專利名稱：一種提取藍(lán)萼香茶菜總二萜或藍(lán)萼甲素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥提取領(lǐng)域，涉及一種以藥材藍(lán)萼香茶菜為原材料制備藍(lán)萼香茶菜總二萜或藍(lán)萼甲素的方法。
背景技術(shù)：
藍(lán)萼香茶菜(Isodon japonica var glaucocalyx (Maxim) Hara)為唇形禾斗香茶菜屬植物，廣泛分布在我國的東北，華北，華東等地區(qū)；具有健胃、清熱解毒、活血、抗菌消炎等活性，用于治療胃炎，脘腹脹痛，肝炎初期，感冒發(fā)熱，乳腺炎、關(guān)節(jié)痛等。藍(lán)萼香茶菜主要含有藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素、藍(lán)萼丁素、藍(lán)萼戊素、glaucocalyxin F、 glaucocalyxin X，等對映-貝殼杉燒型二萜(參見Zhao Bao Xiang, et al. Two new diterpenoids from Rabdosia japonica var. glaucocalyx. Chinese Chemical Letters. 2008, 19: 852，曹露曄等，藍(lán)萼香茶菜研究進(jìn)展，云南中醫(yī)中藥雜志，2004，25 (3) :42.)。 藍(lán)萼香茶菜中的二萜類成分是其主要活性物質(zhì)，藍(lán)萼甲素可抑制卡西霉素刺激的兔血小板生成血小板活化因子，能抑制花生四烯酸誘導(dǎo)的兔血小板血栓素A2生成，并同時升高前列腺素E2，能顯著抑制ADP，AA，PAF等誘導(dǎo)的兔血小板聚集，顯著升高血小板內(nèi)cAMP水平(參見Zhang B, Long K. Effects of glaucocalyxin A on aggtegation and cAMP levels of rabbit platelets in vitro. Acta Pharmacologica Sinica 1993, 14 (4): 347.) 藍(lán)萼甲素對艾氏腹水癌有一定抑制作用，體內(nèi)對S180實體瘤抑制率達(dá)30. 4% (10mg/kg, 7天)，(參見張淑香等，藍(lán)萼甲素在體外對DNA，RNA和蛋白質(zhì)生物合成的影響，藥學(xué)情報通訊，1990，8 (3) 238.)。藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丁素、藍(lán)萼戊素、藍(lán)萼己素對A549 (人肺癌細(xì)胞)、L0V0 (人腸癌細(xì)胞)、6T-CEM (人T細(xì)胞白血病細(xì)胞)、HL-60 (人白血病細(xì)胞) 具有較強的細(xì)胞毒活性，可用于制備抗癌藥物(參見陳海生等，藍(lán)萼香茶菜中二萜類化合物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，專利號為200910044882. O的中國發(fā)明專利)；藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素、藍(lán)萼丁素、藍(lán)萼戊素和藍(lán)萼己素進(jìn)行了抗乙肝表面抗原和乙肝核心抗原試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們具有顯著的抗乙肝病毒活性，可用于制備抗乙肝病毒的藥物(參見陳海生等，藍(lán)萼香茶菜中二萜類化合物在制備抗肝炎病毒藥物中的應(yīng)用，專利號為200910044883. 5的中國發(fā)明專利)?，F(xiàn)有技術(shù)中，從藥材藍(lán)萼香茶菜中提取藍(lán)萼甲素的方法不僅步驟繁瑣，得率偏低， 普遍低于10%，而且由于采用對生物體具有毒性的溶劑，殘留的有毒溶劑不符合藥典要求， 具體包括以下步驟
( 采集藥材藍(lán)萼香茶菜地上部分并粉碎，在常壓下，用體積百分?jǐn)?shù)859Γ95%乙醇水溶液回流提取2 3次，每次回流提取2小時，合并提取液，減壓回收溶劑，至每毫升溶劑含原藥材3 IOg ；
G)用等體積的石油醚萃取三次，石油醚層棄去，水層再用等體積氯仿萃取三次，合并氯仿層并濃縮，得到氯仿萃取液；(3J向步驟 所得氯仿萃取液中加入硅膠攪拌均勻，減壓干燥，進(jìn)行硅膠柱層析；以氯仿甲醇200:1或氯仿甲醇100:1洗脫，以薄層層析對照，收集含有藍(lán)萼甲素的洗脫液，將洗脫液回收溶劑；
(4)以無水乙醇或甲醇反復(fù)結(jié)晶，得藍(lán)萼甲素，測試純度，計算得率。采用上述技術(shù)方案所得藍(lán)萼甲素的純度一般在90%以上，但得率一般為79Γ9%，而且過程中使用了有毒的溶劑，氯仿、甲醇，并且殘留的有毒溶劑會影響藍(lán)萼甲素作為藥物的使用，不符合藥典要求。公開號為CN 101914002的中國發(fā)明專利申請公開了一種藍(lán)萼甲素的提取方法， 提取、硅膠柱層析洗脫色素和雜質(zhì)、純化步驟，具體包括以下步驟
⑴采集原藥材藍(lán)萼香茶菜地上部分并粉碎，在常壓下，用體積百分?jǐn)?shù)75、0%乙醇水溶液回流提取2 3次，每次回流提取2 3小時，合并提取液，減壓除去部分溶劑，得濃縮提取液；
⑵向步驟⑴所得濃縮提取液中加入硅膠并攪拌均勻，減壓干燥，進(jìn)行硅膠柱層析以硅膠柱體積為1體積份，首先以2 3份體積份的洗脫液A洗脫脂溶性色素，再以4飛份體積份的洗脫液B洗脫雜質(zhì)，最后以1(Γ15份體積份的洗脫液C洗脫；收集洗脫液，濃縮后放置， 析出晶體；
其中，所述洗脫液A為石油醚和乙酸乙酯的混合物，并且按體積比，石油醚乙酸乙酯=8 1 ；所述洗脫液B為石油醚和乙酸乙酯的混合物，并且按體積比，石油醚乙酸乙酯=4 1 ；所述洗脫液C為石油醚和乙酸乙酯的混合物，并且按體積比，石油醚乙酸乙酯 =2:1;
)無水乙醇重結(jié)晶，得藍(lán)萼甲素晶體。經(jīng)上述方法得到的藍(lán)萼甲素的純度在95 100%，純度高，適于制備各種劑型，得率在10%以上，得率高，方法的重現(xiàn)性強，按照2010版藥典附錄中有機(jī)溶劑殘留測定方法測定，無有機(jī)溶劑殘留，并且適用的有機(jī)溶劑無毒性，符合2010版藥典要求。大孔吸附樹脂是一類不帶離子交換基團(tuán)的多孔性交聯(lián)聚合物，具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑。物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，比表面積大，吸附容量大，選擇性好，吸附速度快，解吸條件溫和，對有機(jī)物選擇性好，不受無機(jī)鹽類及其他強離子、低分子存在的影響，有利于吸附， 品種多，不同品種可吸附多種有機(jī)化合物，流體阻力較小，脫色能力高，再生處理方便、使用周期長、宜于構(gòu)成閉路循環(huán)、節(jié)省費用；同時還可減少產(chǎn)品的吸潮性，有效去除重金屬，解決中藥重金屬超標(biāo)的難題。目前主要用于中草藥的分離純化，如對藥材樣品的預(yù)處理、對單味中藥提取物的分離純化及對中藥復(fù)方提取物的分離純化，有的已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，具有廣闊的發(fā)展前景。(參見劉帥英等，赤芍中芍藥苷的大孔吸附樹脂純化研究，中草藥，2010， 41 (9) :1480.)
硅膠為不可重復(fù)使用的柱填料，化學(xué)分離純化藍(lán)萼甲素，硅膠用量大，成本較高，而大孔樹脂為可重復(fù)使用的柱層析填料，并且可以工業(yè)化生產(chǎn)，會大大降低成本。藍(lán)萼香茶菜中藍(lán)萼甲素及二萜具有顯著的藥理活性，但未見有文獻(xiàn)報道藍(lán)萼甲素及總二萜的大孔樹脂制備方法，有必要進(jìn)行制備工藝考察。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種提取藍(lán)萼香茶菜總二萜的方法。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種提取藍(lán)萼香茶菜總二萜的方法，包括提取、洗脫、脫色步驟，其中，
所述提取步驟為將藥材藍(lán)萼香茶菜地上部分粉碎，用乙醇水溶液回流提取，得到提取液，減壓回收溶劑，得濃縮提取液，所述每毫升濃縮提取液中含原藥材0. 5-lg ；
所述洗脫步驟為將所得濃縮提取液過大孔吸附樹脂，以50倍柱體積水洗脫色素，25 倍柱體積30%乙醇水溶液洗脫雜質(zhì)，30倍柱體積60%乙醇水溶液洗脫，收集此洗脫部分，回收溶劑，得到藍(lán)萼香茶菜二萜提取物。所述脫色步驟為將藍(lán)萼香茶菜二萜提取物溶于乙醇中，然后加入活性炭脫色，回收溶劑，干燥，得到藍(lán)萼香茶菜總二萜。上述技術(shù)方案中，脫色步驟是為了去除葉綠素等色素，提高得率。上述技術(shù)方案中，用乙醇水溶液回流提取的方法為在常壓下，用體積百分?jǐn)?shù) 55-70%乙醇水溶液回流提取廣3次，每次回流提取廣3小時，合并提取液。上述技術(shù)方案中，所述大孔吸附樹脂為非極性或弱極性的大孔吸附樹脂，包括 AB-8 型、DlOl 型、HPD-100、HPD-200A、HPD-200B、HPD-300、HPD-700、HPD-722 型，在使用前按現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行處理。上述技術(shù)方案中，洗脫步驟中，大孔樹脂質(zhì)量藥材質(zhì)量為1 1. 0-2. 7。上述技術(shù)方案中，洗脫步驟中，大孔樹脂柱直徑柱高為1 4-9。上述技術(shù)方案中，洗脫步驟中，大孔樹脂質(zhì)量柱體積為Img lmL。上述技術(shù)方案中，脫色步驟中，藍(lán)萼香茶菜二萜提取物的質(zhì)量和乙醇的體積比為 1 250-300。上述技術(shù)方案中，脫色步驟中，活性炭的質(zhì)量為藍(lán)萼香茶菜二萜提取物質(zhì)量的
1 5%。進(jìn)一步的技術(shù)方案中，取上述藍(lán)萼香茶菜總二萜，乙醇結(jié)晶，制備得到藍(lán)萼甲素， 純度90%以上，得率7%以上。因此，本發(fā)明同時又要求保護(hù)一種提取藍(lán)萼甲素的方法。采用本發(fā)明所述制備方法制備得到的藍(lán)萼甲素及總二萜可以用于制成片劑、膠囊劑、丸劑等劑型，應(yīng)用于復(fù)方或單方制劑。由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點
采用本發(fā)明所述制備方法得到的藍(lán)萼香茶菜總二萜含量高，藍(lán)萼甲素純度90%以上， 得率7%以上，此工藝操作簡單，無污染，可工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1是實施例一中藍(lán)萼甲素的純度分析色譜圖； 圖2是實施例二中藍(lán)萼甲素的純度分析色譜圖3是實施例三中藍(lán)萼甲素的純度分析色譜圖； 圖4是實施例五中藍(lán)萼甲素的氫譜分析圖； 圖5是實施例五中藍(lán)萼甲素的碳譜分析圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述 實施例一
取藍(lán)萼香茶菜地上部分100克，經(jīng)粉碎，在常壓回流提取裝置中，用體積分?jǐn)?shù)55%乙醇水溶液回流提取2次，每次回流提取2小時，合并提取液，減壓回收溶劑，至200毫升；經(jīng)過 80克HPD-100型大孔吸附樹脂(柱體積80毫升，大孔樹脂柱直徑2. 8厘米，大孔樹脂柱高13 厘米)，以50倍水洗脫色素，25倍體積分?jǐn)?shù)30%乙醇水溶液洗脫雜質(zhì)，30倍60%體積分?jǐn)?shù)乙醇水溶液洗脫，收集此洗脫部分，回收溶劑，得到藍(lán)萼香茶菜二萜提取物1. 65克。將藍(lán)萼香茶菜二萜提取物溶于430毫升乙醇中，向此溶液加入0. 08克活性炭脫色素，干燥，得到藍(lán)萼香茶菜總二萜1. 08克，含量41. 3%，2毫升乙醇結(jié)晶，得藍(lán)萼甲素0. 02克，其純度為95. 6%， 得率8%。上述技術(shù)方案中，藍(lán)萼甲素純度檢測方法為藍(lán)萼甲素2毫克，甲醇溶解定容到10 毫升，色譜柱為瑞典Kromasil C18 (4.6 mmX250 mm, 5 μ m)；流動相甲醇0. 1%磷酸 (70:30)；流速1 mL/min ；檢測波長231 nm ；進(jìn)樣量20 μ L ；柱溫30°C，檢測所得圖如液相色譜圖1所示，數(shù)據(jù)見下表
峰(Peak)保留時間面積尚度面積％拖尾因子12. 72611437274622. 0981. 16523. 61310559746151. 9370. 95935. 127520931342349295.5731. 04848. 2472134913230. 3920. 735總和5450631436892100.000實施例二
取藍(lán)萼香茶菜地上部分1000克，經(jīng)粉碎，在常壓回流提取裝置中，用60%乙醇回流提取 2次，每次回流提取3小時，合并提取液，減壓回收溶劑，至1500毫升，經(jīng)過600克DlOl型大孔吸附樹脂(柱體積600毫升，大孔樹脂柱直徑5. 5厘米，大孔樹脂柱高沈厘米，)，以50倍水洗脫色素，25倍30%乙醇洗脫雜質(zhì)，30倍60%乙醇洗脫，收集此洗脫部分，回收溶劑，得到藍(lán)萼香茶菜二萜提取物16. 72克。將藍(lán)萼香茶菜二萜提取物溶于4190毫升乙醇中，向此溶液加入0. 60克活性炭脫色素，干燥，得到藍(lán)萼香茶菜總二萜10. 16克，含量42. 0%, 35毫升乙醇結(jié)晶，得藍(lán)萼甲素0. 25克，其純度為95. 0%，得率9%。上述技術(shù)方案中，藍(lán)萼甲素純度檢測方法為藍(lán)萼甲素2毫克，甲醇溶解定容到10 毫升，色譜柱為瑞典Kromasil C18 (4.6 mmX250 mm, 5 μ m)；流動相甲醇0. 1%磷酸 (70:30)；流速1 mL/min ；檢測波長231 nm ；進(jìn)樣量20 μ L ；柱溫30°C，檢測所得圖如液相色譜圖2所示，數(shù)據(jù)見下表
峰(Peak)保留時間面積尚度面積％拖尾因子12. 68813760592023. 0261. 42523. 5267671141571. 6871. 02834. 988432050338974495. 0181. 12846. 6161221913120. 2691. 062總和4547037404415100.000 實施例三
取藍(lán)萼香茶菜地上部分10000克，經(jīng)粉碎，在常壓回流提取裝置中，用70%乙醇回流提
6取2次，每次回流提取2小時，合并提取液，減壓回收溶劑，至16000毫升，經(jīng)過6000克AB-8 型大孔吸附樹脂(柱體積6000毫升，大孔樹脂柱直徑10厘米，大孔樹脂柱高77厘米，)，以 50倍水洗脫色素，25倍30%乙醇洗脫雜質(zhì)，30倍60%乙醇洗脫，收集此洗脫部分，回收溶劑， 得到藍(lán)萼香茶菜二萜提取物170. 20克。將藍(lán)萼香茶菜二萜提取物溶于4190毫升乙醇中， 向此溶液加入5. 98克活性炭脫色素，干燥，得到藍(lán)萼香茶菜總二萜121. 83克，含量43. 2%， 50毫升乙醇結(jié)晶，得藍(lán)萼甲素2. 48克，其純度為96. 0%，得率8%。 上述技術(shù)方案中，藍(lán)萼甲素純度檢測方法為藍(lán)萼甲素2毫克，甲醇溶解定容到10 毫升，色譜柱為瑞典Kromasil C18 (4.6 mmX250 mm, 5 μ m)；流動相甲醇0. 1%磷酸 (70:30)；流速1 mL/min ；檢測波長231 nm ；進(jìn)樣量20 μ L ；柱溫30°C，檢測所得圖如液相色譜圖3所示，數(shù)據(jù)見下表
權(quán)利要求
1.一種提取藍(lán)萼香茶菜總二萜的方法，包括提取、洗脫、脫色步驟，其特征在于所述提取步驟為將藥材藍(lán)萼香茶菜地上部分粉碎，用乙醇水溶液回流提取，得到提取液，減壓回收溶劑，得濃縮提取液，每毫升濃縮提取液中含原藥材0. 5-lg；所述洗脫步驟為將所得濃縮提取液過大孔吸附樹脂，以50倍柱體積水洗脫色素，25 倍柱體積的濃度為體積百分?jǐn)?shù)30%乙醇水溶液洗脫雜質(zhì)，30倍柱體積的濃度為體積百分?jǐn)?shù) 60%乙醇水溶液洗脫，收集此洗脫部分，回收溶劑，得到藍(lán)萼香茶菜二萜提取物；所述脫色步驟為將藍(lán)萼香茶菜二萜提取物溶于乙醇中，然后加入活性炭脫色，回收溶劑，干燥，得到藍(lán)萼香茶菜總二萜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取藍(lán)萼香茶菜總二萜的方法，其特征在于，用乙醇水溶液回流提取的方法為在常壓下，用體積百分?jǐn)?shù)55-70%乙醇水溶液回流提取廣3次，每次回流提取廣3小時，合并提取液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取藍(lán)萼香茶菜總二萜的方法，其特征在于，所述大孔吸附樹脂為非極性或弱極性的大孔吸附樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取藍(lán)萼香茶菜總二萜的方法，其特征在于，所述大孔吸附樹脂包括 AB-8 型、DlOl 型、HPD-100、HPD-200A、HPD-200B、HPD-300、HPD-700、HPD-722 型。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取藍(lán)萼香茶菜總二萜的方法，其特征在于，洗脫步驟中，大孔樹脂質(zhì)量藥材質(zhì)量為1 1. 0-2. 7。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取藍(lán)萼香茶菜總二萜的方法，其特征在于，洗脫步驟中，大孔樹脂柱直徑柱高為1:4-9。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取藍(lán)萼香茶菜總二萜的方法，其特征在于，洗脫步驟中，大孔樹脂質(zhì)量柱體積為Img lmL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取藍(lán)萼香茶菜總二萜的方法，其特征在于，脫色步驟中，藍(lán)萼香茶菜二萜提取物的質(zhì)量和乙醇的體積比為1 250-300。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取藍(lán)萼香茶菜總二萜的方法，其特征在于，脫色步驟中，活性炭的質(zhì)量為藍(lán)萼香茶菜二萜提取物質(zhì)量的1 5%。
10.一種提取藍(lán)萼甲素的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1所述提取藍(lán)萼香茶菜總二萜的方法制備得到藍(lán)萼香茶菜總二萜，乙醇結(jié)晶，制備得到藍(lán)萼甲素。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥提取領(lǐng)域，公開了一種制備藍(lán)萼香茶菜總二萜或藍(lán)萼甲素的方法包括提取、洗脫、脫色步驟，將藥材藍(lán)萼香茶菜地上部分粉碎，在常壓下，用乙醇水溶液回流提取1~3次，合并提取液，減壓回收溶劑，得濃縮提取液；將所得濃縮提取液過已經(jīng)處理好的大孔吸附樹脂，50倍柱體積水洗脫色素，25倍柱體積30%乙醇洗脫雜質(zhì)，30倍柱體積60%乙醇洗脫，收集此洗脫部分，回收溶劑，得到藍(lán)萼香茶菜二萜提取物；將藍(lán)萼香茶菜二萜提取物溶于乙醇，加入活性炭脫色，回收溶劑，干燥，得到藍(lán)萼香茶菜總二萜，乙醇結(jié)晶，制備得到藍(lán)萼甲素。采用本發(fā)明所述制備方法得到的藍(lán)萼香茶菜總二萜含量高，藍(lán)萼甲素純度90%以上，得率7%以上。
文檔編號C07C49/743GK102389456SQ201110387128
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月29日
發(fā)明者吳雙慶, 姚士, 張健, 徐乃玉, 沈曉丹, 褚純雋 申請人:蘇州大學(xué)