專利名稱：一種從靈芝子實(shí)體中高效制備靈芝酸a的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從靈芝子實(shí)體中高效制備靈芝酸A的方法。背景資料靈芝是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材之一，在我國(guó)具有悠久的藥用歷史，據(jù)《本草綱目》記載，靈芝能“治胸中結(jié)、溢心氣”，“入心生血、助心沖脈”，“安神”，“保神”，“益肺氣”，“益脾氣”，“益精氣”，“補(bǔ)肝氣”等，可用于治療多種疾病。我國(guó)靈芝資源豐富，據(jù)《真菌詞典》第八版記載， 全世界靈芝科有100種以上，我國(guó)已知靈芝屬69種，是世界靈芝科真菌物種多樣性最豐富的國(guó)家之一。目前的研究表明，靈芝的化學(xué)成分有多種，主要包括三萜類、多糖類、核苷類、呋喃類衍生物、留醇類、生物堿類、多肽氨基酸類、油脂類、無(wú)機(jī)離子、有機(jī)鍺等。其中，主要活性成分為三萜類和多糖類。靈芝三萜屬于高度氧化的羊毛留醇烷衍生物，目前已發(fā)現(xiàn)近二百種三萜類存在于靈芝中，其他植物中也含有三萜類，但是靈芝所含有的特殊三萜類(或稱 “靈芝酸”)為其他生物所沒(méi)有。三萜類靈芝酸具有廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、細(xì)胞毒性、 抗HIV-I型病毒、護(hù)肝、解毒等作用，誘導(dǎo)NADPH的作用、改善記憶力等功能等，因而具有良好的藥用前景。靈芝酸也是靈芝商品及靈芝制品質(zhì)量品質(zhì)保證的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，三萜類靈芝酸含量越高，靈芝產(chǎn)品質(zhì)量越好。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于靈芝三萜酸的研究主要集中在構(gòu)型、理化特征，生理活性以及新的三萜種類的發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)工藝和靈芝子實(shí)體、菌絲體，靈芝孢子等靈芝商品及各種靈芝制品的質(zhì)檢質(zhì)控方法標(biāo)準(zhǔn)等各個(gè)方面，而要對(duì)上述各方面進(jìn)行深入研究，就必須首先進(jìn)行分離純化，獲得靈芝三萜化合物的純品。目前對(duì)于靈芝酸分離純化方面的研究工作進(jìn)行得不多， 實(shí)驗(yàn)室中的各種三萜類物質(zhì)研究的標(biāo)準(zhǔn)品制備依然存在問(wèn)題；同時(shí)由于沒(méi)有相應(yīng)的工業(yè)化制備方法，無(wú)法將之應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)之中，嚴(yán)重制約了靈芝三萜類物質(zhì)的研究和生產(chǎn)應(yīng)用?，F(xiàn)有的關(guān)于分離純化的研究只是針對(duì)靈芝三萜類物質(zhì)極少量的分離，方法主要為使用硅膠柱層析法反復(fù)分離法，薄層色譜法，制備或半制備高效液相色譜法等。硅膠柱層析法反復(fù)分離法是目前靈芝酸分離純化最基本的方法，也是最主要的方法，但這種分離方法較為繁瑣，時(shí)間較長(zhǎng)，而且所使用的試劑都是有毒有機(jī)溶劑，所獲得的產(chǎn)品純度較低，不是最佳分離途徑；薄層色譜法分離效率不高，產(chǎn)率低，難以作為常規(guī)制備的有效方法使用。制備HPLC法用于制備靈芝酸是個(gè)很好的選擇，但是目前的HPLC法分析和制備多是采用梯度洗脫法，這給制備過(guò)程帶來(lái)諸多不便，尤其是需要進(jìn)行多次和反復(fù)制備的生產(chǎn)性制備，所使用的溶劑多為較為昂貴的乙腈和2%乙酸混合溶液，使得生產(chǎn)成本極為高昂，同時(shí)乙腈的毒性較強(qiáng)對(duì)操作者極為有害。另外當(dāng)前的制備方法中，樣品上樣量較低，單次制備需要較長(zhǎng)時(shí)間，生產(chǎn)效率低下。所分離的量只能滿足極少實(shí)驗(yàn)室中某些分析、實(shí)驗(yàn)之用，不能為大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)室，更不能為工廠所能接受。而高速逆流色譜(high-speed counter current chromatography, HSCCC)是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的新型液-液分配色譜技術(shù)。它是一種不用任何固態(tài)支撐體或載體的液液分配層析法，能夠完全排除固體載體導(dǎo)致的不可逆吸附和對(duì)樣品的玷污、失活、變性等影響，能實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜混合物中各組分的高純度制備量分離。目前，該法已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于天然產(chǎn)物、抗生素、食品、無(wú)機(jī)物等物質(zhì)的分離與純化，尤其是在植物活性成分的研究開(kāi)發(fā)方面顯示出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。而利用高速逆流色譜分離純化靈芝三萜類化合物的研究卻極少。本專利是利用高速逆流色譜設(shè)備的“制備”和可實(shí)現(xiàn)“色譜”行為的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)結(jié)合超臨界二氧化碳萃取技術(shù)對(duì)于靈芝三萜成分的高度選擇性，形成從靈芝三萜類化和物中單體成分靈芝酸A的高效制備工藝，以簡(jiǎn)化操作步驟，降低制備成本，為靈芝三萜類化合物的構(gòu)型、理化特征，生理活性等以及新的三萜種類的發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)工藝和靈芝子實(shí)體、菌絲體， 靈芝孢子等靈芝商品及各種靈芝制品的質(zhì)檢質(zhì)控方法標(biāo)準(zhǔn)等各個(gè)方面研究提供方便，使靈芝產(chǎn)業(yè)發(fā)展進(jìn)一步擴(kuò)大推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從靈芝子實(shí)體中高效制備靈芝酸A的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下設(shè)計(jì)方案一種從靈芝子實(shí)體中高效制備靈芝酸A的方法，它包括(1)采用超臨界二氧化碳萃取裝置萃取靈芝粉得超臨界(SFE)萃取物。(2)配制逆流色譜的溶劑體系為氯仿甲醇水，分離上、下相，分別作為逆流色譜的固定相和流動(dòng)相。( 將固定相、流動(dòng)相依次泵入逆流色譜儀，使體系充分平衡。(4)將SFE 萃取物溶解于甲醇中，由逆流色譜儀進(jìn)樣，同時(shí)調(diào)節(jié)紫外檢測(cè)器于254nm處，根據(jù)檢測(cè)器譜圖接收目標(biāo)成分，得HSCCC分離物。其中氯仿甲醇水體系的用量體積比為14 10 7 10。 具體實(shí)施例1.將IOOOg的靈芝片經(jīng)超微粉碎后，超臨界二氧化碳萃取儀(HA221-50-02，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司)于壓力50Mpa，溫度40°C條件下，萃取1. 0h，將所得萃取液于溫度60°C條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至漿狀，得到SFE萃取物，39. 6g。2.用高速逆流色譜儀(上海同田生物技術(shù)有限公司)分離SFE萃取物上樣量 15mg，甲醇溶解定容至10ml，溶劑體系及用量比為氯仿甲醇水=14 10 7 10(體積)，柱體積為300ml，轉(zhuǎn)速800rpm，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流速為2ml/min，固定相保留值64. 2%，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。操作步驟是按各種溶劑體積比配制溶劑體系，在分液漏斗中靜置分層，分離上、 下相，上相為固定相、下相為流動(dòng)相。先將固定相泵入逆流色譜儀，使逆流色譜儀的柱子中充滿固定相，然后將逆流色譜儀主機(jī)的轉(zhuǎn)速調(diào)至800 850r/min，泵入流動(dòng)相，當(dāng)出液口流出下相時(shí)，繼續(xù)泵液至體系充分平衡；由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，根據(jù)檢測(cè)器譜圖接收目標(biāo)成分。3.將HSCCC分離物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至漿狀，約ang，經(jīng)甲醇溶解后，HPLC定量分析HSCCC分離物中靈芝酸A的含量；HPLC的檢測(cè)條件為安捷倫LC1200高效液相色譜儀， 靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，色譜柱Z0RBAX SB-C18(4.6X150mm, 5um)，流動(dòng)相A 醋酸水溶液，B甲醇，A B = 40% 60% ；流速0. 5ml/min ；紫外吸收波長(zhǎng)2Mnm ；柱溫25°C ；進(jìn)樣量5ul。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明采用超臨界二氧化碳萃取儀和高速逆流色譜儀，并配以合適的溶劑體系，具有制備時(shí)間短，制備量大，效率高等特點(diǎn)，分離得到靈芝酸A，純度在95%以上。
權(quán)利要求
1.一種從靈芝子實(shí)體中高效制備靈芝酸A的方法，其特征在于它包括(1)采用超臨界二氧化碳萃取裝置萃取靈芝粉得SFE萃取物。( 配制逆流色譜的溶劑體系分離上、下相，分別作為逆流色譜的固定相、流動(dòng)相，溶劑體系由氯仿甲醇水組成；C3)將(1)得到 SFE萃取物溶解于甲醇中，由逆流色譜儀進(jìn)樣，調(diào)節(jié)紫外檢測(cè)器于254nm處，根據(jù)檢測(cè)器譜圖接收目標(biāo)成分，得HSCCC分離物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從靈芝子實(shí)體中高效制備靈芝酸A的方法，其特征在于 步驟O)中所述的溶劑體系氯仿、甲醇、水的體積比為14 10 7 10。
全文摘要
一種從靈芝子實(shí)體中高效制備靈芝酸A的方法，它包括(1)采用超臨界二氧化碳萃取裝置對(duì)靈芝粉進(jìn)行萃取得SFE萃取液。(2)配制逆流色譜的溶劑體系為氯仿∶甲醇∶水，分離上、下相，分別作為逆流色譜的固定相和流動(dòng)相。(3)將固定相泵入逆流色譜儀至主機(jī)出液口有液體流出，然后調(diào)轉(zhuǎn)速至800r/min，泵入流動(dòng)相，當(dāng)出液口流出下相時(shí)，繼續(xù)泵液至體系充分平衡；(4)將漿狀SFE萃取物溶解于甲醇中，進(jìn)樣，同時(shí)調(diào)節(jié)紫外檢測(cè)器于254nm處，根據(jù)檢測(cè)器譜圖接收目標(biāo)成分。采用超臨界二氧化碳萃取儀和高速逆流色譜儀，并配以合適的溶劑體系，具有制備時(shí)間短，制備量大，效率高等特點(diǎn)，分離得到靈芝酸A，純度在95％以上。
文檔編號(hào)C07J9/00GK102532231SQ20111044348
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者劉連強(qiáng), 周永斌, 唐柳, 張志軍, 李鳳美, 李淑芳, 王玫, 羅瑩, 訾惠君, 陳曉明, 魏雪生 申請(qǐng)人:天津市林業(yè)果樹研究所