抗膜突蛋白自身抗體滴度與免疫性血小板減少癥病理狀況之間關(guān)系的參照數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，所述的參照數(shù)據(jù)庫是從患病的參照樣品得來的，根據(jù)比較結(jié)果確定所述主體的病理狀況。
[0030]在某些實(shí)施方式中，所述的參照數(shù)據(jù)庫是顯示抗膜突蛋白自身抗體的滴度與主體的血小板計(jì)數(shù)水平之間關(guān)系的參照曲線。
[0031]另一方面，本申請?zhí)峁┝艘环N在進(jìn)行免疫性血小板減少癥治療的主體中監(jiān)測治療應(yīng)答的方法，包括:
[0032](i)將來自疑似免疫性血小板減少癥的主體的樣品與能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的肽接觸，其中所述肽包括基本上由人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域或其片段組成的膜突蛋白片段；
[0033](ii)檢測所述肽與抗膜突蛋白自身抗體的結(jié)合并測量與所述肽結(jié)合的抗膜突蛋白自身抗體的水平；以及
[0034](iii)將所述抗膜突蛋白自身抗體的水平與顯示抗膜突蛋白自身抗體滴度與免疫性血小板減少癥病理狀況之間關(guān)系的參照數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，所述參照數(shù)據(jù)庫是從患病的參照樣品得來的，根據(jù)比較結(jié)果確定所述患者的病理狀況，其中滴度降低表明所述主體對所述治療產(chǎn)生有效應(yīng)答。
[0035]在某些實(shí)施方式中，所述的參照數(shù)據(jù)庫含有治療的不同階段抗膜突蛋白自身抗體水平的數(shù)據(jù)。
[0036]另一方面，本申請?zhí)峁┝艘环N在主體中診斷免疫性血小板減少癥的方法，包括下述步驟:(i)將包含人膜突蛋白C-末端尾結(jié)構(gòu)域至少八個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基的肽與來自所述主體的樣品接觸；和(ii)確定所述樣品中抗膜突蛋白自身抗體的水平是否高于參照樣品中所述抗膜突蛋白自身抗體的水平，以顯示主體是否患有免疫性血小板減少癥。
[0037]附圖簡述
[0038]圖1.全長人膜突蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1，在本申請中也稱為膜突蛋白 _5)。
[0039]圖2.膜突蛋白片段的氨基酸序列:膜突蛋白-1 (SEQ ID NO:2);膜突蛋白_2 (SEQID NO:3);膜突蛋白-3 (SEQ ID NO:4)和膜突蛋白-4 (SEQ ID NO:5)。
[0040]圖3.編碼全長人膜突蛋白的eDNA序列(SEQ ID NO:6)。
[0041]圖4.pET32a(+)表達(dá)載體的克隆譜。
[0042]圖5.pET28a(+)表達(dá)載體的克隆譜。
[0043]圖6.在不同患者組的血清中，抗自身抗體對特定膜突蛋白片段的滴度的圖示說明。
【具體實(shí)施方式】
[0044]除非另有說明，本申請的實(shí)施將采用常規(guī)的分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)，其均在本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段的范圍內(nèi)。在文獻(xiàn)中對此類技術(shù)進(jìn)行了詳細(xì)說明，如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook 等，1989) ；01igonucleotide Synthesis (M.J.Gait, 1984 版)；Animal CellCulture (R.1.Freshney, 1987 版)；Methods in Enzymology 叢書(美國學(xué)術(shù)出版社有限公司)；Current Protocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel 等，1987 版，及其定期更新版本)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullis 等，1994 版)。本申請中使用的引物、多核苷酸和多肽可以采用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。
[0045]除非另有定義，本申請所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的含義。Singleton等，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology 第二 版，J.ffiley&Sons(New York, N.Y.1994),和 March, AdvancedOrganic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure第四版，John ffiley&Sons (NewYork, N.Y.1992)，針對本申請中使用的多個(gè)術(shù)語為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了一般性的指導(dǎo)。[0046]定義
[0047]如Lankes和 Furthmayr (1991)Proc.Natl.Acad.Sc1.,88:8297-8301 中所描述的，術(shù)語“膜突蛋白”指膜組織延伸刺突蛋白。全長的人膜突蛋白是577個(gè)氨基酸的多肽，其具有如圖1所不的氣基酸序列(SEQ ID NO:1) o根據(jù)下文中的進(jìn)一步定義，I旲突蛋白由二個(gè)結(jié)構(gòu)域組成:N-末端FERM結(jié)構(gòu)域、螺旋結(jié)構(gòu)域和C-末端尾結(jié)構(gòu)域。其屬于ERM(埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白)家族。所述的三種ERM蛋白，主要在細(xì)胞質(zhì)膜下的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，其具有高度的序列同源性，并作為細(xì)胞質(zhì)膜和肌動蛋白細(xì)胞骨架之間的連接蛋白。此外，人膜突蛋白與其他種屬如小鼠和牛的膜突蛋白之間具有高度的氨基酸序列同一性。Sato等，(1992)J.Cell Sc1.103:131-143。
[0048]術(shù)語“膜突蛋白片段”指短于全長野生型膜突蛋白的膜突蛋白多肽的一部分，其能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合。此類能夠與結(jié)構(gòu)域特異性抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的膜突蛋白片段在本申請中是有用的。所述膜突蛋白片段的“片段”指短于此類膜突蛋白片段的膜突蛋白片段的一部分，其能與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合。
[0049]人膜突蛋白的“N-末端FERM結(jié)構(gòu)域”指野生型人膜突蛋白的球狀部分，其在結(jié)構(gòu)上與所述蛋白的氨基末端鄰近，在功能上負(fù)責(zé)將所述蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜并且與粘附分子相互作用。因?yàn)樗鯢ERM結(jié)構(gòu)域其與條帶4.1蛋白具有同源性而代表了條帶4.1、埃茲蛋白、根蛋白、膜突蛋白同源結(jié)構(gòu)域，該FERM結(jié)構(gòu)域定義了條帶4.1蛋白超家族成員，其包括細(xì)胞骨架蛋白如紅細(xì)胞條帶4.1、踝蛋白和埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ERM)蛋白家族，以及若干酪氨酸激酶和磷酸酶及腫瘤抑制蛋白merlin。特別地，該術(shù)語指人膜突蛋白成熟形式的約前297個(gè)氨基酸殘基(例如，氨基酸殘基1-297 (SEQ ID N0:2))。在某些文獻(xiàn)中，也將同一結(jié)構(gòu)域稱為N-ERM相關(guān)結(jié)構(gòu)域(N-ERMAD)，其包括在本申請的定義中。Bretscher等，(1995)Biochem.34，16830-7。
[0050]人膜突蛋白的“C-末端尾結(jié)構(gòu)域”指野生型人膜突蛋白的一部分，其在結(jié)構(gòu)上與所述蛋白的羧基末端鄰近，在功能上負(fù)責(zé)與肌動蛋白絲結(jié)合并與其相互作用。膜突蛋白的尾結(jié)構(gòu)域帶正電并采用延伸、彎曲 的結(jié)構(gòu)。特別地，該術(shù)語指人膜突蛋白的約最后107個(gè)氨基酸殘基(例如，氨基酸殘基471-577 (SEQ ID N0:5))。在某些文獻(xiàn)中，也將同一結(jié)構(gòu)域稱為C-ERM相關(guān)結(jié)構(gòu)域(C-ERMAD)，其包括在本申請的定義中。Bretscher等，(1995)。C-末端尾結(jié)構(gòu)域的最后34個(gè)氨基酸殘基在ERM蛋白中高度保守，并形成與F-肌動蛋白結(jié)合的區(qū)段。在F-肌動蛋白結(jié)合區(qū)段內(nèi)，存在蘇氨酸殘基(在野生型人膜突蛋白中為Thr558)，其在該蛋白活化的過程中磷酸化。
[0051 ] 人膜突蛋白的“螺旋結(jié)構(gòu)域”指位于N-末端FERM結(jié)構(gòu)域和C-末端尾結(jié)構(gòu)域之間的野生型人膜突蛋白的中間部分。其采用延伸的a-螺旋結(jié)構(gòu)，作為兩個(gè)末端結(jié)構(gòu)域之間的連接子。特別地，該術(shù)語指包含人膜突蛋白大約298-470位的氨基酸殘基(SEQ ID NO:4)區(qū)段。
[0052]術(shù)語“抗膜突蛋白自身抗體”指抗膜突蛋白抗體，其由個(gè)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，并與此類個(gè)體自身的膜突蛋白或其片段識別和結(jié)合。?？鼓ね坏鞍鬃陨砜贵w的存在與免疫性血小板減少癥相關(guān)，此類抗膜突蛋白自身抗體的滴度可能與免疫性血小板減少癥的病理狀況相關(guān)。
[0053]本申請所使用的術(shù)語“診斷”指鑒別分子或病理狀況，疾病或狀況，如鑒別自身免疫性疾病，或者指鑒別可能從特定治療方案中獲益的自身免疫性疾病患者。在一個(gè)實(shí)施方式中，診斷指鑒別免疫性血小板減少癥。在又Iv實(shí)施方式中，診斷指鑒別免疫性血小板減少癥，所述疾病與主體中的抗膜突蛋白自身抗體高于正常值相關(guān)。
[0054]本申請所使用的術(shù)語“預(yù)后”指疾病癥狀后果的可能性預(yù)測，包括例如疾病的復(fù)發(fā)、發(fā)作和耐藥性。該術(shù)語也指治療的臨床益處的可能性預(yù)測。
[0055]本申請所使用的術(shù)語“預(yù)測”指患者對藥物或一組藥物或特定治療過程產(chǎn)生有利或不利應(yīng)答的可能性。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述預(yù)測與那些應(yīng)答的程度相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述預(yù)測涉及經(jīng)治療后患者是否存活或病情改善和/或其概率，例如使用特定治療劑治療，以及疾病某一時(shí)間段沒有復(fù)發(fā)。本發(fā)明的預(yù)測方法可以在臨床上使用，以便通過對任意特定患者選擇最合適的治療形式作出治療決定。本申請的預(yù)測方法在預(yù)測患者是否可能對治療方案產(chǎn)生有利應(yīng)答方面是有價(jià)值的工具，如給定治療方案，包括例如給予給定治療劑或其組合、手術(shù)干預(yù)、類固醇治療等，或者在采用治療方案后患者是否可能長期存活。
[0056]本申請所使用的術(shù)語“血小板減少癥”指因血小板產(chǎn)生障礙或破壞而使得主體的血小板水平低于該個(gè)體血小板數(shù)正常范圍的任意疾病。在一個(gè)實(shí)施方式中，在人體內(nèi)正常血小板水平的范圍是每微升外周血約150.000至300.000個(gè)。如本申請所使用的，血小板減少癥還指與個(gè)體在某個(gè)參照點(diǎn)測定的血小板數(shù)相比，該個(gè)體的血小板數(shù)減少。所述的參照點(diǎn)可以是例如治療如放療或化療開始時(shí)。
[0057]本申請所使用的術(shù)語“免疫性血小板減少癥”指由定向針對個(gè)體自身血小板的自身免疫應(yīng)答引起的任意類型的血小板減少癥。免疫性血小板減少癥包括原發(fā)性免疫性血小板減少癥，其中自身免疫應(yīng)答是導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)減少的根本原因。免疫性血小板減少癥包括例如特發(fā)性血小板減少性紫癜。此外,還有繼發(fā)性免疫性血小板減少癥,其中血小板計(jì)數(shù)減少與一種或多種其他疾病有關(guān)`，`如再生障礙性貧血、缺鐵性貧血和自身免疫性溶血性貧血、白血病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、HIV相關(guān)的血小板減少癥、維斯科特-奧爾德里奇綜合癥、伊文思綜合癥等。在繼發(fā)性免疫性血小板減少癥中，其他疾病誘導(dǎo)或觸發(fā)或者以其他原因?qū)е聜€(gè)體的機(jī)體針對其自身血小板產(chǎn)生自身免疫性應(yīng)答。
[0058]本申請中的“樣品”或“待測樣品”指獲取自或來自所關(guān)注主體的組分，含有細(xì)胞和/或其他分子實(shí)體，所述細(xì)胞和/或其他分子實(shí)體可以基于其性質(zhì)例如物理學(xué)、生化、化學(xué)和/或生理學(xué)性質(zhì)而被表征和/或鑒定。在一個(gè)實(shí)施方式中，該定義包括來源于生物的血液和其他液體樣品以及組織樣品如活檢標(biāo)本或組織培養(yǎng)物或從中得到的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。組織樣品的來源可以是實(shí)體組織如來自新鮮、冰凍和/或保存的器官或組織樣品或者活檢樣品或抽出物；血液或任意血液成分如血漿或血清；體液；以及來自主體在妊娠或發(fā)育的任意時(shí)間的細(xì)胞或血漿。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述樣品是來自主體的全血、血清或血漿。主體可以是人或動物主體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，主體患有或疑似患有免疫性血小板減少癥。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該定義包括在取得后經(jīng)過任意方法處理的生物樣品，如使用試劑處理、增溶或?qū)δ承┏煞秩绲鞍谆蚨嗪塑账徇M(jìn)行富集。
[0059]在一個(gè)實(shí)施方式中，樣品來自進(jìn)行任何治療以前的主體或患者。在另一個(gè)實(shí)施方式中，待測樣品來自如免疫性血小板減少癥治療的過程中或治療后。在一個(gè)實(shí)施方式中，待測樣品是臨床樣品。在另一個(gè)實(shí)施方式中，待測樣品用于診斷分析。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在采用本申請的方法進(jìn)行檢測前，使用其他已知的血液檢測方法對所述樣品進(jìn)行預(yù)檢。這些血液檢測方法包括，例如全血計(jì)數(shù)、肝酶、腎功能、維生素B12水平、葉酸水平、紅細(xì)胞沉降率、外周血液涂片、骨髓活檢等。
[0060]如本申請所使用的，“參照樣品”指獲取自已知來源，或來自確信未患有使用本申請的方法或組合物用于鑒別的疾病或病癥的主體的樣品。在一個(gè)實(shí)施方式中，對照樣品獲取自使用本申請的組合物或方法對其疾病或病癥進(jìn)行鑒定的同一主體或患者機(jī)體的健康部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，對照樣品獲取自不是使用本申請的組合物或方法對其疾病或病癥進(jìn)行鑒定的主體或患者的個(gè)體機(jī)體的健康部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，參照樣品是來自具有正常血小板計(jì)數(shù)的健康個(gè)體。
[0061 ] 如本申請所使用的，“疾病參照樣品”指來自在臨床上已鑒定為患有疾病或病癥的來源的樣品，將使用本申請的方法或組合物對所述樣品進(jìn)行鑒別。在一個(gè)實(shí)施方式中，疾病對照樣品是獲取自在臨床上診斷為免疫性血小板減少癥的主體或患者的樣品。在一個(gè)實(shí)施方式中，在臨床上診斷為免疫性血小板減少癥的主體或患者正接受針對免疫性血小板減少癥的治療。
[0062]如本申請所使用的，“參照數(shù)據(jù)庫”指來自一個(gè)或多個(gè)參照樣品或疾病參照樣品的數(shù)據(jù)、標(biāo)準(zhǔn)或水平的集 合。在一個(gè)實(shí)施方式中，此類數(shù)據(jù)、標(biāo)準(zhǔn)或水平的集合是標(biāo)準(zhǔn)化的，以便可以用來比較來自一個(gè)或多個(gè)樣品的數(shù)據(jù)?！皹?biāo)準(zhǔn)化”或“規(guī)范化”是一種方法，通過其將測量的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成可以直接與其他這樣標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)直接進(jìn)行比較的數(shù)據(jù)。標(biāo)準(zhǔn)化用于克服由于不同分析之間因素變化而導(dǎo)致的分析特異性誤差，例如上樣量、結(jié)合效率、檢測敏感性和其他多種誤差的變異性。在一個(gè)實(shí)施方式中，參照數(shù)據(jù)庫包括來自一個(gè)或多個(gè)參照樣品或疾病參照樣品的抗膜突蛋白自身抗體滴度、血小板計(jì)數(shù)、血細(xì)胞計(jì)數(shù)和/或其他實(shí)驗(yàn)室和臨床數(shù)據(jù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，參照數(shù)據(jù)庫包括抗膜突蛋白自身抗體的水平，其每個(gè)均標(biāo)準(zhǔn)化為與對比樣品(例如，已知量的抗膜突蛋白自身抗體)的抗膜突蛋白自身抗體水平的百分率，所述對比樣品的抗膜突蛋白自身抗體水平是在與參照樣品或疾病參照樣品相同的條件下檢驗(yàn)得到的。為了與此類標(biāo)準(zhǔn)化的抗膜突蛋白自身抗體的水平進(jìn)行比較，還對待測樣品抗膜突蛋白自身抗體的水平進(jìn)行測量，并計(jì)算為對比樣品的抗膜突蛋白自身抗體水平的百分率，所述對比樣品的抗膜突蛋白自身水平是在與待測樣品在相同條件下進(jìn)行檢驗(yàn)得到的。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過匯總來自參照樣品的數(shù)據(jù)建立參照數(shù)據(jù)庫，所述參照樣品來自健康主體和/或使用本申請的組合物或方法對其疾病或病癥進(jìn)行鑒定的同一主體或患者機(jī)體的未患病部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過匯總來自疾病參照樣品的數(shù)據(jù)建立參照數(shù)據(jù)庫，所述疾病參照樣品來自正在治療免疫性血小板減少癥的個(gè)體。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過匯總來自疾病參照樣品的數(shù)據(jù)建立參照數(shù)據(jù)庫，所述疾病參照樣品來自處于免疫性血小板減少癥不同階段的個(gè)體，所述免疫性血小板減少癥所處的不同階段通過例如血小板計(jì)數(shù)和其他臨床指征的不同水平證實(shí)。
[0063]在某些實(shí)施方式中，術(shù)語“增加”指與參照樣品或疾病參照樣品相比自身抗體的水平總體升高 5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多，所述自身抗體的水平通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法如本申請所描述的那些方法檢測得到。在某些實(shí)施方式中，術(shù)語增加指在樣品中自身抗體的水平增加，其中增加的自身抗體的水平是參照樣品或疾病參照樣品的至少約1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、25倍、50倍、75倍或100倍。[0064]在某些實(shí)施方式中，本申請中的術(shù)語“減少”指與參照樣品或疾病參照樣品相比自身抗體的水平總體降低 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多，所述自身抗體的水平通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法如本申請所描述的那些方法檢測得到。在某些實(shí)施方式中，術(shù)語減少指在樣品中自身抗體的水平減少，其中減少的自身抗體的水平是參照樣品或疾病參照樣品的至少約0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.6倍、0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍或0.01倍。
[0065]術(shù)語“檢測方法”指在本申請所述的ELISA中用于檢測可檢測抗體是否存在的部分或技術(shù)，包括檢測劑，其擴(kuò)增固化的標(biāo)記如被酶標(biāo)板捕獲的標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方式中，檢測方法是比色檢測劑如抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素HRP。在另一個(gè)實(shí)施方式中，檢測方法是H202/TMB顯色系統(tǒng)。
[0066]術(shù)語“捕獲試劑”指在樣品中能夠結(jié)合并捕獲靶分子的試劑，這樣在適宜條件下，可以將捕獲試劑-靶分子復(fù)合物與其余的樣品分離。典型地，捕獲試劑被固定或是可固定的。在夾心免疫分析中，捕獲試劑優(yōu)選是針對靶抗原的抗體或不同抗體的混合物。
[0067]所謂“關(guān)聯(lián)”或“相關(guān)性”指以任何方式將第一種分析或方案的表現(xiàn)和/或結(jié)果與第二種分析或方案的表現(xiàn)和/或結(jié)果進(jìn)行比較。例如，可以使用第一種分析或方案的結(jié)果實(shí)施第二種方案和/或可以使用第一種分析或方案的結(jié)果確定是否應(yīng)實(shí)施第二種分析或方案。就自身抗體檢測的實(shí)施方式而言，可以使用檢測分析或方案的結(jié)果確定是否應(yīng)實(shí)施特定的治療方案。
[0068]本申請中使用的單詞“標(biāo)記”指化合物或組合物，其直接或間接地偶聯(lián)或融合至某種試劑如核酸探針或抗體·，并使其偶聯(lián)或融合的試劑易于檢測。標(biāo)記本身可以是可檢測的(例如，放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或者對于酶標(biāo)記而言，其可以催化底物化合物或組合物的化學(xué)變化，所述化學(xué)變化是可檢測的。
[0069]“分離的”多肽指已從其天然環(huán)境的污染組分中鑒別和分離和/或回收的多肽。其天然環(huán)境的污染組分是干擾多肽的診斷或治療用途的材料，其可以包括酶、激素和其他蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，所述多肽將被純化至(I)通過Lowry法測得多肽以重量計(jì)大于95%，或者以重量計(jì)大于99%，(2)通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀測得達(dá)到足以獲得至少15個(gè)N-末端或內(nèi)部氨基酸序列殘基的程度，或者(3)通過使用考馬斯藍(lán)或銀染色法以還原或非還原條件下的SDS-PAGE測得具有同質(zhì)性。分離的多肽包括在重組細(xì)胞內(nèi)原位的多肽，因?yàn)槎嚯奶烊画h(huán)境中的至少一種污染組分將不存在。然而，通常的，分離的多肽將通過至少一個(gè)純化步驟制備。
[0070]與本申請的膜突蛋白結(jié)構(gòu)域或片段相關(guān)的術(shù)語“氨基酸序列同一性百分率(% ) ”，其被定義為在所關(guān)注序列中與膜突蛋白結(jié)構(gòu)域或片段的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基百分率，且是在序列比對后，且如果必要引入間隙，以達(dá)到序列同一性的最大百分率，并且不把任何保守性氨基酸取代作為所述序列同一性的一部分。用于確定氨基酸序列同一性百分率目的的比對可以通過本領(lǐng)域內(nèi)公知的多種方法實(shí)現(xiàn)，例如使用公眾可以獲得的計(jì)算機(jī)軟件如 BLAST、BLAST-2、ALIGN 或 Megalign (DNASTAR)軟件。參見例如 Altschul等，Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997) ;Altschul 等，Methods in Enzymology266:460-480(1996)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定用于測量比對的適宜參數(shù)，包括在待比較序列的全長范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)最大比對所需的任意算法。
[0071]術(shù)語“抗體”使用其最廣泛的含義并且特別地涵蓋了單克隆抗體(包括全長或完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、多價(jià)抗體、由至少兩個(gè)完整抗體形成的多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和只要其展示出所需的抗原結(jié)合活性的抗體片段即可。
[0072]“治療”指治療性治療和預(yù)防或防范措施。需要治療的主體包括已經(jīng)患有疾病的主體以及需要預(yù)防疾病的主體。
[0073]可以使用任何表明對患者的益處的終點(diǎn)對患者的應(yīng)答性進(jìn)行評估，包括但不限于，在治療后的給定時(shí)間點(diǎn)(I)在某種程度上抑制疾病的進(jìn)展，包括延緩和完全阻止；(2)減少疾病發(fā)作的次數(shù)和/或減輕癥狀；⑶縮小損傷尺寸；⑷抑制(即，減少、延緩或完全阻止)疾病細(xì)胞向周圍鄰近的器官和/或組織浸潤；(5)抑制(即，減少、延緩或完全阻止)疾病傳播；(6)在某種程度上減輕與疾病相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)癥狀；(7)治療后增加無病期的長度；(8)減少自身免疫性應(yīng)答，其可能，但不必須，導(dǎo)致疾病損傷消失或除去的結(jié)果，例如無進(jìn)展生存；(9)增加總生存期；(10)提高應(yīng)答率；和/或(11)降低死亡率。術(shù)語“益處”使用其最廣泛的含義并且指任意令人滿意的效果。
[0074]本發(fā)明的典型方法和材料
[0075]本申請?zhí)峁┝擞糜谠\斷和監(jiān)測免疫性血小板減少癥的組合物和方法，所述免疫性血小板減少癥與抗膜突蛋白自身抗體的存在或滴度相關(guān)。本申請可以通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法實(shí)施。
[0076]載體、宿主細(xì)胞和重組方法
[0077]本申請的多肽可以使用易于獲得的技術(shù)和材料來重組生產(chǎn)。對于本申請多肽的重組生產(chǎn)而言，會將編碼多肽的核酸分離并插入可復(fù)制載體中，所述載體供進(jìn)一步克隆(DNA的擴(kuò)增)或表達(dá)。使用常規(guī)方法可以容易地對編碼本申請中多肽的DNA進(jìn)行分離和測序。例如，通過使用寡核苷酸探針 對編碼人膜突蛋白的DNA進(jìn)行分離和測序，所述探針能夠特異性地與編碼蛋白的基因結(jié)合。可以使用多種載體。載體組分一般包括，但不限于，下述中的一種或多種:信號序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種選擇基因、增強(qiáng)子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。
[0078]信號序列組分
[0079]本申請的多肽不僅可以直接重組生產(chǎn)，還可以作為帶有異源多肽的融合多肽來重組生產(chǎn)，所述融合多肽一般地是在成熟蛋白或多肽的N-末端，具有特異性裂解位點(diǎn)的信號序列或其他多肽。一般選擇的異源性信號序列可以被宿主細(xì)胞識別和處理(即，通過信號肽酶裂解)。對于原核宿主細(xì)胞而言，信號序列可以選自，例如原核信號序列堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)物。對于酵母分泌物，信號序列可以是例如酵母轉(zhuǎn)化前導(dǎo)物、a因子前導(dǎo)物(包括酵母屬和克魯維酵母屬a-因子前導(dǎo)物)或酸性磷酸酶前導(dǎo)物、白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)物或W090/13646中描述的信號。在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)中，可以使用哺乳動物的信號序列以及病毒分泌前導(dǎo)物例如單純皰疹gD信號。
[0080]將此類前體區(qū)的DNA在讀碼框中連接至編碼本申請的多肽的DNA。
[0081]復(fù)制起點(diǎn)組分
[0082]表達(dá)和克隆載體均含有能夠使載體在一個(gè)或多個(gè)選定的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。在一般情況下，在克隆載體中該序列可以使所述載體的復(fù)制獨(dú)立于宿主染色體DNA，且包括復(fù)制起點(diǎn)或自發(fā)復(fù)制的序列。在多種細(xì)菌、酵母和病毒中，此類序列是公知的。來自質(zhì)粒PBR322的復(fù)制起點(diǎn)適用于大多數(shù)的革蘭氏陰性細(xì)菌、2 y質(zhì)粒起點(diǎn)適用于酵母、以及多種病毒起點(diǎn)(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)均可在哺乳動物細(xì)胞中用于克隆載體。在一般情況下，在哺乳動物表達(dá)載體中不需要復(fù)制起點(diǎn)組分(一般地可以僅使用SV40起點(diǎn)，因?yàn)槠浜性缙趩幼?。
[0083]詵擇某因鉬分
[0084]表達(dá)和克隆載體可以含有選擇基因，也稱為選擇性標(biāo)記物。典型的選擇基因編碼蛋白，該蛋白(a)提供對抗生素或其他毒素，例如氨芐西林、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素的抗性，(b)彌補(bǔ)營養(yǎng)缺陷型缺陷，或者(C)提供從復(fù)合培養(yǎng)基中無法獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)成分，例如編碼桿菌屬D-丙氨酸消旋酶的基因。
[0085]選擇方案的一個(gè)例子是利用藥物阻止宿主細(xì)胞生長。那些被異源基因成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生能賦予藥物抗性的蛋白，因而在選擇過程中得以存活。此類顯性選擇的例子使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
[0086]另一個(gè)用于哺乳動物細(xì)胞的適宜選擇性標(biāo)記物的例子是能夠識別可以攝取核酸的細(xì)胞的那些，如DHFR、胸腺嘧啶激酶、金屬硫蛋白-1和-11、典型的靈長類動物金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。
[0087]例如，通過在含有DHFR的競爭性拮抗劑甲氨蝶呤(Mtx)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所有轉(zhuǎn)化體，對使用DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞首先進(jìn)行鑒別。當(dāng)引入野生型DHFR時(shí)適宜的宿主細(xì)胞是缺乏DHFR活性的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。
[0088]或者，可以通過在含有針對選擇性標(biāo)記物如氨基糖苷類抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的選擇劑的培養(yǎng)基中，通過細(xì)胞生長對宿主細(xì)胞(特別是含有內(nèi)源性DHFR的野生型宿主)進(jìn)行選擇，所述宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化了編碼本申請的多肽、野生型DHFR蛋白和其他選擇性標(biāo)記物如 氨基糖苷3’ -磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)的DNA序列。參見美國專利號4，965，199。
[0089]在酵母中使用的適宜選擇基因是在酵母質(zhì)粒Yrp7中存在的trpl基因(Stinchcomb等，Nature, 282:39 (1979))。trpl基因提供了針對酵母突變株的選擇標(biāo)記物，所述酵母突變株在色氨酸中缺乏生長能力，例如ATCC N0.44076或PEP4-1，Jones,Genetics, 85:12 (1977)。在酵母宿主細(xì)胞的基因組中的trpl損傷提供了一個(gè)有效環(huán)境，所述環(huán)境用于通過在缺乏色氨酸條件下生長來檢測轉(zhuǎn)化。類似地，使用已知攜帶Leu2基因的質(zhì)粒彌補(bǔ)Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC20，622或38，626)。
[0090]啟動子組分
[0091]表達(dá)和克隆載體通常含有啟動子，其可被宿主生物體識別并且且與編碼本申請多肽的核酸可操作性地連接。適用于原核宿主的啟動子包括PhoA啟動子、^ -內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、喊性憐Ife酶、色氣fe (trp)啟動子系統(tǒng)和雜父啟動子如tac啟動子。但是，其他已知的細(xì)菌啟動子也是適宜的。在細(xì)菌系統(tǒng)中使用的啟動子還含有與編碼本申請多肽的DNA可操作性地連接的Shine-Dalgamo (S.D.)序列。
[0092]用于真核生物的啟動子序列是已知的。幾乎所有真核基因在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游約25至30個(gè)堿基的位置均具有富含AT的區(qū)域。多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游70至80個(gè)堿基處存在另一個(gè)序列，所述序列是CNCAAT區(qū)段，在該區(qū)段中N可以是任意核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3’末端是AATAAA序列，所述序列可能是在編碼序列的3’末端添加polyA尾的信號。所有這些序列均適宜插入真核表達(dá)載體。
[0093]供酵母宿主使用的適宜啟動子序列的例子包括3-磷酸甘油激酶或其他糖解酶如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸-果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶的啟動子。
[0094]其他酵母啟動子，其是具有轉(zhuǎn)錄的附加優(yōu)勢的誘導(dǎo)型啟動子，所述轉(zhuǎn)錄由生長條件控制，所述酵母啟動子是針對乙醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶以及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區(qū)段。在EP73，657中對適宜在酵母表達(dá)中使用的載體和啟動子作了進(jìn)一步的描述。將酵母增強(qiáng)子與酵母啟動子一起使用也是有利地。
[0095]通過來自病毒基因組的啟動子，在哺乳動物宿主細(xì)胞的載體中控制本申請多肽的轉(zhuǎn)錄，所述病毒基因組例如多瘤病毒、鳥痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、鳥類肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40 (SV40)，所述啟動子還來自異源性哺乳動物的啟動子如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子，來自熱休克的啟動子，所提供的此類啟動子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)具有相容性。
[0096]SV40病毒的早期和晚期啟動子能夠方便地以SV40限制性片段的形式獲得，所述限制性片段也含有SV40病毒的復(fù)制起點(diǎn)。人巨細(xì)胞病毒的即刻早期啟動子能夠方便地以HindIII E限制性片段的形式獲得。在美國專利號4，419，446中披露了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達(dá)DNA的系統(tǒng)。在美國專利號4，601，978中描述了對該系統(tǒng)的改進(jìn)。在來自單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶啟動子的控制下，人￠-干擾素cDNA在小鼠細(xì)胞中的表達(dá)亦可參見Reyes等，Nature297:598-601 (1982)。或者，可以使用勞氏肉瘤病毒長末端重復(fù)序列作為啟動子。
[0097]增強(qiáng)子元件 組分
[0098]通過將增強(qiáng)子序列插入載體通常會增加高等真核細(xì)胞對編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。現(xiàn)已知來自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、a-胎蛋白和胰島素)的多個(gè)增強(qiáng)子序列。典型地，可以使用來自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。例子包括在復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)(bpl00-270)的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強(qiáng)子、在復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子。用于真核啟動子活化的增強(qiáng)元件亦可參見Yaniv，NatUre297:17-18(1982)。增強(qiáng)子可以在多肽編碼序列的5’或3’位點(diǎn)連接至載體，但是其一般位于啟動子的5’位點(diǎn)。
[0099]轉(zhuǎn)錄終Ih鉬分
[0100]在真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或者來自其他多細(xì)胞生物體的有核細(xì)胞)中使用的表達(dá)載體還將含有轉(zhuǎn)錄終止和穩(wěn)定mRNA所必須的序列。此類序列通常來自真核或病毒DNA或cDNA的非轉(zhuǎn)譯區(qū)5’位點(diǎn)，有時(shí)來自3’位點(diǎn)。這些區(qū)域含有轉(zhuǎn)錄為編碼本申請多肽的mRNA非翻譯部分的多聚腺苷酸片段的核苷酸片段。牛生長激素聚腺苷酸化區(qū)段是一種有用的轉(zhuǎn)錄終止組分。參見W094/11026和本申請公開的表達(dá)載體。
[0101]宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化
[0102]用于在本申請所述的載體中克隆或表達(dá)編碼本申請多肽DNA的適宜宿主細(xì)胞為上文所述的原核細(xì)胞、酵母或高等真核細(xì)胞。適宜的原核生物包括真細(xì)菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科如埃希桿菌屬例如大腸桿菌、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、變形桿菌屬、沙門氏菌屬例如鼠傷寒沙門氏菌、沙雷氏菌屬例如粘質(zhì)沙雷氏菌和忐賀氏菌屬以及桿菌屬如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌(例如，在1989年4月12日公開的DD266，710中披露的地衣芽胞桿菌)、假單胞菌屬如銅綠假單胞菌和鏈霉菌屬。典型地，大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294 (ATCC31, 446)，但是其他菌株如大腸桿菌B、大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌X1776(ATCC31, 537)和大腸桿菌W3110 (ATCC27, 325)也是適宜的。這些例子是說明性的而非限制性的。
[0103]除了原核生物以外，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適宜用于編碼本申請多肽的載體的克隆或表達(dá)宿主。在低等真核宿主微生物中，釀酒酵母或普通的面包酵母是最常用的。但是，多種其他的屬、種和菌株通常在本申請中也是可用的和有用的，如粟酒裂殖酵母；克魯維酵母菌屬宿主例如克魯維乳酸酵母、脆弱克魯維酵母(ATCC12，424)、克魯維保加利亞酵母(ATCC16，045)、維克拉姆克魯維酵母(ATCC24，178)、瓦爾特克魯維酵母(ATCC56, 500)、果蠅克魯維酵母(ATCC36，906)、耐熱克魯維酵母和馬克斯克魯維酵母；耶氏酵母屬(EP402, 226);畢赤酵母屬(EP183, 070);念珠菌屬；瑞氏木霉(EP244, 234);粗糙脈孢菌；許旺酵母屬如許旺酵母；和絲狀真菌例如鏈孢霉菌、青霉菌、彎頸霉菌和曲霉宿主如構(gòu)巢曲霉和黑曲霉。
[0104]用于表達(dá)本申請多肽的適宜宿主細(xì)胞可以來自多細(xì)胞生物體。非脊椎動物細(xì)胞包括植物和昆蟲細(xì)胞。已鑒定了多種桿狀病毒菌株及其變體和對應(yīng)許可的昆蟲宿主細(xì)胞，其來自宿主如草地夜蛾(幼蟲)、埃及伊蚊(蚊子)、白紋伊蚊(蚊子)、黑腹果蠅(果蠅)和家蠶。用于轉(zhuǎn)染的多種病毒菌株是可以公開獲得的，例如苜蓿銀紋夜蛾NPV的L-1變體和家蠶NPV的Bm-5菌株，此類病毒可以在此作為根據(jù)本申請的病毒使用，特別是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛和番茄的植物細(xì)胞培養(yǎng)物也能夠作為宿主。
[0105]然而，最感興趣的是脊椎動物細(xì)胞，在培養(yǎng)基(組織培養(yǎng)基)中繁殖脊椎動物細(xì)胞已成為常規(guī)方法。有用的哺乳動物宿主細(xì)胞系的例子是由SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVl細(xì)胞系(COS-7, ATCC CRL1651);人胚腎細(xì)胞系(用于在懸浮培養(yǎng)物中生長的亞克隆293或293細(xì)胞，Graham 等，J.Gen Virol.36:59(`1977));幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL10);中國倉鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CH0，Urlaub 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA77:4216(1980));小鼠支持細(xì)胞(TM4，Mather，Biol.R印rod.23:243-251(1980));猴腎細(xì)胞(CVIATCC CCL70);非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76，ATCC CRL-1587);人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCCCCL2);犬腎細(xì)胞(MDCK，ATCCCCL34);布法羅大鼠肝細(xì)胞(BRL3A，ATCC CRL1442);人肺細(xì)胞(W138，ATCC CCL75);人肝細(xì)胞 Ofep G2，HB8065);小鼠乳房腫瘤(MMT060562，ATCC CCL51) ;TRI 細(xì)胞(Mather 等，AnnalsN.Y.Acad.Sc1.383:44-68(1982)) ；MRC5 細(xì)胞；FS4 細(xì)胞；和人肝癌細(xì)胞系(Hep G2)。
[0106]使用上文所述的用于生產(chǎn)本申請多肽的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中對其進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基被修飾以適合誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。
_7] 培養(yǎng)宿主細(xì)胞
[0108]用于生產(chǎn)本申請的多肽的宿主細(xì)胞可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。市售的培養(yǎng)基如Ham’ sFlO(Sigma)、最低必需培養(yǎng)基(MEM) (Sigma)、RPM1-1640 (Sigma)和達(dá)爾伯克改良伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基(Dulbecco，s Modified Eagle，s Medium, DMEM) (Sigma)均適于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。此外，Ham 等，Meth.Enz.58:44 (1979)，Barnes 等，Anal.Biochem.102:255 (1980)，美國專利號 4，767，704 ;4，657，866 ;4，927，762 ;4，560，655 ；或 5，122，469 ；W090/03430 ；W087/00195 ;或美國專利復(fù)審號30，985中描述的任意培養(yǎng)基也可以作為宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基。必要時(shí)可以用激素和/或其他生長因子(如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(如氯化鈉、鈣鹽、鎂鹽和磷酸鹽)、緩沖劑(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCIN?藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩范圍的最終濃度存在的無機(jī)化合物)和葡萄糖或等效能量來源補(bǔ)充這些培養(yǎng)基中的任意一種。還可以補(bǔ)充本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的適宜濃度的任意其他必要的添加劑。培養(yǎng)條件如溫度、PH等均是此前被選擇用于表達(dá)宿主細(xì)胞的那些，其對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。
[0109]肽的化學(xué)合成
[0110]還可以通過化學(xué)合成生產(chǎn)本申請的多肽，例如Merrifield in J.A.C.S.85:2149-2154 (1963)中描述的固相合成法，或 Bodanszky 等,第二版，John Wiley and Sons,1976的《肽合成》中描述的標(biāo)準(zhǔn)溶液合成方法。這些書籍整體參考并入本申請。
[0111]肽合成的固相合成方法的一般步驟涉及首先將肽被保護(hù)的C-末端氨基酸與樹脂連接。連接后，過濾、洗滌樹脂并除去C-末端氨基酸a氨基基團(tuán)上的保護(hù)基團(tuán)(例如叔丁氧羰基)。當(dāng)然，除去該保護(hù)基團(tuán)必須在不破壞氨基酸與樹脂之間連接的前提下進(jìn)行。然后在得到的樹脂肽上偶聯(lián)倒數(shù)第二個(gè)C-末端被保護(hù)的氨基酸。進(jìn)行這一偶聯(lián)時(shí)，在第二個(gè)氨基酸的游離羧基與連接在樹脂上的第一個(gè)氨基酸的氨基之間形成一個(gè)酰胺鍵。用連續(xù)的氨基酸重復(fù)這一反應(yīng)過程，直到肽全部的氨基酸均與樹脂連接。最后，從樹脂上裂解下被保護(hù)的肽，除去保護(hù)基團(tuán)，得到所需的肽。用于從樹脂上分離肽和除去保護(hù)基團(tuán)的裂解技術(shù)取決于所選擇的樹脂和保護(hù)基團(tuán)，這些技術(shù)對熟悉肽合成領(lǐng)域的人來說是已知的。
[0112]上述樹脂可以是任意適宜的聚合物并且其含有能夠通過共價(jià)鍵與第一個(gè)被保護(hù)的氨基酸牢固連接的官能團(tuán)。多種聚合物均適用于這一目的，如纖維素、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯。可以在固相合成中使用的適宜保護(hù)基團(tuán)包括叔丁氧羰基(BOC)、芐基(BZL)、叔戊氧羰基(AOC)、對甲苯磺酰基(TOS)、鄰溴苯基甲氧羰基(BrZ)、2，6-二氯芐基(BZLCl2)和苯基甲氧羰基(Z或CBZ)。其他保護(hù)基團(tuán)亦可參見J.F.W.McOmie，" ProtectiveGroups in Organic Chemistry",Plenum Press,New York, 1973 中的描述。這本書整體參考并入本申請。
[0113]可以通過使用形成酰胺鍵的化學(xué)或酶學(xué)方法分步或嵌段偶聯(lián)的方式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液合成方法。這些溶液合成方法是本領(lǐng)域公知的。
[0114]多肽的純化
[0115]可以從主體中回收本申請的多肽或蛋白。當(dāng)使用重組技術(shù)時(shí)，本申請的多肽可能在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞周質(zhì)間隙中產(chǎn)生，或者直接分泌到培養(yǎng)基中?？梢詮呐囵B(yǎng)基或從宿主細(xì)胞的裂解物中回收本申請的多肽。如果是膜結(jié)合的，可以使用適宜的去垢劑溶液(例如，Triton-XlOO)或通過酶解將其從膜上釋放?？梢酝ㄟ^多種物理或化學(xué)方法破壞本申請多肽表達(dá)中使用的細(xì)胞，如反復(fù)凍融、超聲、機(jī)械破壞或細(xì)胞溶解劑。
[0116]如果肽是化學(xué)合成的，可以通過任意適宜的技術(shù)將本申請的肽從反應(yīng)基質(zhì)中回收，所述技術(shù)能夠?qū)⑺P(guān)注的多肽與基質(zhì)中的其他組分分離。對于固相合成而言，首先使用適宜的裂解溶液將被保護(hù)的肽從樹脂上裂解。裂解溶液的選擇依賴于樹脂以及與其結(jié)合的氨基酸的性質(zhì)(如FMOC法使用三氟乙酸)。裂解通常在酸性條件下進(jìn)行。裂解完成后，獲得分離的肽，并使用任意適宜的技術(shù)對其進(jìn)一步純化(如下文中描述的方法)。
[0117]下述方法是示例性的適宜的蛋白純化方法:在離子交換柱上分離；乙醇沉淀；反相HPLC ;在二氧化硅上層析、在肝素SEPHAR0SE?上層析、在陰離子或陽離子交換樹脂上層析(如聚天冬氨酸柱、DEDA等)；聚焦層析；SDS_PAGE ;硫酸銨沉淀；使用例如SephadexG-75的凝膠過濾；除去污染物如IgG的蛋白A瓊脂糖柱；以及與本申請的多肽以表位標(biāo)記的形式結(jié)合的金屬螯合柱?？梢圆捎枚喾N蛋白純化方法，此類方法是本領(lǐng)域公知的并且已在例如 Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990) ；Scopes, Protein Purification:Principles and Practice, Springer-Verlag, New York(1982)中描述。純化步驟的選擇將依賴于例如所使用的生產(chǎn)工藝和所生產(chǎn)的本申請?zhí)囟ǖ鞍椎男再|(zhì)。
[0118]檢測方法
[0119]在本申請的方法中，生物樣品來自疑似患有免疫性血小板減少癥的主體，針對一種或多種抗膜突蛋白自身抗體的表達(dá)對其進(jìn)行檢查。可以通過多種方法對樣品中不同抗膜突蛋白自身抗體的表達(dá)進(jìn)行分析，其中的多種方法是本領(lǐng)域公知和本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的，包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、酶聯(lián)免疫流分析(ELIFA)、免疫印跡、Western印跡分析、免疫組化分析、免疫沉淀、分子結(jié)合分析等。多重免疫分析如從RulesBased Medicine或Meso Scale Discovery (MSD)獲得的那些也可以使用。這些方法包括非競爭性類型的單一位點(diǎn)和雙位點(diǎn)或“夾心”檢測，以及常規(guī)的競爭性結(jié)合分析。檢測可以在體外、體內(nèi)或離體進(jìn)行。
[0120]夾心分析是最有用和最常用的分析之一。夾心分析技術(shù)存在的多種變體，均包含在本申請中。簡言之，在典型的正向夾心分析中，將未標(biāo)記的捕獲試劑(例如膜突蛋白片段)固定在固體底物上，將針對靶蛋白(例如，抗膜突蛋白自身抗體)的待測樣品與底物中結(jié)合的分子接觸。經(jīng)過一段適宜時(shí)間的培養(yǎng)后，即一段足以形成抗體-抗原復(fù)合物的時(shí)間，然后加入對靶蛋白具有特異性的檢測抗體(例如，通過與抗膜突蛋白自身抗體的Fe區(qū)結(jié)合)，所述檢測抗體標(biāo)記了能 夠產(chǎn)生檢測信號的報(bào)告分子，并進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間要足以形成另一個(gè)捕獲試劑-靶蛋白-檢測抗體的復(fù)合物。洗滌除去所有未反應(yīng)的材料，通過觀察報(bào)告分子產(chǎn)生的信號確定靶蛋白的存在?？梢允峭ㄟ^對可視信號的簡單觀察得到的定性結(jié)果，或者可以是通過與含有已知量報(bào)告分子的對照樣品進(jìn)行比較得到的定量結(jié)果。
[0121]在典型的正向夾心檢測中，對靶蛋白具有特異性的捕獲試劑與固體支持物形成共價(jià)或被動的結(jié)合。固體支持物一般是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固體支持物可以以小管、小珠、微板盤或適于進(jìn)行免疫檢測的任意其他表面。
[0122]正向分析的變體包括同時(shí)分析，其中將樣品和檢測抗體同時(shí)加入捕獲試劑中。這些技術(shù)均是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括任何微小的變化也是顯而易見的。另一種替代方法包括固定樣品中的靶蛋白，然后將固定的靶蛋白暴露于本申請的肽，其可以使用或不使用報(bào)告分子標(biāo)記。根據(jù)靶蛋白的量和報(bào)告分子信號的強(qiáng)度，可以通過使用捕獲試劑(例如，膜突蛋白片段)直接標(biāo)記來檢測結(jié)合的靶蛋白?；蛘?，將另一個(gè)特異性針對捕獲試劑的檢測抗體暴露于靶蛋白-捕獲試劑復(fù)合物，以便形成靶蛋白-捕獲試劑-檢測抗體三重復(fù)合物。通過報(bào)告分子發(fā)出的信號對復(fù)合物進(jìn)行檢測。
[0123]如本申請所使用的，術(shù)語“報(bào)告分子”指通過其化學(xué)性質(zhì)提供分析上可識別信號的分子，其允許對抗原-結(jié)合的抗體的檢測。在這一類型的分析中最常用的報(bào)告分子是酶、熒光團(tuán)或含放射性核素的分子(即放射性同位素)和化學(xué)發(fā)光分子。
[0124]在某些實(shí)施方式中，報(bào)告分子是與檢測抗體偶聯(lián)的酶。酶一般催化顯色底物的化學(xué)變化，能夠使用多種技術(shù)對所述顯色變化進(jìn)行測量。例如，酶可以催化底物的顏色變化，能夠通過分光光度法對其進(jìn)行測量?；蛘撸缚梢愿淖兊孜锏臒晒饣蚧瘜W(xué)發(fā)光。通過用特定波長的光照射激發(fā)熒光染料，其吸收光能，染料分子處于激發(fā)態(tài)，隨后發(fā)射出使用光學(xué)顯微鏡可以目測檢測的具有特征顏色的光?；瘜W(xué)發(fā)光底物通過化學(xué)反應(yīng)處于電子激發(fā)態(tài)，然后可以發(fā)射能夠被測量(例如，使用化學(xué)發(fā)光計(jì))或向熒光受體提供能量的光。酶標(biāo)記的例子包括熒光素酶(例如，螢火蟲熒光素酶和細(xì)菌熒光素酶；美國專利號4，737，456)、熒光素、2，3-二氫酞嗪基二酮、蘋果酸脫氫酶、尿素酶、過氧化物酶如辣根過氧化物酶(HRPO)、堿性磷酸酶、3 -半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。將酶與抗體偶聯(lián)的技術(shù)在0' Sullivan et ah, Methods forthe Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay,in Methods in Enzym.(ed.J.Langone&H.Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166(1981)中進(jìn)行了描述。
[0125]酶-底物組合的例子包括，例如:(i)辣根過氧化物酶(HRPO)和底物過氧化氫酶，其中過氧化氫酶氧化染料前驅(qū)體(例如，鄰苯二胺(OPD)或3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(TMB)) ；(ii)堿性磷酸酶(AP)和顯色底物對-硝基苯磷酸鹽；和(iii) P-D-半乳糖苷酶(P-D-Gal)和顯色底物(例如，P-硝基苯基-P-D-半乳糖苷酶)或熒光底物(例如，4-甲基傘形-P-D-半乳糖苷酶)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以采用多種其他的酶-底物組合。對這些組合的一般性綜述見美國專利號4，275，149和4，318，980。
[0126]在某些實(shí)施方 式中，報(bào)告分子是熒光團(tuán)，包括但不限于，稀土螯合物(銪螯合物)、德州紅、羅丹明、熒光素、丹酰、麗絲胺、傘形花內(nèi)酯、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白或可購買獲得的熒光團(tuán)如SPECTRUM 0RANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或上述任意一種或多種的衍生物。例如，可以使用在 Current Protocols in Immunology,第 I 和 2 卷，Coligen 等，Wiley-1nterscience,New York,Pubs.(1991)版中披露的技術(shù)將突光團(tuán)與抗體偶聯(lián)?？梢允褂脽晒庥?jì)對熒光進(jìn)行定量。
[0127]在某些實(shí)施方式中，報(bào)告分子是放射性同位素，如35S、14C、1251、3H和1311。例如可以使用上文所述的Current Protocols in Immunology中描述的技術(shù)對檢測抗體或捕獲試劑進(jìn)行標(biāo)記，并且使用閃爍計(jì)數(shù)測量放射活性。
[0128]有時(shí)，將標(biāo)記間接地與檢測抗體或捕獲試劑偶聯(lián)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)的多種技術(shù)。例如，檢測抗體可以與生物素偶聯(lián)，標(biāo)記可以與抗生物素蛋白偶聯(lián)，反之亦然。生物素選擇性地與抗生物素蛋白結(jié)合，這樣標(biāo)記就可以通過這種間接方式與檢測抗體偶聯(lián)?；蛘撸瑸閷?shí)現(xiàn)將標(biāo)記與檢測抗體間接偶聯(lián)，將檢測抗體與較小的半抗原偶聯(lián)，將標(biāo)記與抗-半抗原的抗體偶聯(lián)。這樣，可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記與抗體的間接偶聯(lián)。
[0129]在某些實(shí)施方式中，檢測方法是競爭結(jié)合分析，其中使用競爭性抗膜突蛋白抗體。此類競爭性抗體能夠與膜突蛋白自身抗體競爭結(jié)合至本申請的肽。在競爭結(jié)合分析中，結(jié)合信號減弱可以表明存在相應(yīng)的自身抗體及其滴度。
[0130]診斷試劑盒
[0131]對于在本申請上文描述的或建議的用途，本申請還提供了生產(chǎn)的試劑盒和產(chǎn)品。此類試劑盒可以包括被分隔成用于密封收納一個(gè)或多個(gè)容器如小瓶、小管等的載體，每個(gè)容器均包括將在所述方法中使用的一個(gè)獨(dú)立元件。例如，其中一個(gè)容器可以包括探針，其是或者可能是可檢測標(biāo)記的。此類探針可以是對抗膜突蛋白自身抗體具有特異性的膜突蛋白片段。
[0132]典型地，本申請的試劑盒將包括上文所述的容器和一個(gè)或多個(gè)其他容器，所述容器包括從商業(yè)和用戶的角度看所需的材料，包括緩沖劑、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器和插入包裝中的使用說明書?？梢栽谌萜魃鲜褂脴?biāo)簽，以便說明所述組分用于特定的治療或非治療應(yīng)用，并且還可以說明是在體內(nèi)或體外使用，如上文所述的那些。
[0133]本申請的試劑盒具有多種實(shí)施方式。一個(gè)典型的實(shí)施方式是試劑盒，其包括容器、在所述容器上的標(biāo)簽和在所述容器內(nèi)的組分；其中所述組分包括能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的本申請的肽，在所述容器上的標(biāo)簽表明可以使用所述組分評估樣品中是否存在抗膜突蛋白自身抗體，并針對使用本申請的肽評估樣品中是否存在抗膜突蛋白自身抗體進(jìn)行說明。該試劑盒可以進(jìn)·一步包括一組說明和用于制備組織樣品和將本申請的肽應(yīng)用于樣品的材料。該試劑盒可以包括第二抗體，其中第二抗體與標(biāo)記偶聯(lián)，例如酶標(biāo)記。
[0134]在試劑盒中的其他可選組分包括一種或多種緩沖劑(例如，封閉緩沖液、洗滌緩沖液、底物緩沖液等)、其他試劑如底物(例如，顯色體)，所述底物是通過酶標(biāo)簽化學(xué)改變的、表位修復(fù)溶液、對照樣品(陽性和/或陰性對照)、對照片等。
[0135]下述為本申請方法和組合物的實(shí)施例。可以理解，考慮到上文所提供的一般性描述，可以實(shí)施多種其他的實(shí)施方式。
[0136]實(shí)施例
[0137]實(shí)施例1膜突蛋白片段系列的產(chǎn)生
[0138]生產(chǎn)下述五個(gè)膜突蛋白片段:
[0139]a.膜突蛋白1，包含人膜突蛋白的氨基酸1-297 (SEQ ID NO:2)，接近人膜突蛋白的N-末端結(jié)構(gòu)域；
[0140]b.膜突蛋白-2，包含人膜突蛋白的氨基酸298-577 (SEQ ID NO:3)，接近人膜突蛋白的螺旋和C-末端尾結(jié)構(gòu)域；
[0141]c.膜突蛋白-3，含有人膜突蛋白的氨基酸298-470 (SEQ ID NO:4)，接近人膜突蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)域；
[0142]d.膜突蛋白_4，含有人膜突蛋白的氨基酸471-577 (SEQ ID NO:5)，接近人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域；以及
[0143]e.膜突蛋白-5，全長人膜突蛋白，氨基酸1-577 (SEQ ID N0:1)。
[0144]全長的膜突蛋白cDNA序列(l_1734bp)從Genebank獲得(Genebank登錄號AB527296.1)，見圖3。為產(chǎn)生上述所需的膜突蛋白片段，使用PCR擴(kuò)增與上文所述的不同氨基酸片段對應(yīng)的cDNA片段。
[0145]將PCR擴(kuò)增的膜突蛋白DNA片段克隆至選自pET32a(+)和pET28a(+)的表達(dá)載體。然后使用已構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化用于培養(yǎng)和表達(dá)的大腸桿菌宿主細(xì)胞系BL21 (DE3)oPET32a(+)和pET28a(+)的限制性和克隆譜分別見圖4和5。使用限制性酶切反應(yīng)對針對不同膜突蛋白片段構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證，所述限制性酶切反應(yīng)通過測序以確認(rèn)膜突蛋白片段表達(dá)的正確閱讀框。
[0146]充分培養(yǎng)后，收獲已表達(dá)膜突蛋白片段的宿主細(xì)胞，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白表達(dá)方案采集和純化膜突蛋白片段。使用SDS-PAGE對最終得到的蛋白片段進(jìn)行分析，以確認(rèn)其種類和純度。
[0147]實(shí)施例2在免疫性血 小板減少癥患者的血 清中對特定抗膜突蛋白自身抗體的檢測和測暈
[0148]從不同階段的免疫性血小板減少癥患者中采集血清和血漿樣品，并檢驗(yàn)抗膜突蛋白自身抗體的存在，所述抗膜突蛋白自身抗體識別并與膜突蛋白特定區(qū)段結(jié)合。使用患者的檔案資料和臨床信息基于其疾病的類型和階段對其進(jìn)行分類。
[0149]將從實(shí)施例1中獲得的膜突蛋白片段作為針對抗膜突蛋白抗體的ELISA分析中的抗原。特別地，在2°C至8°C條件下使用約400ng膜突蛋白片段將ELISA板的各微孔包被12-16小時(shí),然后用PBS洗滌一次,隨后使用封閉溶液封閉并真空干燥貯存?zhèn)溆?。這樣,在自然保存抗原的條件下，將經(jīng)高度純化的膜突蛋白抗原與聚苯乙烯微孔板的孔結(jié)合。
[0150]血清樣品采集自兩個(gè)患者組，即免疫性血小板減少癥和非免疫性血小板減少癥。采集免疫性血小板減少癥患者組的血清樣品用于后續(xù)檢測，該患者組共有77名患者，其中包括25名臨床上診斷為特發(fā)性血小板減少性紫癜的患者、17名臨床上診斷為由藥物治療或輸血引起的免疫介導(dǎo)的血小板減少癥的患者、35名臨床上診斷為伴有缺鐵性貧血的血小板減少癥的患者。采集非免疫性血小板減少癥患者組的血清樣品用于后續(xù)檢測，該患者組共有47名患者，其中包括9名臨床上診斷為非免疫介導(dǎo)的原因不明的血小板減少性紫癜的患者、11名臨床上診斷為過敏性紫癜的患者、12名臨床上診斷為骨髓增生異常綜合癥的患者、15名臨床上診斷為多發(fā)性骨髓瘤的患者。還采集了來自50個(gè)健康個(gè)體的血清樣品并作為健康對照樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。
[0151 ] 使用PBS-T緩沖液(即，含有0.05 % (v/v)吐溫-20的PBS緩沖液)對對照樣品和患者血清進(jìn)行稀釋，然后在各孔中分別加入IOOiil此類已稀釋的對照樣品和已稀釋的患者血清，以使得存在的所有抗膜突蛋白抗體均與固定的抗原結(jié)合。使用PBS-T緩沖液洗去未結(jié)合的樣品，將酶標(biāo)記的抗人IgG偶聯(lián)物加入各孔。再次進(jìn)行培養(yǎng)，使得酶標(biāo)記的抗人IgG與已同微孔連接的任意抗膜突蛋白抗體結(jié)合。洗去未結(jié)合的酶標(biāo)記的抗人IgG后，通過加入顯色底物(H202/TMB)測量保留的酶活性并測量顯色強(qiáng)度。然后將IOOiU HRP終止液(例如，2MH2S04)加入各孔中。根據(jù)TMB顯色體確定HRP終止溶液加入的順序和保持的時(shí)間。使用手指輕輕敲擊各ELISA板，以便將孔徹底混勻。
[0152]通過使用分光光度計(jì)測量并比較患者孔顯色和對照孔顏色的顏色強(qiáng)度，對分析進(jìn)行評估。特別地，使用雙色測量以測量和比較顏色強(qiáng)度，其中在終止反應(yīng)15分鐘內(nèi)讀取各孔的OD45tl值和OD63tl值(作為參照)。通過OD45tl值減去OD63tl值計(jì)算各待測或?qū)φ諛悠返腛D值。
[0153]在各批次樣品中采用ELISA低陽性對照樣品、ELISA高陽性對照樣品和ELISA陰性對照樣品，以確保所有試劑和程序均正確地進(jìn)行。ELISA陰性對照樣品是采集自健康個(gè)體的血清。分別測量并采集自50個(gè)健康個(gè)體的血清的OD值，計(jì)算這50個(gè)樣品的平均OD值(“對照OD值”)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(“對照標(biāo)準(zhǔn)偏差”)。此類對照OD值和對照標(biāo)準(zhǔn)偏差用于確定ELISA低陽性對照和高陽性對照樣品的濃度。ELISA低陽性對照樣品包含來自免疫性血小板減少癥患者的血清，已對所述對照樣品進(jìn)行足夠稀釋以顯示出等于對照OD值加三倍對照標(biāo)準(zhǔn)偏差的OD值。ELISA高陽性對照樣品包含來自免疫性血小板減少癥患者的血清，已對所述對照樣品進(jìn)行足夠稀釋以顯示出等于三倍ELISA低陽性對照OD值的OD值。使用0.0lM PBS-T緩沖液進(jìn)行稀釋。
[0154]首先確定樣品各重復(fù)試驗(yàn)的平均OD值，如果該平均OD值高于ELISA低陽性對照的平均OD值，則確定樣品為陽性(如表I所示)。測量的各樣品的平均滴度以樣品的平均OD值表示(如圖6所示)。
[0155]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可以通過不同方式來實(shí)施和實(shí)現(xiàn)確定特定疾病存在與否與標(biāo)記物水平之間關(guān)系的步驟。一般選擇參照人群并建立正常范圍。使用適宜的參照人群確立抗膜突蛋白抗體的正常范圍是非常常規(guī)的做法。人們通常認(rèn)為，在某種但是有限的程度上，正常范圍依賴于確立其的參照人群。一方面，參照人群數(shù)量較多例如成百上千，并且按年齡、性別和視情況選取其他所關(guān)注的變量來匹配。依據(jù)絕對值的正常范圍如給定的濃度，也依賴于所采用的分析和在實(shí)施所述分析的過程中使用的標(biāo)準(zhǔn)化方法。
[0156]可以使用在實(shí)施例部分給出的分析程序測量和建立抗膜突蛋白抗體的水平。應(yīng)理解，不同分析可能會導(dǎo)致不同的界值。
[0157]實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的臨床表現(xiàn)依賴于其診斷`準(zhǔn)確度，或者將主體正確分類至臨床相關(guān)亞組的能力。診斷準(zhǔn)確度用于衡量所述檢驗(yàn)正確區(qū)分被研究主體不同狀況的能力。此類狀況例如健康和疾病或者良性對惡性疾病。
[0158]也就是說，從某個(gè)患者人群中獲得顯著升高的值表明相應(yīng)抗膜突蛋白自身抗體的陽性存在。
[0159]針對對某些膜突蛋白片段具有特異性的不同抗膜突蛋白抗體的陽性存在對不同患者組進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于下表(表I):
[0160]表1:在患者組和對照組的血清樣品中比較針對特定膜突蛋白片段的抗膜突蛋白
自身抗體的陽性存在
[0161]

抗-各膜突;蛋白片段陽性
患者組患者M(jìn)組患者數(shù)__DL削大入mu n訓(xùn)I土_
___膜突IfiCl-1 膜突Ifill丨-3 膜突ffill丨-4 膜突膜突lSfl-5
免疫性血.j-,, '威
小扳減少廄25 220 (0) 18 (72,0%) 19 (76.0%) 21 (84.0%)
[0162]
【權(quán)利要求】
1.一種診斷免疫性血小板減少癥的方法，包括(i)將來自疑似免疫性血小板減少癥的主體的樣品與能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的第一肽接觸，其中所述第一肽包括基本上由人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域或其片段組成的第一膜突蛋白片段；(ii)檢測所述第一肽與抗膜突蛋白自身抗體的結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一肽包括人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域的至少八個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域含有選自以下組的氨基酸殘基:人膜突蛋白氨基酸殘基區(qū)段471-487、488-501、502-577和471-577的氨基酸殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第一肽基本上由人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域或其片段的氨基酸殘基組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一肽進(jìn)一步包括載體多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述第一肽不含有人膜突蛋白N-末端FERM結(jié)構(gòu)域的任意實(shí)質(zhì)性部分。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括將所述樣品與能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的第二肽接觸，其中所述第二肽包括基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM結(jié)構(gòu)域或其片段組成的第二膜突蛋白片段；以及檢測所述第二肽與抗膜突蛋白自身抗體的結(jié)合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述第二肽包括人膜突蛋白的N-末端FERM結(jié)構(gòu)域的至少八個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法 ，其中所述人膜突蛋白N-末端FERM結(jié)構(gòu)域含有選自以下組的氨基酸殘基:人膜突蛋白氨基酸殘基區(qū)段1-94、95-201、202-297和1-297的氨基酸殘基。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述第二肽基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM結(jié)構(gòu)域或其片段的氨基酸殘基組成。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫性血小板減少癥是原發(fā)性免疫性血小板減少癥。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品用血液計(jì)數(shù)法進(jìn)行預(yù)檢。
13.據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過ELISA或免疫印跡對所述第一肽與抗膜突蛋白自身抗體的結(jié)合進(jìn)行檢測。
14.能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的第一肽在制備用于在主體中診斷免疫性血小板減少癥的診斷組合物中的用途，其中所述第一肽包括膜突蛋白片段，所述膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域或其片段組成。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述第一肽包括人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域的至少八個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述診斷組合物進(jìn)一步包括能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的第二肽，其中所述第二肽包括第二膜突蛋白片段，所述第二膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的N-末端FERM結(jié)構(gòu)域或其片段組成。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的用途，其中所述第一肽包括人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域的至少八個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，和第二肽包括人膜突蛋白的N-末端FERM結(jié)構(gòu)域的至少八個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。
18.一種用于診斷免疫性血小板減少癥的試劑盒，包括a)能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的肽，其中所述肽包括基本上由人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域或其片段組成的膜突蛋白片段；以及b)檢測試劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括固相，其中所述肽與所述固相結(jié)合。
20.一種確定疑似患有免疫性血小板減少癥的患者病理狀況的方法，包括下述步驟: (i)將來自疑似患有免疫性血小板減少癥的主體的樣品與能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的肽接觸，其中所述肽包括基本上由人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域或其片段組成的膜突蛋白片段； (ii)檢測所述肽與抗膜突蛋白自身抗體的結(jié)合并測量與所述肽結(jié)合的抗膜突蛋白自身抗體的水平；以及 (iii)將所述抗膜突蛋白自身抗體的水平與顯示抗膜突蛋白自身抗體滴度與免疫性血小板減少癥病理狀況之間關(guān)系的對照數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，所述的對照數(shù)據(jù)庫是從患病的對照樣品得來的，根據(jù)比較結(jié)果確定所述患者的病理狀況。
21.—種在進(jìn)行免疫性血小板減少癥治療的主體中監(jiān)測治療應(yīng)答的方法，包括下述步驟: (i)將來自疑似免疫性血小板減少癥的主體的樣品與能夠與抗膜突蛋白自身抗體結(jié)合的肽接觸，其中所述肽包括基本上由人膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域或其片段組成的膜突蛋白片段；` (ii)檢測所述肽與抗膜突蛋白自身抗體的結(jié)合并測量與所述肽結(jié)合的抗膜突蛋白自身抗體的水平；以及 (iii)將所述抗膜突蛋白自身抗體的水平與顯示抗膜突蛋白自身抗體滴度與免疫性血小板減少癥病理狀況之間關(guān)系的對照數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，所述對照數(shù)據(jù)庫是從患病的對照樣品得來的，根據(jù)比較結(jié)果確定所述患者的病理狀況，其中滴度降低表明所述主體對所述治療產(chǎn)生有效應(yīng)答。
【文檔編號】C07K2/00GK103429253SQ201180059277
【公開日】2013年12月4日 申請日期:2011年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2010年10月8日
【發(fā)明者】張玥, 包駿 申請人:上?？菩律锛夹g(shù)股份有限公司