專利名稱：一種分離胰島素單體和多聚體的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種分離胰島素單體和多聚體的方法，屬于儀器分析領域。
背景技術：
由于胰島素具有自我締合的特性。在不同的PH、溫度、離子強度等條件下，它能以單體、 二聚體、四聚體、六聚體或更高的聚集態(tài)存在。胰島素是一種變構(gòu)蛋白，去鋅胰島素在很大的濃度范圍內(nèi)以二聚體和四聚體的形式存在，較難以單體或六聚體存在。含兩個Zn2+的胰島素在很大的濃度范圍內(nèi)以二聚體和六聚體的形式存在，其所含的鋅離子對六聚體復合物的穩(wěn)定性和動力學性質(zhì)影響很大。在大多數(shù)溶液或胰島素制劑中，胰島素主要以六聚體形式存在，只有在濃度極稀(約10_9mol ·Ι^)，小于臨界聚集濃度的生理條件下，胰島素才完全解聚以單體活性形式存在。在中性pH7.0時，兩個鄰近的胰島素單體的B-M和B-沈之間通過氫鍵形成二聚體，三個二聚體能聚集成六聚體，鋅離子可加速六聚體形成，此時單體的含量小于0. 1%。因其不同聚集態(tài)的分子量的不同，利用電泳技術可將其分離成分子量大小不同的條帶。但常規(guī)電泳的分離分子量范圍有限，很難分離出胰島素這類小分子蛋白的單體。與普通凝膠電泳相比，梯度凝膠電泳的優(yōu)點在于蛋白質(zhì)在梯度凝膠中遷移，經(jīng)過的孔徑越來越小，直到凝膠的孔徑不能通透，這樣蛋白質(zhì)就被濃縮，集中在一個很窄的區(qū)帶中。利用這一很窄的區(qū)帶，可以分辨出小分子量及分子量相差較小的蛋白質(zhì)(胰島素的分子量約為 6KD)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種分離胰島素單體和多聚體的實驗方法。本發(fā)明的分離胰島素單體和多聚體的方法，包括下列步驟
(1)配置磷酸鹽緩沖液(PB)、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、Tris-HCl溶液和NaCl溶液，濃度均為 100-500mmol/L, pH 均為 4-8 ；
(2)稱取4份一定量的胰島素，分別溶于一定體積步驟(1)得到的四種溶液中，制成胰島素含量為0. 5-2mg/ml的4種樣品，使其充分溶解，分裝保存；
(3)步驟(2)所得的四種胰島素溶液中加入一定量的鋅和苯酚作為穩(wěn)定劑，使胰島素、 鋅和苯酚三者摩爾比為1: (21000 22000) (140 160)。(4)微量注射針上樣，進行梯度凝膠電泳，恒壓100 200v電泳30min 120min。為了進一步鑒定所分離開的胰島素單體和多聚體，還要包括如下步驟
(5)配制考馬斯亮藍或銀染顯色的各種試劑，進行凝膠染色；
(6)凝膠成像系統(tǒng)照相。步驟(2)中，對4種樣品，使用微型混合儀混合15min，37°C水浴lOmim，使其充分溶解。步驟(3)中，穩(wěn)定劑鋅和苯酚的配制條件為分別用去離子水溶解一定量的易溶于水的分析純鋅鹽和苯酚，最后定容，使得加入胰島素溶液前，鋅離子的濃度范圍為 0. 25 7. 5g/ml，苯酚的濃度范圍為1 5mg/ml。梯度電泳使用質(zhì)量體積濃度1 20%的聚丙烯酰胺梯度凝膠，冷卻電泳槽至10°C以下，并預電泳25min 45min。本發(fā)明以胰島素為實驗對象，分離和鑒定其單體、二聚體、六聚體等各種存在形式，其有益效果在于
(1)為進一步研究胰島素與糖尿病及阿爾茨海默癥的關系奠定了實驗基礎；
(2)探討了磷酸根離子對胰島素單體或多聚體存在形式的影響；
(3)為除胰島素以外的其它蛋白質(zhì)多聚體的分析研究、蛋白的磷酸化和去磷酸化研究、 阿爾茨海默癥等蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病的診斷與防治找出新的藥物干預手段等提供了新的思路；
(4)原材料來源廣泛，價格低廉，而梯度凝膠雖然價格較貴，但一次可上10個樣，對總體價格影響不太大，實驗方法簡單易操作。


圖1 Bis-Tris梯度膠電泳分離Img · πιΓ1胰島素在相同ρΗ7. 4，不同溶液介質(zhì)中的胰島素單體和多聚體電泳圖譜(采用考馬斯亮藍染色法)。圖2 Bis-Tris梯度膠電泳分離Img · πιΓ1胰島素在相同ρΗ7. 4，不同溶液介質(zhì)中的胰島素單體和多聚體電泳圖譜(采用銀染染色法)。具體實施方法
下面通過實施例進一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于下述實施例。實施例1 1.試劑和儀器
商品化的胰島素，4%_20%的NuPAGE Novex Bis-Tris預制凝膠，SeeBlue Plus2預染標準蛋白(IX)(蛋白Marker)，NuPAGE十二烷基硫酸鋰樣品溶液GX) (LDS)，十二烷基硫酸鈉(SDS)，三羥甲基氨基甲烷(1Tris-base )，2_ (N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)，乙二酰四乙酸 (EDTA)，考馬斯亮藍 R-250, NaH2PO4 · 2H20, Na2HPO4 · 12H20, NaCl，KH2PO4, HCl，NaOH 等均為國產(chǎn)分析純。微型梯度電泳槽、搖床、PH計、電泳儀、微型漩渦混合儀、電子分析天平、凝膠成像系統(tǒng)。2.溶液的配制 (1) IOOmmol/L 的 PB
A 液為 100mmol/L 的 NaH2PO4 · 2H20 稱取 1. 5600 g NaH2PO4 · 2H20，加去離子水定容至 IOOml ；
B 液為 IOOmmol/L 的 Na2HPO4 · 12H20 稱取 2. 2460 g Na2HPO4 · 12H20，加去離子水定容至 100ml。將19ml的A液與81ml的B液混合后即成IOOmmol/L PB0(2) 100mmol/L 的 PBS
稱取 8. OOOOgNaCl，0. 2000gKCl, 1. 4400g Na2HPO4 和 0. 2400gKH2P04,加去離子水定容至 100ml。(3) 1 OOmmo 1/L 的 Tris-HCl
① IOOmmol/L 的 Tris base 稱取 1. 2100g Tris base 用去離子水定容至 100ml。
②100mmol/L的HCl (IOOml)用移液管吸取0. 85ml濃HC1，加去離子水定容至 100ml。將IOOmmol/L HCl緩慢加入到IOOmmol/L Tris base中，邊加邊調(diào)PH值至7. 4，即為 100mmol/L 的 Tris-HCl。(4) IOOmmol/L 的 NaCl 溶液
稱取分析純NaCl 0. 6000g,用去離子水定容至100ml，其摩爾濃度為100mmol/L。(1) (2) (4)均用 10mmol/L 的此1、100讓01/1妝0!1，使用？!1計調(diào)節(jié)？!1值至7.4。(5) 20XNuPAGE SDS 電泳緩沖液的配制(貯備液)
稱取 9. 7600g MES, 6. 0600g Tris base, 1. OOOOg SDS，0.3000g EDTA，加超純水定容至 50ml (電泳前加950ml超純水即成1 X NuPAGE SDS電泳緩沖液)。(6)考馬斯亮藍染色試劑
①固定液(200ml)甲醇100ml，乙酸20ml，加去離子水定容至200ml。②考馬斯亮藍染色液(200ml):甲醇100ml，考馬斯亮藍R-250 0. lOOOg，乙酸 20ml，加去離子水定容至200ml，在加乙酸和超純水之前將R-250溶于甲醇。③脫色液(500ml)乙酸35ml，甲醇25ml，加去離子水定容至500ml。3.胰島素樣品溶液的制備
稱取4份0. OOlOg的胰島素，分別溶于Iml上述四種溶液中，制成胰島素含量為Img/ ml的4種樣品，使用微型混合儀混合15min，37°C水浴lOmim，使其充分溶解，然后四種胰島素溶液中各加入一定量的穩(wěn)定劑鋅和苯酚，使胰島素、鋅和苯酚三者的物質(zhì)的量摩爾比為 1:21000:140。4.胰島素蛋白梯度電泳步驟
(1)將NuPAGE預制膠從包裝袋拿出來，用去離子水沖洗凝膠，撕掉凝膠底部的膠帶，輕輕拔掉凝膠上部的梳子；
(2)用移液器吸取一定量IXNuPAGE SDS電泳緩沖液沖洗上樣孔2_3遍，倒置凝膠， 將電泳緩沖液輕輕甩出(必要時用濾紙吸干)；
(3)定向2塊凝膠，使其上樣孔(即低的一面)朝向緩沖區(qū)核心，將凝膠插入電泳槽底部， 向里推動張力楔，固定凝膠；
(4)在電泳槽中央倉倒入少量電泳緩沖液，檢查槽的封閉緊密性。如果發(fā)現(xiàn)電泳緩沖液從中央倉向外泄露，倒掉電泳緩沖液，重新檢漏，重新裝配裝置；
(5)檢漏完成后，將IX電泳緩沖液倒入電泳槽中央倉，裝滿。緩沖液要漫過上樣孔，冷卻裝置(即將電泳槽置于裝滿冰塊的容器里)，預電泳25 min.
(6)胰島素溶液樣品上樣量為5μ1 (所有樣品上樣前均經(jīng)過500-1000rpm離心處理 5-15min)，蛋白 Marker 上樣量為 10 μ 1 ；
(7)在中央倉外的槽倒入適量的IX電泳緩沖液，約600ml；
(8)冷卻裝置，恒壓200v電泳35min；
(9)電泳完后，用鑷子小心地從四周撬開凝膠塑料板，取出凝膠。5.蛋白染色(考馬斯亮藍染色)
(1)將聚丙烯酰胺凝膠放在塑料容器并以3-5倍的固定液覆蓋，在旋轉(zhuǎn)搖床中緩慢搖動2h。(2)傾去固定液，以考馬斯亮藍染色液覆蓋凝膠，并緩慢搖動4h。(3)傾去染色液，用約50ml固定液沖洗凝膠。(4)傾去固定液，以脫色液覆蓋凝膠，緩慢搖動，傾去脫色液，再加入新脫色液同時至獲得藍色條帶及干凈的背景(換液3-4次，脫色過夜可脫得比較干凈)。凝膠可放置在7% 乙酸或水中保存。(5) Bio-Profil凝膠成像系統(tǒng)給凝膠拍照(見圖1)。圖譜中以PB、PBS溶液為溶解介質(zhì)的胰島素樣品出現(xiàn)了胰島素單體條帶，以Tris-HCl溶液為溶解介質(zhì)的胰島素樣品出現(xiàn)了胰島素二聚體條帶，以生理鹽水為溶解介質(zhì)的胰島素樣品中出現(xiàn)三聚體條帶(因未見有關胰島素三聚體的文獻報道，故不確定該條帶是三聚體還是四聚體)，本實驗結(jié)果說明不同溶液介質(zhì)中胰島素多聚體存在穩(wěn)定性的差別，同時也證明了磷酸根離子具有抑制胰島素聚集成多聚體的作用。實施例2 1.試劑和儀器
商品化的胰島素，4%_18%的NuPAGE Novex Bis-Tris預制凝膠，SeeBlue Plus2預染標準蛋白(IX)，NuPAGE十二烷基硫酸鋰樣品溶液GX) (LDS)，十二烷基硫酸鈉(SDS)， 三羥甲基氨基甲烷(Tris-base)，2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)，乙二酰四乙酸(EDTA)JIHf 硫酸鈉(Νει2&03)，硝酸銀(AgNO3), K2CO3, NaH2PO4 · 2H20, Na2HPO4 · 12H20, NaCl，KH2PO4, HCl， NaOH等均為國產(chǎn)分析純。微型梯度電泳槽、搖床、PH計、電泳儀、微型漩渦混合儀、電子分析天平、凝膠成像系統(tǒng)。2.溶液的配制
(1) 500mmol/L 的 PB
A 液為 500mmol/L 的 NaH2PO4 · 2H20 稱取 7. 8000 g NaH2PO4 · 2H20，加去離子水定容至 100ml。B 液為 500mmol/L 的 Na2HPO4 · 12H20 稱取 11. 2300 g Na2HPO4 · 12H20,加去離子水定容至100ml。將19ml的A液與81ml的B液混合后即成500mmol/L PB。(2) 500mmol/L 的 PBS
稱取 40. OOOOgNaCl，1. OOOOgKCl，7. 2000g Na2HPO4 和 1. 2000gKH2P04，加去離子水定容至 100ml。(3) 500mmol/L 的 Tris-HCl
① 500mmol/L 的 Tris base 稱取 6. 0500g Tris base 用去離子水定容至 100ml。②500mmol/L的HCl (100ml)用移液管吸取4. 25ml濃HC1，加去離子水定容至 IOOml
將500mmol/L HCl緩慢加入到500mmol/L Tris base中，邊加邊調(diào)PH值至7. 4，即為 500mmol/L 的 Tris-HCl。(4) 500mmol/L 的 NaCl 溶液
稱取分析純NaCl 3. OOOOg,用去離子水定容至100ml，其摩爾濃度為500mmol/L。
(1) (2) (4)均用 10mmol/L 的 HC1、10(toimol/L 的 NaOH，使用 pH 計調(diào)節(jié) pH 值至
7. 4。(5) 20X NuPAGE SDS電泳緩沖液的配制(貯備液)
稱取 9. 7600g MES, 6. 0600g Tris base, 1. OOOOg SDS，0.3000g EDTA，加超純水定容至 50ml (電泳前加950ml超純水即成1 X NuPAGE SDS電泳緩沖液)。(6)銀染試劑
①凝膠固定液(500ml)甲醇200ml，醋酸50ml，加超純水定容至500ml。②敏化液(200ml)=Naj2O3 0. 0400g，加超純水定容至 200ml。③染色液(200ml) =AgNO3 0. 4000g，加超純水定容至200ml，福爾馬林0.(臨用前加)。④顯色液(200ml)=K2CO36. OOOOg, Na2S2O3 2. 5000g,加超純水定容至 200ml，福爾馬林0. 13細1(臨用前加)。⑤終止液(200ml) :Tris base 6g，醋酸20ml，加超純水定容至200ml。3.胰島素樣品溶液的制備
稱取4份0. OOlOg的胰島素，分別溶于Iml上述四種溶液中，制成胰島素含量為lmg/ml 的4種樣品，使用微型混合儀混合15min，37°C水浴lOmim，使其充分溶解。4.胰島素蛋白梯度電泳步驟
(1)將NuPAGE預制凝膠1從包裝袋拿出來，用去離子水沖洗凝膠，撕掉凝膠底部的膠帶，輕輕拔掉凝膠上部的梳子；
(2)用移液器吸取一定量IXNuPAGE SDS電泳緩沖液沖洗上樣孔2_3遍，倒置凝膠， 將電泳緩沖液輕輕甩出(必要時用濾紙吸干)；
(3)定向2塊凝膠，使其上樣孔(即低的一面)朝向緩沖區(qū)核心，將凝膠插入電泳槽底部， 向里推動張力楔，固定凝膠；
(4)在電泳槽中央倉倒入少量電泳緩沖液，檢查槽的封閉緊密性。如果發(fā)現(xiàn)電泳緩沖液從中央倉向外泄露，倒掉電泳緩沖液，重新檢漏，重新裝配裝置；
(5)檢漏完成后，將IX電泳緩沖液倒入電泳槽中央倉，裝滿。緩沖液要漫過上樣孔，冷卻裝置(即將電泳槽置于裝滿冰塊的容器里)，預電泳45 min.
(6)胰島素蛋白上樣量為20μ 1，蛋白Marker上樣量為15μ 1 ；
(7)在中央倉外的槽倒入適量的IX電泳緩沖液，約600ml；
(8)冷卻裝置，恒壓IOOv電泳90min；
(9)電泳完后，用鑷子小心地從四周撬開凝膠塑料板，取出凝膠。5.蛋白染色(銀染)
(1)將凝膠置于塑料容器中，加入50ml甲醛固定液，在旋轉(zhuǎn)搖床中緩慢搖動lOmin。(2 )傾去固定液，用純凈水洗2次，每次5min，緩慢搖動。(3)傾去水，凝膠浸泡在0. 2g/L硫代硫酸鈉溶液中Imin，緩慢搖動。(4)傾去硫代硫酸鈉溶液，用純凈水洗凝膠2次，每次20s。(5)傾去水，將凝膠浸泡在50ml 0. 1%硝酸銀中l(wèi)Omin，緩慢搖動。(6)傾去硝酸銀溶液，用純凈水洗膠，然后用小量體積的硫代硫酸鈉顯影液洗。(7)將凝膠浸泡在50ml新配制的硫代硫酸鈉顯影液中，緩慢搖動，直至獲得足夠的條帶顯色強度(約lmin)，在下一步停影前繼續(xù)顯影一會兒，或顯影到此為止。(8)每IOOml硫代硫酸鈉顯影液加入5ml 2. 3mol/L檸檬酸，緩慢搖動lOmin。(9)傾去液體，用純凈水洗凝膠，緩慢搖動lOmin。(10)傾去水，將凝膠浸泡在50ml干膠液中l(wèi)Omin。(11)將凝膠放在2張濕潤的透析膜之間，夾在玻璃平板中，平板中邊緣用夾子夾好，在室溫干燥過夜，次日用凝膠成像系統(tǒng)照相；或?qū)⒛z保存在去離子水中，做完銀染后立即用凝膠成像系統(tǒng)照相(見圖2)。圖片經(jīng)過反相處理，胰島素在四種溶液介質(zhì)(PB、PBS、 TriS-HCl、NaCl)中均有單鏈( 3KD)條帶出現(xiàn)，提示胰島素有可能被解鏈；胰島素在PB溶液中電泳出現(xiàn)的條帶比其它三種溶液(PBS、Tris-HCl, NaCl)多一條帶，即為胰島素二聚體 ( 12KD)的條帶。表明胰島素在PB溶液介質(zhì)中除大量存在胰島素單體外，也有少量的二聚體存在。在其它三種溶液中的胰島素則主要以單體形式存在。討論
實施例1顯示出了不同溶液介質(zhì)中胰島素多聚體存在穩(wěn)定性的差別，同時也證明了磷酸根離子具有抑制胰島素聚集成多聚體的作用，而實施例2中沒有體現(xiàn)出這些區(qū)別；此外實施例1采用考馬斯亮藍染色法，出現(xiàn)的條帶清晰、明了，實施例2采用銀染法出現(xiàn)的條帶較模糊，雖然銀染的靈敏度比考馬斯亮藍染色法要高，但由于銀染實驗步驟繁多且對實驗操作的要求也極高，故本實驗采用考馬斯亮藍染色法足以。
權(quán)利要求
1.一種分離胰島素單體和多聚體的方法，包括下列步驟(1)配置磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖鹽水、TriS-HCl溶液和NaCl溶液，濃度均為100— 500mmol/L，pH 均為 4一8 ；(2)稱取4份一定量的胰島素，分別溶于一定體積步驟(1)得到的四種溶液中，制成胰島素含量為0. 5—2mg/ml的4種樣品，分裝保存；(3)步驟(2)所得的四種胰島素溶液中加入一定量的鋅和苯酚作為穩(wěn)定劑，使胰島素、 鋅和苯酚三者摩爾比為1: (21000 22000) (140 160);(4)微量注射針上樣，進行梯度凝膠電泳，恒壓100 200v電泳35min 90min。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，對4種樣品，使用微型混合儀混合15min，37°C水浴lOmim，使其充分溶解。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，穩(wěn)定劑鋅和苯酚的配制條件為分別用去離子水溶解一定量的易溶于水的分析純鋅鹽和苯酚，最后定容，使得加入胰島素溶液前，鋅離子的濃度范圍為0. 25 7. 5g/ml，苯酚的濃度范圍為1 5mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，梯度電泳使用質(zhì)量體積濃度m 20% 的聚丙烯酰胺梯度凝膠，冷卻電泳槽至10°C以下，并預電泳25min 45min。
全文摘要
本發(fā)明運用梯度電泳分離胰島素單體和多聚體，其中在胰島素樣品溶液中加入了穩(wěn)定劑鋅和苯酚，使胰島素、鋅和苯酚三者摩爾比為1:(21000～22000):(140～160)。本實驗成功地建立了分離胰島素單體與多聚體梯度電泳檢測分析方法，為進一步研究胰島素與糖尿病及阿爾茨海默癥的關系奠定了實驗基礎，同時為除胰島素以外的其它蛋白質(zhì)多聚體的分析研究、蛋白的磷酸化和去磷酸化研究、阿爾茨海默癥等蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病的診斷與防治找出新的藥物干預手段等提供了新的思路。
文檔編號C07K1/26GK102276686SQ201110202209
公開日2011年12月14日 申請日期2011年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月19日
發(fā)明者田衛(wèi)群, 胡巧琳 申請人:武漢大學