專(zhuān)利名稱(chēng)：抗vla-4抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及α -4結(jié)合抗體及其片段。
背景技術(shù)：
人源化抗體可代替鼠抗體用作治療劑以避免人體中的稱(chēng)為ΗΑΜΑ(人抗小鼠抗體)反應(yīng)的不良免疫反應(yīng)。通常通過(guò)用另一物種(通常為小鼠抗體)的CDR置換人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)來(lái)構(gòu)建人源化抗體。VLA_4(也稱(chēng)為α 4β I)是細(xì)胞表面受體的β I整聯(lián)蛋白家族的成員。VLA-4含有α4鏈和β I鏈并且牽涉于細(xì)胞間的相互作用中。其表達(dá)主要限于淋巴和骨髓細(xì)胞。VLA-4結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞配體VCAM-1 (血管細(xì)胞粘附分子-1)，并且可介導(dǎo)T和B淋巴細(xì)胞附著于人血漿纖連蛋白的肝素II結(jié)合片段。
發(fā)明概要發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)種系可變區(qū)骨架可用于優(yōu)化⑶R移植α-4結(jié)合抗體，例如抗VLA-4抗體。因此，本發(fā)明特寫(xiě)了抗VLA-4可變重(VH)和可變輕(VL)鏈和包括此類(lèi)骨架的抗體分子。一方面，本發(fā) 明特寫(xiě)了具有來(lái)自供體抗CI4抗體(例如，本文所述抗α4抗體)的⑶R的抗α 4抗體VH鏈，和具有來(lái)自VH鏈的序列的區(qū)域1、2、3和4或?qū)τ赩H鏈而言與種系可變區(qū)序列具有不超過(guò)5、10或15個(gè)差異的VH骨架。在一個(gè)實(shí)施方案中，可變骨架區(qū)4(FR4)為人共有序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，存在完整的VH鏈骨架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4。在另一個(gè)實(shí)施方案中，鏈為VH區(qū)的抗原結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，種系序列為

圖1中描繪的人IGHVl_f(SEQ ID N0:2)。在某些實(shí)施方案中，VH骨架序列可與種系序列(例如，SEQ ID NO: 2)有至少一個(gè)但不超過(guò)2、3、4、5、10或15個(gè)氨基酸殘基不同。在一個(gè)實(shí)施方案中，除相應(yīng)人殘基外，VH骨架進(jìn)一步包括其它殘基。例如，VH鏈包括在SEQ ID N0:2的骨架位置24、67、76、80和94(Kabat編號(hào))的一處或多處的非人殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，可變結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)源自供體非人α4_結(jié)合抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，CDR移植重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合區(qū)包括與位置 26-34 (CDRl)、50-65 (CDR2)和 95-102 (CDR3)相對(duì)應(yīng)的 CDR (Kabat 編號(hào)；Kabat等，Sequences of Proteins of Tmmunological Interest,第 5 版，第 4 卷，1991, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, USA)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，可變重鏈(VH)骨架具有源自人抗體種系序列IGHVl-f的受體序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，在VH的FRl區(qū)中，至少一個(gè)氨基酸和少于2、3、4、5或10個(gè)氨基酸殘基不同于相應(yīng)的人種系殘基。例如，一個(gè)或多個(gè)此類(lèi)殘基可與CDR序列源自其中的非人抗體骨架區(qū)相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，Kabat位置24處的氨基酸殘基突變?yōu)榕c非人抗體骨架區(qū)相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在VH的FR2區(qū)中，至少一個(gè)氨基酸和少于2、3、4、5或10個(gè)氨基酸殘基不同于相應(yīng)的人種系殘基。例如，一個(gè)或多個(gè)此類(lèi)殘基可與CDR序列源自其中的非人抗體骨架區(qū)相同。在又一個(gè)實(shí)施方案中，在VH鏈的FR3中，至少一個(gè)氨基酸和少于2、3、4、5或10個(gè)氨基酸殘基不同于相應(yīng)的人種系殘基。例如，一個(gè)或多個(gè)此類(lèi)殘基可與CDR序列源自其中的非人抗體骨架區(qū)相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，Kabat位置94處的氨基酸殘基與非人抗體骨架區(qū)相同。在又一個(gè)實(shí)施方案中，Kabat位置67、76、80和94處的氨基酸殘基與非人抗體骨架區(qū)相同。在某些實(shí)施方案中，抗體的VH鏈具有SEQ ID NO:3,SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:5的序列。一方面，本發(fā)明特寫(xiě)了具有來(lái)自供體抗VLA-4抗體(例如，本文所述抗VLA-4抗體)的CDR的抗VLA-4VL鏈，和具有來(lái)自VL鏈的序列的區(qū)域1、2、3和4或?qū)τ赩L鏈而言與種系可變區(qū)序列具有不超過(guò)5、10或15個(gè)差異(每個(gè)區(qū)域或總共)的VL骨架。在一個(gè)實(shí)施方案中，可變骨架區(qū)4 (FR4)為人共有序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，存在完整的VL鏈骨架區(qū)FRl、FR2、FR3和FR4。在另一個(gè)實(shí)施方案中，鏈為VL區(qū)的抗原結(jié)合片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，種系序列為圖2中描繪的IGKV4_1(SEQ ID N0:7)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，VL骨架序列可 與種系骨架序列(例如，SEQ ID NO: 7)有至少一個(gè)但不超過(guò)
2、3、4、5、10或15個(gè)氨基殘基不同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，除相應(yīng)人氨基酸殘基外，VL進(jìn)一步包括其它殘基。例如，VL鏈進(jìn)一步包括在SEQ ID NO: 7的骨架位置1、73和87 (Kabat編號(hào))的一處或多處的非人殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，序列為圖2中描繪的AAH7035. 1 (SEQ ID N0:12)或其種系工程化形式(SEQ ID N0:13)。在一些實(shí)施方案中，VL骨架序列可與種系工程化骨架序列(例如，SEQ ID NO: 13)有至少一個(gè)但不超過(guò)5、10、15、20或25個(gè)氨基酸殘基不同。在一個(gè)實(shí)施方案中，除相應(yīng)人殘基外，VL鏈包括其它殘基。例如，VL鏈包括在SEQ ID NO: 12的骨架位置I和87 (Kabat編號(hào))的一處或多處的非人殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，VL在骨架區(qū)包括氨基酸取代以類(lèi)似于不同人種系骨架序列，例如來(lái)自種系序列IGKV4-1。在某些實(shí)施方案中，將VL骨架序列改變?yōu)榕c在SEQ ID NO: 12的位置1-3、5-23、35-37、39-42、45_49、57、59-61、63-64、70-72、74-84、86-88、99-106 (Kabat 編號(hào))處的 IGKV4-1 種系序列相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，可變結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)源自供體非人α 4-結(jié)合抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，CDR移植重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合區(qū)包括與位置 24-31 (CDRl)、50-56 (CDR2)和 89-97 (CDR3) (Kabat 編號(hào))相對(duì)應(yīng)的 CDR0 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，VL骨架具有由IGKV4-1種系序列、抗體ΑΑΗ70335.1或由種系工程化抗體ΑΑΗ70335.1構(gòu)建的受體序列。在又一個(gè)實(shí)施方案中，在VL鏈的FRl中，至少一個(gè)氨基酸和少于2、3、4、5、10或15個(gè)殘基不同于相應(yīng)的人殘基。例如，一個(gè)或多個(gè)此類(lèi)殘基可與CDR序列源自其中的非人抗體骨架區(qū)相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)Rl的N端位置的氨基酸殘基突變?yōu)榕c非人抗體骨架區(qū)相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在VL鏈的FR2中，至少一個(gè)氨基酸和少于2、3、4、5、10或15個(gè)殘基不同于相應(yīng)的人殘基。例如，一個(gè)或多個(gè)此類(lèi)殘基可與CDR序列源自其中的非人抗體骨架區(qū)相同。在又一個(gè)實(shí)施方案中，在VL的FR3中，至少一個(gè)氨基酸和少于2、3、4、5、10或15個(gè)殘基不同于相應(yīng)的人殘基。例如，一個(gè)或多個(gè)此類(lèi)殘基可與CDR序列源自其中的非人抗體骨架區(qū)相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Kabat位置87處的氨基酸殘基突變?yōu)榕c非人抗體骨架區(qū)相同。在又一個(gè)實(shí)施方案中，Kabat位置67和87處的氨基酸殘基突變?yōu)榕c非人抗體骨架序列相同。在又一個(gè)實(shí)施方案中，在SEQ ID NO:7的Kabat位置67、73和87處的氨基酸殘基突變?yōu)榕c非人抗體骨架序列相同。在其它實(shí)施方案中，抗體的VL鏈具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇VH和VL受體骨架序列與非人(例如，鼠)抗體序列的CDR序列類(lèi)似的CDR，其中非人抗體結(jié)合整聯(lián)蛋白α _4或其片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，選擇與結(jié)合VLA-4 α 4 鏈的BI表位的非人抗體的CDR序列類(lèi)似的CDR序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇與鼠單克隆抗體，例如HP1/2、HP2/1、HP2/4、L25、P4C2或21. 6類(lèi)似的CDR (PuIido等，J. Biol. Chem. 266:10241-10245, 1991 ;美國(guó)專(zhuān)利 No. 6，033，665)。修飾可指(例如)切除和插入或改變，例如通過(guò)定點(diǎn)誘變。另一方面，本發(fā)明特寫(xiě)了抗體或其抗原結(jié)合片段，其包括-本文所述抗VLA-4VL鏈，例如，具有來(lái)自供體抗VLA-4抗體(例如，本文所述抗VLA-4抗體)的⑶R的抗VLA-4VL鏈，和具有來(lái)自VL鏈的序列的LC骨架區(qū)1、2和3或?qū)τ赩L鏈而言與種系可變區(qū)序列具有不超過(guò)5、10或15個(gè)差異的VL骨架。在一個(gè)實(shí)施方案中，可變區(qū)4為人共有序列；和-本文所述抗VLA-4VH鏈，例如具有來(lái)自供體抗VLA-4抗體(例如，本文所述抗VLA-4抗體)的⑶R的抗VLA-4VL鏈，和具有來(lái)自VL鏈的序列的LC骨架區(qū)1、2和3或?qū)τ赩L鏈而言與種系可變區(qū)序列具有不超過(guò)5、10或15個(gè)差異的VL骨架。在一個(gè)實(shí)施方案中，可變區(qū)4為人共有序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體結(jié)合α 4β I和α 4 β 7的其中一者或兩者。另一方面，可檢測(cè)地標(biāo)記本文所述VL或VH鏈或抗體或其片段。又一方面，本發(fā)明特寫(xiě)了含有編碼本文所述抗體重鏈或其α 4結(jié)合片段的DNA的載體。在一些實(shí)施方案中，載體的DNA編碼具有SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5的序列的VH。又一方面，本發(fā)明特寫(xiě)了含有編碼本文所述抗體輕鏈或其α 4結(jié)合片段的DNA的載體。在一些實(shí)施方案中，載體的DNA編碼具有SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11的序列的VL鏈。又一方面，本發(fā)明特寫(xiě)了含有編碼本文所述抗體重鏈或其α 4結(jié)合片段和本文所述抗體輕鏈或其α 4結(jié)合片段的DNA的載體。另一方面，本發(fā)明特寫(xiě)了含有本文所述載體的宿主細(xì)胞，例如能夠表達(dá)本文所述重和/或輕鏈抗體或抗體片段的宿主細(xì)胞。一方面，本發(fā)明特寫(xiě)了制備重組抗α 4抗體或其α 4-結(jié)合片段的方法，所述方法通過(guò)提供用(a)編碼本文所述抗體重鏈或其α 4-結(jié)合片段的DNA序列，和(b)編碼抗體輕鏈或其α 4-結(jié)合片段的DNA序列轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，并且培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以產(chǎn)生重組抗α 4抗體分子或其α 4-結(jié)合片段。編碼抗體重鏈和輕鏈的DNA可在相同載體或不同載體上產(chǎn)生。一方面，本發(fā)明特寫(xiě)了制備重組抗α 4抗體或其α 4-結(jié)合片段的方法，所述方法通過(guò)提供用(a)編碼抗體重鏈或其α 4-結(jié)合片段的DNA序列(例如，其中DNA序列具有SEQ ID Ν0:3、4或5的序列)，和(b)編碼抗體輕鏈或其α 4-結(jié)合片段的DNA序列(例如，其中DNA序列具有SEQ ID Ν0:8、9、10或11的序列)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，并且培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以產(chǎn)生重組抗α 4抗體分子或其α 4-結(jié)合片段。編碼抗體重鏈和輕鏈的DNA可在相同載體或不同載體上產(chǎn)生。另一方面，本發(fā)明特寫(xiě)了通過(guò)向需要此類(lèi)治療的受試者施用本文所述的CI4抗體或抗體片段或含有抗體或片段的藥物組合物治療由α 4整聯(lián)蛋白，例如α 4β I (VLA-4)或α4β 7整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的疾病或病癥的方法。受試者可患有以下疾病或處于發(fā)展以下疾病的風(fēng)險(xiǎn)中，例如炎癥性、免疫性或自身免疫性病癥(例如，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，諸如多發(fā)性硬化、腦膜炎、視神經(jīng)脊髓炎、神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)節(jié)病、CNS脈管炎、腦炎和橫貫性脊髓炎)、組織或器官移植排斥或移植物抗宿主病、急性CNS損傷(例如中風(fēng)、外傷性腦損傷(TBI)或脊椎損傷(SCI));慢性腎?。贿^(guò)敏癥，例如變應(yīng)性哮喘；1型糖尿?。谎装Y性腸病，例如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎；重癥肌無(wú)力；纖維肌痛；關(guān)節(jié)炎病癥，例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎；炎癥性/免疫性皮膚病癥，例如牛皮癬、白癲風(fēng)、皮炎、扁平苔癬；全身性紅斑狼瘡；干燥綜合征(Sjogren/ s Syndrome);血液學(xué)癌癥，例如多發(fā)性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤；實(shí)體癌，例如如肺、乳房、前列腺、大腦的肉瘤或癌；和纖維化病癥，例如肺纖維化、骨髓纖維化、肝硬化、系膜增生性腎小球腎炎、新月體性腎小球腎炎、糖尿病性腎病和腎間質(zhì)纖維化。

另一方面，本發(fā)明特寫(xiě)了通過(guò)向患者施用α 4結(jié)合抗體或抗體片段治療患者的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，患者患有癌癥，例如實(shí)體瘤或血液惡性腫瘤。例如，用α4結(jié)合抗體或抗體片段治療的患者可患有急性骨髓性白血病(AML)或多發(fā)性骨髓瘤(MM)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，患者患有炎癥，例如多發(fā)性硬化、哮喘(例如，中度至重度哮喘)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病或克羅恩病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，按一種方案施用所述組合物。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括選擇適合用組合物治療的患者。例如，適合治療的患者已證實(shí)了表明疾病發(fā)作的跡象或癥狀，例如表明MS的跡象或癥狀。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括向患者施用第二治療劑，例如化學(xué)治療劑、血栓溶解劑、神經(jīng)保護(hù)劑、抗炎劑、類(lèi)固醇、細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，向患者施用本文所述的人源化抗VLA-4抗體或其片段，例如HuHP1/2、H1L1、H1L2 或 H1L3。在一個(gè)實(shí)施方案中，按一種方案，例如定期施用含有α 4結(jié)合抗體的組合物。例如，可每天、每周或每月施用I次組合物；每周I次、每周2次、每周3次、每周4次或更多；或每2周I次、每3周I次、每4周I次或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，可根據(jù)患者對(duì)先前施用的抗α 4抗體的清除率調(diào)整劑量。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，在患者體內(nèi)的抗α 4抗體的水平降至預(yù)定水平以下之前將不會(huì)向患者施用第二或后續(xù)劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定來(lái)自患者的樣品(例如，血漿、血清、血液或尿樣品)是否存在抗α 4抗體，并且如果抗α 4抗體的水平高于預(yù)定水平，將不會(huì)向患者施用第二或后續(xù)劑量。如果患者體內(nèi)的α 4抗體的水平低于預(yù)定水平，則向患者施用第二或后續(xù)劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，連續(xù)使用組合物，例如在30min以上但小于1、2、4或12小時(shí)的期間?？赏ㄟ^(guò)適當(dāng)方法，例如經(jīng)皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)施用含有抗體和第二藥劑的組合物。在一些實(shí)施方案中，抗體和第二藥劑的每一種均按相同劑量施用，如同每一種均開(kāi)處方用于單一療法一樣。在其它實(shí)施方案中，按等于或小于如果單獨(dú)施用的療效所需的量施用抗體。同樣，按等于或小于如果單獨(dú)施用的療效所需的量施用第二藥劑。本公開(kāi)中特寫(xiě)的另一方面是通過(guò)確定患者是否滿(mǎn)足預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)和患者是否滿(mǎn)足向患者批準(zhǔn)、提供、開(kāi)處方或施用本文所述VLA-4結(jié)合抗體制劑的預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)估患者的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)為患者不能對(duì)先前的交替治療或方案(例如，用于MS的治療)充分反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)為缺乏進(jìn)行性多灶性腦白質(zhì)病(PML)的任何跡象或癥狀，或缺乏PML的任何診斷。在一些情況下，基于PML風(fēng)險(xiǎn)因素的缺乏進(jìn)行選擇，例如受試者對(duì)于JC病毒DNA測(cè)試不呈陽(yáng)性或?qū)τ贘C病毒抗體測(cè)試不呈陽(yáng)性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)如通過(guò)引用特此并入的PCT/US07/75577 (作為W02008/021954公開(kāi))中所述，其描述了用于藥物分配和向患者提供藥物的方法和系統(tǒng)。另一方面，提供了分配本文所述組合物的方法。組合物含有α-4結(jié)合抗體。所述方法包括為受者(例如，最終使用者、患者、醫(yī)師、零售或批發(fā)藥房、經(jīng)銷(xiāo)商或醫(yī)院、療養(yǎng)院診所或HMO的藥劑科)提供裝有治療患者至少6、12、24、36或48個(gè)月的足夠單位劑量的藥物的包。另一方面，本發(fā)明特寫(xiě)了評(píng)估一包或許多包的本文所述含有α-4結(jié)合抗體的組合物的質(zhì)量(例如，確定其是否已經(jīng)過(guò)期)的方法。所述方法包括評(píng)估所述包是否已經(jīng)過(guò)期。有效期為從預(yù)選事件，例如生產(chǎn)、化驗(yàn)或包裝開(kāi)始，至少6、12、24、36或48個(gè)月，例如大于24或36個(gè)月。在一些實(shí) 施方案中，根據(jù)分析的結(jié)果采取決定或步驟。例如，根據(jù)正確分析，根據(jù)產(chǎn)品是否已經(jīng)過(guò)期來(lái)使用或丟棄、分類(lèi)、選擇、放出或扣留、運(yùn)輸、移動(dòng)至新地點(diǎn)、投放到市場(chǎng)中、銷(xiāo)售或提供以出售、退出市場(chǎng)或不再提供以出售包裝的抗體。另一方面，本發(fā)明特寫(xiě)了裝有至少2個(gè)單位劑量的含有α 4結(jié)合抗體的水性組合物的包。在一個(gè)實(shí)施方案中，所有單位劑量均含有相同量的抗體，并且在其它實(shí)施方案中存在兩種或更多種強(qiáng)度的單位劑量，或兩種或更多種不同制劑，例如具有不同強(qiáng)度或釋放性質(zhì)。另一方面，本發(fā)明包括指導(dǎo)受者施用含有α 4結(jié)合抗體的制劑。所述方法包括指導(dǎo)受者(例如，最終使用者、患者、醫(yī)師、零售或批發(fā)藥房、經(jīng)銷(xiāo)商或醫(yī)院、療養(yǎng)院診所或HMO的藥劑科)，應(yīng)根據(jù)本文所述的方案向患者施用抗體。所述方法還可包括指導(dǎo)受者，應(yīng)在有效期之前施用抗體。有效期為從預(yù)選事件，例如生產(chǎn)、化驗(yàn)或包裝開(kāi)始，至少6、12、24、36或48個(gè)月，例如大于24或36個(gè)月。在一個(gè)實(shí)施方案中，受者也接受抗體的供給，例如單位劑量的抗體的供給。另一方面，本發(fā)明特寫(xiě)了制備抗體的方法，所述抗體包括來(lái)自供體抗體例如非人(例如，鼠)抗體的CDR，和源自人種系可變區(qū)骨架區(qū)或區(qū)域的一條或兩條重鏈和輕鏈可變區(qū)骨架。所述方法包括I和2的其中一項(xiàng)或兩項(xiàng)，其中I和2如下1.鑒定或選擇在a)、b)和c)的一項(xiàng)或多項(xiàng)中的一個(gè)或多個(gè)殘基處具有與非人供體重鏈相同的殘基的穩(wěn)定人受體重鏈可變骨架a)VH Kabat#2、4、24、26、27、29、36、38、46、47、48、49、66、67、69、71、78、93和 94，不
受理論約束，據(jù)信對(duì)維持CDR構(gòu)象非常重要；b)VH Kabat#l、2、27、28、30、43、66、68、70、72、73、74 和 75，不受理論約束，據(jù)信能
與抗原相互作用；和c)VH Kabat#37、39、44、45、47、91、93 和 103，不受理論約束，據(jù)信對(duì)于 VH/VL 界面完整性非常重要；和2.鑒定或選擇在a)、b)和c)的一項(xiàng)或多項(xiàng)中的一個(gè)或多個(gè)殘基處具有與供體輕鏈相同的殘基的穩(wěn)定受體輕鏈可變骨架a) VL Kabat#2、4、38、43、44、48、58、64、71 和 73，不受理論約束，據(jù)信對(duì)維持 CDR 構(gòu)
象非常重要；b) VL Kabat#1、2、49、57、60、63、65、66、67、68、69 和 70，不受理論約束，據(jù)信能與抗
原相互作用；和 c) VL Kabat#36、38、43、44、46、49、87 和 98，不受理論約束，據(jù)信對(duì)于 VH/VL 界面完整性非常重要；3.提供具有供體CDR的可變區(qū)和具有在I或2中鑒定的匹配殘基的所選種系骨架，例如通過(guò)選擇種系序列并進(jìn)一步使在I或2中鑒定的種系的另外的殘基突變回鼠序列以進(jìn)一步最大化在I或2中鑒定的匹配；和4.例如通過(guò)3D結(jié)構(gòu)分析或建模，評(píng)估每個(gè)匹配位置，并評(píng)估位置是否滿(mǎn)足(例如)干擾CDR構(gòu)象、抗原相互作用或VH/VL界面完整性的風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)，然后再引入與抗體結(jié)構(gòu)相容的等效鼠殘基或常見(jiàn)人抗體殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，(La)中鑒定的至少3、4或5個(gè)殘基匹配。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，殘基24、29或94匹配。在一個(gè)實(shí)施方案中，(l.b)中鑒定的至少3、4、或5個(gè)殘基匹配。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，殘基1、73或75匹配。在一個(gè)實(shí)施方案中，(l.c)中鑒定的至少3、4、或5個(gè)殘基匹配。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，殘基37、93或103匹配。在一個(gè)實(shí)施方案中，(2. a)中鑒定的至少3、4、或5個(gè)殘基匹配。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，殘基2、71和73匹配。在一個(gè)實(shí)施方案中，(2. b)中鑒定的至少3、4、或5個(gè)殘基匹配。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，殘基1、68或70匹配。在一個(gè)實(shí)施方案中，(2. c)中鑒定的至少3、4、或5個(gè)殘基匹配。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，殘基46、87或98匹配。在一個(gè)實(shí)施方案中，(La)中的殘基6、(l.b)中的殘基2和(l.c)中的殘基4匹配。在另一個(gè)實(shí)施方案中，(2. a)中的殘基4、(2. b)中的殘基2和(2. c)中的殘基4匹配。
在一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈種系序列為VH3、VHl和VH5種系類(lèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈種系序列為Vkappa或Vlambda序列。術(shù)語(yǔ)“治療”指按改善與病癥相關(guān)的病狀、癥狀或參數(shù)或防止病癥進(jìn)展至統(tǒng)計(jì)上顯著的程度或本領(lǐng)域的技術(shù)人員可檢測(cè)的程度有效的量、方式和/或模式施用療法。有效的量、方式或模式可根據(jù)受試者而改變并且可為受試者定制?！?α 4結(jié)合抗體”指與VLA_4(a 4β I)整聯(lián)蛋白的a 4亞單位結(jié)合，并且至少部分抑制VLA-4的活性，尤其是VLA-4整聯(lián)蛋白的結(jié)合活性或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性(例如轉(zhuǎn)導(dǎo)VLA-4介導(dǎo)的信號(hào)的能力)的抗體。例如，VLA-4結(jié)合抗體可抑制VLA-4與VLA-4的同源配體，例如諸如VCAM-1 (血管細(xì)胞粘附分子-1)的表面蛋白，或與諸如纖連蛋白或骨橋蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)組分結(jié)合。α _4結(jié)合抗體可能與α4β I或α4β7結(jié)合。通常，抗體與a 4的BI表位結(jié)合。a 4結(jié)合抗體可能以低于約lO'lO'lO'lO'lO—1?；騃iT11M的Kd與VLA-4結(jié)合。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“抗體”指包括至少一個(gè)提供免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序列的免疫球蛋白可變區(qū)，例如氨基酸序列。例如，抗體可包括I個(gè)重(H)鏈可變區(qū)(本文縮寫(xiě)為VH)和I個(gè)輕(L)鏈可變區(qū)(本文縮寫(xiě)為VL)。在另一個(gè)實(shí)例中，抗體包括2個(gè)重(H)鏈可 變區(qū)和2個(gè)輕(L)鏈可變區(qū)。免疫球蛋白的輕鏈可為K或λ型。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體糖基化?？贵w可對(duì)抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性和/或補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性起作用，或?qū)τ谶@些活性的一種或兩種無(wú)作用。VH和VL區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分為稱(chēng)為“互補(bǔ)決定區(qū)”(“CDR”)，散布有更保守的稱(chēng)為“骨架區(qū)”(FR)的區(qū)域的超變區(qū)。已精確限定了 FR和CDR的范圍(見(jiàn)，Kabat、E.A.等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、Fifth Edition、U. S. Departmentof Health and Human Services、NIH 公布 No. 91-3242 ;和 Chothia、C.等(1987) J.Mol·Biol. 196:901-917) 0本文使用Kabat定義。每個(gè)VH和VL通常由3個(gè)CDR和4個(gè)FR構(gòu)成，按以下順序從氨基端至羧基端排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。“免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域”指來(lái)自免疫球蛋白分子的可變或恒定結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域。免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域通常含有由約7條β鏈和保守二硫鍵形成的2個(gè)β折疊(見(jiàn)，例如A. F. Williams 和 A. N. Barclay (1988) Ann. Rev.1mmunol. 6:381-405)。如本文所使用，“免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序列”指可形成免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。例如，序列可包括天然存在的可變結(jié)構(gòu)域的所有或部分氨基酸序列。例如，序列可能遺漏1、2個(gè)或更多個(gè)N或C端氨基酸、內(nèi)部氨基酸，可能包括一個(gè)或多個(gè)插入或附加的末端氨基酸，或可能包括其它改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，包括免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序列的多肽可與另一免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序列結(jié)合以形成靶結(jié)合結(jié)構(gòu)(或“抗原結(jié)合位點(diǎn)”)，例如與VLA-4相互作用的結(jié)構(gòu)?？贵w的VH或VL鏈可進(jìn)一步包括整個(gè)或部分重鏈或輕鏈恒定區(qū)，從而分別形成免疫球蛋白重鏈或輕鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體為2條免疫球蛋白重鏈和2條免疫球蛋白輕鏈的四聚物。免疫球蛋白重鏈和輕鏈可通過(guò)二硫鍵連接。重鏈恒定區(qū)通常包括3個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。輕鏈恒定區(qū)通常包括一個(gè)CL結(jié)構(gòu)域。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)通常介導(dǎo)抗體與宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和典型補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)。術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”包括各種廣泛類(lèi)別的可從生物化學(xué)上區(qū)別的多肽。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到，重鏈分類(lèi)為Υ、μ、α、δ或ε(γ、μ、α、δ、ε ),其中有一些亞類(lèi)(例如，Y1-Y 4) 0將抗體的“類(lèi)別”分別確定為IgG, IgM, IgA, IgD或IgE的是這條鏈的特性。免疫球蛋白亞類(lèi)(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl等，表征清楚并且已知賦予了功能特化。鑒于本公開(kāi)，這些類(lèi)別和同種型的每一個(gè)的修飾形式易于為技術(shù)人員辨別，并且因此，在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。所有免疫球蛋白類(lèi)別明顯在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。輕鏈分類(lèi)為K或λ (K、λ)。每條重鏈類(lèi)別均可與K或λ輕鏈結(jié)合。術(shù)語(yǔ)全長(zhǎng)抗體的“抗原結(jié)合片段”指全長(zhǎng)抗體保持與所關(guān)注靶標(biāo)(例如，VLA-4)特異性結(jié)合的能力的一個(gè)或多個(gè)片段。涵蓋于術(shù)語(yǔ)全長(zhǎng)抗體的“抗原結(jié)合片段”中的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab' )2片段，包括通過(guò)鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接的2個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(V)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341:544-546);和(vi)保持功能性的分離互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH由單獨(dú)基因編碼，但是使用重組方法，通過(guò)能夠使其制備為蛋白質(zhì)單鏈的合成連接子連接兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中VL和VH區(qū)配對(duì)形成稱(chēng)為單鏈 Fv(scFv)的單價(jià)分子。見(jiàn)例如，Bird 等(1988) Science 242:423-426 ;和 Huston等(1988)Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 85:5879-5883。在一些實(shí)施方案中，上述抗體被聚乙二醇化。在一些實(shí)施方案中，上述抗體或其片段為多特異性的。在更多實(shí)施方案中，上述抗體或其片段為單價(jià)或雙特異性的。以下的附圖和描述中提出了本發(fā)明一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的詳情。從描述和附圖以及從權(quán)利要求將顯而易見(jiàn)本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)。附圖簡(jiǎn)述 圖1展示了 HP1/2重鏈向人重鏈種系IGHVl-f的3種序列變體。序列上方的小寫(xiě)字母表示根據(jù)Kabat編號(hào)方案的插入。圖2展示了 HP1/2輕鏈向種系IGKV4-1抗體序列(設(shè)計(jì)L0、LI和L2)或人κ種系工程化ΑΑΗ7033.1抗體序列(設(shè)計(jì)L3)的4種序列變體。序列上方的小寫(xiě)字母表示根據(jù)Kabat編號(hào)方案的插入。圖3為描繪ELISA試驗(yàn)的結(jié)果的曲線(xiàn)圖。圖4為描繪ELISA試驗(yàn)的結(jié)果的曲線(xiàn)圖。圖5為IgG4Fc (鉸鏈+CH2+CH3結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列。用粗體描繪鉸鏈區(qū)，并且為CH3結(jié)構(gòu)域加下劃線(xiàn)。加框的“S”為Ser228。畫(huà)圈的“N”為Asn297。圖6為描繪來(lái)自HuHPl/2與各種腫瘤細(xì)胞系結(jié)合的流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)的曲線(xiàn)圖?！癏P1/2” 指人源化 HP1/2。圖7A-7C為一組描繪HuHPl/2對(duì)AML細(xì)胞系與涂覆纖連蛋白或VCAMl-1g的孔的結(jié)合的抑制的曲線(xiàn)圖。圖7A描繪了對(duì)HL60和KGl細(xì)胞與涂覆FN的孔的結(jié)合的抑制。圖7B描繪了對(duì)KGl細(xì)胞與涂覆VCAMl-1g的孔的結(jié)合的抑制。圖7C描繪了當(dāng)與20 μ g/mLHuHPI/2孵育時(shí)對(duì)HL60細(xì)胞與涂覆FN和VCAMl-1g的孔的結(jié)合的抑制(實(shí)體柱)?？瞻字硎驹谕N型對(duì)照存在下的細(xì)胞粘著百分比?！癏P1/2”指人源化HP1/2。圖8A-8C組成一組描繪HuHPl/2對(duì)麗細(xì)胞系與涂覆纖連蛋白或VCAMl-1g的孔的結(jié)合的抑制的曲線(xiàn)圖。圖8A描繪了對(duì)U266和H929細(xì)胞與涂覆FN的孔的結(jié)合的抑制。圖8B描繪了對(duì)U266和H929細(xì)胞與涂覆VCAMl-1g的孔的結(jié)合的抑制。圖8C描繪了當(dāng)與20 μ g/mL HuHPI/2孵育時(shí)對(duì)U266細(xì)胞與涂覆FN和VCAMl-1g的孔的結(jié)合的抑制(實(shí)體柱)。空白柱表示在同種型對(duì)照存在下的細(xì)胞粘著百分比。“HP1/2”指人源化HP1/2。圖9A-9C組成一組描繪HuHPl/2對(duì)CLL細(xì)胞系與涂覆纖連蛋白或VCAMl-1g的孔的結(jié)合的抑制的曲線(xiàn)圖。圖9A描繪了對(duì)Mecl和JMl細(xì)胞與涂覆FN的孔的結(jié)合的抑制。圖9B描繪了對(duì)Mecl和JMl細(xì)胞與涂覆VCAMl-1g的孔的結(jié)合的抑制。圖9C描繪了當(dāng)與20 μ g/mL HuHPI/2孵育時(shí)對(duì)Mecl細(xì)胞與涂覆FN和VCAMl-1g的孔的結(jié)合的抑制(實(shí)體柱)?？瞻字硎驹谕N型對(duì)照存在下的細(xì)胞粘著百分比?！癏P1/2”指人源化HP1/2。發(fā)明詳述已經(jīng)證實(shí)抗VLA-4抗體在治療疾病中有用。例如，那他珠單抗(Tysabri )，抗VLA-4抗體，用于治療復(fù)發(fā)性多發(fā)性硬化和克羅恩病。然而，對(duì)于某些病狀，例如急性病狀諸如脊椎損傷(SCI)或外傷性腦損傷(TBI)的治療，或施用有限次數(shù)的治療例如癌癥的治療，用以不同于那他珠單抗的親和力(例如，較高親和力)結(jié)合的抗VLA-4抗體治療可能有利。另外，用抗VLA-4抗體治療與罕見(jiàn)但是有時(shí)致死的病癥進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病(PML)相關(guān)，對(duì)于所述病癥而言，部分治療需要(例如)使用血漿交換或免疫吸附從受治受試者中去除抗體。由于需要去除抗體，也期望平衡對(duì)VLA-4具有增加親和力的抗體的優(yōu)點(diǎn)和結(jié)合非常緊密以致使得難以去除或產(chǎn)生低周轉(zhuǎn)率相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)的抗體的缺點(diǎn)。此類(lèi)抗體也可用于治療諸如多發(fā)性硬化的病狀，因?yàn)榭赡苄枰荒敲搭l繁的治療或通過(guò)除輸注之外的方式施用可能更有效。以較低劑量使治療可能也可降低不良事件(例如PML)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本發(fā)明提供了具有所需性質(zhì)的抗體。本發(fā)明至少部分基于新設(shè)計(jì)的對(duì)α 4的結(jié)合親和力是抗α 4抗體那他珠單抗的結(jié)合親和力的10倍的人源化α 4結(jié)合抗體的非預(yù)期特征。提供了 α 4結(jié)合抗體及其片段，其中可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)骨架具有由種系或種系工程化抗體序 列構(gòu)建的受體序列，例如IGKV4-1或geAAH70335.1或IGHVl-f抗體。CDR序列源自非人抗α4結(jié)合抗體，例如抗VLA-4抗體HP1/2。本文所述的抗體(例如)相對(duì)于其鼠親本的親和力增強(qiáng)至少1·5、2·0、2·5、3·0倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，親和力增強(qiáng)至少1.5、2. 0、2. 5、3. O倍，但是分別低于25、20或15倍。藥物組合物α 4結(jié)合劑，例如VLA-4結(jié)合抗體，可配制為藥物組合物。通常,藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的載體。如本文所使用，“藥學(xué)上可接受的載體”包括所有任何生理上相容的溶齊U、分散介質(zhì)、包衣、抗菌和抗真菌劑、等滲和吸附延緩劑等?！八帉W(xué)上可接受的鹽”指保持親本化合物的所需生物學(xué)活性并且不賦予任何不良毒理學(xué)效應(yīng)的鹽(見(jiàn)例如，Berge，S.M.等(1977) J. Pharm. Sc1. 66:1-19)。此類(lèi)鹽的實(shí)例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括源自無(wú)毒無(wú)機(jī)酸，例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸等，以及源自無(wú)毒有機(jī)酸，例如脂肪族一元羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等的酸加成鹽。堿加成鹽包括源自堿金屬，例如鈉、鉀、鎂、鈣等，以及源自無(wú)毒有機(jī)胺，例如N，N' -二芐基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等的堿加成鹽。
可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法配制本文所述的抗體組合物。藥物制劑是得到確認(rèn)的技術(shù)，并且在 Gennaro (編)，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 20版，Lippincott, ffilliams&ffilkins(2000)(ISBN:0683306472) ；Ansel 等，PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems,第 7 版，Lippincott ffilliams&ffilkinsPublishers (1999)(ISBN:0683305727)；和 Kibbe(編),Handbook of PharmaceuticalExcipients American Pharmaceutical Association,第 3 版(2000)(ISBN:091733096X)中進(jìn)一步描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，可用賦形劑材料，例如氯化鈉、磷酸氫二鈉七水合物、磷酸二氫鈉和聚山梨醇酯80配制ci4抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將α 4抗體配制于例如在pH5、5. 5、6、6. 5、7或7. 5下的朽1檬酸鹽緩沖液中。在又一個(gè)實(shí)施方案中,可將α 4抗體配制于包括2、4、5、6、8、IO、12、14或15%蔗糖的溶液中。例如，可在濃度為約20mg/ml的緩沖溶液中提供并且可儲(chǔ)存在2-8°C下。藥物組合物也可呈各種其它形式。這些包括(例如)液體、半固體和固體劑型,例如液體溶液(例如，可注射和可輸注的溶液)、分散體或懸浮液、片劑、丸劑、粉劑、脂質(zhì)體和栓劑。形式可取決于預(yù)期的施用模式和治療應(yīng)用。通常，本文所述藥劑的組合物呈可注射或可輸注溶液的形式。此類(lèi)組合物可通過(guò)腸胃外方式(例如，靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)注射)施用。如本文所使用的短語(yǔ)“腸胃外施用”和“經(jīng)腸胃外施用”指除腸內(nèi)和局部施用之外的施用方式，通常通過(guò)注射，并且包括但不限于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眼眶內(nèi)、心臟內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下藥物組合物通常必須無(wú)菌且穩(wěn)定。也可測(cè)試藥物組合物以確保其滿(mǎn)足施用的監(jiān)管和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)?？蓪⒔M合物配制為溶液、微乳劑、分散體、脂質(zhì)體或其它適于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。根據(jù)需要，可通過(guò)在具有上面列舉的成分的一種或組合的適當(dāng)溶劑中并入所需量的本文所述藥劑，接著過(guò)濾滅菌制備無(wú)菌注射液。通常，通過(guò)將本文所述藥劑并入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需來(lái)自上面列舉的其它成分的無(wú)菌媒介物中制備分散體。在用于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉劑的情況下，典型制備方法是真空干燥和冷凍干燥，獲得本文所述藥劑的粉劑加上來(lái)自其先前無(wú)菌過(guò)濾溶液的任何附加所需成分。例如，可通過(guò)使用諸如卵磷脂的包衣，在分散體的情況下通過(guò)保持所需粒度和通過(guò)使用表面活性劑來(lái)保持溶液的適當(dāng)流動(dòng)性?？赏ㄟ^(guò)使延緩吸收的藥劑，例如單硬脂酸鹽和明膠包括在組合物內(nèi)使可注射組合物的吸收延長(zhǎng)。施用可通過(guò)多種方法向受試者， 例如人受試者，施用α 4結(jié)合抗體。對(duì)于許多應(yīng)用而言，施用途徑為以下的一種靜脈內(nèi)注射或輸注、皮下注射或肌肉內(nèi)注射?？砂垂潭▌┝炕虬磎g/kg劑量施用α 4結(jié)合抗體?？山?jīng)靜脈內(nèi)(IV)或經(jīng)皮下(SC)施用抗體。例如，可按約50-600mg IV之間的固定單位劑量，例如每4周施用一次抗體，或按約50-100mg SC之間的固定單位劑量(例如，75mg),例如至少每周施用一次抗體(例如，每周2次)。在一個(gè)實(shí)施方案中，按 50mg、60mg、80mg、IOOmg> 120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、180mg、200mg、300mg、400mg、500mg或600mg或更高的固定單位劑量IV施用抗體。IV劑量的施用可為每周I次或2次或3次或更多次，或每2、3、4或5周一次或更長(zhǎng)時(shí)間一次。在一個(gè)實(shí)施方案中，按50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、IOOmg或120mg或更高的固定單位劑量SC施用抗體。SC劑量的施用可為每周I次或2次或3次或更多次，或每2、3、4或5周一次或更長(zhǎng)時(shí)間一次。也可按約I 至 10mg/kg之間的劑量,例如約 6. 0mg/kg、4. 0mg/kg、3. 0mg/kg、2. Omg/kg、1. Omg/kg的大藥丸施用抗α 4抗體。劑量變更范圍包括低于約600mg/受試者的劑量，約400mg/受試者、約300mg/受試者、約250mg/受試者、約200mg/受試者或約150mg/受試者，通常用于每4周或每月施用一次。例如，可每3-5周，例如每4周或每月施用α4結(jié)合抗體一次。可根據(jù)患者對(duì)先前施用的抗α 4抗體的清除率調(diào)整劑量。例如，在患者體內(nèi)的抗α4抗體的水平降至預(yù)定水平以下之前可能不向患者施用第二或后續(xù)劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定來(lái)自患者的樣本(例如，血漿、血清、血液、尿液或腦脊液(CSF))是否存在抗α4抗體，并且如果抗α 4抗體的水平高于預(yù)定水平，將不會(huì)向患者施用第二或后續(xù)劑量。如果患者體內(nèi)的α 4抗體的水平低于預(yù)定水平，則向患者施用第二或后續(xù)劑量。I或2或3天或一周后可再次測(cè)試確定抗α4水平太高(高于預(yù)定水平)的患者，并且如果患者樣本中抗α 4抗體的水平降至預(yù)定水平以下，可向患者施用第二或后續(xù)劑量的抗體。也可選擇劑量以減少或避免抗α 4結(jié)合抗體的抗體產(chǎn)生，以達(dá)到高于40、50、70、75或80%的α 4亞單位飽 和，以達(dá)到低于80、70、60、50或40%的α 4亞單位飽和，或以防止循環(huán)白血細(xì)胞的水平升高。在某些實(shí)施方案中，可用會(huì)防止化合物迅速釋放的載體，例如包括植入物和微膠囊化遞送系統(tǒng)的控釋制劑制備活性劑。可使用生物可降解、生物相容聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備此類(lèi)制劑的許多方法申請(qǐng)了專(zhuān)利或皿常已失口。見(jiàn) 列如，Controlled Drug Delivery (Drugs and the PharmaceuticalSciences),第 2 版，J. Robinson 和 V. H. L. Lee 編，Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987?？捎冕t(yī)療裝置施用藥物組合物。例如，可用皮下無(wú)針注射裝置，例如美國(guó)專(zhuān)利No. 5，399，163,5, 383，851,5, 312，335,5, 064，413,4, 941，880,4, 790，824 或 4，596，556 中公開(kāi)的裝置施用藥物組合物。例如，在美國(guó)專(zhuān)利No. 4，487，603、美國(guó)專(zhuān)利No. 4，486，194、美國(guó)專(zhuān)利No. 4，447，233、美國(guó)專(zhuān)利No. 4，447，224、美國(guó)專(zhuān)利No. 4，439，196和美國(guó)專(zhuān)利No. 4，475，196中討論了眾所周知的植入物和組件的實(shí)例，美國(guó)專(zhuān)利No. 4，487，603公開(kāi)了用于按受控速率分散藥物的可植入微型輸注泵；美國(guó)專(zhuān)利No. 4，486，194公開(kāi)了用于通過(guò)皮膚施用藥劑的治療設(shè)備；美國(guó)專(zhuān)利No. 4，447，233公開(kāi)了用于按精確輸注速率遞送藥物的藥物輸注泵；No. 4，447，224公開(kāi)了用于持續(xù)藥物遞送的可植入式變流量輸注裝置；美國(guó)專(zhuān)利No. 4，439，196公開(kāi)了具有多室隔間的滲透藥物遞送系統(tǒng)；并且美國(guó)專(zhuān)利No. 4，475，196公開(kāi)了滲透藥物遞送系統(tǒng)。當(dāng)然，許多其它此類(lèi)植入物、遞送系統(tǒng)和組件也已知。本公開(kāi)還特寫(xiě)了用于施用第一和第二藥劑的裝置。所述裝置可(例如)包括一個(gè)或多個(gè)用于儲(chǔ)存藥物制劑的外殼，并且可構(gòu)造為遞送單位劑量的第一和第二藥劑。第一和第二藥劑可儲(chǔ)存在同一或單獨(dú)隔間中。例如，在施用之前所述裝置可合并藥劑。也可能使用不同裝置來(lái)施用第一和第二藥劑。調(diào)整劑量方案以提供所需反應(yīng)，例如治療反應(yīng)或組合療效。通常，可使用VLA-4結(jié)合劑和第二藥劑的劑量(單獨(dú)或共同配制的)的任何組合以便為受試者提供生物可用量的兩種藥劑。如本文所使用的劑量單位形式或“固定劑量”指適合作為用于待治療的受試者的單位劑量的物理離散單位；每個(gè)單位含有經(jīng)計(jì)算以產(chǎn)生預(yù)期療效的預(yù)定量的活性化合物連同所需藥物載體并且任選地連同其它藥劑。藥物組合物可包括“治療有效量”的本文所述藥劑?？筛鶕?jù)施用的第一和第二藥劑的組合效果確定此有效量。藥劑的治療有效量也可能根據(jù)以下因素改變，例如病情、年齡、性別和個(gè)體的體重和化合物在個(gè)體中引起預(yù)期反應(yīng)的能力，例如改善至少一種病癥參數(shù)例如多發(fā)性硬化參數(shù)，或改善病癥的至少一種癥狀例如多發(fā)性硬化的癥狀(例如肌肉萎縮、共濟(jì)失調(diào)和震顫)。治療有效量也是治療有益作用比組合物的任何毒性或有害作用更重要的量。裝置和試劑盒可用醫(yī)療裝置施用含有本文所述抗體的制劑。所述裝置可設(shè)計(jì)為具有諸如輕便、室溫儲(chǔ)存和易于使用的特征，以致可在緊急情況下，例如由未經(jīng)訓(xùn)練的受試者或在場(chǎng)的緊急救援人員使用，移動(dòng)到醫(yī)療設(shè)施和其它醫(yī)療設(shè)備上。所述裝置可包括(例如)一個(gè)或多個(gè)用于儲(chǔ)存包括α 4結(jié)合抗體的藥物制劑的外殼，并且可構(gòu)造為遞送一個(gè)或多個(gè)單位劑量的藥劑。例如，可用經(jīng)皮遞送裝置，例如注射器，包括皮下或多室注射器，施用藥物組合物。其它適合遞送裝置包括支架、導(dǎo)管、顯微操作針和可植入的控釋裝置?？捎脴?biāo)準(zhǔn)IV設(shè)備，包括(例如)IV管，用或不用串 聯(lián)過(guò)濾器經(jīng)靜脈內(nèi)施用組合物。在某些實(shí)施方案中，所述設(shè)備將為用于SC或IM施用的注射器?？捎冕t(yī)療設(shè)備施用藥物組合物。例如，可用皮下無(wú)針注射裝置，例如美國(guó)專(zhuān)利No. 5，399，163,5, 383，851,5, 312，335,5, 064，413,4, 941，880,4, 790，824 或 4，596，556 中公開(kāi)的裝置施用藥物組合物。例如，在美國(guó)專(zhuān)利No. 4，487，603、美國(guó)專(zhuān)利No. 4，486，194、美國(guó)專(zhuān)利No. 4，447，233、美國(guó)專(zhuān)利No. 4，447，224、美國(guó)專(zhuān)利No. 4，439，196和美國(guó)專(zhuān)利No. 4，475，196中討論了眾所周知的植入物和組件的實(shí)例，美國(guó)專(zhuān)利No. 4，487，603公開(kāi)了用于按受控速率分散藥物的可植入微型輸注泵；美國(guó)專(zhuān)利No. 4，486，194公開(kāi)了用于通過(guò)皮膚施用藥劑的治療設(shè)備；美國(guó)專(zhuān)利No. 4，447，233公開(kāi)了用于按精確輸注速率遞送藥物的藥物輸注泵；No. 4，447，224公開(kāi)了用于持續(xù)藥物遞送的可植入式變流量輸注裝置；美國(guó)專(zhuān)利No. 4，439，196公開(kāi)了具有多室隔間的滲透藥物遞送系統(tǒng)；并且美國(guó)專(zhuān)利No. 4，475，196公開(kāi)了滲透藥物遞送系統(tǒng)。治療性組合物也可呈用于皮下或肌肉內(nèi)施用的生物可降解或非生物可降解的緩釋制劑形式。用于此類(lèi)組合物的方法在本領(lǐng)域中已知。也可使用可植入或外用泵實(shí)現(xiàn)持續(xù)施用。也可(例如)通過(guò)每天注射間歇性進(jìn)行施用，或按低劑量，例如以緩釋制劑持續(xù)進(jìn)行施用。遞送裝置可改進(jìn)為最佳適于施用α4結(jié)合抗體。例如，可將注射器硅化至對(duì)于儲(chǔ)存和遞送抗體最佳的程度。當(dāng)然，許多其它此類(lèi)植入物、遞送系統(tǒng)和組件也已知。本公開(kāi)還特寫(xiě)了用于施用第一和第二藥劑(例如，抗體和第二藥劑)的裝置。所述裝置可包括(例如)一個(gè)或多個(gè)用于儲(chǔ)存藥物制劑的外殼，并且可構(gòu)造為遞送單位劑量的第一和第二藥劑。第一和第二藥劑可儲(chǔ)存在同一或單獨(dú)隔間中。在一個(gè)實(shí)施方案中，在施用之前所述裝置合并藥劑。在一些實(shí)施方案中，用不同裝置施用第一和第二藥劑?？稍谠噭┖兄刑峁│?4結(jié)合抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括(a)裝有包括高濃度的VLA-4結(jié)合抗體的組合物的容器，任選地(b)裝有包括第二藥劑的組合物的容器，和任選地(c)信息材料。信息材料可為涉及本文所述方法和/或藥劑對(duì)于治療利益的用途的描述性、指導(dǎo)性營(yíng)銷(xiāo)材料或其它材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒還包括第二藥劑。例如，試劑盒包括裝有包括α 4結(jié)合抗體的組合物的第一容器和包括第二藥劑的第二容器。試劑盒的信息材料形式不限。在一個(gè)實(shí)施方案中，信息材料可包括關(guān)于抗體的生產(chǎn)、濃度、有效期、批次和生產(chǎn)地點(diǎn)的信息等。在一個(gè)實(shí)施方案中，信息材料涉及(例如)以適合劑量、劑型或施用模式(例如，本文所述的劑量、劑型或施用模式)施用α 4結(jié)合抗體，以治療患有急性病癥(例如脊椎損傷或外傷性腦損傷)或炎癥性疾病(例如，MS)的受試者，或有處于與炎癥性疾病相關(guān)的階段的風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法。信息可以各種格式提供，包括印刷文本、計(jì)算機(jī)可讀材料、錄象或錄音或提供實(shí)質(zhì)性材料的鏈接或地址的信息。除藥劑外，試劑盒中的組合物可包括其它成分，例如溶劑或緩沖液、穩(wěn)定劑或防腐齊U。藥劑可以任何形式提供 ，例如液體、干燥或凍干形式，并且大體上純凈和/或無(wú)菌。當(dāng)于液體溶液中提供藥劑時(shí)，液體溶液通常為水溶液。當(dāng)作為干燥形式提供藥劑時(shí)，通常通過(guò)添加適合溶劑復(fù)溶。可任選在試劑盒中提供溶劑，例如無(wú)菌水或緩沖液。試劑盒可包括一個(gè)或多個(gè)用于組合物或含有藥劑的組合物的容器。在一些實(shí)施方案中，試劑盒裝有用于組合物和信息材料的單獨(dú)容器、分配器或隔間。例如，組合物可裝在瓶、小瓶或注射器中，而信息材料可裝在塑料套管或塑料袋中。在其它實(shí)施方案中，試劑盒的單獨(dú)元件可裝在單個(gè)未分割容器中。例如，組合物裝在以標(biāo)簽形式貼有信息材料的瓶、小瓶或注射器中。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括若干(一盒)單獨(dú)容器，每個(gè)容器裝有一種或多種單位劑型(例如，本文所述劑型)的藥劑。容器可包括組合單位劑量，例如包括例如呈所需比例的α 4結(jié)合抗體和第二藥劑的單位。例如，試劑盒可包括若干注射器、安瓿、鋁箔包、泡板包裝或醫(yī)療設(shè)備，每一個(gè)均裝有(例如)單次組合單位劑量。試劑盒的容器可為氣密性、防水(例如，不受水分或蒸發(fā)改變)和/或不透光。試劑盒任選地包括適于施用組合物的設(shè)備，例如注射器或其它適合的遞送裝置。提供預(yù)先裝載一種或兩種藥劑的裝置或可為空的但是適合裝載。腫瘤學(xué)本文所述的α 4結(jié)合抗體和方法可用于治療癌癥，包括實(shí)體癌和血液惡性腫瘤。示例性實(shí)體癌包括例如肺、乳房、胰腺、結(jié)腸、前列腺、膀胱和大腦的肉瘤和癌。血液惡性腫瘤包括癌癥，例如多發(fā)性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。提供了用于用含有α 4結(jié)合抗體例如本文所述抗VLA-4抗體的組合物治療患有血液惡性腫瘤的患者的方法。血液惡性腫瘤是身體造血和免疫系統(tǒng)的癌癥。這種類(lèi)型的癌癥影響血液、骨髓和/或淋巴結(jié)。血液惡性腫瘤包括白血病，例如急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性紅白血病和毛細(xì)胞白血病(HCL);淋巴瘤，例如霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤；和多發(fā)性骨髓瘤；原發(fā)性巨球蛋白血癥(WaldenstiOm’ smacroblobulinemia);骨髓增生異常綜合征(MDS)(可以AML告終)；骨髓增生性疾病，例如真性紅細(xì)胞增多(也稱(chēng)為PV、PCV或紅細(xì)胞增多(PRV))、原發(fā)性血小板增多癥(ET)、骨髓纖維化、重鏈??；和由于輕鏈病引起的淀粉體?？赏ㄟ^(guò)用(例如)可用于鑒定惡性腫瘤細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡分析血細(xì)胞計(jì)數(shù)和血涂片鑒定患有血液惡性腫瘤的患者。例如來(lái)自骨髓的活組織檢查也可用于鑒定惡性腫瘤細(xì)胞，并且來(lái)自淋巴結(jié)的活組織檢查可用于鑒定淋巴結(jié)病。α 4結(jié)合抗體(例如，人源化抗VLA-4抗體例如HuHP1/2、H1L0、H1L1、H1L2或H1L3)用于治療白血病，例如AML。白血病是起源于骨髓的癌癥，其中惡性腫瘤細(xì)胞為白血細(xì)胞(白細(xì)胞)。AML(也稱(chēng)為急性骨髓性白血病、急性成髓細(xì)胞白血病、急性粒細(xì)胞白血病和急性非淋巴細(xì)胞白血病)是在粒細(xì)胞或單核細(xì)胞中出現(xiàn)的惡性腫瘤。AML特征在于不能起正常血細(xì)胞的作用，稱(chēng)為白血病原始細(xì)胞的細(xì)胞不受控制、夸大的增長(zhǎng)和積累，并且阻斷正常骨髓細(xì)胞的生成，導(dǎo)致血液中缺乏紅細(xì)胞(貧血)和血小板(血小板減少)和正常白細(xì)胞(尤其是嗜中性粒細(xì)胞，即嗜中性白血球減少癥)。所有子類(lèi)型的AML均適合用VLA-4結(jié)合抗體治療。根據(jù)診斷時(shí)成髓細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到的發(fā)育階段來(lái)為AML的子類(lèi)型分類(lèi)。種類(lèi)和亞類(lèi)使醫(yī)師決定對(duì)于細(xì)胞類(lèi)型而言哪種治療效果最好和疾病發(fā)展可能多快。亞類(lèi)為M0，成髓細(xì)胞性，特殊分析時(shí)；M1，成髓細(xì)胞性，未成熟；M2，成髓細(xì)胞性，成熟；M3，早幼粒細(xì)胞性；M4，髓單核細(xì)胞性；M5，單核細(xì)胞性；M6，紅白血病；和M7，巨核細(xì)胞性。VLA-4抗體可與特別適合AML亞類(lèi)的第二藥劑一起使用。例如，急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)和急性單核細(xì)胞白血病是需要不同于AML亞類(lèi)的治療的AML亞類(lèi)。用于治療APL的第二藥劑包括全反式視黃酸(ATRA)或抗代謝物，例如阿糖胞苷。用于治療急性單核細(xì)胞白血病的第二藥劑可包括脫氧腺苷類(lèi)似物，例如2-氯-2'-脫氧腺苷(2-CDA)。AML的風(fēng)險(xiǎn)因素包括某些遺傳病的存在，例如唐氏綜合征、范科尼貧血(Fanconianemia)、Shwachman-Dia mond綜合征等。可向患有AML和遺傳病的患者施用VLA-4結(jié)合抗體和第二藥劑以治療遺傳病的癥狀。例如，可向患有AML和范科尼貧血的患者施用VLA-4結(jié)合抗體和抗生素。AML的其它風(fēng)險(xiǎn)因素包括用于治療不同癌癥的化學(xué)療法或放射療法、煙草煙霧和
暴露于大量苯中。其它適合用α 4結(jié)合抗體治療的癌癥包括實(shí)體瘤，例如肉瘤和癌(例如，纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤(Ewing’ s tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、卵巢癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、絨膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維耳姆斯瘤(Wilm’ s tumor)、宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、小細(xì)胞肺癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室鼓膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)。其它病癥本文所述制劑和方法也可用于治療其它炎癥性、免疫性或自身免疫性病癥，例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥(例如，除多發(fā)性硬化、腦膜炎、神經(jīng)脊髓炎、神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)節(jié)病、CNS脈管炎、腦炎和橫貫性脊髓炎外)；組織或器官移植物排斥或移植物抗宿主病；急性CNS損傷，例如中風(fēng)或脊椎損傷(SCI);慢性腎??；過(guò)敏癥，例如變應(yīng)性哮喘、中度至重度過(guò)敏性鼻炎、眼部過(guò)敏；1型糖尿??；炎癥性腸病，例如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎(例如，用于治療或保持緩解)；嗜酸細(xì)胞性胃腸炎；重癥肌無(wú)力；纖維肌痛；風(fēng)濕病學(xué)/免疫學(xué)相關(guān)病癥，例如關(guān)節(jié)炎，例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎；皮膚病癥，例如炎癥性/免疫性皮膚病，例如牛皮癬、白癲風(fēng)、皮炎(例如，特應(yīng)性皮炎)、扁平苔癬、中度至重度慢性蕁麻疹；全身性紅斑狼瘡(SLE ;例如狼瘡性腎炎)；硬皮病(例如，進(jìn)行性全身性硬化(PSS)，例如肺的PSS);急性或慢性原發(fā)嗜酸細(xì)胞性肺炎；干燥綜合征；急性冠脈綜合征(ACS);急性心肌梗塞；動(dòng)脈粥樣硬化；和纖維化病癥，例如肺纖維化(例如，先天性肺纖維化)、肺部纖維化(例如，XRT誘導(dǎo)的)、骨髓纖維化、肝硬化、系膜增生性腎小球腎炎、新月體性腎小球腎炎、糖尿病腎病和腎間質(zhì)纖維化。本文所述制劑和方法也可用于治療神經(jīng)障礙，例如腦缺血，包括防止患者短暫性腦缺血發(fā)作和/或動(dòng)脈狹窄。其它示例性神經(jīng)障礙包括慢性炎癥性脫髓鞘性多神經(jīng)病(CIDP);格林-巴利綜合征(GBS);眼病，例如黃斑變性(例如，濕性黃斑變性)和前部缺血性視神經(jīng)病變；神經(jīng)性疼痛(例如，有癥狀的神經(jīng)性疼痛)；阿爾茨海默?。患∥s性側(cè)索硬化(ALS)(例如改善ALS的疾病)和帕金森氏病。本文所述制劑和方法也可用于治療經(jīng)歷了移植，例如腎臟、心臟或骨髓移植的患者。多發(fā)性硬化含有本文所述α -4結(jié)合抗體的制劑用于治療炎癥性疾病，例如多發(fā)性硬化(MS)。多發(fā)性硬化是特征在于髓鞘發(fā)炎和丟失的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病?？赏ㄟ^(guò)建立如通過(guò)關(guān)于MS診斷的學(xué)術(shù)討論會(huì)定義的臨床確診MS的診斷的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)鑒定患有MS的患者(Pos er等，Ann. Neurol. 13:227, 1983)。例如，患有臨床確診MS的個(gè)體已經(jīng)發(fā)作兩次并且具有兩種病變的證據(jù)或一種病變的臨床證據(jù)和另一種單獨(dú)病變的近似臨床證據(jù)。也可通過(guò)兩次發(fā)作的證據(jù)和腦脊髓液中IgG的寡克隆帶或通過(guò)發(fā)作、兩種病變的臨床證據(jù)和腦脊髓液中IgG的寡克隆帶的組合來(lái)診斷確診MS。McDonald標(biāo)準(zhǔn)也可用于診斷 MS。(McDonald 等，2001，“Recommended diagnostic criteria for multiplesclerosiss:guidelines from the International Panel on the Diagnosis of MultipleSclerosiss, ”Ann. Neurol. 50:121-127)。McDonald標(biāo)準(zhǔn)包括在無(wú)多次臨床發(fā)作時(shí)使用隨著時(shí)間推移CNS損傷的MRI證據(jù)以用于診斷MS?？捎萌舾刹煌绞皆u(píng)估多發(fā)性硬化的有效治療。以下參數(shù)可用于測(cè)量治療的有效性。2個(gè)示例性標(biāo)準(zhǔn)包括EDSS(殘疾狀態(tài)擴(kuò)展評(píng)分)和MRI (磁共振成象)上出現(xiàn)惡化。EDSS是用于對(duì)由于MS引起的臨床損傷進(jìn)行分級(jí)的方法(Kurtzke, Neurology 33:1444，1983)。評(píng)估8個(gè)功能系統(tǒng)的神經(jīng)功能損傷的類(lèi)型和嚴(yán)重程度。簡(jiǎn)言之，治療之前，評(píng)估患者以下系統(tǒng)的損傷錐體、小腦、腦干、感官、腸和膀胱、視覺(jué)、大腦等。按確定的時(shí)間間隔進(jìn)行隨訪(fǎng)。評(píng)分范圍從0(正常)到10(由于MS死亡)。一個(gè)完整步驟的減少表明治療有效(Kurtzke, Ann. Neurol. 36:573-79, 1994)。也可使用本領(lǐng)域人員使用的其它標(biāo)準(zhǔn)診斷患者。將惡化定義為可歸因于MS并且伴有適當(dāng)?shù)男律窠?jīng)系統(tǒng)異常的新癥狀的出現(xiàn)(上述IFNB MS研究組)。另外,惡化必須持續(xù)至少24小時(shí)并且先于穩(wěn)定或改善至少30天。簡(jiǎn)言之，由臨床醫(yī)師給予患者標(biāo)準(zhǔn)的神經(jīng)學(xué)檢查。根據(jù)神經(jīng)病測(cè)定等級(jí)的變化，惡化為輕度、中度或重度(Sipe等，Neurology34:1368, 1984)。確定年惡化率和未惡化患者的比例。如果用于這些測(cè)量的任一項(xiàng)的治療組和安慰劑組之間未惡化或未復(fù)發(fā)患者的比率或比例存在統(tǒng)計(jì)上的顯著差異，認(rèn)為療法有效。另外，也可測(cè)量到第一次惡化的時(shí)間和惡化持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度。在這點(diǎn)上作為療法的有效性的測(cè)量方法是與對(duì)照組相比，治療組中到第一次惡化的時(shí)間或持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度的統(tǒng)計(jì)上的顯著差異。大于I年、18個(gè)月或20個(gè)月的無(wú)惡化或無(wú)復(fù)發(fā)期尤其顯著。也可使用本領(lǐng)域的任何方法估定功效，例如以估定MS的癥狀，包括使用單獨(dú)使用的定時(shí)步行測(cè)試或與其它標(biāo)準(zhǔn)的組合估定活動(dòng)性改善。

也可基于以下一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估施用第一藥劑和任選第二藥劑的功效通過(guò)有限稀釋確定的MBP反應(yīng)T細(xì)胞的頻率，MBP反應(yīng)T細(xì)胞系和克隆的增殖反應(yīng)，T細(xì)胞系和克隆對(duì)從患者確定的MBP的細(xì)胞因子性質(zhì)。通過(guò)反應(yīng)細(xì)胞的頻率降低、與天然胸苷相比并入改變肽的胸苷減少和TNF和IFN- α減少來(lái)表明功效。臨床測(cè)量包括I和2年間隔中的復(fù)發(fā)率，EDSS的變化，包括EDSS上從1. O單位的基線(xiàn)持續(xù)6個(gè)月進(jìn)展。在卡普蘭-邁耶曲線(xiàn)(Kaplan-Meier)上，持續(xù)失能進(jìn)展的延遲表示有效。其它標(biāo)準(zhǔn)包括MRI上Τ2圖像的面積和體積變化和通過(guò)釓增強(qiáng)圖像確定的病變次數(shù)和量。MRI可用于使用釓-DTPA-增強(qiáng)成像來(lái)測(cè)量活性病變(McDonald等Ann.Neurol. 36:14, 1994)或使用T2-加權(quán)技術(shù)來(lái)測(cè)量病變的位置和程度。簡(jiǎn)言之，獲得基線(xiàn)MRL·將相同成像平面和患者位置用于每個(gè)后續(xù)研究?？蛇x擇定位和成像順序以最大化病變檢測(cè)并促進(jìn)病變跟蹤。相同定位和成像順序可用于后續(xù)研究。MS病變的存在、位置和程度可由放射學(xué)家確定?？筛攀霾∽兊拿娣e并且逐片地加和病變的面積得出病變總面積?？蛇M(jìn)行3次分析新病變的證據(jù)、活性病變的出現(xiàn)率、病變面積的變化百分比(Paty等，Neurology43:665, 1993)?？赏ㄟ^(guò)與基線(xiàn)相比的個(gè)體患者或與安慰劑組相比的治療組的統(tǒng)計(jì)上的顯著改善來(lái)確定由于治療的改善?？捎帽疚乃龇椒ㄖ委煹呐c多發(fā)性硬化相關(guān)的示例性癥狀包括視神經(jīng)炎、復(fù)視、眼球震顫、視辨距不良、核間性眼肌麻痹、運(yùn)動(dòng)和聲音光幻視、幢孔傳入缺陷、輕癱、單肢輕癱、下肢輕癱、輕偏癱、四肢輕癱、麻痹、截癱、偏癱、四肢癱瘓、四肢麻痹、強(qiáng)直、構(gòu)音障礙、肌肉萎縮、痙攣、抽筋、張力減退、陣攣、肌陣攣、肌纖維顫搐、下肢不寧綜合征、足下垂、功能障礙性反射、感覺(jué)異常、麻木、神經(jīng)痛、神經(jīng)病和神經(jīng)源性疼痛、萊爾米特氏征(I' hermitte/ s)、本體感受功能障礙、三叉神經(jīng)痛、共濟(jì)失調(diào)、意向震顫、辨距不良、前庭共濟(jì)失調(diào)、眩暈、語(yǔ)言共濟(jì)失調(diào)、肌張力障礙、輪替運(yùn)動(dòng)障礙、尿頻、膀胱痙攣、弛緩性膀胱、逼尿肌-括約肌不協(xié)調(diào)、勃起功能障礙、性快感缺失、性冷淡、便秘、大便緊迫、大便失禁、抑郁、認(rèn)知功能障礙、癡呆、情緒波動(dòng)、情緒不穩(wěn)、欣快、復(fù)極綜合征、焦慮、失語(yǔ)癥、言語(yǔ)障礙癥、疲勞、uhthoff綜合征、胃食管反流和睡眠障礙。MS的每種情況展示了陳述和后續(xù)過(guò)程的若干模式的一種。最常見(jiàn)的是，MS首先自身表現(xiàn)為一系列發(fā)作，接著完全或部分緩解，如癥狀不可思議地減輕，只有在一段穩(wěn)定期后恢復(fù)。這稱(chēng)為復(fù)發(fā)緩解型(RR)MS。雖然癥狀存在臨時(shí)停滯或輕微減輕，但是原發(fā)進(jìn)展型(PP)MS特征在于臨床逐漸減退，無(wú)明顯緩解。繼發(fā)進(jìn)展型(SP)MS從復(fù)發(fā)緩解過(guò)程開(kāi)始，接著是后期原發(fā)進(jìn)展過(guò)程。罕見(jiàn)的是，患者可能有進(jìn)展復(fù)發(fā)型(PR)過(guò)程，其中疾病采取受急性發(fā)作打斷的漸進(jìn)式途徑。PP、SP和PR有時(shí)集中在一起并且稱(chēng)為慢性進(jìn)展型MS。少數(shù)患者經(jīng)歷惡性MS，定義為迅速且持續(xù)衰退，在疾病發(fā)作不久之后導(dǎo)致重大殘疾或甚至死亡?？赏ㄟ^(guò)施用本文所述的組合療法阻止或減速這種衰退。施用本文特寫(xiě)的抗α 4抗體對(duì)于減輕MS的一種或多種癥狀，例如上述一種或多種癥狀有效。例如，施用本文所述的抗α 4抗體可用于治療原發(fā)或繼發(fā)進(jìn)展型多發(fā)性硬化(分別為PPMS或SPMS)，并且用抗α 4抗體治療可對(duì)防止復(fù)發(fā)有效。除人類(lèi)研究外或在人類(lèi)研究之前，可使用動(dòng)物模型以評(píng)估使用兩種藥劑的功效。多發(fā)性硬化的示例性動(dòng)物模型為實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎(EAE)小鼠模型，例如(Tuohy等(J.1mmunol. (1988) 141:1126-1130)，Sobel 等(J.1mmunol. (1984) 132:2393-2401)，和Traugott (Cell Immunol. (1989) 119:114-129)中描述的(EAE)小鼠模型。在 EAE 誘導(dǎo)之前，可向小鼠施用本文所述的第一和第二藥劑。然后評(píng)估小鼠的特征標(biāo)準(zhǔn)以確定在模型中使用兩種藥劑的功效。抗體生成可通過(guò)體內(nèi)或體外方法，例如噬菌體展示生成與α-4結(jié)合的重組抗體。所述方法可用于供給抗a4CDR以用于本文所述CDR移植抗體中。另外，諸如噬菌體展示的方法可用于在本文公開(kāi)的種系骨架的情況下，例如通過(guò)骨架為種系骨架的庫(kù)選擇此類(lèi)⑶R。EP 239 400 (Winter等)描述了通過(guò)用來(lái)自另一物種的互補(bǔ)決定區(qū)取代一種物種的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(在指定可變區(qū)內(nèi))來(lái)改變抗體。與真正的嵌合抗體相比，CDR取代的抗體不太可能在人體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，因?yàn)镃DR取代的抗體含有相當(dāng)少的非人組分。(Riechmann 等，1988，Nature 332, 323-327 ；Verhoeyen 等，1988，Science239，1534-1536)。通常， 通過(guò)使用重組核酸技術(shù)將鼠抗體的⑶R取代至人抗體中的相應(yīng)區(qū)域以產(chǎn)生編碼所需經(jīng)取代抗體的序列。可添加所需同種型(通常對(duì)于CH而言為Yl并且對(duì)于CL而言為κ)的人恒定區(qū)基因片段并且重鏈和輕鏈基因可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中共同表達(dá)以生成可溶性抗體。大型非免疫噬菌體展示庫(kù)也可用于分離可使用標(biāo)準(zhǔn)噬菌體技術(shù)開(kāi)發(fā)為人治療劑的高親和力抗體(見(jiàn)，例如，Hoogenboom等(I998)Immunotechnology 4:1-20 ；和 Hoogenboom 等(2000)Immunol Today 2:371-8 ；U.S. 2003-0232333)。本文所述抗α 4抗體或抗體片段可識(shí)別在與同源配體(例如，VCAM-1或纖連蛋白)的結(jié)合中牽涉的α4亞單位的表位。本文所述抗體可抑制與一種或多種同源配體(例如，VCAM-1和纖連蛋白)的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，本文特寫(xiě)的抗體可與細(xì)胞(例如，淋巴細(xì)胞)上的VLA-4相互作用，但不引起細(xì)胞聚集。示例性的α 4結(jié)合抗體具有一個(gè)或多個(gè)CDR，例如本文公開(kāi)的特殊抗體的3個(gè)重鏈(HC) CDR和/或所有這3個(gè)輕鏈(LC) CDR，或總計(jì)與此類(lèi)抗體至少80、85、90、92、94、95、96、97、98、99%相同的⑶R。在一個(gè)實(shí)施方案中，Hl和Η2超變環(huán)具有與本文所述抗體相同的正則結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，LI和L2超變環(huán)具有與本文所述抗體相同的正則結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，HC和/或LC可變結(jié)構(gòu)域序列的氨基酸序列與本文所述抗體的HC和/或LC可變結(jié)構(gòu)域至少有70、80、85、90、92、95、97、98、99或100%同一性。HC和/或LC可變結(jié)構(gòu)域序列的氨基酸序列可與本文所述抗體的相應(yīng)序列有至少一個(gè)氨基酸，但不超過(guò)10、8、6、5、4、3或2個(gè)氨基酸不同。例如，差異可能主要或全部在骨架區(qū)內(nèi)。
HC和LC可變結(jié)構(gòu)域序列的氨基酸序列可由在高嚴(yán)格性條件下與本文所述核酸序列雜交的核酸序列或編碼本文所述可變結(jié)構(gòu)域或氨基酸序列的核酸序列編碼。在一個(gè)實(shí)施方案中，HC和/或LC可變結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)骨架區(qū)(例如，F(xiàn)R1、FR2、FR3和/或FR4)的氨基酸序列與本文所述抗體的HC和LC可變結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)骨架區(qū)至少有70、80、85、90、92、95、97、98、99或100%同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)重鏈或輕鏈骨架區(qū)(例如，HCFR1、FR2和FR3)與來(lái)自人種系抗體的相應(yīng)骨架區(qū)的序列至少有70、80、85、90、95、96、97、98或100%同一性。兩個(gè)個(gè)序列之間的“同源性”或“序列同一性”(在本文中術(shù)語(yǔ)可交換使用)的計(jì)算如以下進(jìn)行。為了最佳比較目的，比對(duì)序列(例如，可在第一和第二氨基酸的一個(gè)或兩個(gè)或核酸序列中引入空位以進(jìn)行最佳比對(duì)并且為了比較可忽略非同源序列)。使用具有Blossum 62打分矩陣的GCG軟件包中的GAP程序?qū)⒆罴驯葘?duì)確定為最高分，空位罰分為12，空位拓展罰分為4和移碼空位罰分為5。然后比較相應(yīng)氨基酸位置或核酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢帽慌c第二序列中相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則在該位置分子相同(如本文所使用的氨基酸或核酸“同一性”與氨基酸或核酸“同源性”等效)。2個(gè)序列之間的同一性百分比是序列共有相同位置的數(shù)量的函數(shù)。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“在高嚴(yán)格性條件下雜交”描述了雜交和洗滌的條件?？稍谕ㄟ^(guò)引用并入的 Current Protocols in Molecular Biology, Tohn ffiley&Sons, N.Y. (1989),6. 3. 1-6. 3. 6中找到進(jìn)行雜交反應(yīng)的指導(dǎo)。在該參考中描述了水性和非水方法并且可使用任一種。高嚴(yán)格性雜交條件包括在約45°C下于6X SSC中雜交，接著在65°C下用O. 2X SSC、0. 1%SDS洗滌一次或多次，或大體上相似的條件?？贵w產(chǎn)生抗體可在原核和真核細(xì)胞中產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體(例如，scFv)在酵母細(xì)胞中表達(dá)，例如畢赤酵母(Pichia)(見(jiàn)，例如,Powers等(2001) J.1mmunol. Methods251:123-35)、漢遜氏酵 母(Hanseula)或酵母屬(Saccharomyces)。在一個(gè)實(shí)施方案中，尤其是全長(zhǎng)抗體(例如，IgG)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。用于重組表達(dá)的示例性哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CH0細(xì)胞)(包括Urlaub和Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 77:4216-4220 中描述的 dhfr-CHO 細(xì)胞，與 DHFR選擇標(biāo)記一起使用，例如，如Kaufman和Sharp (1982)Mol. Biol. 159:601-621中所述)、淋巴細(xì)胞系(例如，NSO骨髓瘤細(xì)胞和SP2細(xì)胞)、C0S細(xì)胞、K562和來(lái)自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物)的細(xì)胞。例如，細(xì)胞為哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞。除編碼免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的核酸序列外，重組表達(dá)載體可能攜帶另外的核酸序列，例如調(diào)控宿主細(xì)胞中載體的復(fù)制(例如，復(fù)制起點(diǎn))和選擇標(biāo)記基因的序列。選擇標(biāo)記基因有助于對(duì)已經(jīng)引入了載體的宿主細(xì)胞的選擇(見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利No. 4，399，216、4，634，665和5，179，017)。示例性的選擇標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于有甲氨蝶呤選擇/擴(kuò)增的dhfr-宿主細(xì)胞)和neo基因(用于G418選擇)。在用于抗體(例如，全長(zhǎng)抗體或其抗原結(jié)合部分)的重組表達(dá)的示例性系統(tǒng)中，通過(guò)磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染將編碼抗體重鏈和抗體輕鏈的重組表達(dá)載體引入dhfr-CHO細(xì)胞。在重組表達(dá)載體中，抗體重鏈和輕鏈基因各自與增強(qiáng)子/啟動(dòng)子調(diào)控元件(例如，源自SV40、CMV、腺病毒等，例如CMV增強(qiáng)子/AdMLP啟動(dòng)子調(diào)控元件或SV40增強(qiáng)子/AdMLP啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件)操作性連接以驅(qū)動(dòng)基因的高水平轉(zhuǎn)錄。重組表達(dá)載體還攜帶了 DHFR基因，允許使用甲氨蝶呤選擇/擴(kuò)增來(lái)選擇已經(jīng)用載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。培養(yǎng)所選轉(zhuǎn)化體宿主細(xì)胞以允許抗體重鏈和輕鏈表達(dá)并且從培養(yǎng)基中回收完整抗體。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，選擇轉(zhuǎn)化珠，培養(yǎng)宿主細(xì)胞和從培養(yǎng)基中回收抗體。例如，可通過(guò)用蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G進(jìn)行親合色譜法分離一些抗體。例如，可使用本領(lǐng)域中已知的蛋白質(zhì)濃縮技術(shù)將純化ct 4結(jié)合抗體濃縮至約100mg/mL至約200mg/mL。抗體也可包括修飾，例如改變Fe功能的修飾，(例如)以減少或去除與Fe受體或與Clq或二者的相互作用。例如，人IgG4恒定區(qū)可在殘基228處具有Ser至Pro突變以固定鉸鏈區(qū)。圖5中提供了 IgG4Fc的氨基酸序列(鉸鏈+CH2+CH3結(jié)構(gòu)域)。在另一實(shí)例中，人IgGl恒定區(qū)可在一個(gè)或多個(gè)殘基處，例如殘基234和237的一處或多處(例如，根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利No. 5，648，260中的編號(hào))突變。其它示例性修飾包括在美國(guó)專(zhuān)利No. 5，648，260中描述的修飾。對(duì)于包括Fe結(jié)構(gòu)域的一些抗體而言，可將抗體產(chǎn)生系統(tǒng)設(shè)計(jì)為合成其中Fe區(qū)糖基化的抗體。在另一實(shí)例中，IgG分子的Fe結(jié)構(gòu)域在CH2結(jié)構(gòu)域中的天冬酰胺297處糖基化(見(jiàn)圖5)。該天冬酰胺是用雙觸角型寡糖修飾的位點(diǎn)。這種糖基化參與Fe Y受體和補(bǔ)體 Clq 介導(dǎo)的效應(yīng)功能(Burton 和 Woof (1992) Adv.1mmunol. 51:1-84 ；Jefferis 等(1998)Immunol. Rev. 163:59-76)。可在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生Fe結(jié)構(gòu)域，以適當(dāng)糖基化與天冬酰胺297相對(duì)應(yīng)的殘基。Fe結(jié)構(gòu)域也可包括其它真核翻譯后修飾。其它適合的Fe結(jié)構(gòu)域修飾包括W02004/029207中所述的修飾。例如，F(xiàn)e結(jié)構(gòu)域可為XmAb Fe (Xencor，Monrovia, CA)。Fe結(jié)構(gòu)域或其片段可在Fe Y受體(FcyR)結(jié)合區(qū)中具有取代，例如W005/063815中所述的結(jié)構(gòu)域和片段。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)e結(jié)構(gòu)域或其片段在新生兒Fe受體(FcRn)結(jié)合區(qū)中具有取代，例如W005047327中所述的結(jié)構(gòu)域和片段。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)e結(jié)構(gòu) 域?yàn)閱捂溁蚱淦位蚱湫揎椥问?，例如W02008143954中所述的單鏈。在本領(lǐng)域中已知并描述了其它適合的Fe修飾。抗體也可由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生。例如，美國(guó)專(zhuān)利No. 5，849，992描述了在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳腺中表達(dá)抗體的方法。將轉(zhuǎn)基因構(gòu)建為包括乳特異性啟動(dòng)子和編碼所關(guān)注抗體(例如，本文所述抗體)的核酸序列和分泌信號(hào)序列。此類(lèi)轉(zhuǎn)基因雌性哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的乳包括其中分泌的所關(guān)注抗體，例如本所述抗體?？蓮娜橹屑兓贵w，或?qū)τ谝恍?yīng)用，直接使用。例如，可用增強(qiáng)其在循環(huán)(例如，在血液、血清、淋巴、支氣管肺泡灌洗或其它組織)中的穩(wěn)定性和/或保持性(例如)至少1. 5、2、5、10或50倍的部分修飾抗體。例如，可使VLA-4結(jié)合抗體與聚合物連接，例如大體上非抗原性的聚合物(例如聚亞烷基氧化物或聚氧化乙烯)。適合的聚合物將大體上因重量而不同?？墒褂脭?shù)均分子量范圍為約200至約35，000道爾頓(或約1，000至約15，000和2，000至約12，500)的聚合物。例如，VLA-4結(jié)合抗體可與水溶性聚合物，例如親水性聚乙烯聚合物(例如，聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮)偶聯(lián)。此類(lèi)聚合物的非限制性列表包括聚亞烷基氧化物均聚物(例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇)、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物，條件是保持嵌段共聚物的水溶性。另外的有用聚合物包括聚氧化烯，例如聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧乙烯與聚氧丙烯的嵌段共聚物(Pluronics);聚甲基丙烯酸酯；卡波姆(carbomers)；帶支鏈或不帶支鏈的多糖，包括糖單體D-甘露糖、D和L-半乳糖、巖藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(例如，聚甘露糖醛酸或褐藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神經(jīng)氨酸，包括同多糖和雜多糖例如乳糖、支鏈淀粉、淀粉、羥乙基淀粉、直鏈淀粉、硫酸葡聚糖、葡聚糖、糊精、糖原或酸性粘多糖的多糖亞單位(例如透明質(zhì)酸)；糖醇的聚合物，例如聚山梨糖醇和聚甘露醇；肝素或肝磷脂(heparon)。示例性的第二藥劑在一些情況下，本文所述制劑，例如含有α -4結(jié)合抗體的制劑，包括第二藥劑，或與含有第二藥劑的制劑聯(lián)合施用。在一個(gè)實(shí)施方式中，α 4結(jié)合抗體和第二藥劑作為復(fù)合制劑提供，并且向受試者施用復(fù)合制劑。施用復(fù)合制劑前后，可能進(jìn)一步單獨(dú)施用一個(gè)劑量的α 4結(jié)合抗體制劑，并且然后施用一個(gè)劑量的含有第二藥劑的制劑，例如至少在施用復(fù)合制劑24小時(shí)前或24小時(shí)后。在另一實(shí)施方式中，抗體和第二藥劑作為單獨(dú)制劑提供，并且施用步驟包括序貫施用抗體和第二藥劑?？稍谕惶?例如，相互間隔I小時(shí)或至少3、6或12小時(shí)之內(nèi))或在不同日子提供序貫施用。通常，抗體和第二藥劑各自作為若干在時(shí)間上分開(kāi)的劑量施用?？贵w和第二藥劑各自根據(jù)一種方案施用。用于抗體和第二藥劑的一種或兩種的方案可能具有規(guī)律周期性。用于抗體的方案可具有不同于第二藥劑的方案的周期性，例如其中一種可比另一種更頻繁地施用。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體和第二藥劑的其中一種可每周施用一次而另一種每月施用一次。在另一實(shí)施方式中，抗體和第二藥劑的其中一種持續(xù)施用30分鐘以上但少于1、2、4或12小時(shí)的時(shí)間段，而另一種作為大藥丸施用。可通過(guò)任何適當(dāng)方法，例如經(jīng)皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)施用抗體和第二藥劑。在一些實(shí)施方案中，抗體和第二藥劑的每一種均按相同劑量施用，如同每一種均開(kāi)處方用于單一療法一樣 。在其它實(shí)施方案中，按等于或小于對(duì)于如果單獨(dú)施用的療效而言所需的量施用抗體。同樣，按等于或小于對(duì)于如果單獨(dú)施用的療效而言所需的量施用第二藥劑。用于與α 4結(jié)合抗體組合治療多發(fā)性硬化的第二藥劑的非限制性實(shí)例包括■干擾素，例如人干擾素β _la(例如，AVONEX 或Rebif '( ))和干擾素
3-lb(BETASER0NTM;在位置 17 經(jīng)取代的人干擾素 β ；Berlex/Chiron)；■醋酸格拉替雷(也稱(chēng)為共聚物1、Cop-1; COPAXONE ;Teva PharmaceuticalIndustries, Inc.)；■ Rituxan (利妥昔單抗)或另一種抗⑶20抗體，例如與利妥昔單抗競(jìng)爭(zhēng)或結(jié)合重疊表位的抗⑶20抗體；■雙輕蒽醌(mixtoxantrone) (N0VANTR0NE , Lederle)；■化學(xué)治療劑，例如克拉屈濱(clabribine) (LEUSTATIN )、硫唑嘌呤(MURAN K)、環(huán)磷酰胺(CYTOXAN )、環(huán)孢霉素-A、甲氨蝶呤、4-氨基吡啶和替扎尼定；■皮質(zhì)類(lèi)固醇，例如甲基強(qiáng)的松龍(MEDR0NE , Pfizer)、強(qiáng)的松；■免疫球蛋白，例如Rituxan (利妥昔單抗)；CTLA4Ig ;阿侖單抗(MabCAMPATH )或達(dá)利珠單抗(結(jié)合⑶25的抗體)；■他汀類(lèi)；和■ TNF 拮抗劑。醋酸格拉替雷是由隨機(jī)的氨基酸鏈-谷氨酸、賴(lài)氨酸、丙氨酸和酪氨酸(因此為GLATiramer)形成的蛋白質(zhì)?？墒褂肗-羧基氨基酸酐在溶液中按大約5份丙氨酸3份賴(lài)氨酸、1. 5份谷氨酸和I份酪氨酸的比例由這些氨基酸合成醋酸格拉替雷。另外的第二藥劑包括其它人細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因此的抗體或拮抗劑，例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-15、IL-16、IL-18, EMAP-11, GM-CSF, FGF 和 PDGF。還有其它示例性的第二藥劑包括細(xì)胞表面分子，例如⑶2、⑶3、⑶4、⑶8、⑶25、⑶28、⑶30、⑶40、⑶45、⑶69、⑶80、⑶86、⑶90或其配體的抗體。例如，達(dá)利珠單抗是可改善多發(fā)性硬化的抗⑶25抗體。還有其它示例性抗體包括提供本文所述藥劑的活性的抗體，例如接合干擾素受體(例如，干擾素β受體)的抗體。通常，在第二藥劑包括抗體的實(shí)施方式中，第二藥劑與除VLA-4外或除α 4整聯(lián)蛋白外的靶蛋白或VLA-4上除由第一藥劑識(shí)別的表位外的至少一個(gè)表位結(jié)合。還有其它示例性的第二藥劑包括FK506、雷帕霉素、嗎替麥考酚酯、來(lái)氟米特、非類(lèi)固醇抗炎藥物(NSAID)，例如磷酸二酯酶抑制劑、腺苷激動(dòng)劑、抗血栓劑、補(bǔ)體抑制劑、腎上腺素能藥劑、如本文所述干擾促炎性細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥劑、IL-1 β轉(zhuǎn)化酶抑制劑(例如，Vx740)、抗P7、PSGL、TACE抑制劑、T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(例如激酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑)、柳氮磺胺吡淀、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、如本文所述的可溶性細(xì)胞因子受體及其 衍生物、抗炎性細(xì)胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-13和TGF)。在一些實(shí)施方案中，第二藥劑可用于治療MS的一種或多種癥狀或副作用。此類(lèi)藥劑包括(例如)金剛烷胺、巴氯芬、罌粟堿、美其敏(meclizine)、羥嗪、磺胺甲惡唑、環(huán)丙沙星、多庫(kù)酯鈉、匹莫林、丹曲林、去氨加壓素、地塞米松、托特羅定、苯妥英、奧昔布寧、比沙可啶、文拉法辛、阿米替林、烏洛托品、氯硝安定、異煙肼、伐地那非、呋喃妥英、車(chē)前子親水膠、前列地爾、加巴噴丁、去甲替林、帕羅西汀、溴丙胺太林、莫達(dá)非尼、氟西汀、非那吡啶、甲基強(qiáng)的松龍、氨甲酰氮草、丙咪嗪、安定、西地那非、安非他酮和舍曲林。為小分子的許多第二藥劑的分子量在150至5000道爾頓之間。TNF拮抗劑的實(shí)例包括TNF(例如，人TNFa )的嵌合、人源化、人或體外生成的抗體(或其抗原結(jié)合片段)，例如D2E7 (人TNF α抗體，美國(guó)專(zhuān)利No. 6，258，562 ；BASF)、CDP_571/CDP-870/BAY-10-3356 (人源化抗 TNF α 抗體；Celltech/Pharmacia)、cA2 (嵌合抗 TNF α抗體；REMICADE ，Centocor);抗TNF抗體片段(例如，CPD870) ;TNF受體的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受體或其片段，例如75kdTNFR_IgG (75kD TNF受體-1gG融合蛋白，ENBREL ；Immunex ;見(jiàn)例如，Arthritis&Rheumatism(1994)第 37 卷，S295 ； J.1nvest. Med.(1996)第 44 卷，235A)、p55kdTNFR-1gG(55kD TNF 受體-1gG 融合蛋白(LENERCEPT ));酶拮抗劑，例如TNFa轉(zhuǎn)化酶(TACE)抑制劑(例如，a -磺酰基異羥肟酸衍生物，WO 01/55112和N-羥基甲酰胺TACE抑制劑Gff 3333、-005或-022)；和TNF_bp/s_TNFR(可溶性TNF結(jié)合蛋白；見(jiàn)例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第 39 卷，No. 9 (附錄)，S284 ；Amer.J. Physiol. -Heart and Circulatory Physiology (1995)第 268 卷，第 37-42 頁(yè))。
除第二藥劑外，也可能向受試者遞送其它藥劑。然而，在一些實(shí)施方案中，除α4結(jié)合抗體和第二藥劑外，未向受試者施用作為藥物組合物的蛋白質(zhì)或生物制劑。α 4結(jié)合抗體和第二藥劑可能是通過(guò)注射遞送的唯一藥劑。在第二藥劑為重組蛋白的實(shí)施方案中，α 4結(jié)合抗體和第二藥劑可能是向受試者施用的唯一重組藥劑，或至少是調(diào)節(jié)免疫或炎癥性反應(yīng)的唯一重組藥劑。還有其它實(shí)施方案中，單獨(dú)的α4結(jié)合抗體是向受試者施用的唯一重組藥劑或唯一生物制劑。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然與本文所述相似或等效的方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中，但是以下描述了適合的方法和材料。本文提到的所有公布、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和其它參考通過(guò)引用整體并入。如有沖突，以本說(shuō)明書(shū)，包括定義為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實(shí)施例僅為說(shuō)明性并不旨在限制。
實(shí)施例實(shí)施例1.奪體杭VLA-4杭體比人源化ΗΡ1/2審有效。對(duì)于VL鏈而言使用種系骨架IGKV4-1 (或設(shè)計(jì)LI和L2)或種系工程化ΑΑΗ7033.1 (設(shè)計(jì)L3)而對(duì)于VH而言使用種系骨架IGHVl-f構(gòu)建抗VLA-4抗體。這些抗體具有比美國(guó)專(zhuān)利No. 6，602，503中所述人源化HP1/2抗體更少的回復(fù)突變。重鏈變異圖1中將重鏈的3個(gè)變異序列顯示為設(shè)計(jì)HO、設(shè)計(jì)Hl和設(shè)計(jì)H2。每個(gè)設(shè)計(jì)的鼠HPI/2的⑶R移植到IGHVl-f骨架中。設(shè)計(jì)HO不包括骨架區(qū)的回復(fù)突變，而設(shè)計(jì)Hl和H2在骨架區(qū)序列中具有各種程度的回復(fù)突變以最優(yōu)化人源化抗體的親和力。輕鏈變異圖2中將輕鏈的4個(gè)變異序列顯示為設(shè)計(jì)L0、設(shè)計(jì)L1、設(shè)計(jì)L2和設(shè)計(jì)L3 (也稱(chēng)為L(zhǎng)0、L1、L2、L3)。每個(gè)設(shè)計(jì)的鼠HP1/2的⑶R移植到種系骨架中。IGKV4-1種系骨架用于設(shè)計(jì)L0、L1和L2，并且AAH70335種系工程化骨架用于設(shè)計(jì)L3。設(shè)計(jì)LO不包括骨架區(qū)的回復(fù)突變，而設(shè)計(jì)L1、L2和L3在骨架區(qū)中具有各種程度的回復(fù)突變以最優(yōu)化人源化抗體的親和力。競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定的結(jié)果示于表I和圖3中。在該實(shí)驗(yàn)中，將α 4 β I與試驗(yàn)mAb預(yù)孵育并且鼠HP1/2用作競(jìng)爭(zhēng)藥劑。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表示，具有輕鏈L2或L3的抗體比美國(guó)專(zhuān)利No. 6，602，503中描述的人源化抗體HuHPl/2更有效。結(jié)果示于下表I和圖3中?？贵w中做該項(xiàng)測(cè)定的重鏈(Hl)具有圖1所示的“設(shè)計(jì)H1”序列，而LI指圖2中的設(shè)計(jì)LI。表1.通過(guò)ELISA講行的竟?fàn)帨y(cè)定
權(quán)利要求
1.一種重組抗體分子或其α 4-結(jié)合片段，所述重組抗體分子或其α 4-結(jié)合片段包含含有來(lái)自IGKV4-1的受體序列的可變輕鏈骨架和含有來(lái)自IGHVl-f的受體序列的可變重鏈骨架，并且具有源自鼠抗體HP1/2或源自鼠抗體21. 6的重鏈和輕鏈CDR。
2.一種能夠結(jié)合α 4的重組抗體分子或其α 4-結(jié)合片段，所述重組抗體分子或其 α 4-結(jié)合片段包含含有來(lái)自種系工程化ΑΑΗ70335.1的受體序列的可變輕鏈骨架和含有來(lái)自IGHVl-f的受體序列的可變重鏈骨架。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組抗體分子或其α4-結(jié)合片段，所述重組抗體分子或其α 4-結(jié)合片段進(jìn)一步包含源自鼠抗體ΗΡ1/2的⑶R。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組抗體分子或其α4-結(jié)合片段，所述重組抗體分子或其α 4-結(jié)合片段進(jìn)一步包含源自鼠抗體21. 6的⑶R。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組抗體分子或其α4-結(jié)合片段，其中所述重鏈可變區(qū)包含 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4 或 SEQ ID NO:5 的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組抗體分子或其α4-結(jié)合片段，其中所述輕鏈可變區(qū)包含 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO: 10 的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組抗體分子或其α4-結(jié)合片段，其中所述輕鏈可變區(qū)包含 SEQ ID NO: 11 的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體，其中所述抗體結(jié)合VLA-4。
9.一種包含編碼抗體重鏈或其α 4-結(jié)合片段的DNA的載體，所述DNA包括SEQ ID Ν0:3、4或5的序列。
10.一種包含編碼抗體輕鏈或其α 4-結(jié)合片段的DNA的載體，所述DNA包括SEQ ID Ν0:8、9、10或11的序列。
11.一種制備重組抗α 4抗體或其α 4-結(jié)合片段的方法，所述方法包括(a)提供宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含(i)編碼抗體重鏈或其α4-結(jié)合片段的DNA序列，其中所述DNA序列包括SEQ ID NO: 3、4或5的序列，和(ii)編碼抗體輕鏈或其α 4-結(jié)合片段的DNA序列，其中所述DNA序列包括SEQ ID Ν0:8、9、10或11的序列，和(b)培養(yǎng)所述細(xì)胞以產(chǎn)生所述重組抗α4抗體分子或其α 4結(jié)合片段。
12.—種治療患者的方法，所述方法包括向所述患者施用根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述患者患有癌癥。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述患者患有實(shí)體瘤。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述患者患有血液惡性腫瘤。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述患者患有多發(fā)性骨髓瘤或急性骨髓性白血病(AML)。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述患者患有炎癥性病癥。
18.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述患者患有多發(fā)性硬化、哮喘、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、視神經(jīng)炎或克羅恩氏病。
19.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述患者患有急性病癥。
20.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述患者患有脊椎損傷或外傷性腦損傷。
21.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中按一種方案施用所述組合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括向所述患者施用第二治療劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述第二治療劑為血栓溶解劑、化學(xué)治療劑、神經(jīng)保護(hù)劑、抗炎劑、類(lèi)固醇、細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子。
全文摘要
本發(fā)明涉及α-4結(jié)合抗體及其片段。
文檔編號(hào)C07K16/28GK103038257SQ201180029674
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者A·A·魯格夫斯科伊, F·R·泰勒, K·麥克拉克蘭 申請(qǐng)人:比奧根艾迪克Ma公司