專(zhuān)利名稱(chēng)：多特異性抗體、抗體類(lèi)似物、組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了特異性結(jié)合至少兩個(gè)不同表位的多特異性抗體。還提供了天然抗體的結(jié)構(gòu)性變體(抗體類(lèi)似物)。另外，提供了具有一系列生物學(xué)活性的多特異性抗體和抗體類(lèi)似物。提供了激動(dòng)劑及拮抗劑多特異性抗體和激動(dòng)劑及拮抗劑抗體類(lèi)似物。還提供了與治療劑和/或診斷劑綴合的多特異性抗體和抗體類(lèi)似物，還提供了與意在增加體內(nèi)半壽期的試劑綴合的多特異性抗體和抗體類(lèi)似物，與缺少這種試劑的多特異性抗體和抗體類(lèi)似物相比，所述試劑意在增加體內(nèi)半壽期。此外，提供了制造多特異性抗體及抗體類(lèi)似物和包含多特異性抗體及抗體類(lèi)似物的組合物的方法。也提供了多特異性抗體和抗體類(lèi)似物的治療用途、研究用途和診斷用途。背景單克隆抗體已經(jīng)為治療多種疾病提供了新療法，所述疾病包括癌癥、免疫學(xué)疾病和神經(jīng)學(xué)疾病并且還包括傳染病。Newsome, B. W.等人，Br JClin Pharmacol 66(1)6-19(2008) ；Chames, P.等人，Br J Pharmacol 157 (2) :220-33(2009) ；Dimitrov, D. S.等人，Methods Mol Biol 525 :1_27，xiii (2009)。這些療法已經(jīng)獲得成功，至少部分因?yàn)閱慰寺】贵w提供與靶蛋白的穩(wěn)健和強(qiáng)烈相互作用及單一特異性。單克隆抗體相對(duì)長(zhǎng)的體內(nèi)半壽期和穩(wěn)定性允許合乎需要的給藥方案，并且細(xì)胞介導(dǎo)的毒性可以由抗體的Fe區(qū)引起(Tabrizi, M. A.等人，Drug Discov Today 11(1-2) :81-8[2006])。在某些情況下，治療性抗體已經(jīng)用來(lái)通過(guò)結(jié)合于并中和分泌蛋白和細(xì)胞表面蛋白的重要功能區(qū)域而阻斷細(xì)胞信號(hào)。目前正在利用單克隆抗體的此類(lèi)基本特性來(lái)設(shè)計(jì)與傳統(tǒng)抗體相比作用機(jī)制不同的分子療法(Dimitrov，D. S.等人，Methods Mol Biol 525 1-27, xiii [2009]) 某些的此類(lèi)技術(shù)目前正處于臨床開(kāi)發(fā)中并且顯示有前景的跡象(Chames, P.等人，Br J Pharmacol 157 (2)220-33[2009])。例如，一種方法涉及使用抗體以遞送細(xì)胞毒性劑至腫瘤的細(xì)胞特異靶向法。Carter,P. J.等人，Cancer J 14(3) :154-69(2008) ；Junutula, J. R.等人，Nat Biotechnol26(8) :925-32(2008) ；Senter, P. D.，Curr Opin Chem Biol 13 (3) :235-44 (2009)。在這種情況下，單克隆抗體特異性引導(dǎo)細(xì)胞毒分子至靶細(xì)胞，從而在需要高毒性的情況下集結(jié)細(xì)胞毒部分的高毒性，同時(shí)對(duì)非靶細(xì)胞的影響最小化。此類(lèi)抗體-藥物綴合物允許增加殺死腫瘤細(xì)胞的效力，同時(shí)維持了使脫靶毒性最小化的給藥窗口。另一個(gè)實(shí)例是遞送如含有物質(zhì)如SiRNA的納米粒子和在粒子表面上包括單克隆抗體用于打革G的功能性復(fù)合物。Schiffelers, R. M.等人，Nucleic Acids Res 32(19)el49 (2004) ；Vornlocher, H. P.，Trends Mol Med 12(1) :1-3(2006) ；Davis, M. E.，MolPharm 6(3) :659-68 (2009)。又一個(gè)方法使用抗體的雙價(jià)結(jié)構(gòu)來(lái)構(gòu)建與兩個(gè)靶同時(shí)結(jié)合的雙特異性分子(Fischer, N.等人，Pathobiology 74 (I) :3_14 [2007])。雙特異性抗體為增加特異性、拓寬效力和利用不能以傳統(tǒng)單克隆抗體實(shí)現(xiàn)的新作用機(jī)制提供了機(jī)會(huì)。Drakeman，D. L. , Expert Opin Investig Drugs 6(9) 1169-78 (1997) ；Kontermann, R.E., ActaPharmacol Sin 26(1) :1-9(2005) ；Marvin, J. S.等人，Acta Pharmacol Sin 26(6)649-58(2005) ；Marvin, J. S.等人，Curr Opin Drug Discov Devel 9(2) :184-93(2006)；Shen, J.等人，J Biol Chem281 (16) 10706-14(2006) ；Chames, P.等人，Curr Opin DrugDiscov Devell2(2) :276-83 (2009)。用雙特異性抗體交聯(lián)兩個(gè)不同的受體以抑制信號(hào)傳導(dǎo)途徑已經(jīng)在眾多應(yīng)用中顯示了應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)例中，將細(xì)胞表面酪氨酸磷酸酶招募 至IgE受體復(fù)合物中以減少磷酸化IgE受體的活性(Jackman等人,J. Biol. Chem. 285 20850-20859(2010))。這種方法比阻斷配體結(jié)合位點(diǎn)更有效，原因是甚至在高濃度配體存在下，也出現(xiàn)雙特異性抗體抑制信號(hào)傳導(dǎo)。見(jiàn)上文。在通過(guò)雙特異性抗體同時(shí)結(jié)合兩個(gè)不同細(xì)胞類(lèi)型上的受體在腫瘤細(xì)胞附近實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞活化的情況下，雙特異性抗體招募細(xì)胞毒T細(xì)胞的用途也已經(jīng)顯示出臨床可能性。Bargou, R.，E.等人，Science 321(5891) :974-7(2008) ；Shekhar, C.，Chem Biol 15(9)877-8(2008) ；Baeuerle, P. A.等人，CancerRes 69(12) :4941-4(2009)。在一種方法中，開(kāi)發(fā)了具有結(jié)合Fe Y RIII的一條臂和與HER2受體結(jié)合的另一條臂的雙特異性抗體用于治療過(guò)量表達(dá)J1ER2抗原的卵巢腫瘤和乳腺腫瘤。(Hseih-Ma等人Cancer Research 52:6832-6839「19921 和 Weiner 等人 Cancer Research 53 :94-100[1993])。雙特異性抗體也可以介導(dǎo)T細(xì)胞殺傷。一般，雙特異性抗體將T細(xì)胞上的CD3復(fù)合物與腫瘤相關(guān)抗原連接。由連接至抗pl85HEK2的抗⑶3組成的完全人源化的F(ab' )2雙特異性抗體用來(lái)引導(dǎo)T細(xì)胞靶向以殺死過(guò)量表達(dá)HER2受體的腫瘤細(xì)胞。Shalaby等人，I. Exp. Med. 175(1)217(1992)。雙特異性抗體已經(jīng)在幾種早期階段臨床試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試，取得令人鼓舞的結(jié)果。在一個(gè)試驗(yàn)中，12位肺癌、卵巢癌或乳腺癌患者用輸注活化的T淋巴細(xì)胞來(lái)治療，其中所述打林巴細(xì)胞用抗CD3/抗腫瘤(M0C31)雙特異性抗體引導(dǎo)革巴向。deLei i等人BispecificAntibodies and TarReted Cellular Cytotoxicity(雙特異十生抗體矛口定向細(xì)胞十生細(xì)胞毒),Romet-Lemonne, Fanger 和 Segal 編著，Lienhart (1991)第 249 頁(yè)。被引導(dǎo)革巴向的細(xì)胞引起腫瘤細(xì)胞的明顯局部裂解、輕微炎癥反應(yīng)，但是沒(méi)有有毒副作用或抗小鼠抗體應(yīng)答。此外，雙特異性抗體可以用于傳染病的治療(例如，用于將效應(yīng)細(xì)胞靶向至病毒如HIV或流感病毒感染的細(xì)胞,或原生動(dòng)物如崗地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)感染的細(xì)胞)，用來(lái)遞送免疫毒素至腫瘤細(xì)胞，或?qū)⒚庖邚?fù)合物靶向至細(xì)胞表面受體。見(jiàn)，例如，F(xiàn)anger 等人，Crit. Rev. Immunol. 12 :101-124 (1992)。例如，就 HIV 感染而言，Berg 等人，PNAS (USA) 88 =4723-4727 (1991)制備了衍生自鼠CD4_IgG的雙特異性抗體-免疫黏附素嵌合體。這些作者構(gòu)建一種具有兩條臂的四聚體分子。一條臂由與抗體重鏈恒定域融合的CD4連同CD4與抗體輕鏈恒定域的融合物組成。另一條臂由抗CD3抗體的完整重鏈連同該抗體的完整輕鏈組成。借助所述CD4-IgG臂，這種雙特異性分子與細(xì)胞毒T細(xì)胞表面上的CD3結(jié)合。細(xì)胞毒細(xì)胞與HIV感染的細(xì)胞并置導(dǎo)致特異性殺死后一種細(xì)胞。已經(jīng)描述了用于合成多特異性抗體(包括雙特異性抗體)的眾多方法。用于合成二價(jià)抗體片段的方法已經(jīng)在WO 99/64460中描述。然而，這些方法中許多存在各種問(wèn)題。例如，已經(jīng)報(bào)道了蛋白質(zhì)表達(dá)與大規(guī)模生產(chǎn)、穩(wěn)定性及體內(nèi)半壽期、折疊和聚集方面的難題。Morimoto, K.等人，J TmmunoI Methods 224(1-2) :43-50(1999) ；Kriangkum,J.等人，Biomol Engl8(2) :31-40(2001) ；Segal, D. M.和 B. J. Bast (2001) " Productionof bispecific antibodies (雙特異性抗體的產(chǎn)生) " Curr Protoc Immunol 第 2 章第 213 單兀；Graziano, R. F.等人，Methods Mol Biol 283 :71-85(2004) ；Kontermann,R.E.等人，Methods Mol Biol 248 :227-42(2004) ；Das, D.等人，Methods Mol Med 109 329-46(2005) ；Fischer, N.等人，Pathobiology74(I) :3-14(2007) ；Shen, J 等人，JImmunol Methods 318(1-2) :65-74 (2007)。此外，這些方法中的許多方法繁瑣且費(fèi)時(shí)，因而限制了可以構(gòu)建和篩選所需活性的分子的數(shù)目和種類(lèi)。本文所述的方法解決了這些問(wèn)題， 并且本文所述的方法、組合物、多特異性抗體及抗體類(lèi)似物提供了額外的益處。本文中提到的全部參考文獻(xiàn)，包括專(zhuān)利申請(qǐng)和出版物，通過(guò)引用的方式完整并入本文用于任何目的。概述本發(fā)明的方法和組合物至少部分地基于開(kāi)發(fā)用于可靠和可重復(fù)地產(chǎn)生高純度多特異性抗體和抗體類(lèi)似物的方法。在某些實(shí)施方案中，可以容易地制備大量的多特異性或單特異組合并且對(duì)它們篩選所需的活性。在一個(gè)方面，基于令人驚訝和出人意料的以下研究結(jié)果提供了工程化抗體功能的新方法天然抗體的結(jié)構(gòu)性變體可以擁有廣譜的范圍從強(qiáng)力拮抗劑至強(qiáng)力激動(dòng)劑的生物學(xué)活性，伴有在其間變化水平的活性。在另一個(gè)方面，使用本文所述的方法，提供了從預(yù)存親本抗體獲得的多特異性抗體和抗體類(lèi)似物，它們擁有與親本抗體不相關(guān)的新功能。本文所述的方法和多特異性抗體和抗體類(lèi)似物至少部分地提供了用于產(chǎn)生、篩選、鑒定及開(kāi)發(fā)新治療劑和診斷劑的新方法以及研究工具。在一個(gè)方面，提供了合成多特異性抗體的方法，其中從具有第一單特異性和游離硫氫基的第一親本抗體獲得的第一抗體片段與巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑(thio-reactivecrosslinker)反應(yīng)以產(chǎn)生抗體片段-交聯(lián)劑部分，并且其中所述抗體片段_交聯(lián)劑部分與從具有第二單特異性和游離硫氫基的第二親本抗體獲得的第二抗體片段反應(yīng)以產(chǎn)生多特異性抗體，并且其中所述第一單特異性與第二單特異性不同。在某些實(shí)施方案中，第一親本抗體選自抗Herl和抗Her2。在某些實(shí)施方案中，第一親本抗體是抗Her2并且第二親本抗體是抗Herl，或者第一親本抗體是抗Herl并且第二親本抗體是抗Her2。在某些實(shí)施方案中，抗Her2選自赫賽汀 (曲妥珠單抗)和2C4(帕妥珠單抗)。在某些實(shí)施方案中，第一親本抗體是抗Her2并且第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :1、2、3、6和7的輕鏈序列和/或選自SEQ ID NOs. :4、5和8的重鏈序列。在某些實(shí)施方案中，抗Herl選自D1-5和C3-101。在某些實(shí)施方案中，第一親本抗體是抗Herl并且第一抗體片段包含選自SEQ IDNOs. :18、19、21和22的輕鏈序列和/或選自SEQ ID NOs. :17和20的重鏈序列。在某些實(shí)施方案中，抗Her2選自曲妥珠單抗和帕妥珠單抗，并且抗Herl選自D1-5和C3-101。在某些實(shí)施方案中，從抗Her2獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :1、2、3、6和7的輕鏈序列和/或選自SEQ ID NOs. :4、5和8的重鏈序列；并且從抗Herl獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :18、19、21和22的輕鏈序列和/或選自SEQ ID NOs. :17和20的重鏈序列。在上述方法的又一個(gè)方面，第一親本抗體選自抗Fe Y RIIb和抗Fe e RI a。在某些實(shí)施方案中，第一親本抗體是抗FcYRIIb并且第二親本抗體是抗Fe e RIa，或者第一親本抗體是抗Fee RI a并且第二親本抗體是抗Fe Y Rllb。在某些實(shí)施方案中，抗Fe Y RIIb是5A6。在某些實(shí)施方案中，第一親本抗體是抗Fe Y RIIb并且第一抗體片段包含選自SEQ IDNOs. 11和12的輕鏈序列和/或選自SEQ ID NOs. 9和10的重鏈序列。在某些實(shí)施方案中，抗Fee RI a是22E7。在某些實(shí)施方案中，第一親本抗體是抗Fe e RI a并且第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. : 15和16的輕鏈序列和/或選自SEQ ID NOs. : 13和14的重鏈序列。在某些實(shí)施方案中，從抗Fe Y RIIb獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :11和12的輕鏈序列和/或選自SEQ ID NOs. 9和10的重鏈序列；并且從抗Fe e RI a獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. : 15和16的輕鏈序列和/或選自SEQ ID NOs. :13和14的重鏈 序列。在又一個(gè)方面，所述巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑選自雙馬來(lái)酰亞氨基鹵、雙烷基鹵、吡啶基二硫化物、雙汞鹽、5-硫基-2-硝基苯甲酸介導(dǎo)的交聯(lián)和雙硫代磺酸酯。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述交聯(lián)劑是雙馬來(lái)酰亞胺。在某些實(shí)施方案中，第一抗體片段和/或第二抗體片段從半胱氨酸工程化抗體獲得。在某些此類(lèi)實(shí)施方案中，第一抗體片段和/或第二抗體片段是硫代Fab。在某些實(shí)施方案中，所述半胱氨酸工程化抗體包含在所述輕鏈的位置110或在位置205處的半胱氨酸置換，其中所述的殘基編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)。在某些實(shí)施方案中，所述半胱氨酸工程化抗體包含在所述重鏈的位置118或在位置121處的半胱氨酸置換，其中所述的殘基編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)。在某些實(shí)施方案中，第一抗體片段和/或第二抗體片段從天然抗體獲得，其中所述天然抗體用胃蛋白酶消化以產(chǎn)生F(ab' )2片段，其中所述F(ab' )2片段經(jīng)純化并且用還原劑并隨后用氧化劑在其中Fab重鏈和輕鏈之間的二硫鍵重新形成及鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基仍是未氧化的條件下處理。在另一個(gè)方面，提供了合成抗體類(lèi)似物的方法，其中具有游離硫氫基的第一抗體片段與巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑反應(yīng)以產(chǎn)生抗體片段-交聯(lián)劑部分，并且其中所述抗體片段-交聯(lián)劑部分與具有游離硫氫基的第二抗體片段反應(yīng)以產(chǎn)生所述抗體類(lèi)似物，并且其中所述第一抗體片段和所述第二抗體片段從單一親本抗體獲得。在某些實(shí)施方案中，所述抗體類(lèi)似物具有在結(jié)構(gòu)上與親本抗體的抗原結(jié)合區(qū)不同的抗原結(jié)合區(qū)。在某些實(shí)施方案中，所述親本抗體選自抗Herl、抗Her2、抗Fe e RI a和抗FcyRIIb。在某些實(shí)施方案中，抗Her2選自赫賽汀 (曲妥珠單抗)和2C4(帕妥珠單抗)。在某些實(shí)施方案中，所述親本抗體是抗Her2并且第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQID NOs. :1、2、3、6和7，和/或相同的重鏈序列，其中所述重鏈序列選自SEQ ID NOs. :4、5和8。在某些實(shí)施方案中，抗Herl選自D1-5和C3-101。在某些實(shí)施方案中，所述親本抗體是抗Herl并且第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs. :18、19、21和22，和/或相同的重鏈序列，其中所述重鏈序列選自SEQ IDNOs. :17和20。在某些實(shí)施方案中，抗Fe Y RIIb是5A6。在某些實(shí)施方案中，所述親本抗體是抗FcYRIIb并且第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs. :11和12，和/或相同的重鏈序列，其中所述重鏈序列選自SEQ ID NO.9和10。在某些實(shí)施方案中，抗Fe e RIa是22E7。在某些實(shí)施方案中，所述親本抗體是抗Fe e RI a并且第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs. :15和16，和/或相同的重鏈序列，其中所述重鏈序列選自SEQ ID NO. :13和14。在某些實(shí)施方案中，所述親本抗體是半胱氨酸工程化抗體。在某些實(shí)施方案中，所述親本抗體是天然抗體。在又一個(gè)方面，提供了如上合成多特異性抗體或抗體類(lèi)似物的方法，其中所述交聯(lián)劑是包含受保護(hù)的SH基團(tuán)的改性交聯(lián)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述改性交聯(lián)劑是雙馬來(lái)酰亞氨基-乙酰乙酸酯(BMata)。在某些實(shí)施方案中，包含所述改性交聯(lián)劑的多特異性抗體或抗體類(lèi)似物進(jìn)一步與包含官能團(tuán)的試劑反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，所述試劑選自聚乙二醇(PEG)、白蛋白結(jié)合肽(ABP)、熒光標(biāo)簽、放射成像劑、細(xì)胞毒性劑和siRNA。在某些實(shí)施方案中，包含所述改性交聯(lián)劑的多特異性抗體或抗體類(lèi)似物進(jìn)一步與PEG反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，所述 PEG 是 2000mw (2K) PEG、12，OOOmw (12K) PEG 和 20，OOOmw (20K) PEG。在又一個(gè)方面，提供了合成一組多特異性抗體的方法，其中從具有第一單特異性 和游離硫氫基的第一親本抗體獲得的第一抗體片段與巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑反應(yīng)以產(chǎn)生抗體片段-交聯(lián)劑部分，并且其中所述抗體片段-交聯(lián)劑部分與從與所述第一親本抗體具有不同單特異性的一個(gè)或多個(gè)親本抗體獲得的兩個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中每一者配對(duì)反應(yīng)，所述每個(gè)額外抗體片段具有游離硫氫基，以產(chǎn)生多特異性抗體組。在某些實(shí)施方案中，所述抗體片段-交聯(lián)劑部分與三個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者、或四個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者、或五個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者、或十個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者、或15個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者、或20個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者、或25個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者、或50個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者或100個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者配對(duì)反應(yīng)，在每種情況下，所述的額外抗體片段均從在每種情況下與第一親本抗體具有不同單特異性的一種或更多種親本抗體、或兩個(gè)或更多個(gè)親本抗體、或三種或更多種親本抗體、或四種或更多種親本抗體、或五種或更多種親本抗體、或十種或更多種親本抗體、或15種或更多種親本抗體、或20種或更多種親本抗體、或25種或更多種親本抗體、或50種或更多種親本抗體、或100種或更多種親本抗體中獲得。在某些實(shí)施方案中，第一親本抗體選自抗Herl、抗Her2、抗Fe e RIa和抗Fe Y Rllb。在某些實(shí)施方案中，第一抗體片段從抗Her2獲得并且所述兩個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者從抗Herl獲得，或第一抗體片段從抗Herl獲得并且所述兩個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者從抗Her2獲得，或者第一抗體片段從抗Fe e RI a獲得并且所述兩個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者從抗Fe y RIIb獲得，或第一抗體片段從抗Fe Y RIIb獲得并且所述兩個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者從抗Fee RI a獲得。在某些實(shí)施方案中，抗Her2選自赫賽汀藝(曲妥珠單抗)和2C4(帕妥珠單抗)。在某些實(shí)施方案中，抗Herl選自D1-5和C3-101。在某些實(shí)施方案中，抗Her2選自曲妥珠單抗和帕妥珠單抗，并且抗Herl選自D1-5和C3-101。在某些實(shí)施方案中，抗Fe Y RIIb是5A6。在某些實(shí)施方案中，抗Fee RI a是22E7。在某些實(shí)施方案中，抗Fe Y RIIb是5A6并且抗Fe e RI a是22E7。在某些實(shí)施方案中，所述巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑選自雙馬來(lái)酰亞氨基鹵、雙烷基鹵、吡啶基二硫化物、雙汞鹽、5-硫基-2-硝基苯甲酸介導(dǎo)的交聯(lián)和雙硫代磺酸酯。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑是雙馬來(lái)酰亞胺。在某些實(shí)施方案中，第一抗體片段和/或兩個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者從半胱氨酸工程化抗體獲得。在某些的此類(lèi)實(shí)施方案中，所述半胱氨酸工程化抗體包含在所述輕鏈的位置110或在位置205處的置換，其中所述的殘基編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)，并且其中所述置換是半胱氨酸。在某些實(shí)施方案中，所述半胱氨酸工程化抗體包含在所述重鏈的位置118或在位置121處的置換，其中所述的殘基編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)，并且其中所述置換是半胱氨酸。在仍就另一個(gè)方面，提供了合成一組抗體類(lèi)似物的方法，其中具有游離硫氫基的第一抗體片段與巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑反應(yīng)以產(chǎn)生抗體片段-交聯(lián)劑部分，并且其中所述抗體片段-交聯(lián)劑部分與兩個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段的每一者配對(duì)反應(yīng)，所述每個(gè)額外抗體片段具有游離硫氫基，以產(chǎn)生所述的抗體類(lèi)似物組，其中所述抗體片段的每一者從單一親本抗體獲得。在某些實(shí)施方案中，所述抗體片段-交聯(lián)劑部分與三個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者、或四個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者、或五個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者、或十個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者、或15個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者、或20個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者、或25個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者、或50個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者配對(duì)反應(yīng)，其中所述抗體片段的每一者從 單一親本抗體獲得。在某些實(shí)施方案中，所述組的一個(gè)或多個(gè)抗體類(lèi)似物有在結(jié)構(gòu)上與親本抗體的抗原結(jié)合區(qū)不同的抗原結(jié)合區(qū)。在某些實(shí)施方案中，所述親本抗體選自抗HerI、抗Her2、抗Fe e RIa和抗Fe Y RIIb。在某些實(shí)施方案中，抗Her2選自曲妥珠單抗和帕妥珠單抗。在某些實(shí)施方案中，抗Herl選自D1-5和C3-101。在某些實(shí)施方案中，抗Fe Y RIIb是5A6。在某些實(shí)施方案中，抗Fe e RIa是22E7。在某些實(shí)施方案中，所述巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑選自雙馬來(lái)酰亞氨基鹵、雙烷基鹵、吡啶基二硫化物、雙汞鹽、5-硫基-2-硝基苯甲酸介導(dǎo)的交聯(lián)和雙硫代磺酸酯。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑是雙馬來(lái)酰亞胺。在某些實(shí)施方案中，所述親本抗體是半胱氨酸工程化抗體。在某些的此類(lèi)實(shí)施方案中，所述半胱氨酸工程化抗體包含在所述輕鏈的位置110或在位置205處的置換，其中所述的殘基編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)，并且其中所述置換是半胱氨酸。在某些實(shí)施方案中，所述半胱氨酸工程化抗體包含在所述重鏈的位置118或在位置121處的置換，其中所述的殘基編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)，并且其中所述置換是半胱氨酸。在又一個(gè)方面，提供了通過(guò)下述方法合成的多特異性抗體，所述方法使得從具有第一單特異性和游離硫氫基的第一親本抗體獲得的第一抗體片段與巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑反應(yīng)以產(chǎn)生抗體片段-交聯(lián)劑部分，并且使得所述抗體片段-交聯(lián)劑部分與從具有第二單特異性和游離硫氫基的第二親本抗體獲得的第二抗體片段反應(yīng)以產(chǎn)生多特異性抗體，并且其中所述第一單特異性與第二單特異性不同。在某些實(shí)施方案中，第一親本抗體選自抗Her I和抗Her2。在某些實(shí)施方案中，第一親本抗體是抗Her2并且第二親本抗體是抗Herl，或者第一親本抗體是抗Herl并且第二親本抗體是抗Her2。在某些實(shí)施方案中，抗Her2選自赫賽汀 (曲妥珠單抗)和2C4(帕妥珠單抗)。在某些實(shí)施方案中，第一親本抗體是抗Her2并且第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :1、2、3、6和7的輕鏈序列和/或選自SEQ ID NOs.4、5和8的重鏈序列。在某些實(shí)施方案中，抗Herl選自D1-5和C3-101。在某些實(shí)施方案中，第一親本抗體是抗Herl并且第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. : 18、19、21和22的輕鏈序列和/或選自SEQ ID NOs. : 17和20的重鏈序列。在某些實(shí)施方案中，抗Her2選自曲妥珠單抗和帕妥珠單抗，并且抗Herl選自D1-5和C3-101。在某些實(shí)施方案中，從抗Her2獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :1、2、3、6和7的輕鏈序列和/或選自SEQ ID NOs.4、5和8的重鏈序列；并且從抗Herl獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :18、19、21和22的輕鏈序列和/或選自SEQ ID NOs. 17和20的重鏈序列。在上述多特異性抗體的又一個(gè)方面，第一親本抗體選自抗FcyRIIb和抗Fe e RIa。在某些實(shí)施方案中，第一親本抗體是抗Fe Y RIIb并且第二親本抗體是抗Fe e RIa，或者第一親本抗體是抗Fe e RIa并且第二親本抗體是抗Fe Y Rllb。在某些實(shí)施方案中，抗Fe Y RIIb是5A6。在某些實(shí)施方案中，第一親本抗體是抗Fe Y RIIb并且第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. 11和12的輕鏈序列和/或選自SEQ ID NOs. 9和10的重鏈序列。在某些實(shí)施方案中，抗Fe e RIa是22E7。在某些實(shí)施方案中，第一親本抗體是抗Fee RI a并且第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. : 15和16的輕鏈序列和/或選自SEQID NOs. :13和14的重鏈序列。在某些實(shí)施方案中，從抗Fe Y RIIb獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. : 11和12的輕鏈序列和/或選自SEQ ID NOs. :9和10的重鏈序列；并且從抗Fe e RI a獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. 15和16的輕鏈序列和/或選自SEQID NOs. 13和14的重鏈序列。
在又一個(gè)方面，提供了由如上文所述的方法合成的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體特異性結(jié)合T細(xì)胞上的靶，并且所述第二親本抗體特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞上的靶。在某些實(shí)施方案中，第一親本抗體是抗CD3，并且第二親本抗體選自抗BLRl、抗BR3、抗CD19、抗 CD20、抗 CD22、抗 CD72、抗 CD79A、抗 CD79B、抗 CD180、抗 CR2、抗 FCER2、抗 FcRHl、抗FcRH2、抗FcRH5、抗FCRL4、抗Her2、抗HLA-D0B和抗NAG14。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一親本抗體是抗CD3，并且第二親本抗體是抗CD19。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一親本抗體是抗CD3，并且第二親本抗體是抗CD20。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一親本抗體是抗CD3，并且第二親本抗體是抗CD22。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一親本抗體是抗CD3，并且第二親本抗體是抗FcRH5。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一親本抗體是抗CD3，并且第二親本抗體是抗Her2。在某些實(shí)施方案中，所述多特異性抗體展示多表位特異性。在某些實(shí)施方案中，所述多特異性抗體展示與所述親本抗體的每一者不可區(qū)分的一種或多種生物學(xué)活性。在某些實(shí)施方案中，所述多特異性抗體展示與所述親本抗體的至少之一者可區(qū)分的一種或多種生物學(xué)活性。在另一個(gè)方面，提供了通過(guò)下述方法合成的抗體類(lèi)似物，所述方法包括使具有游離硫氫基的第一抗體片段與巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑反應(yīng)以產(chǎn)生抗體片段-交聯(lián)劑部分，并且使所述抗體片段-交聯(lián)劑部分與具有游離硫氫基的第二抗體片段反應(yīng)以產(chǎn)生所述抗體類(lèi)似物，并且其中所述第一抗體片段和所述第二抗體片段從單一親本抗體獲得。在某些實(shí)施方案中，所述親本抗體選自抗Herl、抗Her2、抗Fe e RIa和抗FcyRIIb。在某些實(shí)施方案中，抗Her2選自赫賽?、?曲妥珠單抗)和2C4(帕妥珠單抗)。在某些實(shí)施方案中，所述親本抗體是抗Her2并且第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs. :1、2、3、6和7，和/或相同的重鏈序列，其中所述重鏈序列選自SEQID NOs. :4、5和8。在某些實(shí)施方案中，抗Herl選自D1-5和C3-101。在某些實(shí)施方案中，所述親本抗體是抗Herl并且第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs. :18、19、21和22，和/或相同的重鏈序列，其中所述重鏈序列選自SEQ ID NOs. : 17和20。在某些實(shí)施方案中，抗Fe Y RIIb是5A6。在某些實(shí)施方案中，所述親本抗體是抗FcYRIIb并且第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs. :11和12，和/或相同的重鏈序列，其中所述重鏈序列選自SEQ ID NO. :9和10。在某些實(shí)施方案中，抗Fe e RIa是22E7。在某些實(shí)施方案中，所述親本抗體是抗Fe e RI a并且第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs. :15和16，和/或相同的重鏈序列，其中所述重鏈序列選自SEQ ID NO. :13和14。在某些實(shí)施方案中，所述親本抗體是半胱氨酸工程化抗體。在某些實(shí)施方案中，所述親本抗體是天然抗體。在某些實(shí)施方案中，所述多特異性抗體展示與所述親本抗體不可區(qū)分的一種或多種生物學(xué)活性。在某些實(shí)施方案中，所述多特異性抗體展示與所述親本抗體可區(qū)分的一種或多種生物學(xué)活性。在某些實(shí)施方案中，所述生物學(xué)活性是細(xì)胞增殖作用。在某些實(shí)施方案中，所述抗體類(lèi)似物是表達(dá)Her2的細(xì)胞的拮抗劑，并且所述親本抗體是赫賽汀 (曲妥珠單抗)。在某些的此類(lèi)實(shí)施方案中，所述抗體類(lèi)似物選自雙Fab 1324、雙Fab 1328和雙Fab 1329。在某些實(shí)施方案中，所述抗體類(lèi)似物的生物學(xué)活性是拮抗的，并且所述親本抗體的生物學(xué)活性是激動(dòng)的。在某些實(shí)施方案中，所述抗體類(lèi)似物的生物學(xué)活性是激動(dòng)的，并且所述親本抗體的生物學(xué)活性是拮抗的。在某些實(shí)施方案中，所述抗體類(lèi)似物是表達(dá)Her2的細(xì)胞的激動(dòng)劑，并且所述親本抗體是赫賽汀 )(曲妥珠單抗)。在某些的此類(lèi)實(shí)施方案中，所述抗體類(lèi)似物選自雙Fab 1188、雙Fab 1321、雙Fab 1322、雙 Fab 1323 和雙 Fab 1325。在另一個(gè)方面，提供了包含一個(gè)或多個(gè)多特異性抗體的組合物。在某些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)多特異性抗體選自雙Fab 1187、雙Fabll89、雙Fab 1190、雙Fab1191、雙 Fab 1192、雙 Fab 1193、雙 Fab 1299、雙 Fab 1300、雙 Fab 1301、雙 Fab 1302、雙Fabl303、雙 Fab 1304、雙 Fab 1305、雙 Fab 1306 和雙 Fab 1307。在又一個(gè)方面，提供了包含一種或多種抗體類(lèi)似物的組合物。在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種抗體類(lèi)似物選自雙Fab 1188、雙Fab 1204、雙Fab 1321、雙Fab 1322、雙Fab 1323、雙 Fab 1324、雙 Fab 1325、雙 Fab 1326、雙 Fab 1327、雙 Fab 1328、雙 Fab 1329、雙 Fab 1400 和雙 Fabl401。在仍然另一個(gè)方面，提供治療癌癥的方法，其中將治療有效量的如上文所述的多特異性抗體施用至需要治療的受試者。在某些實(shí)施方案中，第一抗體片段是抗Her2，并且第二抗體片段是抗Herl。在某些實(shí)施方案中，抗Her2選自赫賽汀_ (曲妥珠單抗)和2C4 (帕妥珠單抗)。在某些實(shí)施方案中，抗Herl選自D1-5和C3-101。在某些實(shí)施方案中，第一抗體片段是抗⑶3，并且第二抗體片段選自抗BLRl、抗BR3、抗⑶19、抗⑶20、抗⑶22、抗⑶72、抗 CD79A、抗 CD79B、抗 CD 180、抗 CR2、抗 FCER2、抗 FcRHl、抗 FcRH2、抗 FcRH5、抗 FCRL4、抗Her2、抗HLA-DOB和抗NAG14。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一抗體片段是抗⑶3，并且第二抗體片段是抗CD19。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一抗體片段是抗CD3，并且第二抗體片段是抗CD20。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一抗體片段是抗CD3，并且第二抗體片段是抗CD22。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一抗體片段是抗CD3，并且第二抗體片段是抗FcRH5。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一抗體片段是抗⑶3，并且第二抗體片段是抗Her2。在另一個(gè)方面，提供了用于殺死腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞或抑制其增殖的方法，所述方法包括用某個(gè)量的如上文所述的多特異性抗體或其可藥用鹽或溶劑化物處理所述細(xì)胞，所述量有效殺死腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞或抑制其增殖。
提供了又一個(gè)方面，其包括用于治療自身免疫病或傳染病的方法，所述方法包括施用有效量的如上文所述的多特異性抗體或其可藥用鹽或溶劑化物至有需求的受試者。附圖簡(jiǎn)述圖I顯示用于合成如實(shí)施例I中所述的雙Fab的方法。小圖I，通過(guò)還原和氧化除去硫代加合物；小圖2，第一硫代Fab或鉸合部-cys-Fab與雙馬來(lái)酰亞氨基交聯(lián)劑的反應(yīng)；小圖3，通過(guò)大小排阻層析(SEC)分離含有交聯(lián)劑的單體種類(lèi)，小圖插頁(yè)；小圖4，單體性交聯(lián)種類(lèi)與第二硫代Fab或鉸合部-cys-Fab的反應(yīng),上半個(gè)小圖插頁(yè)顯示IOOkD雙Fab產(chǎn)物的質(zhì)譜結(jié)果和分離，下半個(gè)小圖插頁(yè)顯示通過(guò)SEC分離二聚體雙Fab ;小圖5，雙Fab終產(chǎn)物的示意圖，兩個(gè)不同的雙Fab，a VEGF/a Her2 (I)和a VEGF/a VEGF(2)，在非還原和還原(+DTT)條件下的SDS-PAGE分析結(jié)果。圖2顯示實(shí)施例2中所述的某些雙Fab的純度和某些生物學(xué)特性。(A)左側(cè)，某些雙Fab的示意圖和提供雙Fab鑒定編號(hào)及每個(gè)硫代Fab來(lái)源的表格；右側(cè)，該表中列出的雙 Fab的非還原SDS-PAGE分析結(jié)果；⑶上側(cè)小圖，NR-gD_EGFR細(xì)胞中TGFa刺激的EGFR磷酸化被某些雙Fab抑制，所述雙Fab含有衍生自抗EGFR抗體的Fab ;下側(cè)小圖，MCF7細(xì)胞中調(diào)蛋白誘導(dǎo)的Her3磷酸化被某些雙Fab抑制，所述雙Fab含有衍生自抗Her2抗體的Fab ；(C)比較所示雙Fab和Fab分子對(duì)MDA-175細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；⑶比較所示雙Fab、Fab和抗體分子對(duì)NR6-EGFR細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；(E)比較帕妥珠單抗和雙Fab 1204對(duì)MDA-175細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；(F)比較曲妥珠單抗、曲妥珠單抗-Fab和雙Fab 1188對(duì)BT474細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。圖3顯示如實(shí)施例3中所述的曲妥珠單抗衍生的雙Fab結(jié)構(gòu)性變體的產(chǎn)生和表征。(A)顯示硫代連接點(diǎn)的四種曲妥珠單抗衍生的Fab的示意圖(上半部分)和顯示每個(gè)雙Fab的獨(dú)特標(biāo)識(shí)及每個(gè)硫代Fab的來(lái)源的表格(下半部分)；(B)雙Fab的非還原SDS-PAGE ；(C)濃度變化的雙Fab對(duì)BT474細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；(D)雙Fab 1325(向上斜紋棒)與親本抗體赫賽汀_ (曲妥珠單抗)(空心棒)相比隨時(shí)間推移對(duì)BT474細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。向下斜紋棒是未處理的。圖4顯示如實(shí)施例3中所述的所示雙Fab的凝膠過(guò)濾分析結(jié)果。顯示了相對(duì)保留時(shí)間(橫軸)(RT)和流體動(dòng)力學(xué)半徑(Rh)。圖5顯示如實(shí)施例3中所述分析BT474細(xì)胞中Her2雙Fab和赫賽汀 (曲妥珠單抗)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的結(jié)果。(A)應(yīng)答于用赫賽?、?曲妥珠單抗)、激動(dòng)劑雙Fab 1325、拮抗劑雙Fabl329或gD處理的AKT磷酸化的ELISA分析結(jié)果；(B)探測(cè)用赫賽汀 (曲妥珠單抗)、激動(dòng)劑雙Fab 1325、拮抗劑雙Fab 1329或gD (pHER3、pAKT、pMAPK :磷酸特異性抗體；HER3、AKT、MAPK :非磷酸特異性抗體；微管蛋白對(duì)照)處理的BT474細(xì)胞中某些Her信號(hào)傳導(dǎo)途徑酶(HER3、AKT和MAPK)的磷酸化狀態(tài)的蛋白質(zhì)印跡分析；C)源自胰蛋白酶裂解Her2的磷酸化肽的表格。每種肽中磷酸化的目的殘基在肽序列中以粗斜字形的小體大寫(xiě)字母顯示。該表格還提供如通過(guò)絕對(duì)定量法(AQUA)或通過(guò)無(wú)標(biāo)記物定量法定量時(shí)，在無(wú)處理(基礎(chǔ))、用赫賽汀磐(曲妥珠單抗)處理、用激動(dòng)劑雙Fab 1325(雙Fab)處理或用IOnM調(diào)蛋白處理后，Her2中磷酸肽位點(diǎn)的總磷酸化作用的質(zhì)譜分析結(jié)果。數(shù)據(jù)代表了三個(gè)獨(dú)立生物學(xué)及技術(shù)重復(fù)的均數(shù)并且包括標(biāo)準(zhǔn)差(SD) ；(D)列出合成肽的表格，所述合成肽含有用于AQUA的重原子(AQUA肽)；“+13C” :AQUA肽中重碳原子的數(shù)目；“+15N” :AQUA肽中重氮原子的數(shù)目；“增加的質(zhì)量” =AQUA肽相對(duì)于天然肽質(zhì)量的總質(zhì)量增加；“重單同位素MH+ ”處于單一充電狀態(tài)下的重肽的總質(zhì)量;AQUA肽中含有重原子的殘基由大體大寫(xiě)的粗斜體加下劃線字母顯示；AQUA肽中的磷酸化位點(diǎn)由小體大寫(xiě)的粗斜體字母顯示；(E)三個(gè)處理組雙Fab 1325 (BF激動(dòng)劑，頂圖)、曲妥珠單抗(Here，中圖)和調(diào)蛋白(Hrg，底圖)的配對(duì)比較，每一個(gè)處理組與未處理比較。磷酸化位點(diǎn)沿底圖的橫軸顯示；平均磷酸化百分?jǐn)?shù)的差異沿每幅圖的縱軸顯示。圖6A和6B顯示增加濃度的所示雙Fab對(duì)來(lái)自表達(dá)Fe e RI a和Fe y RIIb的RBL細(xì)胞的組胺釋放的影響，這通過(guò)如實(shí)施例4中所述的ELISA測(cè)量。圖7顯示了如實(shí)施例5中所述的改性交聯(lián)劑BMata的合成⑷和用于合成PEG化雙Fab的總體方案⑶。圖8顯示了如實(shí)施例5中所述，經(jīng)修飾以含有大小變動(dòng)的PEG或ABP的雙FabC3-10IviloVHercvnoc 的 SDS-PAGE 分析(A)和 S-200 凝膠過(guò)濾分析(B)。圖9顯示了如實(shí)施例5中所述，未修飾(裸的)或經(jīng)修飾以含有大小變動(dòng)的PEG或ABP的雙Fab C3-101vlloc/Herc V11°G施用至小鼠(A)或裸大鼠⑶后的藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析。

圖10顯示了如實(shí)施例5中所述，純化的20K PEG-雙Fab2C4V1107Dl-5vll0C的SDS-PAGE分析(A)和使用Calu3細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制測(cè)定法(B)。圖11顯示如實(shí)施例5中所述的20K PEG-2C4v1107D1-5v110c雙Fab (雙硫代Fab)在SCID Beige小鼠中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。(A)血清濃度對(duì)時(shí)間的圖；(B)血清濃度/劑量對(duì)時(shí)間的圖。圖12顯示如實(shí)施例5中所述，20K PEG-2C4v11°7D1-5v110c雙Fab和每種親本抗體2C4和D1-5對(duì)Calu3異種移植小鼠模型中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。圖13顯示如實(shí)施例5中所述，20K PEG-2C4v11°7D1-5v110c雙Fab和每種親本抗體2C4和D1-5對(duì)Calu3異種移植小鼠模型中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，其中將所述的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)分析為腫瘤達(dá)到兩倍大小(2xVo)所花費(fèi)的時(shí)間。(A)Kaplan-Meier分析；(B)單因素分析。圖14顯示如實(shí)施例5中所述，20K PEG-2C4v11°7D1-5v110c雙Fab和每種親本抗體2C4和D1-5對(duì)Calu3異種移植小鼠模型中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，其中將所述的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)分析為腫瘤達(dá)到1500mm3體積所花費(fèi)的時(shí)間。(A)Kaplan-Meier分析；(B)單因素分析。某些實(shí)施方案的詳細(xì)描述現(xiàn)在將詳細(xì)地參照本發(fā)明的某些實(shí)施方案，所述實(shí)施方案的實(shí)例在隨附的結(jié)構(gòu)和式中說(shuō)明。盡管將結(jié)合列舉的實(shí)施方案描述本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解它們不意在將本發(fā)明限于這些實(shí)施方案。相反，本發(fā)明意圖涵蓋全部替代形式、修改和等同物，它們可以被包括于如權(quán)利要求書(shū)所定義的本發(fā)明范圍內(nèi)部。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)出與本文所述的那些方法和材料相似或等同的許多方法和材料，它們可以用于本發(fā)明的實(shí)施。本發(fā)明無(wú)論如何不限于所述的方法和材料。除非另外限定，本文中所用的技術(shù)與科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。Singleton等人,Dictionary of Microbiology and MolecularBiology第 2版，J. Wiley&Sons(New York,N. Y. 1994) ；March,Advanced Organic ChemistryReactions 第 4 版，John ffiley&Sons (New York, N. Y. 1992)和 Janeway, C. , Travers, P.，ffalport, M. , Shlomchik(2001) Immunobiology,第 4 版，Garland Publishing, New York 為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本申請(qǐng)中所用多個(gè)術(shù)語(yǔ)的一般指南。一些定義為了解釋本說(shuō)明書(shū)的目的，以下定義將適用，并且在適宜的任何時(shí)候，以單數(shù)使用的術(shù)語(yǔ)還將包括復(fù)數(shù)形式并且反之亦然。在下文所述的任何定義與通過(guò)引用方式并入本文的任何文獻(xiàn)抵觸的情況下，下文所述的定義應(yīng)當(dāng)起主導(dǎo)作用。當(dāng)本文中使用商品名稱(chēng)時(shí)，申請(qǐng)人意在獨(dú)立地包括該商品名稱(chēng)產(chǎn)品配方、通用的藥物和該商品名稱(chēng)產(chǎn)品的活性藥物成分。術(shù)語(yǔ)“抗體”在本文中以最廣意義使用并且指包含兩條重鏈和兩條輕鏈的任何免疫球蛋白(Ig)分子及其任何片段、突變體、變體或衍生物，只要它們顯示出合乎需要的生物學(xué)活性(例如，表位結(jié)合活性)。見(jiàn)，例如，Miller等人Jour, of Immunology 170 4854-4861 (2003)?？贵w的實(shí)例包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體、抗體類(lèi)似物和抗體片段?？贵w可以是鼠的、人的、人源化的、嵌合的或源自其他物種。本文中的抗體殘基根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)和EU編號(hào)系統(tǒng)編號(hào)。當(dāng)提到可變域中的殘基(大約第1-107位輕鏈殘基和第1-113位重鏈殘基)時(shí)，通常使用Kabat編號(hào)系統(tǒng)(例如，Kabat 等人，Sequences of Immunological Interest.第 5 版Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。當(dāng)提到免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)中的殘基時(shí)，通常使用“EU編號(hào)系統(tǒng)”或“EU索引”(例如，Kabat等人上文中報(bào)道的EU索引)?！叭鏚abat中那樣的EU索引”指人IgGl EU抗體的殘基編號(hào)法。除非本文中另外說(shuō)明，談及抗體的可變域中的殘基編號(hào)意指借助Kabat編號(hào)系統(tǒng)的殘基編號(hào)。除非本文中另外說(shuō)明，談及抗體的恒定域中的殘基編號(hào)意指借助EU編號(hào)系統(tǒng)的殘基編號(hào)。術(shù)語(yǔ)“多特異性抗體”在本文中以最廣意義使用并且特別地涵蓋具有多表位特異性的抗體。多特異性抗體包括但不限于包含重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域的其中所述Vh'單元具有多表位特異性的抗體；具有兩個(gè)或更多個(gè)\和Vh結(jié)構(gòu)域的其中每個(gè)Vh'單元與不同表位結(jié)合的抗體、具有兩個(gè)或更多個(gè)單一可變域而每個(gè)單一可變域與不同表位結(jié)合的抗體；全長(zhǎng)抗體；和包含一個(gè)或多個(gè)抗體片段的抗體以及包含已經(jīng)共價(jià)或非共價(jià)連接的抗體片段的抗體。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述多特異性抗體是以5 y M至0. 001pM,3u M至0. OOlpMU U M 至 0. 001pM、0. 5 y M 至 0. OOlpM、或 0. I y M 至 0. OOlpM 的親和力與每個(gè)表位結(jié)合的IgG抗體。術(shù)語(yǔ)“多表位特異性”指多特異性抗體與相同靶上或不同靶上的兩個(gè)或更多個(gè)不同表位特異性結(jié)合的能力。術(shù)語(yǔ)“單特異的”和“單特異性”指抗體僅結(jié)合一個(gè)表位的能力并且特別地涵蓋特異性結(jié)合祀分子的分子。術(shù)語(yǔ)“抗體類(lèi)似物”在本文中以最廣意義使用并且特別地涵蓋以單特異性特異地結(jié)合靶分子并且結(jié)構(gòu)上與天然抗體不同的分子?？贵w類(lèi)似物可以包含來(lái)自天然抗體的一個(gè)或多個(gè)抗體片段?？贵w類(lèi)似物包括但不限于包含重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(')的其中所述Vh'單元為單特異性的抗體類(lèi)似物；具有兩個(gè)或更多個(gè)\和Vh結(jié)構(gòu)域的其中每個(gè)Vh'單元對(duì)相同表位為單特異性的抗體類(lèi)似物、具有兩個(gè)或更多個(gè)單一可變域而每個(gè)單一可變域與相同表位結(jié)合的抗體類(lèi)似物、包含一個(gè)或多個(gè)抗體片段的抗體類(lèi)似物、包含已經(jīng)共價(jià)或非共價(jià)連接的抗體片段的抗體類(lèi)似物、和其中V1A單元、單一可變域和/或抗體片段在構(gòu)型上與天然抗體不同的抗體類(lèi)似物?！翱贵w片段”包含完整抗體的一部分，一般是完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變域?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab/ )2、Fv、雙體抗體(diabodies，Db);串聯(lián)雙體抗體(taDb)、線性抗體(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，641，870,實(shí)施例2 ;Zapata等人，ProteinEng. 8 (10) 1057-1062 (1995));單臂抗體、單一可變域抗體、微型抗體(minibodies)(Olafsen 等人(2004) Protein Eng. Design&Sel. 17 (4) :315_323)、單一鏈抗體分子、由Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(抗Id)抗體、CDR(互補(bǔ)決定區(qū))和表位結(jié)合片段。術(shù)語(yǔ)“Fab”指由一條完整L鏈((' 和Q)連同一條H鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(Vh)和一條重鏈的第一恒定域(ChI)組成的抗體片段。完整抗體的木瓜蛋白酶消化法可以用來(lái)產(chǎn)生兩個(gè)Fab片段，其中每一者含有單一抗原結(jié)合位點(diǎn)。一般，由木瓜蛋白酶消化法產(chǎn)生的Fab的L鏈和H鏈片段由一個(gè)鏈間二硫鍵連接。
術(shù)語(yǔ)“Fe”指包含由二硫鍵維持在一起的兩條H鏈的羧基端部分(Ch2和CH3)和一部分鉸鏈區(qū)的抗體片段?？贵w的效應(yīng)子功能由Fe區(qū)中的序列決定；該區(qū)域還是由某些類(lèi)型細(xì)胞上存在的Fe受體(FcR)識(shí)別的部分。一個(gè)Fe片段可以通過(guò)木瓜蛋白酶消化完整抗體而獲得。術(shù)語(yǔ)“F(ab' )2”指通過(guò)胃蛋白酶消化完整抗體所產(chǎn)生的抗體片段。F(ab' )2片段含有由二硫鍵維持在一起的兩個(gè)Fab片段和部分鉸鏈區(qū)。F(ab' )2片段具有二價(jià)抗原結(jié)合活性并且能夠交聯(lián)抗原。術(shù)語(yǔ)Fab'指作為還原F(ab' )2片段的產(chǎn)物的抗體片段。Fab'片段因在ChI結(jié)構(gòu)域的羧基端處具有額外幾個(gè)殘基(包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸)而與Fab片段不同。Fab' -SH在本文中是其中恒定域的半胱氨酸殘基攜帶游離巰基的Fab'的名稱(chēng)。術(shù)語(yǔ)“鉸鏈區(qū)”指從人IgGl的Glu216延伸至Pro230的抗體部分(Burton,Molec.Immunol. 22 :161-206 (1985))。其他IgG同種型的鉸鏈區(qū)可以通過(guò)在相同位置放置形成重鏈間S-S鍵的第一和最末半胱氨酸殘基與IgGl序列比對(duì)。術(shù)語(yǔ)“Fv”指由處于緊密、非共價(jià)締合的一個(gè)重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體組成的抗體片段。貢獻(xiàn)用于抗原結(jié)合的氨基酸殘基并向該抗體賦予抗原結(jié)合特異性的6個(gè)高變環(huán)(分別來(lái)自H和L鏈的3個(gè)環(huán))源自這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的折疊。然而，甚至單一可變域(或包含對(duì)一個(gè)抗原特異的僅3個(gè)CDR的半個(gè)Fv)具有識(shí)別并結(jié)合抗原的能力，雖然經(jīng)常以小于完整結(jié)合部位的親和力進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“單一鏈Fv”，也縮寫(xiě)為“sFv”或“scFv”，指抗體片段，其包含連接為單條多肽鏈的Vh和\抗體結(jié)構(gòu)域。一般，scFv多肽還包含在Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，所述多肽接頭能夠使scFv形成合乎需要的結(jié)構(gòu)用于抗原結(jié)合。關(guān)于scFv的綜述，見(jiàn) Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg 和Moore 編著，Springer-Verlag, New York,第 269-315 頁(yè)(1994) ;Malmborg 等人，J. TmmunoI.Methods 183 :7-13,1995。術(shù)語(yǔ)“雙體抗體”指通過(guò)以下方式制備的小抗體片段構(gòu)建在￥11結(jié)構(gòu)域和'結(jié)構(gòu)域之間具有短接頭(一般約5-10個(gè)殘基)的scFv片段，從而實(shí)現(xiàn)V結(jié)構(gòu)域的鏈間而非鏈內(nèi)配對(duì)，產(chǎn)生雙價(jià)片段，即具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的片段。雙特異性雙體抗體是兩個(gè)“交叉” sFv片段的異源二聚體，其中這兩個(gè)抗體的Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域存在于不同的多肽鏈上。示例性雙體抗體是在例如 EP 404,097 ；WO 93/11161 ;和 Hollinger 等人，Proc Natl Acad SciUSA 90 :6444-6448(1993)中描述。術(shù)語(yǔ)“單臂抗體”指這樣的抗體，其包含(I)由肽鍵將可變域接合至多肽，所述多肽包含CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域或CH2-CH3結(jié)構(gòu)域，和(2)缺少可變域的第二 CH2、CH3或CH2-CH3結(jié)構(gòu)域。單臂抗體可以包含3種多肽⑴包含可變域(例如，VH)、CH1、CH2和CH3的第一多肽，(2)包含可變域(例如，VL)和CL結(jié)構(gòu)域的第二多肽，和(3)包含CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的第三多肽。單臂抗體可以具有含有兩個(gè)半胱氨酸殘基的部分鉸鏈區(qū)，其中所述半胱氨酸殘基形成連接恒定重鏈的二硫鍵。一般地，單臂抗體的可變域形成抗原結(jié)合區(qū)。在某些情況下，單臂抗體的可變域是單一可變域，其中每個(gè)單一可變域是抗原結(jié)合區(qū)。 術(shù)語(yǔ)“單一結(jié)構(gòu)域抗體”(sdAbs)或“單一可變域(SVD)抗體”指其中單一可變域(VH或VL)賦予抗原結(jié)合作用的抗體。換而言之，單一可變域不需要與另一個(gè)可變域相互作用來(lái)識(shí)別并且結(jié)合靶抗原。單一結(jié)構(gòu)域抗體的實(shí)例包括源自駱駝科動(dòng)物的(羊駝和駱駝)和軟骨魚(yú)(例如，護(hù)士鯊)的那些單一結(jié)構(gòu)域抗體和源自重組方法來(lái)自人和小鼠抗體的那些單一結(jié)構(gòu)域抗體(Nature (1989) 341 :544-546 ；Dev Comp Immunol (2006) 30 43-56 ；Trend Biochem Sci (2001)26 :230-235 ;Trends Biotechnol(2003) :21:484-490;W02005/035572 ；W0 03/035694 ；Febs Lett (1994) 339 :285-290 ；W000/29004 ；W002/051870)。術(shù)語(yǔ)“線性抗體”指在Zapata 等人，Protein Eng. 8(10) :1057-1062(1995)中描述的抗體。簡(jiǎn)而言之，這些抗體包含一對(duì)串聯(lián)Fd區(qū)段(Vh-ChI-Vh-ChI)，它們與互補(bǔ)性輕鏈多肽一起形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異的或單特異的。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指從基本上同質(zhì)的抗體群體中獲得的抗體，S卩，構(gòu)成該群體的各個(gè)抗體是基本上相同的，除了可能以微小量出現(xiàn)的可能天然存在的突變之外。單克隆抗體是高度特異的，即針對(duì)單一抗原位點(diǎn)。另外，與包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物相反，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體是有利的，在于它們可以不混雜有其他抗體地合成。修飾語(yǔ)“單克隆的”表明該抗體的特征為從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得，并且不得解釋為要求通過(guò)任何具體方法產(chǎn)生該抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明待使用的單克隆抗體可以通過(guò)由Kohler等人(1975)Nature 256 :495首次描述的雜交瘤方法產(chǎn)生，或可以通過(guò)重組DNA方法產(chǎn)生(見(jiàn)例如US4816567 ；US 5807715)。單克隆抗體也可以使用例如在Clackson等人(1991) Nature, 352 624-628 ;Marks等人(1991) J. Mol. Biol.，222 :581-597中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)分離?！巴暾贵w”指包含VL和VH結(jié)構(gòu)域以及輕鏈恒定域(CL)和重鏈恒定域CH1、CH2和CH3的抗體。恒定域可以是天然序列恒定域(例如，人天然序列恒定域)或其氨基酸序列變體。完整抗體可以具有一種或多種“效應(yīng)子功能”，所述效應(yīng)子功能指歸因于抗體Fe恒定區(qū)(天然序列Fe區(qū)或氨基酸序列變體Fe區(qū))的那些生物學(xué)活性。抗體效應(yīng)子功能的實(shí)例包括Clq結(jié)合；依賴(lài)補(bǔ)體的細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)；胞吞；和細(xì)胞表面受體如B細(xì)胞受體的下調(diào)。根據(jù)抗體重鏈恒定域的氨基酸序列，完整抗體可以劃分成不同的“類(lèi)別”。存在五個(gè)主要類(lèi)別的完整免疫球蛋白抗體IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且這些類(lèi)型中的幾種可以進(jìn)一步劃分成“亞類(lèi)”(同種型)，例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。與不同抗體類(lèi)別相對(duì)應(yīng)的重鏈恒定域分別稱(chēng)作a、S、e、Y和ii。不同類(lèi)別的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。Ig形式包括鉸合部修飾形式或無(wú)鉸合部形式(Rcnix等人(1998)J. Immunol. 161 :4083-4090 ；Lund 等人(2000)Eur. J. Biochem. 267 :7246-7256 ；US2005/0048572 ；US 2004/0229310)?！癊rbB受體”是一種屬于ErbB受體家族的受體蛋白酪氨酸激酶，所述ErbB受體家族的成員是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和存活的重要介質(zhì)。ErbB受體家族包括4個(gè)不同成員，包括表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR、ErbBUHERl)、HER2 (ErbB2 或 pl85neu)、HER3 (ErbB3)和 HER4 (ErbB4或tyro2)。一組抗ErbB2抗體已經(jīng)使用人乳腺腫瘤細(xì)胞系SKBR3予以表征(Hudziak等人(1989)Mol. Cell. Biol. 9(3) :1165_1172。用稱(chēng)作4D5的抗體獲得最大抑制作用，所述抗體抑制細(xì)胞增殖達(dá)56%。該組中的其他抗體在這個(gè)測(cè)定法中較小程度地降低細(xì)胞增殖。 進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)抗體4D5使過(guò)量表達(dá)ErbB2的乳腺腫瘤細(xì)胞系對(duì)TNF-a的細(xì)胞毒效應(yīng)敏感(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，677, 171)。在Hudziak等人中討論的抗ErbB2抗體進(jìn)一步在Fendly等人(1990) Cancer Research 50 :1550-1558 ;Kotts 等人(1990) In Vitro 26(3) 59A ；Sarup等人(1991)Growth Regulation I :72-82 ;Shepard 等人 J. (1991)Clin. Immunol. 11(3)117-127 ；Kumar 等人(1991)Mol. Cell. Biol. 11(2) :979-986 ；Lewis 等人(1993)CancerImmunol. Immunother. 37 :255-263 ;Pietras 等人(1994) Oncogene 9:1829-1838;Vitetta 等人(1994)Cancer Research 54 :5301-5309 ;Sliwkowski 等人(1994) J. Biol.Chem. 269(20) : 14661-14665 ;Scott 等人(1991) J. Biol. Chem. 266 :14300-5 ；D ' souza 等A Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91 :7202-7206 ;Lewis 等人(1996) Cancer Research 56:1457-1465 ;和 Schaefer 等人(1997)Oncogene 15 :1385-1394 中表征。ErbB受體通常將包含一個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，其可以結(jié)合ErbB配體；一個(gè)親脂性跨膜結(jié)構(gòu)域；一個(gè)保守的胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域；和羧基端信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其攜帶幾個(gè)可以磷酸化的酪氨酸殘基。ErbB受體可以是“天然序列"ErbB受體或其“氨基酸序列變體”。ErbB受體家族的幾個(gè)成員是已知的并且包括EGFR(ErbBUHERl)、ErbB2(HER2)、ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)。術(shù)語(yǔ)“ErbBI”、“表皮生長(zhǎng)因子受體”、“EGFR”和“HER1 ”在本文中可互換地使用并且指如在例如 Carpenter 等人(1987) Ann. Rev. Biochem. ,56 :881-914 中公開(kāi)的 EGFR,包括其天然存在的突變體形式(例如，如Humphrey等人(1990) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 87 4207-4211中所述的缺失突變體EGFR)。術(shù)語(yǔ)erbBl指編碼EGFR蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因。針對(duì)HERl 的抗體例如在 Murthy 等人(1987) Arch. Biochem. Biophys. , 252 :549-560 中和例如在WO 95/25167 中描述。術(shù)語(yǔ)“ERRP”、“EGF受體相關(guān)蛋白”、“EGFR相關(guān)蛋白”和“表皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)蛋白”在本文中可互換地使用并且指如在例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，399，743和美國(guó)公開(kāi)號(hào)2003/0096373 中公開(kāi)的 ERRP。術(shù)語(yǔ)“ ErbB2 ”和“ HER2 ”在本文中可互換地使用并且指例如在Semba等人(1985)Proc. Nat. Acad. Sci. (USA)82 :6497-6501 和 Yamamoto 等人(1986)Nature,319 230-234 (Genebank登錄號(hào)X03363)中描述的人HER2蛋白。術(shù)語(yǔ)“erbB2”指編碼人ErbB2的基因，并且“neu”指編碼大鼠pl85neu的基因。 術(shù)語(yǔ)“ ErbB3 ”和“ HER3 ”在本文中可互換地使用并且指例如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，183，884 和 5，480，968 中以及在 Kraus 等人(1989) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 86 9193-9197中公開(kāi)的受體多肽。針對(duì)ErbB3的抗體是本領(lǐng)域已知的并且例如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，183, 884,5480968 中和 WO 97/35885 中描述。術(shù)語(yǔ)“ ErbB4 ”和“ HER4 ”在本文中可互換地使用并且指例如在EP專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?99，274 ;Plo碰an 等人(1993)Proc Natl Aead Sci USA90 :1746-1750 ;和 Plo碰an 等人(1993)Nature 366 :473-475中公開(kāi)的受體多肽，包括例如WO 99/19488中公開(kāi)的其同工型。針對(duì)HER4的抗體例如在WO 02/18444中描述。針對(duì)ErbB受體的抗體是從多個(gè)來(lái)源可商業(yè)獲得的，包括例如Santa CruzBiotechnology, Inc. , California, USA。 術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列變體”指具有某種程度上與天然序列多肽不同的氨基酸序列的多肽。通常，氨基酸序列變體將與天然ErbB配體的至少一個(gè)受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或與天然ErbB受體的至少一個(gè)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域擁有至少約70%序列同一性，或它們將在序列上與此類(lèi)受體或配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域至少約80%或至少約90%同源。氨基酸序列變體在天然氨基酸序列的氨基酸序列內(nèi)部的某些位置處擁有置換、缺失和/或插入。氨基酸由常規(guī)名稱(chēng)、單字母代碼和三字母代碼命名?！靶蛄型恍浴倍x為氨基酸序列變體中在比對(duì)序列并且根據(jù)需要導(dǎo)入空位以實(shí)現(xiàn)最大序列同一性百分?jǐn)?shù)后相同的殘基的百分?jǐn)?shù)。用于比對(duì)的方法和計(jì)算機(jī)程序是本領(lǐng)域熟知的。一種這樣的計(jì)算機(jī)程序是Genentech, Inc.編寫(xiě)的“Align 2”,該程序連同用戶(hù)文檔在1991年12月10日提交至美國(guó)版權(quán)局(United States Copyright Office),Washington, DC 20559?！翱贵w依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”和“ADCC”指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fe受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒細(xì)胞(例如，天然殺傷(NK)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體并且隨后造成靶細(xì)胞的裂解。用于介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞即NK細(xì)胞，僅表達(dá)Fe y RIII，而單核細(xì)胞表達(dá)Fe y RI、Fc Y RII和Fe Y RIII。造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)在 Ravetch 和 Kinet, (1991) “Annu. Rev. Immunol. ”9 :457-92 第 464 頁(yè)的表 3 中總結(jié)。為了評(píng)估目的分子的ADCC活性，可以進(jìn)行體外ADCC測(cè)定法，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，500, 362和5，821，337中描述的測(cè)定法。用于此類(lèi)測(cè)定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。備選地或額外地，目的分子的ADCC活性可以在體內(nèi)評(píng)估，例如，在動(dòng)物模型中，如在 Clynes 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656(1998)公開(kāi)中的那種動(dòng)物模型中?！叭诵?yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種恒定區(qū)受體(FcR)并執(zhí)行效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。一般地，效應(yīng)細(xì)胞至少表達(dá)Fe Y RIII并且執(zhí)行ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的實(shí)例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可以從其天然來(lái)源分離，例如，從血液或PBMC分離。術(shù)語(yǔ)“Fe受體”或“FcR”用來(lái)描述與抗體的Fe恒定區(qū)結(jié)合的受體。一般，F(xiàn)cR是結(jié)合IgG抗體的一種受體(Y受體)并且包括Fe y RI、Fe y RII和Fe y RIII亞類(lèi)受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括Fe Y RIIA( “激活性受體”)和FcyRIIB( “抑制性受體”)，它們具有主要在其胞質(zhì)域內(nèi)不同的相似氨基酸序列。激活性受體Fe Y RIIA在其胞質(zhì)域中含有基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受體Fe y RIIB在其胞質(zhì)域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(綜述，見(jiàn)M. in DttHvon^Annu. Rev. Immunol. ”15 :203-234(1997))。FcR 綜述于 Ravetch 和 Kinet,“Annu. Rev. Immunol. ”, 9 :457-92(1991) ；CapeI 等人(1994)Immunomethods 4 :25-34 ；和de Haas 等人(1995) J. Lab. Clin. Med. 126 :330-41 中。其他 FcR 由本文中的術(shù)語(yǔ)“FcR”包括。該術(shù)語(yǔ)還包括新生兒受體FcRn,其負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)移母體IgG至胎兒(Guyer等人(1976)J. Tmmun01.，117 587 和 Kim 等人(1994) J. Tmmuno1. 24 249)?！耙蕾?lài)補(bǔ)體的細(xì)胞毒性”或“CDC”指分子在補(bǔ)體存在下裂解靶細(xì)胞的能力。補(bǔ)體激活途徑始于補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)與復(fù)合于相應(yīng)抗原的分子(例如，抗體)的結(jié)合。為評(píng)估補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行⑶C測(cè)定法，例如，如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods202 :163(1996)中所述。
術(shù)語(yǔ)“天然抗體”指天然存在的基本4鏈抗體單元，其是由兩條相同輕鏈(L)和兩個(gè)相同重鏈(H)組成的異源四聚體的糖蛋白(IgM抗體由5個(gè)基本異源四聚體單元連同稱(chēng)作J鏈的額外多肽組成，并且因此含有10個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，而分泌型IgA抗體可以聚合以形成包含2-5個(gè)基本4鏈單元連同J鏈的多價(jià)裝配物)。在IgG的情況下，該4-鏈單元通常是約150，000道爾頓。每條L鏈由一個(gè)共價(jià)二硫鍵連接至H鏈，而根據(jù)H鏈同種型，兩條H鏈由一個(gè)或多個(gè)二硫鍵彼此連接。每條H和L鏈還具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。在N端，每條H鏈具有一個(gè)可變域(Vh)，后接對(duì)每條a鏈和、鏈而言的3個(gè)恒定域(Ch)，以及對(duì)ii和e同種型而言的4個(gè)Ch結(jié)構(gòu)域。在N端，每條L鏈具有一個(gè)可變域(')，后接在其另一端的恒定域(CJ。'與Vh對(duì)齊，并且Q與重鏈的第一恒定域(CHl)對(duì)齊。認(rèn)為特定的氨基酸殘基形成輕鏈可變域和重鏈可變域之間的界面。Vh和\的配對(duì)共同形成單一抗原結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)于不同抗體類(lèi)別的結(jié)構(gòu)和特征，見(jiàn)，例如，Basic and Clinical Immunology,第8 版，Daniel P. Stites, Abba I. Terr 和 Tristram G. Parslow(編著),Appleton&Lange,Norwalk, CT, 1994，第71頁(yè)和第6章。任何脊椎動(dòng)物物種的L鏈可以基于其恒定域的氨基酸序列劃分成的兩個(gè)明顯不同類(lèi)型(稱(chēng)作K和X)之一。術(shù)語(yǔ)“可變的”指這樣的事實(shí)可變域的某些部分在序列方面于抗體之間明顯不同并且用于每個(gè)特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合作用和特異性中。然而，變異性并不在抗體的可變域范圍內(nèi)均勻分布。它集中于輕鏈可變域和重鏈可變域的三個(gè)區(qū)段(稱(chēng)作高變區(qū))中?？勺冇虻妮^高度保守的部分稱(chēng)作構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含由3個(gè)高變區(qū)連接的大體上采取3折疊構(gòu)型的4個(gè)FR，所述高變區(qū)形成環(huán)，所述環(huán)連接該@折疊結(jié)構(gòu)和在一些情況下形成該P(yáng)折疊結(jié)構(gòu)的部分。每條鏈中的高變區(qū)由FR密切接近地維持在一起，并且在高變區(qū)來(lái)自其他鏈的情況下，對(duì)形成抗體的抗原結(jié)合部位作出貢獻(xiàn)(見(jiàn)Kabat 等人(1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版 PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)。恒定域不直接參與抗體與抗原結(jié)合，但是展示多種效應(yīng)子功能，如使抗體參與依賴(lài)抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)。術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”、“HVR”或“HV”指抗體可變域中在序列方面高度變化和/或形成結(jié)構(gòu)上限定的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個(gè)HVR5VH中的三個(gè)(H1、H2、H3)和VL中的三個(gè)(L1、L2、L3)。在天然抗體中，H3和L3顯示這六個(gè)HVR的大部分多樣性，并且尤其認(rèn)為H3在賦予精細(xì)特異性至抗體方面發(fā)揮獨(dú)特作用。見(jiàn),例如，Xu等人，Immunityl3 37-45 (2000) ; Johnson 和 Wu,在 Methods in Molecular Biology248 :1-25 中(Lo 編著，Human Press, Totowa, NJ, 2003)。實(shí)際上,僅由重鏈組成的天然存在的駱馬它科動(dòng)物的抗體在輕鏈不存在的情況下是有功能和穩(wěn)定的。見(jiàn)，例如，Hamers-Casterman等人，Nature 363 446-448(1993) ;Sheriff 等人，Nature Struct. Biol. 3 :733-736 (1996)。本文中使用和包括了眾多的HVR描述。Kabat互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)基于序列變異性并且是最常使用的(Kabat 等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, Md. (1991))。相反，Chothia 指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(Chothia 和 Lesk J. Mol. Biol. 196 :901-917 (1987))。AbMHVR代表了 Kabat HVR和Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折中方案，并且被Oxford Molecular' sAbM抗體建模軟件使用?！敖佑|” HVR基于可獲得的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果。下文指出來(lái)自這些HVR的每一者中的殘基。
環(huán) Rabat MjMChothia接觸
LI L24-L34 L24-L34L26-L32L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56L50-LS2L46-L55
L3 L89-L97 L83-L97L31-L36L89-L96
Hl H31-H35B H26-H35BH26-H32H3 0-H3 5B
CKabat 編號(hào))
Hl H31-H3 5 H26-H35H26-H32H30-H35 (Chothia 編號(hào)}
H2 H50-H65 H50-H58H53-H55H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101HVR 可以包含如下“延長(zhǎng)的 HVR”:VL 中的 24-36 或 24-34 (LI) ,46-56 或 50-56 (L2)和 89-97 或 89-96 (L3)和 VH 中的 26-35 (Hl) ,50-65 或 49-65 (H2)和 93-102,94-102 或95-102 (H3)。對(duì)于這些定義中的每一者，可變域殘基根據(jù)上文Kabat等人編號(hào)?！皹?gòu)架區(qū)”(FR)是除⑶R殘基之外的那些可變域殘基。每個(gè)可變域一般具有標(biāo)識(shí)為FR1、FR2、FR3和FR4的四個(gè)FR。如果CDR根據(jù)Kabat來(lái)定義，則輕鏈FR殘基約位于殘基1-23 (LCFRl)、35-49 (LCFR2)、57-88 (LCFR3)和 98-107 (LCFR4)處，并且重鏈 FR 殘基約位于重鏈殘基中的殘基 1-30 (HCFRl)、36-49 (HCFR2)、66-94 (HCFR3)和 103-113 (HCFR4)處。如果CDR包含來(lái)自高變環(huán)的氨基酸殘基，則輕鏈FR殘基約位于輕鏈中的殘基1-25 (LCFRl)、33-49 (LCFR2) ,53-90 (LCFR3)、和97-107 (LCFR4)處，并且重鏈FR殘基約位于重鏈殘基中的殘基 1-25 (HCFRI)、33-52 (HCFR2)、56-95 (HCFR3)和 102-113 (HCFR4)處。在一些情況下，當(dāng)⑶R包含來(lái)自如Kabat所定義的⑶R和高變環(huán)的那些⑶R中的氨基酸時(shí)，將相應(yīng)調(diào)整FR殘基。例如，當(dāng)⑶RHl包括氨基酸H26-H35時(shí)，重鏈FRl殘基處于位置1_25，并且FR2殘基處于位置36-49?！叭斯灿袠?gòu)架”是這樣的構(gòu)架，其代表在人免疫球蛋白VL或VH構(gòu)架序列的選擇中最常出現(xiàn)的氨基酸殘基。通常，人免疫球蛋白VL或VH構(gòu)架序列的選擇來(lái)自可變域序列的亞組。通常，所述的序列亞組是如Kabat中那樣的亞組。在某些情況下，對(duì)于VL，該亞組是如Kabat中那樣的亞組K I。在某些情況下，對(duì)于VH，該亞組是如Kabat中那樣的亞組III?！扒逗峡贵w”指這樣的抗體，在所述抗體中重鏈和/或輕鏈的部分與源自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類(lèi)別或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，同時(shí)所述鏈的其余部分與源自另一個(gè)物種或?qū)儆诹硪粋€(gè)抗體類(lèi)別或亞類(lèi)的抗體以及這種抗體的片段中的相應(yīng)序列相同或同源，條件是它們展示想要的生物學(xué)活性(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，816，567 JPMorrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 =6851-6855 (1984)) 嵌合抗體包括靈長(zhǎng)源化抗體，所述靈長(zhǎng)源化抗體包含源自非人靈長(zhǎng)類(lèi)(例如，舊世界猴、猿等)的可變域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū) 序列。非人(例如，嚙齒類(lèi))抗體的“人源化”形式是含有衍生自非人抗體中最少序列的嵌合抗體。對(duì)于大部分情況來(lái)說(shuō)，人源化抗體是人免疫球蛋白(接受方抗體)其中來(lái)自所述接受方抗體的高變區(qū)中的殘基由來(lái)自非人物種(提供方抗體)如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的具有所需抗體特異性、親和力和能力的高變區(qū)中的殘基替換。在一些情況下，人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)的非人殘基替換。另外，人源化抗體可以包含在接受方抗體中或在提供方抗體中不存在的殘基。作出這些修飾以進(jìn)一步改進(jìn)抗體性能。通常，人源化抗體將包含至少I(mǎi)個(gè)、并且一般2個(gè)可變域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高變環(huán)與非人免疫球蛋白的那些高變環(huán)對(duì)應(yīng)并且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的那些FR。人源化抗體任選地也將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白恒定區(qū)的部分。對(duì)于進(jìn)一步細(xì)節(jié)，見(jiàn)Jones等人，Nature 321 =522-525(1986)；Reichmann 等人，Nature 332:323-329(1988)；和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 593-596(1992)。如本文中所用的“復(fù)合物”或“復(fù)合的”指借助鍵和/或不是肽鍵的力(例如，范德華力、疏水力、親水力)彼此相互作用的兩個(gè)或更多個(gè)分子的締合。在某些情況下，復(fù)合物是異源多聚體的。應(yīng)當(dāng)理解，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)復(fù)合物”或“多肽復(fù)合物”包括具有與蛋白質(zhì)復(fù)合物中的蛋白質(zhì)綴合的非蛋白質(zhì)實(shí)體的復(fù)合物(例如，包括但不限于化學(xué)分子如毒素、交聯(lián)劑或檢測(cè)劑)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“異源多聚體”或“異源多聚體的”描述了通過(guò)非肽的共價(jià)鍵(例如，二硫鍵)和/或非共價(jià)相互作用(例如，氫鍵、離子鍵、范德華力和疏水相互作用)彼此相互作用的兩個(gè)或更多個(gè)多肽，其中至少兩個(gè)肽具有彼此不同的氨基酸序列?！敖Y(jié)合”分子靶或目的抗原的抗體是能夠以充足親和力結(jié)合該抗原的一種抗體，從而所述抗體用于靶向某蛋白質(zhì)或表達(dá)該抗原的細(xì)胞或組織，并且不與其他蛋白質(zhì)明顯交叉反應(yīng)。此類(lèi)抗體例如用作診斷劑和/或治療劑和/或研究工具是有用的。一般地，抗體與“非靶”蛋白結(jié)合的程度將小于該抗體與其特定靶蛋白的結(jié)合作用的約10%，如常見(jiàn)測(cè)量方法(例如，熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)或ELISA)所測(cè)定。
術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”或“特異性結(jié)合于”或者是“對(duì)......特異的”指抗體與靶分
子(例如，特定多肽)或特定多肽靶上的表位結(jié)合，并且意指可度量地與非特異性相互作用不同的結(jié)合(例如，非特異性相互作用可以是與牛血清白蛋白或酪蛋白的結(jié)合)。可以例如通過(guò)與對(duì)照分子的結(jié)合作用相比確定靶分子的結(jié)合作用，測(cè)量特異性結(jié)合。例如，可以通過(guò)與類(lèi)似于靶的對(duì)照分子(例如過(guò)量的未標(biāo)記靶)競(jìng)爭(zhēng)來(lái)測(cè)定特異性結(jié)合。在這種情況下，如果標(biāo)記的靶與探針的結(jié)合受過(guò)量未標(biāo)記的靶競(jìng)爭(zhēng)性抑制，則證實(shí)特異性結(jié)合。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”或“特異性結(jié)合于”或者是“特異于”特定多肽或特定多肽靶上的表位，可以例如通過(guò)對(duì)靶具有至少約200nM、備選地至少約150nM、備選地至少約IOOnM、備選地至少約60nM、備選地至少約50nM、備選地至少約40nM、備選地至少約30nM、備選地至少約20nM、備選地至少約10nM、備選地至少約8nM、備選地至少約6nM、備選地至少約4nM、備選地至少約2nM、備選地至少約InM或更大Kd的分子顯示。在某些情況下，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”指這樣的結(jié)合，其中某分子與特定多肽或特定多肽上的表位結(jié)合而基本上不與任何其他多肽或多肽表位結(jié)合。靶分子的實(shí)例包括但不限于血清可溶性蛋白和它們的受體，如細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體、黏附素、生長(zhǎng)因子和它們的受體、激素、病毒顆粒(例如，RSV F蛋白、CMV、StaphA、流感病毒、丙型肝炎病毒)、微生物(例如，細(xì)菌細(xì)胞蛋白、真菌細(xì)胞)、黏附素、CD蛋 白和它們的受體?！敖Y(jié)合親和力”指分子(例如，抗體)的單一結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶物(例如，抗原)之間非共價(jià)相互作用的總和的強(qiáng)度。除非另外指出，否則如本文所用，“結(jié)合親和力”指反映結(jié)合對(duì)子的成員(例如，抗體和抗原)之間I : I相互作用的固有結(jié)合親和力。分子X(jué)對(duì)其配偶物Y的親和力可以通常由解離常數(shù)(Kd)代表。例如，Kd可以是約200nM、150nM、lOOnM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、InM 或更強(qiáng)。親和力可以由本領(lǐng)域已知的常見(jiàn)方法測(cè)量，包括本文所述的那些方法。低親和力抗體通常緩慢結(jié)合抗原并且傾向于輕易解離，而高親和力抗體通常較快地結(jié)合抗原并且傾向于更長(zhǎng)地保持結(jié)合。測(cè)量結(jié)合親和力的多種方法是本領(lǐng)域已知的。如本文所用，“Kd”或“Kd值”指通過(guò)使用表面等離子體共振測(cè)定法，例如使用BIAcore -2000 或 BIAcore -3000 (BIAcore, Inc.，Piscataway, NJ)在 25 °C 米用固定抗原CM5芯片以約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)所測(cè)量的解離常數(shù)。簡(jiǎn)而言之，這種方法使用以鹽酸N-乙基-N' -(3- 二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)根據(jù)供應(yīng)商說(shuō)明書(shū)活化的羧甲基化葡聚糖生物傳感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)?？乖肐OmM乙酸鈉，pH 4. 8稀釋至5 u g/ml ( 0. 2 y M)，隨后以5 yl/分鐘的流速上樣以實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)蛋白的大約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)。在抗原注射后,注入IM乙醇胺以封閉未反應(yīng)的基團(tuán)。對(duì)于動(dòng)力學(xué)測(cè)量，將Fab的兩倍連續(xù)稀釋物(例如，0. 78nM至500nM)在25°C以大約25 U I/分鐘的流速注射于具有0.05%吐溫20 (PBST)的I3BS中。使用簡(jiǎn)單的一對(duì)一朗姆爾結(jié)合模型(BIAcore評(píng)價(jià)軟件3. 2版)通過(guò)同時(shí)擬合締合和解離傳感圖(sensorgram),計(jì)算締合速率(kon)和解離速率。將平衡解離常數(shù)(Kd)計(jì)算為比率kf/k。#見(jiàn)，例如，Chen等人，J. Mol. Biol. 293 =865-881 (1999)。如果通過(guò)以上表面等離子體共振測(cè)定法顯示締合速率超過(guò)IO6M-1 S—1，則締合速率可以使用熒光猝滅技術(shù)測(cè)定，其中所述的熒光猝滅技術(shù)在如光譜儀(如配備止流法(stop-flow)的分光光度計(jì)(Aviv Instruments)或具有攪拌型比色皿的8000-系列SLM-Aminco分光光度計(jì)(ThermoSpectronic))中所測(cè)量的那樣,在增加濃度的抗原存在下，在25°C測(cè)量在PBS，pH7. 2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)的熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)=295nm ;發(fā)射=340nm, 16nm帶通)的增加或減少?！坝坞x半胱氨酸氨基酸”指多肽例如抗體或抗體片段中具有巰基官能團(tuán)(-SH)并且不配對(duì)為分子內(nèi)或分子間二硫鍵的半胱氨酸氨基酸殘基。在某些情況下，已經(jīng)將游離半胱氨酸氨基酸殘基工程化至親本抗體中，如在例如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2007/0092940和Junutula, J. R.等人，J Immunol Methods 332(1-2) :41-52( 2008)中所述。術(shù)語(yǔ)“巰基反應(yīng)性值”是游離半胱氨酸氨基酸的反應(yīng)性的定量性表征。巰基反應(yīng)性值是半胱氨酸工程化抗體中與巰基反應(yīng)試劑反應(yīng)并且換算成最大值I的游離半胱氨酸氨基酸的百分?jǐn)?shù)。例如，半胱氨酸工程化抗體上以100%產(chǎn)率與巰基反應(yīng)試劑如生物素-馬來(lái)酰亞胺試劑反應(yīng)以形成生物素標(biāo)記抗體的游離半胱氨酸氨基酸具有巰基反應(yīng)性值1.0。例如，另一個(gè)工程化至相同或不同親本抗體中的以80%產(chǎn)率與巰基反應(yīng)試劑反應(yīng)的半胱氨酸氨基酸具有0. 8的巰基反應(yīng)性值。另一個(gè)工程化至相同或不同親本抗體中的完全不與巰基反應(yīng)試劑反應(yīng)的半胱氨酸氨基酸具有0的巰基反應(yīng)性值。確定特定半胱氨酸的巰基反應(yīng)性值可以由ELISA測(cè)定法、質(zhì)譜法、液相色譜法、放射自顯影法或其他定量分析試驗(yàn)實(shí)施?！坝H本抗體”是作為一個(gè)或多個(gè)抗體片段的來(lái)源的抗體。親本抗體可以包含天然或野生型序列。親本抗體可以包含其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基由一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基替換的氨基酸序列。相對(duì)于抗體的其他天然、野生型或修飾形式，親本抗體可以具有預(yù)先存在的氨基酸序列修飾(如添加、缺失和/或置換)。親本抗體可以針對(duì)目的靶抗原，例如生物學(xué)重要的多肽。親本抗體可以針對(duì)非多肽抗原(如腫瘤相關(guān)糖脂抗原；見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，091，178。示例性親本抗體包括但不限于，對(duì)細(xì)胞表面受體及跨膜受體和腫瘤相關(guān)抗原(TAA)具有親和力和選擇性的抗體?！胺蛛x的”抗體或多肽是已經(jīng)鑒定過(guò)并且從其自然環(huán)境的組分中分離和/或回收的一種抗體或多肽。其自然環(huán)境的雜質(zhì)組分是一般將干擾例如診斷性或治療性用途并且可以包括酶、激素和其他蛋白質(zhì)性或非蛋白質(zhì)性溶質(zhì)。一般地，將所述抗體或多肽(I)純化至以蛋白質(zhì)重量計(jì)大于95%，如Lowry法所測(cè)定，或以重量計(jì)大于99%，⑵純化至通過(guò)轉(zhuǎn)杯測(cè)序儀(spinning cup sequenator)獲得至少15個(gè)N端殘基或內(nèi)部氨基酸序列的程度,或
(3)純化至通過(guò)還原或非還原條件下使用考馬斯藍(lán)染或銀染法的SDS-PAGE所確定的均一性。分離的抗體或多肽包括重組細(xì)胞內(nèi)部在原位的抗體或多肽，因?yàn)樵摽贵w或多肽的自然環(huán)境的至少一種組分將不存在。然而，一般將通過(guò)至少一個(gè)純化步驟制備分離的抗體或多肽。短語(yǔ)“基本上均一的”、“基本上均一形式”和“基本均一性”是用來(lái)表示，該產(chǎn)物基本上沒(méi)有源自不希望的多肽組合中的副產(chǎn)物(例如同型多聚體)。以純度表述時(shí)，基本上均一性意指副產(chǎn)物的量不超過(guò)以重量計(jì)10%、9%、8%、7%、6%、4%、3%、2%或1%或是小于以重量計(jì)1%。一般地,副產(chǎn)物低于5*%。如本文所用的“Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)”是在氨基酸序列中可以由Lys-C內(nèi)肽酶在C端側(cè)切割的賴(lài)氨酸殘基。Lys-C內(nèi)肽酶在賴(lài)氨酸殘基的C端側(cè)切割。除非另外指出，否則術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體4D5”指具有鼠4D5抗體(ATCCCRL 10463)或衍生自其中的抗原結(jié)合殘基的抗體。例如，單克隆抗體4D5可以是鼠單克隆抗體4D5或其變體，如人源化4D5。示例性人源化4D5抗體包括如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，821，337中的huMAb4D5-l、huMAb4D5-2、huMAb4D5_3、huMAb4D5_4、huMAb4D5_5、huMAb4D5_6、huMAb4D5_7和 huMAb4D5-8 (曲妥珠單抗，HERCEPTIN )。術(shù)語(yǔ)“治療”或“療法”指治療性治療和預(yù)防性或防止性措置，其中目的是防止或減緩(減輕)不想要的生理學(xué)變化或病癥。有益或合乎需要的臨床結(jié)果包括但不限于癥狀減輕、發(fā)病程度減弱、疾病的穩(wěn)定(即，未加重)狀態(tài)、延遲或減緩病情進(jìn)展、疾病狀態(tài)的改善或緩和和消退(無(wú)論是部分或全部消退)，無(wú)論是可檢測(cè)的或不可檢測(cè)的?！爸委煛币部梢砸庵概c如果未接受治療的預(yù)期存活相比，延長(zhǎng)存活(例如，如在癌癥治療中)。需要治療的那些患者包括已經(jīng)患有該病狀或病癥的那些患者以及易于患有該病狀或病癥的那些患者或其中待預(yù)防病狀或病癥的那些患者?！爸委熡行Я俊敝缚贵w、抗體片段或衍生物例如多特異性抗體或抗體類(lèi)似物治療受試者中疾病或病癥的量。在腫瘤(例如，癌性腫瘤)的情況下，抗體或抗體片段(例如，多特異性抗體或抗體類(lèi)似物)的治療有效量可以減少癌細(xì)胞的數(shù)目；縮減原發(fā)腫瘤大小；抑制(即，某種程度減緩并且優(yōu)選地終止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)至外周器官中；抑制(即，某種程度減緩并且優(yōu)選地終止)腫瘤轉(zhuǎn)移；某種程度抑制腫瘤生長(zhǎng)和/或某種程度減輕一種或多種與該 病癥相關(guān)的癥狀。某種程度上，抗體或抗體片段(例如，多特異性抗體或抗體類(lèi)似物)可以防止生長(zhǎng)和/或殺死現(xiàn)存的癌細(xì)胞，它可以是抑制細(xì)胞的和/或細(xì)胞毒的。對(duì)于癌癥療法，體內(nèi)功效可以例如通過(guò)評(píng)估存活持續(xù)期、至疾病進(jìn)展時(shí)間(TTP)、應(yīng)答率(RR)、應(yīng)答的持續(xù)期和/或生活質(zhì)量來(lái)度量?！翱s減或抑制”意指引起總體減少20%或更多、或50%或更多、或75%、85%、90%、95%或更多的能力?？s減或抑制可以指正在治療的疾病的癥狀、轉(zhuǎn)移的存在或大小、原發(fā)腫瘤的大小或生血管性疾病中血管的大小或數(shù)目。術(shù)語(yǔ)“生物利用率”指施用至患者的藥物的給定量的全身性利用率(即，血液/血漿水平)。生物利用率是一個(gè)絕對(duì)術(shù)語(yǔ)，其表示從所施用劑型到達(dá)總循環(huán)的藥物時(shí)間(速率)和總量(程度)的度量。術(shù)語(yǔ)“癌癥”和“癌性的”指或描述哺乳動(dòng)物中一般以失調(diào)的細(xì)胞生長(zhǎng)/增殖為特征的生理病狀?！澳[瘤”包含一個(gè)或多個(gè)癌細(xì)胞。癌癥的實(shí)例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴樣惡變(lymphoid malignancy)。此類(lèi)癌的更多具體實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌(例如，上皮鱗狀細(xì)胞癌)、肺癌，包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌(“NSCLC”)、肺腺癌和肺鱗狀癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌或胃部癌癥，包括胃腸癌、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎臟或腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝臟癌(hepatic carcinoma)、肛門(mén)癌、陰莖癌以及頭頸癌?！氨磉_(dá)ErbB的癌癥”是一種癌癥，其包含使得ErbB蛋白質(zhì)在其細(xì)胞表面存在的細(xì)胞?！氨磉_(dá)ErbB2的癌癥”是一種癌癥，所述癌癥在其細(xì)胞的表面產(chǎn)生充足水平的ErbB2，從而抗ErbB2抗體可以與之結(jié)合并且針對(duì)該癌癥具有治療效果?！斑^(guò)量表達(dá)”抗原性受體的癌癥是與相同組織類(lèi)型的非癌性細(xì)胞相比，在其細(xì)胞表面處具有顯著更高水平的所述受體如ErbB2的癌癥。此類(lèi)過(guò)量表達(dá)可以由基因擴(kuò)增或由增加的轉(zhuǎn)錄或翻譯引起?？梢栽谠\斷性或預(yù)測(cè)性測(cè)定法(例如，通過(guò)免疫組織化學(xué)測(cè)定法；IHC)中通過(guò)評(píng)價(jià)細(xì)胞表面上存在的受體蛋白水平增加，確定受體過(guò)量表達(dá)。備選地或額外地，可以測(cè)量細(xì)胞中編碼受體的核酸水平，例如，通過(guò)熒光原位雜交(FISH;見(jiàn)W096/23874)、DNA印跡法或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)如實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)測(cè)量。過(guò)量表達(dá)ErbB2 (HER2)的腫瘤由與每個(gè)細(xì)胞表達(dá)的HER2分子的拷貝數(shù)相對(duì)應(yīng)的免疫組織化學(xué)評(píng)分定級(jí)，并且可以以生物化學(xué)方式測(cè)定0 = 0-10, 000個(gè)拷貝/細(xì)胞，1+ =至少約200，000個(gè)拷貝/細(xì)胞，2+ =至少約500,000個(gè)拷貝/細(xì)胞，3+ =約l_2xl06個(gè)拷貝/細(xì)胞。在3+水平的HER2過(guò)量表達(dá)，其導(dǎo)致酪氨酸激酶不依賴(lài)配體的活化(Hudziak等人(1987)ProcNatl Acad Sci USA，84 :7159-7163)，在大約30%乳腺癌中出現(xiàn)，并且在這些患者中，無(wú)復(fù)發(fā)存活期和總生存期縮減(Slamon等人(1989) Science, 244 :707-712 ；Slamon等人(1987) Science, 235 :177-182)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性劑”指抑制或阻礙細(xì)胞功能和/或造成細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意在包括放射性同位素(例如，211At、131I、125I、9°Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32p、6°C和Lu的放射性同位素)、化療藥和毒素如小分子毒素或細(xì)菌源、真菌源、植物源或動(dòng)物源的酶活性毒素，包括它們的合成類(lèi)似物及衍生物。本文中的“過(guò)敏性或炎性疾病”是因個(gè)體免疫系統(tǒng)的過(guò)度活化引起的疾病或病癥。示例的過(guò)敏性或炎性疾病包括但不限于哮喘、銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、遺傳過(guò)敏性皮炎、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、濕疹、器官移植、年齡相關(guān)性黃斑變性、節(jié)段性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、嗜酸性粒細(xì)胞食管炎和與炎癥相關(guān)的自身免疫病。本文中的“自身免疫病”是源自并且針對(duì)個(gè)體自身組織或器官或者共分離物的疾病或病癥或其表現(xiàn)或從其中所致的病狀。在這些自身免疫病和炎性疾病的多種疾病中，眾 多臨床標(biāo)記物和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)記物可能存在，包括但不限于聞丙種球蛋白血癥、聞水平的自身抗體、抗原-抗體復(fù)合物沉積在組織中、從皮質(zhì)類(lèi)固醇或免疫抑制性治療中獲益和淋巴樣細(xì)胞聚集于受累組織中。不限于任一種關(guān)于B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病的理論，認(rèn)為B細(xì)胞在人自身免疫病中通過(guò)多種機(jī)理性途徑展示致病作用，所述機(jī)理性途徑包括自身抗體產(chǎn)生、免疫復(fù)合物形成、樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞活化、細(xì)胞因子合成、直接趨化因子釋放和為異位性新淋巴生成提供滋生地。這些途徑的每一者可以不同程度地參與自身免疫病的病理學(xué)。自身免疫病可以是器官特異性疾病(即，免疫應(yīng)答特異性地針對(duì)器官系統(tǒng)如內(nèi)分泌系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、皮膚、心肺系統(tǒng)、胃腸及肝臟系統(tǒng)、腎系統(tǒng)、甲狀腺、耳、神經(jīng)肌肉系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等)或可以影響多個(gè)器官系統(tǒng)的全身性疾病(例如，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性肌炎等)。術(shù)語(yǔ)“抑制細(xì)胞的”指限制細(xì)胞功能(如限制細(xì)胞生長(zhǎng)或細(xì)胞增殖)的作用。“化療藥”是用于治療癌癥中的化學(xué)化合物。化療藥的實(shí)例包括厄洛替尼(TARCEVA , Genentech/OSI Pharm.)、硼替佐米(Bortezomib) ( VELCADE ，Millennium Pharm.)、氟維司群(Fulvestrant) ( It ASLOD.LX , Astrazeneca)、馬來(lái)酸舒尼替尼(Sutent) (SU11248，Pfizer)、來(lái)曲(Letrozole) ( FEMARA , Novartis)、甲磺酸伊馬替尼(GLEEVEC f Novartis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、奧沙利鉬(Etoxatlu , Sanofi)、5-FU(5_氟尿嘧啶)、甲酰四氫葉酸、雷帕霉素(Sirolimus,RAPAMUN.E , Wyeth)、拉帕替尼(Lapatinib) (GSK572016, GlaxoSmithKline)、氯那法尼(Lonafarnib) (SCH 66336)、索拉非尼(Sorafenib) (BAY43-9006，Bayer Labs.)和吉非替尼(IRESSA , Astrazeneca)、AG1478、AG1571 (SU 5271 ；Sugen);烷基化劑如塞替派(Thiotepa)和CYTOXAN㊣環(huán)磷酰胺；烷基磺酸酯如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙唳類(lèi)如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替派(uredopa);乙撐亞胺類(lèi)和甲基蜜胺類(lèi)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亞乙基蜜胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三輕甲蜜胺；乙酸原類(lèi)(acetogenins)(尤其布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹(shù)堿(包括合成性類(lèi)似物拓?fù)涮婵?；苔蘚抑素；海綿多烯酮類(lèi)化合物(callystatin)；CC-1065(包括它的阿多來(lái)新、卡折來(lái)新和比折來(lái)新合成性類(lèi)似物)；隱藻素(尤其隱藻素I和隱藻素8);多拉司他?。欢噙_(dá)霉素(duocarmycin)(包括合成性類(lèi)似物KW-2189和CB1-TM1);艾榴素；水鬼蕉堿；匍枝珊瑚醇AGarcodictyin);海綿素；氮芥類(lèi)如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥、鹽酸氧氮芥、美法倉(cāng)、新氮芥、苯芥膽留醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲類(lèi)如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、羅莫司汀、尼莫司汀、和雷莫司?。豢股厝缦┒差?lèi)抗生素(例如，刺孢霉素，尤其刺孢霉素入 II 和刺孢霉素 QIKAngew Chem Intl. Ed. Engl. (1994)33 :183-186);達(dá)內(nèi)霉素，包括達(dá)內(nèi)霉素A;二膦酸鹽類(lèi)如氯膦酸鹽；埃斯波霉素；以及新制癌菌素發(fā)色團(tuán) 和相關(guān)的色蛋白烯二炔抗生素發(fā)色團(tuán)、阿克拉霉素、放線菌素、安曲霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸、博來(lái)霉素、放線菌素C、卡柔比星(carabicin)、去甲柔紅霉素、嗜癌霉素、色霉素(chromomycinis)、放線菌素D、多柔比星、地托比星、6-重氮基_5_氧代-L-正亮氨酸、阿霉素⑩多柔比星(包括嗎啉基-多柔比星、氰基嗎啉-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊達(dá)比星、馬塞羅霉素、絲裂霉素類(lèi)如絲裂霉素C、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈佐星、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他汀、佐柔比星；抗代謝物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類(lèi)似物如二甲葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤和曲美沙特；嘌呤類(lèi)似物如氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥(niǎo)嘌呤；嘧啶類(lèi)似物如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；雄激素類(lèi)如卡魯睪酮、丙酸屈他雄酮、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺藥如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充劑如亞葉酸；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；嗯尿喃唳；安吖唳；bestrabucil ;比生群；依達(dá)曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鳥(niǎo)氨酸；依利醋銨；埃坡霉素；依托格魯；硝酸鎵；羥脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明；美坦生類(lèi)化合物如美坦生和安斯菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；尼曲吖唳(nitraerine)；噴司他丁 ；蛋氨氮芥(phenamet);卩比柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基肼；丙卡巴肼；PSK⑨多糖復(fù)合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);丙亞胺；利索新；西佐喃；鍺螺胺；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2'，2"-三氯三乙胺；單端孢霉烯族化合物(尤其T-2毒素、疣孢菌素A(Verracurin A)、桿孢菌素A和蛇形菌素)；烏拉坦；長(zhǎng)春地辛(1LDISINE , FILDESW );達(dá)卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴燒；gacytosine ;阿糖胞苷(“Ara_C”；環(huán)磷酰胺；塞替派；紫杉燒類(lèi)化合物，例如，TAXOL馨紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.)、ABRAXANETM紫杉醇的無(wú)乳浮、白蛋白工程化納米粒子制劑(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg, Illinois)和泰索帝 _ 紫杉職(doxetaxel)(麗||&肺-Poulenc Rorer，Antony, France);苯丁酸氮芥;GEMZAR 吉西他濱;6_硫鳥(niǎo)嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉬類(lèi)似物如順鉬和卡鉬；長(zhǎng)春堿；鉬；依托泊苷(VP-16);異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長(zhǎng)春新堿；NA￥E3LB1NE⑩長(zhǎng)春瑞濱；諾安托；替尼泊苷；依達(dá)曲沙;道諾霉素;氨基蝶呤;希羅達(dá)；伊班膦酸鹽；CPT-11 ;拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000 ;二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DMFO);維甲類(lèi)如維甲酸；卡培他濱；以上任意藥物的可藥用鹽、酸或衍生物。另外，在“化療藥”的這個(gè)定義中包括(i)起到調(diào)節(jié)或抑制針對(duì)腫瘤的激素作用的抗激素藥，如抗雌激素藥和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)物(SERMs)，包括例如他莫昔芬(包括NOLVADEX 他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羥他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮和FARESTON 托瑞米芬；(ii)抑制芳香酶的芳香酶抑制劑，其調(diào)節(jié)腎上腺中的雌激素產(chǎn)生，例如4(5)-咪唑類(lèi)、氨魯米特、MEGASE 醋酸甲地孕酮、AROMASIN 依西美坦、福美坦、法倔唑、RIVISOR 伏氯唑、FEMARA 來(lái)曲唑和ARIMIDEX 阿那曲唑；(iii)抗雄激素藥如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙立德和戈舍瑞林；以及曲他沙濱(i，3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類(lèi)似物)；(iv)芳香酶抑制劑；(V)蛋白激酶抑制劑；(vi)脂質(zhì)激酶抑制劑；(vii)反義寡核苷酸，尤 其那些抑制了參與異常細(xì)胞增殖的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的基因(例如PKC-a、Ralf, H-Ras)表達(dá)的反義寡核苷酸；(Viii)核酶，如VEGF表達(dá)抑制劑(例如，ANGIOZYME⑩核酶)和HER2表達(dá)抑制劑；(iX)疫苗，如基因治療疫苗，例如，ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN⑩疫苗和VAXID⑩疫苗；PROLEUKIN⑩m-2 ;IAJRTOTECAN 拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑；ABARFXIX rmRH ； (x)抗血管生成劑，如貝伐單抗(AVASTIN ，Genentech),和(xi)上述藥物中任意者的可藥用鹽、酸或衍生物。在本文中使用時(shí)，“生長(zhǎng)抑制劑”指在體外或在體內(nèi)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物或組合物。因而，生長(zhǎng)抑制劑可以是一種顯著減少處于S期的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)的物質(zhì)。生長(zhǎng)抑制劑的實(shí)例包括阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程(在除S期之外的位置)的物質(zhì)，如誘導(dǎo)Gl停滯和M期停滯的藥物。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長(zhǎng)春堿類(lèi)(例如，長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)、紫杉烷和拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑如多柔比星、表柔比星、佐柔比星、依托泊苷及博來(lái)霉素。使Gl停滯的藥物還導(dǎo)致S期停滯，例如DNA烷基化劑如他莫西芬、潑尼松、達(dá)卡巴嗪、氮芥、順鉬、甲氨蝶呤、5-氟尿P密唳和阿糖胞苷(ara_C)。其他信息可以在 The Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn和 Israel 編著，Murakami 等人，第 I 章，標(biāo)題“Cell cycle regulation, oncogenes,and antineoplastic drugs (細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、癌基因和抗腫瘤藥物)”(WB Saunders Philadelphia，1995)，尤其第13頁(yè)中找到。紫杉烷類(lèi)(紫杉醇和多西紫杉醇)是均源自紫杉的抗癌藥物。源自歐洲紫杉的多西紫杉醇(TAXORhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇的一種半合成性類(lèi)似物(TAXCWL , Bristol-Myers Squibb)。紫杉醇和多西紫杉醇促進(jìn)微管從微管蛋白二聚體中裝配并且通過(guò)阻止解聚而穩(wěn)定微管，這導(dǎo)致細(xì)胞中的有絲分裂抑制。如本文所用的“抗癌療法”指減少或抑制受試者中癌癥的治療?？拱┋煼ǖ膶?shí)例包括細(xì)胞毒性放療法以及施用治療有效量的細(xì)胞毒性劑、化療藥、生長(zhǎng)抑制劑、癌疫苗、血管生成抑制劑、前藥、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子拮抗劑、皮質(zhì)類(lèi)固醇、免疫抑制劑、抗嘔吐藥、抗體或抗體片段或者鎮(zhèn)痛藥至所述受試者?！凹?xì)胞因子拮抗劑”意指部分地或完全阻斷、抑制或中和至少一種細(xì)胞因子的生物學(xué)活性的分子。例如，細(xì)胞因子拮抗劑可以通過(guò)抑制細(xì)胞因子表達(dá)和/或分泌物或通過(guò)結(jié)合至細(xì)胞因子或結(jié)合至細(xì)胞因子受體來(lái)抑制細(xì)胞因子活性。細(xì)胞因子拮抗劑包括與細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體結(jié)合的抗體、合成肽或天然序列肽、免疫黏附素和小分子拮抗劑。細(xì)胞因子拮抗劑任選地與細(xì)胞毒性劑綴合或融合。示例性TNF拮抗劑是依那西普(ENBREL )、英利昔單抗(REMICADE )和阿達(dá)木單抗(humira )。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫抑制劑”指作用在于抑制或掩蔽正在治療的受試者的免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。這包括抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生、下調(diào)或抑制自身抗原表達(dá)或掩蔽MHC抗原的物質(zhì)。免疫抑制劑的實(shí)例包括2-氨基-6-芳基-5取代的嘧啶(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，665，077)；麥考酚酸酯如CELICEPT霞^硫唑嘌呤(IMURAN , AZASAN /6-巰基嘌 呤；溴隱亭(bromocryptine);達(dá)那唑；氨苯砜；戍二醒(其掩蔽MHC抗原，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，120,649中描述)；針對(duì)MHC抗原和MHC片段的抗獨(dú)特型抗體；環(huán)孢菌素A ;類(lèi)固醇類(lèi)如皮質(zhì)類(lèi)固醇和糖皮質(zhì)激素類(lèi)，例如，潑尼松、潑尼松龍如(潑尼松龍磷酸鈉)或ORAPRED⑩(潑尼松龍磷酸鈉口服溶液劑)、甲潑尼龍和地塞米松；甲氨蝶呤(口服或皮下)(RHEUMATREX , trexall );羥氯喹/氯喹;柳氮磺吡啶；來(lái)福米特；細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗劑，包括抗干擾素-Y、-0或-a抗體，抗腫瘤壞死因子-a抗體(英利昔單抗或阿達(dá)木單抗)，抗TNF- a免疫黏附素(ENBREL ,依那西普)，抗腫瘤壞死因子抗體，抗白介素-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-I抗體，包括抗CDlla和抗CD18抗體；抗1314抗體；異源抗淋巴細(xì)胞球蛋白；多克隆或泛T抗體或單克隆抗⑶3或抗⑶4/⑶4a抗體；含有LFA-3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可溶性肽(W0 90/08187);鏈激酶；TGF-0 ;鏈道酶；來(lái)自宿主的RNA或DNA ；FK506 ;RS_61443 ;脫氧精胍菌素；雷帕霉素；T細(xì)胞受體(Cohen等人,美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，114，721) ；T細(xì)胞受體片段(Offner等人Science251 :430-432(1991) ；W0 90/11294 ；Ianeway, Nature 341 :482(1989);和冊(cè) 98/07409)；T細(xì)胞受體抗體(EP 340，109)如T10B9 ;環(huán)磷酰胺(CYTOXAN );氨苯砜；青霉胺<CUPMMINE );血漿交換；或靜脈內(nèi)免疫球蛋白(iviG)。這些免疫抑制劑可以單獨(dú)或彼此組合地使用，尤其類(lèi)固醇與另一種免疫抑制劑的組合，或在此類(lèi)組合后，隨后采用非類(lèi)固醇藥物維持給藥以減少對(duì)類(lèi)固醇的需求?！版?zhèn)痛藥”指作用在于抑制或壓制受試者中疼痛的藥物。示例性鎮(zhèn)痛藥包括非甾體抗炎藥(NSAiD),包括布洛芬(MOTRIN )、萘普生(NAPROSYN )、乙酰水楊酸J引哚美辛、舒林酸和托美丁，包括它們的鹽及衍生物、以及用來(lái)減少可能出現(xiàn)的刺痛的多種其他藥物，包括抗驚厥藥(加巴噴丁、苯妥英、卡馬西平)或三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥。具體實(shí)例包括對(duì)乙酰氨基酚、阿斯匹靈、阿米替林(ELAVIL )、卡馬西平(TEGRETOL )、苯妥英
(DILANTIN )、加巴噴丁(NEURONTIM )、(E)-N-香草基-8-甲基-6-壬烯酰胺(CAPSAICIN )或神經(jīng)阻滯齊IJ?！捌べ|(zhì)類(lèi)固醇”指模擬或增進(jìn)天然存在的皮質(zhì)類(lèi)固醇的作用的具有類(lèi)固醇總體化學(xué)結(jié)構(gòu)的幾種合成物質(zhì)或天然存在物質(zhì)中的任一種物質(zhì)。合成的皮質(zhì)類(lèi)固醇的實(shí)例包括潑尼松、潑尼松龍(包括甲潑尼龍)、地塞米松、曲安西龍和倍他米松。如本文所用，“癌疫苗”是在受試者中刺激針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答的組合物。癌疫苗一般由癌相關(guān)材料或細(xì)胞(抗原)的來(lái)源連同進(jìn)一步刺激和增強(qiáng)針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答的其他組分(例如，佐劑)組成，所述的來(lái)源可以是自體的(來(lái)自自身)或相對(duì)于該受試者是同種異體的(來(lái)自其他)。癌疫苗可以導(dǎo)致刺激受試者的免疫系統(tǒng)以產(chǎn)生針對(duì)一種或幾種特異性抗原的抗體，和/或產(chǎn)生殺傷性T細(xì)胞以攻擊具有那些抗原的癌細(xì)胞。“細(xì)胞毒放療法”如本文所用指抑制或阻礙細(xì)胞功能和/或造成細(xì)胞破壞的輻射療法。輻射療法可以包括例如，外部束照射或采用放射性標(biāo)記物(如抗體)治療。該術(shù)語(yǔ)意在包括使用放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、Ra223、P32 和 Lu的放射性同位素)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“靶向EGFR的藥物”指與EGFR結(jié)合和任選地抑制EGFR活化的 治療劑。這種治療劑的實(shí)例包括與EGFR結(jié)合的抗體和小分子。與EGFR結(jié)合的抗體的實(shí)例包括 MAb 579 (ATCC CRL HB8506) ,MAb 455 (ATCC CRL HB8507) ,MAb 225 (ATCC CRL 8508)、MAb 528 (ATCC CRL 8509)(見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4，943，533，Mendelsohn 等人)及其變體，如嵌合化225 (C225或西妥昔單抗KRBITUX )和重構(gòu)的人225 (H225)(見(jiàn)WO 96/40210，Imclone Systems Inc.);結(jié)合II型突變體EGFR的抗體(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，212，290);如US5891996中所述的結(jié)合EGFR的人源化和嵌合抗體；和結(jié)合EGFR的人抗體如ABX-EGF (見(jiàn)W96/50433，Abgenix)?？笶GFR抗體可以與細(xì)胞毒性劑綴合，因而產(chǎn)生免疫綴合物(見(jiàn)，例如，EP 659，439A2，Merck Patent GmbH)。與EGFR結(jié)合的小分子的實(shí)例包括ZD1839或吉非替尼(IRESSA ;Astra Zeneca)、厄洛替尼 HCl (CP-358774，TARCEVA ；Genentech/0SI)和AG1478、AG1571(SU 5271 ;Sugen)。蛋白激酶抑制劑包括某種程度抑制酪氨酸激酶(如ErbB受體)的酪氨酸激酶活性的酪氨酸激酶抑制劑。此類(lèi)抑制劑的實(shí)例包括前述段落中指出的EGFR靶向藥物以及喹唑啉類(lèi)如I3D 153035,4-(3-氯苯胺基)喹唑啉、吡啶并嘧啶類(lèi)、嘧啶并嘧啶類(lèi)、吡咯并嘧啶類(lèi)、如CGP 59326、CGP 60261和CGP 62706，和吡唑并嘧啶類(lèi)、4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶、姜黃素(二阿魏?；?甲烷、4，5-雙(4-氟苯胺基)鄰苯二甲酰胺)、含有硝基噻吩部分的酪氨酸憐酸化抑制劑(tyrphostine) ；PD~0183805 (Warner-Lambert);反義分子(例如，與編碼ErbB的核酸結(jié)合的那些)；喹喔啉類(lèi)(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，804，396);酪氨酸磷酸化抑制劑類(lèi)(美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，804，396) ；ZD6474 (Astra Zeneca) ；PTK-787 (Novartis/Schering AG);泛 ErbB 抑制劑如 CI-1033 (Pfizer) ；Affinitac (ISIS 3521 ；Isis/Lilly)；甲橫酸伊馬替尼(Gleevec ;Novartis) ；PKI 166 (Novartis) ；GW2016 (Glaxo SmithKline)；CI-1033 (Pfizer) ；EKB-569(Wyeth);司馬沙尼(Sugen) ；ZD6474 (AstraZeneca)；PTK-787 (Novartis/Schering AG) ;INC_1C11 (Imclone);或如以下專(zhuān)利中任一者中描述的抑制劑W099/09016 (American Cyanamid) ；W0 98/43960 (American Cyanamid)；W097/38983(Warner Lambert) ；W0 99/06378(Warner Lambert) ；W099/06396 (WarnerLambert) ；W0 96/30347(Pfizer， Inc) ；W096/33978(Zeneca) ；W0 96/3397(Zeneca)和 WO96/33980 (Zeneca)?！翱寡苌蓜敝改撤N程度地阻斷或干擾血管形成的化合物?？寡苌梢蜃涌梢岳缡桥c參與促進(jìn)血管生成的生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子受體結(jié)合的小分子或抗體。在某些情況下，本文中的抗血管生成因子是與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)結(jié)合的抗體?！翱箛I吐藥”是在受試者中減少或預(yù)防惡心的化合物?？箛I吐化合物包括例如，神經(jīng)激肽-I受體拮抗劑、5HT3受體拮抗劑(如昂丹司瓊、格拉司瓊、托烷司瓊和扎托司瓊)、GABAB受體激動(dòng)劑，如巴氯芬、皮質(zhì)類(lèi)固醇如地塞米松、KENALOG⑩、ARISTOCORT 或NASALIDE 、抗多巴胺能藥、吩噻嗪類(lèi)(例如丙氯拉嗪、氟奮乃靜、硫利達(dá)嗪和美索達(dá)嗪)、屈大麻酚、甲氧氯普胺、多潘立酮、氟哌啶醇、賽克力嗪、勞拉西泮、丙氯拉嗪和左美丙嗪。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”是用于一個(gè)細(xì)胞群體所釋放的蛋白質(zhì)的類(lèi)屬術(shù)語(yǔ)，所述蛋白質(zhì)作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一種細(xì)胞。此類(lèi)細(xì)胞因子的實(shí)例是淋巴因子類(lèi)、單核因子類(lèi)和常規(guī)的多肽激素。在細(xì)胞因子當(dāng)中包括生長(zhǎng)激素如人生長(zhǎng)激素、N-甲硫酰人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；副甲狀腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素類(lèi)如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH);肝生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；催乳素；胎盤(pán)催乳激素；腫瘤壞死因子_a和-3 ;繆勒管抑制物質(zhì)；小鼠促性腺激素 相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；整聯(lián)蛋白；促血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長(zhǎng)因子類(lèi)如NGF-P ;血小生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)如TGF-a和TGF-P ;胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II ;促紅細(xì)胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因子；干擾素如干擾素-a、和-Y ;集落刺激因子類(lèi)(CSF)如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF);粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF);和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF);白介素(IL)如 IL-U IL-I a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-II、IL-12 ;腫瘤壞死因子如TNF-a或TNF-P ;和其他多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”包括來(lái)自天然來(lái)源或來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和天然序列細(xì)胞因子的生物學(xué)活性等同物。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“前藥”指藥學(xué)活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，所述前體或衍生物與親本藥物相比，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較低細(xì)胞毒性并且能夠酶促或水解活化或轉(zhuǎn)變成更有活性的親本形式。見(jiàn)，例如，Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy (癌癥化療中的前藥)，，Biochemical Society Transactions, 14,第 375-382 頁(yè)，615th MeetingBelfast(1986)和 Stella 等人“Prodrugs :A Chemical Approach to Targeted DrugDelivery (前藥定向藥物遞送的化學(xué)手段)”，Directed Drug Delivery, Borchardt等人(編著)，第247-267頁(yè)，Human Press (1985)。示例性前藥包括但不限于含有磷酸酯的前藥、含有硫代磷酸酯的前藥、含有硫酸酯的前藥、含有肽的前藥、D-氨基酸修飾的前藥、糖基化前藥、含有￠-內(nèi)酰胺的前藥，任選地含有取代的苯氧乙酰胺的前藥或任選地含有取代的苯乙酰胺的前藥、5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿苷前藥，它們可以轉(zhuǎn)變成細(xì)胞毒性更強(qiáng)的游離藥物。可以衍生成前藥形式的細(xì)胞毒藥物的實(shí)例包括但不限于上述那些化療藥?！爸|(zhì)體”是由多種類(lèi)型的脂類(lèi)、磷脂和/或表面活性劑組成的小囊泡，其用于遞送藥物(如本文中公開(kāi)的抗ErbB2抗體和任選地化療藥)至哺乳動(dòng)物。脂質(zhì)體的組分通常以雙層形式排列，其類(lèi)似于生物膜的脂質(zhì)排列形式?！鞍b插頁(yè)”用來(lái)指治療產(chǎn)品的商業(yè)包裝中習(xí)慣性包含的說(shuō)明書(shū)，所述說(shuō)明書(shū)含有關(guān)于適應(yīng)癥、用法、劑量、施用、禁忌癥和/或涉及使用此類(lèi)治療產(chǎn)品之警告的信息?！笆删w展示法”是一項(xiàng)技術(shù)，借助所述技術(shù)，將變體多肽作為融合蛋白展示至噬菌體例如絲狀噬菌體、顆粒表面上的外殼蛋白，。噬菌體展示法的一項(xiàng)用途在于以下事實(shí)巨大的隨機(jī)化蛋白質(zhì)變體文庫(kù)可以針對(duì)那些以高親和力與靶分子結(jié)合的序列快速和高效地分選。肽文庫(kù)和蛋白質(zhì)文庫(kù)在噬菌體上的展示已經(jīng)用于篩選數(shù)百萬(wàn)個(gè)多肽以尋找具有特異結(jié)合特性的那些多肽。多價(jià)噬菌體展示方法已經(jīng)用于展示隨機(jī)小肽和小蛋白，一般借助與絲狀卩遼菌體pill或pVIII的融合進(jìn)行(Wells和Lowman, (1992) Curr. Opin. Struct.Biol.，3 :355-362,及其中引用的參考文獻(xiàn))。在單價(jià)噬菌體展示法中，蛋白質(zhì)文庫(kù)或肽文庫(kù)與噬菌體外殼蛋白或其部分融合，并且在野生型蛋白存在下以低水平表達(dá)。相對(duì)于多價(jià)噬菌體，親合力作用降低，從而分選過(guò)程基于固有的配體親和力，并且使用簡(jiǎn)化DNA操作的曬菌粒載體。Lowman 和 Wells, Methods :Acompanion to Methods in Enzymology, 3 205-0216(1991)。卩遼菌體展示法包括用于產(chǎn)生抗體樣分子的技術(shù)(Janeway, C. , Travers,P. ,ffalport,M. , Shlomchik (2001) Immunobiology,第 5版,Garland Publishing, New York,第 627-628 頁(yè)；Lee 等人)?！笆删！笔蔷哂屑?xì)菌復(fù)制起點(diǎn)例如ColEl和噬菌體基因間區(qū)副本的質(zhì)粒載體?？梢栽谌魏我阎删w(包括絲狀噬菌體和入樣噬菌體)上使用噬菌粒。所述質(zhì)粒通常還將含有抗生素耐藥性的選擇標(biāo)記?？寺≈吝@些載體中的DNA區(qū)段可以作為質(zhì)粒增殖。當(dāng)為 攜帶這些載體的細(xì)胞提供產(chǎn)生噬菌體粒子所需要的全部基因時(shí)，質(zhì)粒的復(fù)制模式變成滾環(huán) 復(fù)制以產(chǎn)生質(zhì)粒DNA的一條鏈及包裝噬菌體粒子的副本。噬菌?？梢孕纬筛腥拘曰蚍歉腥拘允删w粒子。該術(shù)語(yǔ)包括這樣的噬菌粒，其含有與異源多肽基因連接的噬菌體外殼蛋白基因或其片段作為基因融合物，從而所述異源多肽展示在噬菌體粒子的表面上。本文中可互換使用的術(shù)語(yǔ)“接頭”、“接頭單元”、“連接”、“交聯(lián)劑”和“交聯(lián)物”意指這樣的化學(xué)部分，其包含將抗體或抗體片段與另一個(gè)抗體、抗體片段或與藥物部分共價(jià)連接的共價(jià)鍵或原子鏈。接頭包括二價(jià)基團(tuán)如烷基二基(alkyldiyl)部分、亞芳基部分、雜亞芳基部分，如-(CR2)nO(CR2)n_、燒氧基重復(fù)單元(例如聚乙烯氧基(polyethylenoxy)、PEG、聚亞甲基氧基)和烷基氨基(例如聚亞乙基氨基、Jeffamine );和二酸酯和酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二甘醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。額外的接頭或交聯(lián)劑包括雙馬來(lái)酰亞胺和雙烷基鹵、吡啶基二硫化物、雙汞鹽、5-硫基-2-硝基苯甲酸介導(dǎo)的交聯(lián)和雙硫代磺酸酯。示例性的市售交聯(lián)劑包括但不限于1，4_雙(馬來(lái)酰亞胺)丁烷、(1，4_雙馬來(lái)酰亞氨基-2，3-二羥基丁烷)、雙(馬來(lái)酰亞胺)己烷、雙(馬來(lái)酰亞胺)乙烷、1，4-二-3' -(2'-卩比唳基二硫代)丙酸胺基]丁燒、1，6-己燒-雙-乙烯基諷、二硫代雙馬來(lái)酰亞胺乙烷、1，8-雙馬來(lái)酰亞氨基-二乙二醇和1，11-雙馬來(lái)酰亞氨基-三乙二醇。在某些情況下，同型三官能性試劑可以用作交聯(lián)劑，例如，三[2-馬來(lái)酰亞胺乙基]胺。術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記物”意指可以與抗體共價(jià)連接并發(fā)揮以下作用的任何部分⑴提供可檢測(cè)信號(hào)；(ii)與第二標(biāo)記物相互作用以調(diào)整第一或第二標(biāo)記物提供的可檢測(cè)信號(hào)，例如FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)穩(wěn)定相互作用或增加與抗原或配體結(jié)合的親和力；(iv)通過(guò)電荷、疏水性、形狀或其他物理參數(shù)影響遷移率例如電泳遷移率或細(xì)胞通透性，或(V)提供捕獲部分以調(diào)節(jié)配體親和力，抗體結(jié)合作用或離子絡(luò)合。本文所用的立體化學(xué)定義和慣例通常遵循S. P. Parker編著McGraw-Hi 11Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hi 11 Book Company, New York ;以及 Eliel.E. ^PWilen. S. , Stereochemistry of Organic Compounds(1994)John ffiley&Sons,Inc.,New York。許多有機(jī)化合物以光學(xué)活性形式存在，即，它們具有轉(zhuǎn)動(dòng)平面偏振光的平面的能力。在描述光學(xué)活性化合物時(shí)，前綴D和L或R和S用來(lái)指明分子圍繞其手性中心的絕對(duì)構(gòu)型。前綴d和I或(+)和(-)用來(lái)命名該化合物轉(zhuǎn)動(dòng)平面偏振光的符號(hào)，其中(_)或I意指該化合物是左旋的。帶有前綴(+)或d的化合物是右旋的。對(duì)于給定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，這些立體異構(gòu)體是相同的，除了它們彼此是鏡像之外。一種特殊的立體異構(gòu)體也可以稱(chēng)作對(duì)映異構(gòu)體，并且此類(lèi)異構(gòu)體的混合物經(jīng)常稱(chēng)作對(duì)映體混合物。對(duì)映異構(gòu)體的50 50混合物稱(chēng)作消旋混合物或消旋物，這可以在化學(xué)反應(yīng)或過(guò)程中不存在立體選擇或立體專(zhuān)一性的情況下出現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)“消旋混合物”和“消旋物”指兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)種類(lèi)的等摩爾混合物，缺少光學(xué)活性。如本文所用，短語(yǔ)“可藥用鹽”指可藥用的有機(jī)鹽或無(wú)機(jī)鹽。示例性鹽包括但不限于硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸性磷酸鹽、異煙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸性檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來(lái)酸鹽、龍膽鹽、延胡索酸酯、葡萄糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、糖二酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽和雙羥萘酸鹽(即，1，I'-亞甲基雙-(2-羥基-3-萘甲酸鹽))。可藥用鹽可以涉及納入另一個(gè)分子如乙酸鹽離子、琥珀酸鹽離子或其他反離子。反離子可以是穩(wěn)定親本化合 物上電荷的任何有機(jī)或無(wú)機(jī)部分。另外，可藥用鹽可以在其結(jié)構(gòu)中具有多于一個(gè)帶電原子。其中多個(gè)帶電原子是可藥用鹽的部分的例子可以具有多個(gè)反離子。因而，可藥用鹽可以具有一個(gè)或多個(gè)帶電原子和/或一個(gè)或多個(gè)反離子?！翱伤幱玫娜軇┗铩敝敢粋€(gè)或多個(gè)溶劑分子和抗體的締合。形成可藥用溶劑化物的溶劑的實(shí)例包括但不限于水、異丙醇、乙醇、甲醇、DMS0、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。本文中使用以下縮寫(xiě)并且具有所示的定義BME是￠-巰基乙醇，Boc是N-(叔丁氧羰基)，cit是瓜氨酸(2-氨基-5-脲基戍酸),dap是多拉脯氨酸(dolaproine), DCC是1，3-二環(huán)己基碳二亞胺，DCM是二氯甲烷，DEA是二乙胺，DEAD是偶氮二甲酸二乙酯，DEPC是氰基磷酸二乙酯，DIAD是偶氮二甲酸二異丙酯，DIEA是N，N- 二異丙基乙胺，dil是多拉異亮氨酸(dolaisoleucine)，DMA是二甲基乙酰胺，DMAP是4-二甲氨基吡唆，DME是乙二醇二甲醚(或1,2-二甲氧基乙烷)，DMF是N，N-二甲基甲酰胺，DMSO是二甲基亞砜，doe是doIaphenine，dov是N，N- 二甲基纈氨酸，DTNB是5，5' - 二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，DTPA是二乙二胺五乙酸，DTT是二硫蘇糖醇，EDCI是I- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基鹽酸碳二亞胺，EEDQ是2-乙氧基-I-乙氧羰基-1，2- 二氫喹啉，ES-MS是電噴霧質(zhì)譜法，EtOAc是乙酸乙酯，F(xiàn)moc是N- (9-芴基甲氧羰基)，gly是甘氨酸，HATU是0- (7-氮雜苯并三唑_1_基-N，N，N’，N’ -四甲基脲鎗六氟磷酸鹽，HOBt是I-羥基苯并三唑，HPLC是高壓液相色譜，ile是異売氨酸，Iys是賴(lài)氨酸，MeCN(CH3CN)是乙臆，MeOH是甲醇，Mtr是4-甲氧節(jié)基二苯甲基(或4-甲氧基二苯甲基)，nor是(1S，2R) - (+)-去甲麻黃喊，PAB是對(duì)氨基節(jié)基氨基甲?；琍BS是磷酸鹽緩沖鹽水(pH7)，PEG是聚乙二醇，Ph是苯基，Pnp是對(duì)硝基苯基，MC是6-馬來(lái)酰亞胺己?；琾he是L-苯丙氨酸，PyBrop是溴化二卩比咯燒基磷鐵六氟磷酸鹽，SEC是大小排阻層析，Su是琥珀酰亞胺，TFA是三氟乙酸，TLC是薄層層析，UV是紫外線并且val是纈氨酸?！笆茉囌摺笔羌棺祫?dòng)物，如哺乳動(dòng)物，例如，人。哺乳動(dòng)物包括但不限于農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物(如奶牛)、競(jìng)賽動(dòng)物、寵物(如貓、犬和馬)、靈長(zhǎng)類(lèi)、小鼠和大鼠。
除非另外說(shuō)明，否則實(shí)施例中提到的市售試劑根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用。以下實(shí)施例中和遍及本說(shuō)明書(shū)中用ATCC登錄號(hào)所標(biāo)識(shí)的那些細(xì)胞的來(lái)源是美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas, VA。除非另外指出，否則本發(fā)明使用重組DNA技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法，如上文和以下教材中所述的那些方法Sambrook等人,上文；Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience,NY,1989)；Innis 等人，PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Academic Press,Inc. , NY, 1990) ;Harlow 等人，Antibodies :A Laboratory Manual (Cold Spring HarborPress, Cold Spring Harbor,1988) ；Gait, Oligonucleotide Synthesis(IRL Press,Oxford, 1984) ；Freshney, Animal Cell Culture, 1987 ;Coligan 等人，Current Protocolsin Immunology,1991o遍及本說(shuō)明書(shū)，詞匯“包含”或其變異形式如“包括了”或“包含有”應(yīng)理解為表示納入所陳述的整數(shù)或整數(shù)群，但不排除任何其它整數(shù)或整數(shù)群。 本文中定義或另外表征了許多其他術(shù)語(yǔ)。組合物和方法多特異性抗體和抗體類(lèi)似物為構(gòu)建如本文所述的多特異性抗體，包括雙特異性抗體和抗體類(lèi)似物，獲得了具有至少一個(gè)游離硫氫基的抗體片段。該抗體片段可以從如上文定義的親本抗體(包括半胱氨酸工程化抗體)獲得。親本抗體可以經(jīng)酶促消化以產(chǎn)生抗體片段。示例性酶促消化方法包括但不限于胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和Lys-C。示例性抗體片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab/ )2、Fv、雙體抗體(Db);串聯(lián)雙體抗體(taDb)、線性抗體(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，641，870，實(shí)施例 2 ;Zapata 等人，Protein Eng. 8 (10) :1057-1062(1995));單臂抗體、單一可變域抗體、微型抗體(Olafsen 等人(2004) Protein Eng. Design&Sel. 17 (4) :315-323)、單一鏈抗體分子、由Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(抗Id)抗體、CDR(互補(bǔ)決定區(qū))和表位結(jié)合片段?？贵w片段也可以作為編碼所述抗體片段的DNA片段被克隆至質(zhì)粒表達(dá)載體或噬菌粒載體中并且直接在大腸桿菌(E. Coli)中表達(dá)?？贵w酶促消化方法、DNA克隆和重組蛋白表達(dá)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且本文中提供了示例性方法?？贵w片段可以使用常規(guī)技術(shù)予以純化并且經(jīng)過(guò)還原以產(chǎn)生游離巰基。具有游離巰基的抗體片段與交聯(lián)劑例如雙馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)。將此類(lèi)交聯(lián)的抗體片段純化并且隨后與具有游離巰基的第二抗體片段反應(yīng)。將其中這兩個(gè)抗體片段交聯(lián)的終產(chǎn)物純化。在某些實(shí)施方案中，每個(gè)抗體片段是Fab，并且其中這兩個(gè)Fab經(jīng)雙馬來(lái)酰亞胺交聯(lián)的終產(chǎn)物在本文稱(chēng)作雙馬來(lái)酰亞氨基-(硫代-Fab)2或雙Fab。此類(lèi)多特異性抗體和抗體類(lèi)似物，包括雙Fab，可以用來(lái)快速地合成大量抗體片段組合或天然抗體的結(jié)構(gòu)性變體或特定抗體片段組合，并且用來(lái)在生物學(xué)測(cè)定法中篩選具有所需要活性的那些。半胱氨酸工稈化抗體已經(jīng)先前描述了半胱氨酸工程化抗體。美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2007/0092940和Junutula, J. R.等人，J Immunol Methods 332(1-2) :41-52 (2008)。半胱氨酸工程化抗體可以是親本抗體。這些親本抗體用于產(chǎn)生在特定位置內(nèi)、一般在恒定區(qū)例如Q*CH1中具有游離半胱氨酸的抗體片段。經(jīng)工程化以含有半胱氨酸的親本抗體在本文中稱(chēng)作“ThioMab”，并且從此類(lèi)半胱氨酸工程化抗體產(chǎn)生的Fab片段，無(wú)論產(chǎn)生方法是什么，均在本文中稱(chēng)作“ThioFab”。如先前描述(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2007/0092940和Junutula，J. R.等人，J ImmunolMethods 332(1-2) :41-52 [2008])，對(duì)具有替換的(“工程化”)半胱氨酸(Cys)殘基的突變體評(píng)價(jià)新導(dǎo)入的工程化半胱氨酸巰基的反應(yīng)性。巰基反應(yīng)性值是一個(gè)相對(duì)的在0至I. 0范圍內(nèi)的數(shù)字術(shù)語(yǔ)并且可以對(duì)任何半胱氨酸工程化抗體進(jìn)行測(cè)量。除具有反應(yīng)性巰基之夕卜，還應(yīng)當(dāng)選擇ThioMab從而它們保留抗原結(jié)合能力。先前詳細(xì)描述了半胱氨酸工程化抗體的設(shè)計(jì)、選擇和制備。美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2007/0092940和Junutula, J. R.等人,J ImmunolMethods 332(1-2) :41-52(2008)。下文列出此類(lèi)半胱氨酸工程化抗體的某些示例性輕鏈(LC)和重鏈(HC)的氨基酸序列和相應(yīng)的野生型序列(工程化半胱氨酸的位置以粗斜體顯示并且加下劃線)。因?yàn)閷⒐こ袒陌腚装彼釋?dǎo)入重鏈或輕鏈的恒定區(qū)中，所以應(yīng)當(dāng)理解下文為導(dǎo)入半胱氨酸至那些指明的抗體中所提供的位置可以用于含有這些恒定區(qū)或基本上相似的恒定區(qū)的任何抗體。I. HercLC (野生型)(SEQ ID NO. 1)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECI. HercLCllocys(SEQ ID NO. 2)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTCAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC2. HercLC205cys (SEQ ID NO. :3)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC4. HercHC (野生型)(SEQ ID NO. :4)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK5. HercHC118cys(SEQ ID NO. :5)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTCSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK6. 2C4LC(野生型)(SEQ ID NO. :6)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC7. 2C4LC110Cys (SEQ ID NO. :7)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTCAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC8. 2C4HC (VH-CHl)(野生型)(SEQ ID NO. :8)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHT9. 5A6HC (VH-CHl)(野生型)(SEQ ID NO. :9)EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSDAWMDWVRQSPERGLEWVAEIRSKPNNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMTSLRPEDTGIYYCTHFDYWGQGTTLTVSSAKTTGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT10. 5A6HC121c(SEQ ID NO. :10)EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSDAWMDWVRQSPERGLEWVAEIRSKPNNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMTSLRPEDTGIYYCTHFDYWGQGTTLTVSSCKTTGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT11. 5A6LC(野生型)(SEQ ID NO. :11)DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISGYLSWFQQKPDGTIKRLIYAASALDSGVPKRFSGSWSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYVSYPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC12. 5A6LC110Cys (SEQ ID NO. :12)DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISGYLSWFQQKPDGTIKRLIYAASALDSGVPKRFSGSWSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYVSYPLTFGAGTKVEIKRTCAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC13. 22E7HC (VH-CHl)(野生型)(SEQ ID NO. :13)EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPEKRLEWVATISGGNNYTFYPDNLKGRFTISRDNAKNILYLQISSLRSVDTALYYCASLWYRASFAYWGQGTLVTVSSAKTTGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT14. 22E7HCmc(SEQ ID NO. :14)EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPEKRLEWVATISGGNNYTFYPDNLKGRFTISRDNAKNILYLQISSLRSVDTALYYCASLWYRASFAYWGQGTLVTVSSCKTTGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT15. 22E7LC(野生型)(SEQ ID NO. :15)
DIMMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLISRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC16. 22E7LC110Cys(SEQ ID NO. :16)DIMMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLISRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPFTFGGGTKVEIKRTCAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC17. D1-5HC (VH-CHl)(野生型)(SEQ ID NO. :17)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTGNWIHWVRQAPGKGLEWVGEISPSGGYTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARESRVSYEAAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTH18. D1_5LC(野生型)(SEQ ID NO. :18)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYPTPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC19. Dl-5LC110Cys(SEQ ID NO. :19)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYPTPYTFGQGTKVEIKRTCAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC20. C3-10IHC (VH-CHl)(野生型)(SEQ ID NO. :20)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVGTINPYSGATDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAVGVFANRYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH21. C3_101LC(野生型)(SEQ ID NO. :21)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC22. C3-10ILCllocys(SEQ ID NO. :22)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPRTFGQGTKVEIKRTCAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC因?yàn)檫x擇半胱氨酸工程化抗體以保留它們的野生型親本抗體對(duì)應(yīng)物的抗原結(jié)合能力，因此它們能夠與抗原特異性結(jié)合。此類(lèi)抗原包括例如腫瘤相關(guān)抗原(TAA)、細(xì)胞表面受體蛋白和其他細(xì)胞表面分子、跨膜蛋白、信號(hào)傳導(dǎo)蛋白、細(xì)胞存活調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)因子、與(例如已知或疑似在功能上有助于)組織發(fā)育或分化相關(guān)的分子、淋巴因子、細(xì)胞因子、參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的分子、參與血管發(fā)生的分子和與(例如已知或疑似在功能上有助于)血管生成相關(guān)的分子。腫瘤相關(guān)抗原可以是簇分化因子(即，CD蛋白)。半胱氨酸工程化抗體能夠結(jié)合的抗原可以是上述分類(lèi)之一的子類(lèi)中的成員，其中所述分類(lèi)的其它子類(lèi)包含(相對(duì)于目的抗原)具有不同特征的其他分子/抗原。親本抗體也可以是選自如通過(guò)引用方式明確并入本文的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，821，337的表 3 中所述的 huMAb4D5-l、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7 和 huMAb4D5-8(曲妥珠單抗，HERCEPTIN導(dǎo))的人源化抗體;人源化520C9(W0 93/21319)和人源化2C4抗體。多功能的多特異性抗體和 抗體類(lèi)似物多特異性抗體和抗體類(lèi)似物可以用改性交聯(lián)劑合成，從而額外的功能部分可以與所述多特異性抗體或抗體類(lèi)似物連接。改性交聯(lián)劑允許任何硫氫基反應(yīng)性部分的連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，N-琥珀酰亞氨基-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)與雙馬來(lái)酰亞胺連接以形成雙馬來(lái)酰亞氨基-乙酰硫代乙酸酯(BMata)。在掩蔽的巰基脫保護(hù)后，可以連接具有硫氫基反應(yīng)性(或巰基反應(yīng)性)部分的任何官能團(tuán)。示例性巰基反應(yīng)性試劑包括多功能接頭試劑、捕獲劑即親和力標(biāo)記物試劑(例如，生物素-接頭試劑)、檢測(cè)標(biāo)記物(例如熒光團(tuán)試劑)、固相固定試劑(例如SEPHAR0SE 、聚苯乙烯或玻璃)或藥物-接頭中間體。巰基反應(yīng)性試劑的一個(gè)實(shí)例是N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)。具有改性交聯(lián)劑的此類(lèi)多特異性抗體或抗體類(lèi)似物可以進(jìn)一步與藥物部分試劑或其他標(biāo)記物反應(yīng)。多特異性抗體或抗體類(lèi)似物與藥物-接頭中間體的反應(yīng)分別地提供了多特異性抗體-藥物綴合物或抗體類(lèi)似物-藥物綴合物。這種方法可以適用于綴合其中反應(yīng)基團(tuán)是例如馬來(lái)酰亞胺、碘乙酰胺、吡啶基二硫化物的其他巰基反應(yīng)試劑或其他巰基反應(yīng)性綴合配偶物(Haugland，2003，MolecularProbes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, MolecularProbes, Inc. ；Brinkley,1992, Bioconjugate Chem. 3 :2 ；Garman,1997, Non-RadioactiveLabelling APractical Approach, Academic Press, London ；Means (1990)BioconjugateChem. I 2 ；Hermanson, G.弓I 自 Bioconjugate Techniques(1996)Academic Press, SanDiego，第40-55,643-671頁(yè))。配偶物可以是細(xì)胞毒性劑(例如毒素如多柔比星或百日咳毒素)、熒光團(tuán)如熒光染料如熒光素或羅丹明、用于成像性金屬或放療性金屬的螯合劑、肽?；蚍请孽；鶚?biāo)記物或檢測(cè)標(biāo)簽、或清除率調(diào)節(jié)劑如聚乙二醇的多種異構(gòu)體、與第三組分結(jié)合的肽或者另一種碳水化合物或親脂物質(zhì)。白蛋白結(jié)合妝(ABP)序列(Dennis等人(2002)“Albumin Binding As A GeneralStrategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins(作為一般策略用于改善蛋白質(zhì)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的白蛋白結(jié)合作用).” J Biol Chem. 277 :35035-35043 ；W001/45746)也可以與具有改性交聯(lián)劑的多特異性抗體或抗體類(lèi)似物反應(yīng)。示例性ABP序列在(i)Dennis 等人(2002) JBiol Chem. 277 :35035-35043 的表 III 和 IV 處，第 35038 頁(yè)中；(ii)US20040001827 的
SEQ ID NOS :9-22 處；和(iii)WO 01/45746 在第 12-13 頁(yè)SEQ ID NOS zl-zl4 處描述。誘變編碼起始多肽的氨基酸序列變體的DNA由本領(lǐng)域已知的多種方法制備。這些方法包括但不限于通過(guò)位點(diǎn)定向(或寡核苷酸介導(dǎo))誘變、PCR誘變和盒誘變?cè)缙谥苽涞木幋a所述多肽的DNA來(lái)制備。也可以通過(guò)限制性片段操作或通過(guò)采用合成性寡核苷酸的重疊延伸PCR，構(gòu)建重組抗體的變體。誘變引物編碼了半胱氨酸密碼子替換。標(biāo)準(zhǔn)的誘變技術(shù)可以用來(lái)產(chǎn)生編碼此類(lèi)突變體半胱氨酸工程化抗體的DNA。一般指導(dǎo)可以在Samtoook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor, N. Y. , 1989 ;和 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York, N. Y. , 1993 中找到。位點(diǎn)定向誘變法是一種制備置換變體即突變體蛋白的方法。該技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的(見(jiàn)例如，Carter (1985)等人，Nucleic Acids Res. 13 :4431-4443 ;Ho 等人,(1989)Gene (Amst.) 77 :51-59 ;和 Kunkel 等人(1987) Proc Natl Acad Sci USA 82 :488)。簡(jiǎn)而言之，在實(shí)施DNA的位點(diǎn)定向誘變時(shí)，首先通過(guò)編碼所需突變的寡核苷酸與起始DNA的單鏈雜交，改變這種起始DNA。在雜交后，使用雜交的寡核苷酸作為引物并且使用起始DNA的單鏈作為模板，用DNA聚合酶來(lái)合成完整的第二鏈。因而，將編碼所需突變的寡核苷酸摻入所得到的雙鏈DNA中。位點(diǎn)定向誘變可以在表達(dá)質(zhì)粒中表達(dá)待誘變蛋白質(zhì)的基因內(nèi)部實(shí)施，并且所得到的質(zhì)?？梢赃M(jìn)行測(cè)序以證實(shí)導(dǎo)入合乎需要的半胱氨酸替換突變(Liu等人，1998)J. Biol. Chem. 273 :20252-20260)。位點(diǎn)定向誘變的操作方案和模式包括那些市售操作方案和模式，例如Quik Change 多重位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖?Stratagene, La Jolla, CA)。 PCR誘變也適于制造起始多肽的氨基酸序列變體。見(jiàn)Higuchi，(1990)PCRProtocols,第 177-183 頁(yè)，Academic Press ;Ito 等人(1991)Genel02 :67-70 ;Bernhard 等人(1994)Bioconjugate Chem. 5 :126-132 ；和 Vallette 等人(1989)Nuc. Acids Res. 17 723-733中。簡(jiǎn)而言之，當(dāng)使用少量模板DNA作為PCR中的起始材料時(shí)，可以使用在序列方面與模板DNA中相應(yīng)區(qū)域略微不同的引物以產(chǎn)生相對(duì)大的量的特定DNA片段，所述特定DNA片段與模板序列僅在該引物與所述模板不同的位置處不同。用于制備變體的另一種方法即盒誘變法基于Wells等人(1985)Gene34 :315-323描述的技術(shù)。起始材料是包含待突變的起始多肽DNA的質(zhì)粒(或其他載體)。確定起始DNA中待突變的密碼子。在確定的突變位點(diǎn)的每一側(cè)必須有獨(dú)特的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。如果不存在此類(lèi)限制性位點(diǎn)，則可以通過(guò)這種方式產(chǎn)生它們使用上述的寡核苷酸誘變方法以在起始多肽DNA中的適宜位置導(dǎo)入此類(lèi)限制性位點(diǎn)。將質(zhì)粒DNA在這些位點(diǎn)處切割以使質(zhì)粒線性化。使用標(biāo)準(zhǔn)方法合成這樣的雙鏈寡核苷酸，其編碼所述DNA在限制性位點(diǎn)之間的序列，但是含有合乎需要的突變，其中分別合成所述寡核苷酸的兩條鏈并且隨后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使它們雜交在一起。這種雙鏈寡核苷酸稱(chēng)作盒。這種盒設(shè)計(jì)為具有與線性化質(zhì)粒的末端相容的5'和3'端，從而它可以與該質(zhì)粒直接連接。這種質(zhì)?，F(xiàn)在含有突變的DNA序列。可以通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)含有所編碼的半胱氨酸替換的突變體DNA。使用雙鏈質(zhì)粒DNA作為模板，借助基于PCR的誘變，還通過(guò)寡核苷酸定向誘變法產(chǎn)生單一突變(Sambrook 和 Russel, (2001)Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 3版；Zoller 等人(1983)Methods EnzymoI. 100 :468-500 ；Zoller, M. J.和 Smith, M. (1982)NucI.Acids Res. 10 :6487-6500)。寡核苷酸由亞磷酰胺合成法制備(US 4415732 ；US 4458066 ；Beaucage,S.和 Iyer, R. (1992) “Advances in the synthesis of oligonucleotides by thephosphoramidite approach (亞憐酸胺法合成寡核苷酸的進(jìn)展)”，Tetrahedron 48 2223-2311)。亞磷酰胺方法能夠輪換添加具有反應(yīng)性3'亞磷酰胺部分的核苷酸單體單元至固相支持物上正在生長(zhǎng)的寡核苷酸鏈，所述固相支持物由可控孔度玻璃或高度交聯(lián)的聚苯乙烯組成，并且最常見(jiàn)地以3'端核苷在合成開(kāi)始時(shí)與固相支持物連接的3'至5'方向添加(US5047524 ;US 5262530)。該方法通常使用自動(dòng)化市售合成儀(AppliedBiosystems, Foster City, CA)實(shí)施。可以將寡核苷酸用非同位素部分以化學(xué)方式標(biāo)記用于檢測(cè)、捕獲、穩(wěn)定或其他目的(Andrus, A. “Chemical methods for 5 ' non-isotopiclabeling of PCR probes and primers (用于5'非同位素標(biāo)記PCR探針和引物的化學(xué)方法)”(1995),引自 PCR 2 A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford,第 39-54 頁(yè)；Hermanson, G.弓丨自 Bioconjugate Techniques(1996)Academic Press, SanDiego,第 40-55,643-671 頁(yè)；Keller, G.和 Manak, M.引自 DNA Probes 第 2 版(1993)，Stockton Press, New York,第 121-23 頁(yè))。對(duì)抗體中反應(yīng)性半胱氨酸基團(tuán)的檢測(cè)可以使用如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2007/0092940和 Junutula，J. R.等人，J Immunol Methods 332(1-2) :41-52(2008)中所述的 ELISA 噬菌 體模式(PHESELECT0R[用于選擇反應(yīng)性巰基的噬菌體ELISA])來(lái)實(shí)施。蛋白質(zhì)表達(dá)和純化使用常規(guī)方法(例如，通過(guò)使用能夠與編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)，輕易地分離編碼抗體或抗體片段的DNA。雜交瘤細(xì)胞可以充當(dāng)此DNA的來(lái)源。一旦分離，可以將所述DNA置于表達(dá)載體中，隨后將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至不產(chǎn)生抗體蛋白的宿主細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或其他哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞如骨髓瘤細(xì)胞(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，807，715 ;美國(guó)公開(kāi)號(hào)2005/0048572和2004/0229310)中，以獲得單克隆抗體在重組宿主細(xì)胞中的合成。關(guān)于細(xì)菌中重組表達(dá)編碼抗體的 DNA 的綜述包括 Skerra 等人(1993)Curr. Opinion in Immunol. 5 :256-262 和Pliickthun (1992) Immunol. Revs. 130 :151-188?？梢酝ㄟ^(guò)⑴在細(xì)菌系統(tǒng)(例如大腸桿菌)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(W001/00245)例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中表達(dá)；并且(ii)使用常見(jiàn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)(Lowman 等人(1991) J. Biol. Chem. 266(17) =10982-10988)純化，產(chǎn)生具有高度反應(yīng)的非配對(duì)Cys殘基的半胱氨酸工程化抗體(例如ThioFab)。示例性純化方法包括在免疫親和層析柱或離子交換柱上分級(jí)、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(例如DEAE)上層析、聚焦層析、SDS-PAGE、硫酸銨沉淀和例如使用Sephadex G-75的凝膠過(guò)濾。在一個(gè)方面，在固相上固定的蛋白A用于本發(fā)明全長(zhǎng)抗體產(chǎn)物的免疫親和純化。蛋白A是來(lái)自黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的41kD胞壁蛋白，其以高親和力與抗體的Fe區(qū)結(jié)合。Lindmark等人，(1983) J. Immunol. Meth. 62 :1-13。固定有蛋白A的固相優(yōu)選地是包含玻璃或二氧化硅表面的柱，更優(yōu)選地是可控孔度玻璃柱或硅酸柱。在一些應(yīng)用中，所述柱已經(jīng)用試劑如甘油涂敷，試圖防止雜質(zhì)的非特異性黏附。作為純化的第一步驟，將源自如上文所述的細(xì)胞培養(yǎng)物的制備物施加到蛋白A固定的固相上，以允許目的抗體與蛋白A特異性結(jié)合。隨后洗滌該固相以除去與固相非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。目的抗體可以通過(guò)洗脫入含有離液劑或溫和洗滌劑的溶液從固相回收。示例性離液劑和溫和洗滌劑包括但不限于鹽酸胍、脲、高氯酸鋰、精氨酸、組氨酸、SDS(十二烷基硫酸鈉)、吐溫、Triton和NP-40,它們?nèi)烤鞘惺鄣摹？贵w從該柱(例如,mAbSure柱)洗脫后稀釋至含有離液劑或溫和洗滌劑的溶液中維持了洗脫后抗體的穩(wěn)定性并且允許如本文所述的進(jìn)一步操作。標(biāo)記的多特異性抗體和抗體類(lèi)似物本發(fā)明的多特異性抗體和抗體類(lèi)似物，尤其是用具有游離硫氫基的改性交聯(lián)劑合成的那些，可以與任何標(biāo)記物部分綴合，所述標(biāo)記物部分可以通過(guò)反應(yīng)性半胱氨酸巰基與抗體共價(jià)連接(Singh 等人(2002)Anal. Biochem. 304 :147-15 ；Harlow E.和 Lane,
D.(1999)Using Antibodies A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY ；LundbIad R. L. (1991)Chemical Reagents for ProteinModification,第2版CRC Press,Boca Raton,FL)。連接的標(biāo)記物可以發(fā)揮以下功能(i)提供可檢測(cè)信號(hào)；(ii)與第二標(biāo)記物相互作用以調(diào)整第一或第二標(biāo)記物提供的可檢測(cè)信
號(hào)，例如，以產(chǎn)生FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)穩(wěn)定相互作用或增加與抗原或配體結(jié)合的親和力；(iv)通過(guò)電荷、疏水性、形狀或其他物理參數(shù)影響遷移率例如電泳遷移率或細(xì)胞通透性，或(V)提供捕獲部分以調(diào)節(jié)配體親和力，抗體/抗原結(jié)合作用或離子絡(luò)合。標(biāo)記的多特異性抗體可以用于診斷測(cè)定中，例如，用于檢測(cè)特定細(xì)胞、組織或血清中目的抗原的表達(dá)。對(duì)于診斷性應(yīng)用，抗體一般將用可檢測(cè)的部分標(biāo)記。眾多標(biāo)記物是可用的，它們通?？梢詣澐殖梢韵骂?lèi)別(a)放射性同位素(放射性核素)，3H、llC、14C、18F、32p、35S、64Cu、68Ga、86Y、99Tc、mIn、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Ln、211At或213Bi。放射性同位素標(biāo)記的抗體用于受體靶向的成像實(shí)驗(yàn)中。使用Current Protocols in Immunology,第I和第2卷，Coligen等人編著，ffiley-Interscience, New York, NY, Pubs. (1991)中所述的技術(shù)，抗體可以用結(jié)合、螯合或絡(luò)合了放射性同位素金屬的配體試劑標(biāo)記，其中所述試劑與抗體的工程化半胱氨酸巰基反應(yīng)?？梢越j(luò)合金屬離子的螯合配體包括D0TA、DOTP, DOTMA, DTPA和TETA(Macrocyclics，Dallas, TX) 放射性核素可以與本發(fā)明的抗體-藥物綴合物絡(luò)合被導(dǎo)引靶向(Wu等人(2005)Nature Biotechnology 23(9) :1137-1146)。合適作為成像實(shí)驗(yàn)用抗體標(biāo)記物的金屬-螯合絡(luò)合物(Metal-chelatecomplexe)在以下文獻(xiàn)中公開(kāi)美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，342，606 ;5，428，155 ;5，316，757 ；5，480，990 ;5，462，725 ;5，428，139 ;5，385，893 ;5，739，294 ;5，750，660 ;5，834，456 ；Hnatowich 等人(1983)J. Immunol. Methods 65 :147-157 ;Meares 等人(1984)Anal.Biochem. 142 :68-78 ；Mirzadeh 等人(1990)Bioconjugate Chem. I :59-65 ；Meares 等人(1990)J. Cancer, SuppI. 10 :21-26 ；Izard 等人(1992)Bioconjugate Chem. 3 :346-350 ；Nikula 等人(1995) Nucl. Med. Biol. 22 :387-90 ；Camera 等人(1993) Nucl. Med. Biol. 20 955-62 ;Kukis 等人(1998) J. Nucl. Med. 39 :2105-2110 ;Verel 等人(2003) J. Nucl. Med. 44 1663-1670 ;Camera 等人(1994)J. Nucl. Med. 21:640-646 ;Ruegg 等人(1990)CancerRes. 50 :4221-4226 ;Verel 等人(2003) J. Nucl. Med. 44 :1663-1670 ;Lee 等人(2001) CancerRes. 61:4474-4482 ；Mitchell,等人(2003)J. Nucl. Med. 441105-1112 ；Kobayashi 等人(1999) Bioconjugate Chem. 10 :103-111 ;Miederer 等人(2004) J. Nucl. Med. 45 :129-137 ；DeNardo 等人(1998)Clinical Cancer Research 4 :2483-90 ;Blend 等人(2003)CancerBiotherapy & Radiopharmaceuticals 18 :355-363 ;Nikula 等人(1999) J. Nucl. Med. 40 :166-76 ；Kobayashi 等人(1998) J. Nucl. Med. 39 :829-36 ；Mardirossian 等人(1993) Nucl.Med. Biol. 20 :65-74 ;Roselli 等人(1999)Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals,14 209-20o(b)熒光標(biāo)記物如稀土元素螯合物(銪螯合物)、熒光素型，包括FITC、5_羧基熒光素、6-羧基熒光素；羅丹明型，包括TAMRA ;丹磺酰；麗絲胺；花箐；藻紅蛋白；得克薩斯紅；及其類(lèi)似物。突光標(biāo)記物可以使用在例如上文Current Protocols in Immunology中公開(kāi)的技術(shù)與抗體綴合。突光染料和突光標(biāo)記物試劑包括從Invitrogen/MolecularProbes (Eugene, OR)和 Pierce Biotechnology, Inc (Rockford, IL)市售的那些。(c)多種酶-底物標(biāo)記物是可獲得的或公開(kāi)的(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，275，149)。酶通常催化生色底物的化學(xué)改變，其中可以使用多種技術(shù)測(cè)量所述化學(xué)改變。例如，酶可以催化底物中可以按分光光度形式測(cè)量的顏色變化。備選地，酶可以改變底物的熒光或化學(xué)發(fā)光。上文描述了用于量化熒光變化的技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光底物因化學(xué)反應(yīng)被電子激發(fā)并且可以隨后發(fā)射(例如使用化學(xué)發(fā)光計(jì))可測(cè)量的光或饋贈(zèng)能量至熒光受體。酶標(biāo)記物的實(shí)例包括螢光素酶(例如，螢火蟲(chóng)螢光素酶和細(xì)菌螢光素酶；US 4737456)、螢光素、2，3-二氫酞嗪二酮、 蘋(píng)果酸脫氫酶、脲酶、過(guò)氧化物酶如辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、3 -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過(guò)氧化物酶、微過(guò)氧化物酶等。用于酶與抗體綴合的技術(shù)在 0' Sullivan 等人(1981) “Methods for the Preparation ofEnzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay (制備用于酶免疫測(cè)定法中的酶綴合物的方法)”，引自Methods in Enzym. (J. Langone和H. Van Vunakis編著)，Academic Press, New York, 73 147-166 中描述。酶-底物組合的實(shí)例包括，例如(i)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)連同作為底物的過(guò)氧化氫酶，其中所述過(guò)氧化氫酶氧化染料前體(例如，鄰苯二胺(OPD)或3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(TMB))；(ii)堿性磷酸酶(AP)連同對(duì)硝基苯磷酸酯作為生色底物；和(iii) ^ -D-半乳糖苷酶-D-Gal)連同生色底物(例如，對(duì)硝基苯基-P -D-半乳糖苷酶)或熒光底物4-甲基傘形基-P -D-半乳糖苷酶。眾多其他酶-底物組合是本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的。對(duì)于一般綜述，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4，275，149 和 4，318，980。標(biāo)記物可以間接地與多特異性抗體或抗體類(lèi)似物綴合。例如，抗體可以與生物素綴合并且上文提到的三大類(lèi)別標(biāo)記物中任一者可以與抗生物素蛋白或鏈霉親和素綴合，或反之亦然。生物素選擇性地與鏈霉親和素結(jié)合，并且因而標(biāo)記物可以以這種間接方式與抗體綴合。備選地，為實(shí)現(xiàn)標(biāo)記物與多肽變體間接綴合，多肽變體與小的半抗原(例如，地高辛)綴合并且上文提到的不同類(lèi)型的標(biāo)記物之一與抗半抗原多肽變體(例如，抗地高辛抗體)綴合。因而，可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記物與多肽變體的間接綴合(Hermanson，G. (1996)，引自Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego)。此類(lèi)標(biāo)記的多特異性抗體或標(biāo)記的抗體類(lèi)似物可以用于任何已知的測(cè)定法中，如E LISA、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法、直接和間接夾心測(cè)定法和免疫沉淀測(cè)定(Z OI a，(I 98 7)Monoclonal Antibodies A Manual of Techniques,第 147-158 頁(yè)，CRC Press, Inc.)0檢測(cè)標(biāo)記物可以用于定位、可視化和量化結(jié)合事件或識(shí)別事件。本發(fā)明的標(biāo)記的多特異性抗體和標(biāo)記的抗體類(lèi)似物可以檢測(cè)細(xì)胞表面受體。以可檢測(cè)方式標(biāo)記的抗體的另一個(gè)用途是基于珠的免疫捕獲法，其包括將珠與熒光標(biāo)記的抗體綴合并且一旦結(jié)合配體則檢測(cè)到熒光信號(hào)。類(lèi)似的結(jié)合作用檢測(cè)方法利用表面等離子體共振(SPR)效應(yīng)以測(cè)量并檢測(cè)抗體-抗原相互作用。檢測(cè)標(biāo)記物如突光染料和化學(xué)發(fā)光染料(Briggs等人(1997) “Synthesis ofFunctionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids(官能化突光染料的合成和它們與胺和氨基酸的偶聯(lián))”，J. Chem. Soc. , Perkin-Trans. I 1051-1058)提供了可檢測(cè)的信號(hào)，并且通常適用于標(biāo)記抗體，一般具有以下特性(i)標(biāo)記的抗體應(yīng)當(dāng)在低背景情況下產(chǎn)生極高信號(hào)，從而可以在無(wú)細(xì)胞和基于細(xì)胞的測(cè)定法中靈敏地檢測(cè)到少量抗體；和(ii)標(biāo)記的抗體應(yīng)當(dāng)是光穩(wěn)定的，從而可以觀察、監(jiān)測(cè)和記錄熒光信號(hào)，而沒(méi)有明顯的光漂白。對(duì)于涉及標(biāo)記抗體與膜或細(xì)胞表面(尤其活細(xì)胞)的細(xì)胞表面結(jié)合作用的應(yīng)用，標(biāo)記物一般(iii)具有良好的水溶性以實(shí)現(xiàn)有效的綴合物濃度和檢測(cè)靈敏度和(iv)對(duì)活細(xì)胞無(wú)毒，從而不破壞細(xì)胞的正常代謝過(guò)程或造成成熟前細(xì)胞死亡。直接定量細(xì)胞熒光強(qiáng)度和列舉熒光標(biāo)記事件，例如肽-染料綴合物的細(xì)胞表面結(jié) 合可以在采用活細(xì)胞或珠的自動(dòng)混合和讀取、非放射性測(cè)定的系統(tǒng)(FMAT 8100HTS系統(tǒng)，Applied Biosystems, Foster City, Calif.)上實(shí)施(Miraglia, “Homogeneouscell-and bead-based assays for high throughput screening using fluorometricmicrovolume assay technology(使用突光計(jì)量微體積分析技術(shù)高通量篩選的基于細(xì)胞和基于珠的均相測(cè)定法)”(1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204)。標(biāo)記抗體的用途還包括細(xì)胞表面受體結(jié)合測(cè)定、免疫捕獲測(cè)定法、熒光關(guān)聯(lián)的免疫吸附測(cè)定(FLISA)、胱天蛋白酶切割測(cè)定法(Zheng, “胱天蛋白酶_3控制與Fas介導(dǎo)的體內(nèi)凋亡相關(guān)的胞質(zhì)事件和胞核事件”，(1998)Proc Natl Acad Sci USA95 :618-23 ;US 6372907)、凋亡測(cè)定法(Vermes, “A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detectionof phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluoresceinlabeled Annexin V(—種新的凋亡測(cè)定法使用突光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V流式細(xì)胞檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞上的磷脂酰絲氨酸表達(dá))” (1995) J. Immunol. Methods 184 :39-51)和細(xì)胞毒測(cè)定法。借助靶向細(xì)胞表面的分子，熒光計(jì)量微體積測(cè)定技術(shù)可以用來(lái)鑒定上調(diào)或下調(diào)(Swartzman,“A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughputscreening using fluorometric micro volume assay technology (使用突光計(jì)量微體積分析技術(shù)高通量篩選的均相和多重免疫測(cè)定法)”，(1999) Anal. Biochem. 271 :143-51)。本發(fā)明的標(biāo)記的多特異性抗體和標(biāo)記的抗體類(lèi)似物被生物醫(yī)學(xué)成像和分子成像的多種方法和技術(shù)用作成像用生物標(biāo)記物和探針，如(i)MRI (磁共振成像術(shù))；(ii)MicroCT (計(jì)算機(jī)化斷層X(jué)射線照相法)；(iii) SPECT (單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)化斷層X(jué)射線照相法)；(iv)PET(正電子發(fā)射斷層照相術(shù))Chen等人(2004)Bioconjugate Chem. 15 41-49 ; (V)生物發(fā)光；(vi)熒光；和(vii)超聲波。免疫閃爍照相術(shù)是一種成像方法，其中將放射性物質(zhì)標(biāo)記的抗體施用至動(dòng)物或人患者并且拍攝身體內(nèi)抗體存在的部位的畫(huà)面(US6528624)。成像用生物標(biāo)記物可以客觀地測(cè)量并且作為正常生物學(xué)過(guò)程、發(fā)病過(guò)程或治療性介入的藥理學(xué)反應(yīng)的指示物進(jìn)行評(píng)價(jià)。生物標(biāo)記物可以具有幾個(gè)類(lèi)型0型是疾病的自然歷史標(biāo)記物并且與已知的臨床指標(biāo)縱向相關(guān)，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中MRI評(píng)價(jià)滑膜炎癥；1型標(biāo)記物根據(jù)作用機(jī)制捕獲介入治療的效果，即便該機(jī)制可能與臨床結(jié)果不相關(guān)；11型標(biāo)記充當(dāng)替代終點(diǎn)，其中生物標(biāo)記物的變化或來(lái)自生物標(biāo)記的信號(hào)預(yù)測(cè)出“確認(rèn)”靶向應(yīng)答的臨床益處，如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中由CT測(cè)量的骨侵蝕。成像用生物標(biāo)記物因而可以提供關(guān)于以下方面的藥物動(dòng)力學(xué)(PD)治療信息(i)靶蛋白的表達(dá)、(ii)治療藥與靶蛋白的結(jié)合，即選擇性、和(iii)清除率和半壽期藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。相對(duì)于基于標(biāo)記物的生物標(biāo)記物而言，體內(nèi)成像用生物標(biāo)記物的優(yōu)點(diǎn)包括非侵入性治療、可定量、完整身體評(píng)估、反復(fù)給藥和評(píng)估(即多個(gè)時(shí)間點(diǎn))和從臨床前結(jié)果(小動(dòng)物)至臨床結(jié)果(人)結(jié)果的潛在可轉(zhuǎn)移效果。對(duì)于一些應(yīng)用，生物成像法取代了臨床前研究中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或使其數(shù)目最小化。放射性核素成像標(biāo)記物包括放射性核素如3H、nC、14C、18F、32p、35S、64Cu、68Ga、86Y、99TC、mIn、123I、124I、125I、mI、133Xe、177LU、211At或213Bi。放射性核素金屬離子可以與螯合接頭如DOTA絡(luò)合。接頭試劑如DOTA-馬來(lái)酰亞胺(4-馬來(lái)酰亞氨基丁酰氨基芐基-D0TA)可以通過(guò)氨基芐基-DOTA與氯甲酸異丙酯(Aldrich)活化的4-馬來(lái)酰亞氨基丁酸(Fluka)的反應(yīng)，遵循 Axworthy 等人(2000) Proc Natl Acad Sci USA97 (4) :1802-1807)的方法來(lái)制備。DOTA-馬來(lái)酰亞胺試劑與本發(fā)明的多特異性抗體或抗體類(lèi)似物的改性交聯(lián)劑的游離硫氫基反應(yīng)并且產(chǎn)生在抗體上的金屬絡(luò)合配體(Lewis等人(1998)Bioconj. Chem. 9 :72-86)。 螯合接頭標(biāo)記試劑如DOTA-NHS (I，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷_(kāi)1，4，7，10-四乙酸單(N-羥琥珀酰亞胺酯)是市售的(大環(huán)類(lèi)，Dallas，TX)。采用放射性核素標(biāo)記抗體的受體靶成像法可以通過(guò)檢測(cè)和量化抗體在腫瘤組織中進(jìn)行性積累而提供途徑活化的標(biāo)記(Albert等人(1998)Bioorg. Med. Chem. Lett. 8 =1207-1210)。綴合的放射性金屬可以在溶酶體降解后留在胞內(nèi)。妝標(biāo)記方法是熟知的。見(jiàn)Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc. ；Brinkley,1992,Bioconjugate Chem. 3 :2 ；Garman,(1997)Non-Radioactive Labelling A PracticalApproach, Academic Press, London ；Means (1990) Bioconjugate Chem. I :2 ；Glazer 等人(1975)Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology(T. S. Work 和 E. Work 編著)American Elsevier PublishingCo. , New York ；Lundblad, R. L.和 Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for ProteinModification,第 I 卷和第 II 卷，CRC Press, New York ；Pfleiderer, G. (1985) “ChemicalModification of Proteins”，Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche編著，Walter DeGryter, Berlin and New York ;和 Wong (1991) Chemistry of ProteinConjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla. ) ；De Leon-Rodriguez 等人(2004) Chem. Eur. J. 10 :1149-1155 ;Lewis等人(2001)Bioconjugate Chem. 12 :320-324 ；Li 等人(2002) Bioconjugate Chem. 13 :110-115 ;Mier 等人(2005) Bioconjugate Chem. 16 240-237。用足夠接近的兩個(gè)部分即熒光報(bào)道分子和猝滅劑標(biāo)記的肽和蛋白質(zhì)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。報(bào)道分子基團(tuán)一般是熒光染料，所述熒光染料由光在某些波長(zhǎng)上激發(fā)并且將能量轉(zhuǎn)移至受體或猝滅劑基團(tuán)，伴隨以最大亮度發(fā)射的適宜斯托克位移。熒光染料包括具有延長(zhǎng)的芳香度的分子，如熒光素和羅丹明，及它們的衍生物。熒光報(bào)道分子可以部分地或明顯地被完整肽中的猝滅劑部分猝滅。在所述肽由肽酶或蛋白酶裂解后，則可以測(cè)量到突光的可檢測(cè)增加(Knight, C. (1995) “Fluorimetric Assays of ProteolyticEnzymes (蛋白裂解酶的突光計(jì)量測(cè)定)”, Methods in Enzymology, Academic Press, 248 18-34)。本發(fā)明的標(biāo)記的多特異性抗體和標(biāo)記的抗體類(lèi)似物也可以用作親和純化劑。在這種方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法，將標(biāo)記的抗體固定在固相如Sephadex樹(shù)脂或?yàn)V紙上。固定抗體與含有待純化抗原的樣品接觸，并且支持物此后用將除去樣品中除待純化抗原之外的基本上全部物質(zhì)的合適溶劑洗滌，其中所述的待純化抗原與固定的多肽變體結(jié)合。最后，支持物用另一種將使抗原從多肽變體中釋放的合適溶劑如甘氨酸緩沖液，PH5. 0洗滌。標(biāo)記試劑一般地?cái)y帶反應(yīng)性官能團(tuán)，其可以(i)與改性交聯(lián)劑的游離硫氫基直接反應(yīng)以形成標(biāo)記的多特異性抗體或標(biāo)記的抗體類(lèi)似物或(ii)與接頭抗體反應(yīng)以形成標(biāo)記的抗體。標(biāo)記試劑的反應(yīng)性官能團(tuán)包括馬來(lái)酰亞胺、鹵代乙?；?、碘乙酰胺琥珀酰亞胺酯(例如NHS、N-羥珀酰亞胺)、異硫氰酸酯、磺酰氯、2，6- 二氯三嗪基、五氟苯基酯和亞磷酰胺，不過(guò)也可以使用其他官能團(tuán)。 示例的反應(yīng)性官能團(tuán)是可檢測(cè)標(biāo)記物例如生物素或熒光染料的羧基取代基的N-羥珀酰亞胺酯(NHS)。標(biāo)記物的NHS酯可以預(yù)形成、分離、純化和/或表征，或它可以原位形成并且與抗體的親核基團(tuán)反應(yīng)。一般，通過(guò)以下方式活化標(biāo)記物的羧基形式與碳二亞胺試劑(例如二環(huán)己基碳二亞胺、二異丙基碳二亞胺)或脲傭試劑(例如TSTU(0-(N-琥珀酰亞氨基)-N，N，N'，N'-四甲基脲鐵四氟硼酸鹽)、HBTU(0-苯并三唑-I-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲懲六氟磷酸鹽)或HATU (0-(7-氮雜苯并三唑-I-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲猶六氟磷酸鹽)、活化劑(如I-羥基苯并三唑(HOBt)和N-羥基琥珀酰亞胺)的一些組合反應(yīng)以產(chǎn)生標(biāo)記物的NHS酯。在一些情況下，可以通過(guò)以下方式偶聯(lián)標(biāo)記物和抗體原位活化標(biāo)記物并且與抗體反應(yīng)以在一個(gè)步驟中形成標(biāo)記物綴合物。其他活化和偶聯(lián)試劑包括TBTU(2-(1H-苯并三唑)-1-1，3，3_四甲基脲德六氟磷酸鹽)、TFFH(N，N'，N"，N"'-四甲基脲德2-氟-六氟磷酸鹽)、PyB0P (苯并三唑-I-基-氧基-三吡咯烷基-磷馕六氟磷酸鹽)、EEDQ (2-乙氧基-I-乙氧羰基-1，2- 二氫-喹啉)、DCC (二環(huán)己基碳二亞胺)；DIPCDI ( 二異丙基碳二亞胺)、MSNT (1-(1,3, 5-三甲基苯-2-磺酰)-3-硝基-1H-1，2，4-三唑和芳基磺酰鹵例如三異丙基苯磺酰氯。含有白蛋白結(jié)合肽(ABP)的多特異性抗體和抗體類(lèi)似物血漿蛋白結(jié)合可以是改善短壽命分子的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性的有效手段。白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)。血清白蛋白結(jié)合肽(ABP)可以改變?nèi)诤系幕钚越Y(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的藥物動(dòng)力學(xué)，包括改變組織攝入、滲透和擴(kuò)散。這些藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)可以通過(guò)特別選擇適宜的血清白蛋白結(jié)合肽序列予以調(diào)節(jié)(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)20040001827)。一系列白蛋白結(jié)合肽由曬菌體展不篩選法鑒定(Dennis等人(2002)“Albumin Binding As A General StrategyFor Improving The Pharmacokinetics Of Proteins(作為一般策略用于改善蛋白質(zhì)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的白蛋白結(jié)合作用)”J Biol Chem. 277 :35035-35043 ；W0 01/45746)。本發(fā)明的化合物包含由(i)Dennis 等人(2002) J Biol Chem. 277 :35035-35043 的表 III 和 IV 處，第 35038 頁(yè)中；(ii)US20040001827 的
SEQ ID NOS :9_22 處；和(iii)WO 01/45746在第12-13頁(yè)SEQ ID NOS : z 1-z 14處教導(dǎo)的ABP序列。
通過(guò)馬來(lái)酰亞氨基-ABP與含有改性交聯(lián)劑的多特異性抗體或抗體類(lèi)似物反應(yīng)，合成含有白蛋白結(jié)合肽(ABP)的多特異性抗體，其中所述改性交聯(lián)劑攜帶游離硫氫基。示例性白蛋白結(jié)合肽序列包括但不限于SEQ ID NOS :23_27中所列的氨基酸序列CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO 23QRLMEDICLPRffGCLffEDDF SEQ ID NO 24QRLIEDICLPRffGCLffEDDF SEQ ID NO 25RLIEDICLPRffGCLffEDDSEQ ID NO 26DICLPRffGCLffSEQ ID NO 27
白蛋白結(jié)合肽(ABP)序列以Kd(兔)=0. 3iiM結(jié)合來(lái)自多個(gè)物種(小鼠、大鼠、兔、牛、獼猴、狒狒和人)的白蛋白。白蛋白結(jié)合肽不與已知結(jié)合白蛋白并且在兔中具有2. 3小時(shí)半壽期(T1/2)的配體競(jìng)爭(zhēng)。藥物綴合物本發(fā)明的多特異性抗體和抗體類(lèi)似物，尤其是用具有游離硫氫基的改性交聯(lián)劑合成的那些，可以與治療劑即藥物部分綴合，所述治療劑可以通過(guò)反應(yīng)性硫氫基與抗體共價(jià)連接?？贵w-藥物綴合(ADC)化合物的示例性實(shí)施方案包含多特異性抗體或抗體類(lèi)似物(每一者以下討論中稱(chēng)作Ab)和藥物部分(D)，其中所述多特異性抗體或抗體類(lèi)似物已經(jīng)用具有游離硫氫基(L)的改性交聯(lián)劑合成并且該抗體經(jīng)游離硫氫基與D連接；所述組合物具有式I :Ab- (L-D) pI其中p是1、2、3或4?？梢越?jīng)巰基反應(yīng)性接頭部分與多特異性抗體或抗體類(lèi)似物綴合的藥物部分的數(shù)目受通過(guò)本文所述方法導(dǎo)入的反應(yīng)性巰基的數(shù)目限制?？贵w-藥物綴合化合物(ADC)的另一個(gè)示例性實(shí)施方案包含多特異性抗體或抗體類(lèi)似物(Ab)、白蛋白結(jié)合肽(ABP)和藥物部分(D)，其中抗體通過(guò)接頭部分(L)與藥物部分連接并且抗體通過(guò)酰胺鍵或第二接頭部分與白蛋白結(jié)合肽連接；所述組合物具有式Ia ABP-Ab-(L-D)pIa其中p 是 1、2、3 或 4。本發(fā)明的ADC化合物包括具有抗癌活性的那些ADC化合物。具體而言，所述化合物包含通過(guò)接頭與藥物部分即毒素綴合即共價(jià)連接的抗體。當(dāng)藥物不與抗體綴合時(shí)，該藥物具有細(xì)胞毒作用或抑制細(xì)胞作用。藥物部分的生物學(xué)活性因而受與抗體的綴合作用調(diào)節(jié)。本發(fā)明的多特異性抗體-藥物綴合物和抗體類(lèi)似物-藥物綴合物(ADC)選擇性地遞送有效劑量的細(xì)胞毒性劑至腫瘤組織，因而可以實(shí)現(xiàn)更大的選擇性，即更低的有效劑量。 在一個(gè)實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物中，本發(fā)明的ADC或ADC的胞內(nèi)代謝物的生物利用率與包含所述ADC的藥物部分并且缺少抗體組分的藥物化合物相比時(shí)改進(jìn)。另外，在哺乳動(dòng)物中，所述ADC或ADC的胞內(nèi)代謝物的生物利用率與缺少藥物部分的ADC的抗體組分相比時(shí)改進(jìn)。藥物部分抗體-藥物綴合物(ADC)的藥物部分(D)包括具有細(xì)胞毒作用或抑制細(xì)胞作用的任何化合物、部分或基團(tuán)。藥物部分包括(i)可以充當(dāng)微管蛋白抑制劑、有絲分裂抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑或DNA嵌入劑的化療藥；(ii)可以以酶促方式發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)毒素；和(iii)放射性同位素。示例性藥物部分包括但不限于美坦生類(lèi)、澳瑞司他汀(auristatin)、多拉司他汀、單端孢霉烯族化合物、CC1065、刺孢霉素和其他烯二炔類(lèi)抗生素、紫杉烷、蒽環(huán)類(lèi)及其立體異構(gòu)體、電子等排體、類(lèi)似物或衍生物。適合用作美坦生類(lèi)藥物部分的美坦生化合物是本領(lǐng)域熟知的，并且可以根據(jù)已知的方法從天然來(lái)源分離，使用基因工程技術(shù)產(chǎn)生(見(jiàn)Yu等人(2002) Proc. NAT. Acad. SCI.(USA) 99 :7968-7973)，或根據(jù)已知方法合成地制備美登醇和美登醇類(lèi)似物。示例的美坦生類(lèi)藥物部分包括具有修飾的芳香族環(huán)的那些，如C-19_脫氯(US 4256746)(通過(guò)氫化鋰鋁還原美登木素(ansamytocin)P2而制備)；C_20-羥基(或C-20-去甲)+/-C-19-脫氯(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4361650和4307016)(使用鏈霉菌(Streptomyces)或放線菌(Actinomyces)去甲基化或使用LAH脫氯而制備)；和C-20-去 甲氧基，C-20-酰氧基(-0C0R)、+/-脫氯(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，294，757)(使用酰氯?；苽?和在其他位置處具有修飾的那些。示例的美坦生類(lèi)藥物部分還包括具有修飾的那些，如C-9_SH(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，424，219)(美登醇與H2S或P2S5反應(yīng)而制備)；C_14_烷氧甲基(去甲氧基/CH2OR)(US4331598) ;C_14_(羥甲基)或酰氧甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，450，254)(從諾卡氏菌(Nocardia)制備)；C_15_羥基/酰氧基(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，364，866)(通過(guò)鏈霉菌轉(zhuǎn)化美登醇而制備)；C-15-甲氧基(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，313，946和4，315，929)(從Trewianudlf Iora分離)；C-18_N-去甲(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，362，663和4，322，348)(美登醇由鏈霉菌去甲基化而制備)和4，5-脫氧(U. S. 4，371，533)(通過(guò)三氯化鈦/LAH還原美登醇而制備)。取決于連接的類(lèi)型，美坦生化合物上的多個(gè)位置已知可用作連接位置。例如，為形成酯鍵，具有羥基的C-3位置，用羥甲基修飾的C-14位置、用羥基修飾的C-15位置和具有羥基的C-20位置均是合適的。式I的抗體-藥物綴合物(ADC)的藥物部分(D)包括具有以下結(jié)構(gòu)的美坦生類(lèi)化
合物
H3C' (CR2)m—S—I
ONC \-/ O
H3C P 9
…' '
CH3O^Y \
W
I HO I CH3O H其中波浪線表示D的硫原子與抗體-藥物綴合物(ADC)的接頭(L)共價(jià)連接。R可以獨(dú)立地是H或C1-C6燒基，C1-C6燒基選自甲基、乙基、1_丙基、2_丙基、I-丁基、2_甲基_1_丙基、2_ 丁基、2_甲基_2_丙基、I-戍基、2-戍基、3-戍基、2_甲基_2_ 丁基、3_甲基_2- 丁基、3_甲基-I-丁基、2_甲基-I-丁基、I-己基、2_己基、3_己基、2_甲基-2-戍基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2，3-二甲基-2-丁基、和3，3- 二甲基-2- 丁基。使酰胺基團(tuán)與硫原子連接的亞烷基鏈可以是甲基、乙基或丙基，即，m是1、2或3。通過(guò)抑制微管蛋白質(zhì)即微管蛋白(tubulin)聚合而抑制有絲分裂期間微管形成，美坦生化合物抑制細(xì)胞增殖(Remillard等人(1975) Sciencel89 :1002-1005)。美坦生和美坦生類(lèi)具有高度細(xì)胞毒性，但是它們?cè)诎┌Y治療中的臨床使用已經(jīng)因其嚴(yán)重全身性副作用而大大受限，這主要?dú)w咎于它們對(duì)腫瘤的低劣選擇性。采用美坦生的臨床試驗(yàn)已經(jīng)由于對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸系統(tǒng)造成嚴(yán)重副作用而中止(Issel等人(1978)Can. Treatment.Rev. 5 :199-207)。美坦生類(lèi)藥物部分是抗體-藥物綴合物中有吸引力的藥物部分，因?yàn)樗鼈?i)相對(duì)容易通過(guò)發(fā)酵或化學(xué)修飾、衍生化發(fā)酵產(chǎn)物來(lái)制備，(ii)適合于采用適合經(jīng)非二硫鍵接 頭與抗體綴合的官能團(tuán)衍生化，(iii)在血漿中穩(wěn)定，和(iv)有效對(duì)抗多個(gè)腫瘤細(xì)胞系(US2005/0169933 ；W0 2005/037992 ;美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，208，020)。對(duì)于其他藥物部分，將美坦生類(lèi)藥物部分的全部立體異構(gòu)體構(gòu)思為本發(fā)明的化合物，即，在D的手性碳處R和S構(gòu)型的任何組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，美坦生類(lèi)藥物部分(D)將具有以下的立體化學(xué)
權(quán)利要求
1.一種合成多特異性抗體的方法，其中從具有第一單特異性和游離硫氫基的第一親本抗體獲得的第一抗體片段與巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑反應(yīng)以產(chǎn)生抗體片段-交聯(lián)劑部分，并且其中所述抗體片段-交聯(lián)劑部分與從具有第二單特異性和游離硫氫基的第二親本抗體獲得的第二抗體片段反應(yīng)以產(chǎn)生多特異性抗體，并且其中所述第一單特異性與第二單特異性不同。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第一親本抗體選自抗Herl和抗Her2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第一親本抗體是抗Her2并且所述第二親本抗體是抗Herl,或者所述第一親本抗體是抗Herl并且所述第二親本抗體是抗Her2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述抗Her2選自曲妥珠單抗和帕妥珠單抗。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第一親本抗體是抗Her2并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :1、2、3、6和7的輕鏈序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第一親本抗體是抗Her2并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :4、5和8的重鏈序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第一親本抗體是抗Her2并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :1、2、3、6和7的輕鏈序列和選自SEQ ID NOs. :4、5和8的重鏈序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述抗Herl選自D1-5和C3-101。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第一親本抗體是抗Herl并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. : 18、19、21和22的輕鏈序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第一親本抗體是抗Herl并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. : 17和20的重鏈序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第一親本抗體是抗Herl并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :18、19、21和22的輕鏈序列和選自SEQ ID NOs. :17和20的重鏈序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述抗Her2選自曲妥珠單抗和帕妥珠單抗并且所述抗Herl選自D1-5和C3-101。
13.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中從抗Her2獲得的抗體片段包含選自SEQIDNOs. :1、2、3、6和7的輕鏈序列，并且從抗Herl獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :18、19、21和22的輕鏈序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中從抗Her2獲得的抗體片段包含選自SEQIDNOs. :4、5和8的重鏈序列，并且從抗Herl獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :17和20的重鏈序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中從抗Her2獲得的抗體片段包含選自SEQIDNOs. :1、2、3、6和7的輕鏈序列和選自SEQ ID NOs. :4、5和8的重鏈序列；并且從抗Herl獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :18、19、21和22的輕鏈序列和選自SEQ ID NOs.17和20的重鏈序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第一親本抗體選自抗FeYRIIb和抗Fe e RI a 0
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述第一親本抗體是抗FeY RIIb并且所述第二親本抗體是抗Fe e RI a，或者所述第一親本抗體是抗Fe e RI a并且所述第二親本抗體是^lFcyRIIb0
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述抗FeY RIIb是5A6。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述第一親本抗體是抗FeY RIIb并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. : 11和12的輕鏈序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述第一親本抗體是抗FeY RIIb并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :9和10的重鏈序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述第一親本抗體是抗FeY RIIb并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. 11和12的輕鏈序列和選自SEQ ID NOs. 9和10的重鏈序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述抗Fee RI a是22E7。
23.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述第一親本抗體是抗Fee RI a并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :15和16的輕鏈序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述第一親本抗體是抗Fee RI a并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :13和14的重鏈序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述第一親本抗體是抗Fee RI a并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :15和16的輕鏈序列和選自SEQ ID NOs. :13和14的重鏈序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中從抗FeYRIIb獲得的抗體片段包含選自SEQ IDNOs. : 11和12的輕鏈序列，并且從抗Fe e RI a獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. 15和16的輕鏈序列。
27.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中從抗FcYRIIb獲得的抗體片段包含選自SEQID NOs. :9和10的重鏈序列，并且從抗Fe e RIa獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs.13和14的重鏈序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中從抗FeYRIIb獲得的抗體片段包含選自SEQ IDNOs. 11和12的輕鏈序列和選自SEQ ID NOs. :9和10的重鏈序列；并且從抗Fe e RI a獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :15和16的輕鏈序列和選自SEQ ID NOs. :13和14的重鏈序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑選自雙馬來(lái)酰亞氨基鹵、雙烷基鹵、吡啶基二硫化物、雙汞鹽、5-硫基-2-硝基苯甲酸介導(dǎo)的交聯(lián)和雙硫代磺酸酯。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑是雙馬來(lái)酰亞胺。
31.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第一抗體片段和/或第二抗體片段從半胱氨酸工程化抗體獲得。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述半胱氨酸工程化抗體包含在所述輕鏈的位置110或在位置205處的置換，其中所述的殘基編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)，并且其中所述置換是半胱氨酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述半胱氨酸工程化抗體包含在所述重鏈的位置118或在位置121處的置換，其中所述的殘基編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)，并且其中所述置換是半胱氨酸。
34.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第一抗體片段和/或第二抗體片段從天然抗體獲得，其中所述天然抗體用胃蛋白酶消化以產(chǎn)生F(ab' )2片段，其中所述F(ab' )2片段經(jīng)純化并且用還原劑并隨后用氧化劑在其中Fab重鏈和輕鏈之間的二硫鍵重新形成及鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基仍是未氧化的條件下處理。
35.一種合成抗體類(lèi)似物的方法，其中具有游離硫氫基的第一抗體片段與巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑反應(yīng)以產(chǎn)生抗體片段-交聯(lián)劑部分，并且其中所述抗體片段-交聯(lián)劑部分與具有游離硫氫基的第二抗體片段反應(yīng)以產(chǎn)生抗體類(lèi)似物，并且其中所述第一抗體片段和所述第二抗體片段從單一親本抗體獲得。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述親本抗體選自抗Herl、抗Her2、抗Fe e RI a 和抗 Fe yRIIb。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述抗Her2選自曲妥珠單抗和帕妥珠單抗。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述親本抗體是抗Her2并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs. :1、2、3、6和7。
39.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述親本抗體是抗Her2并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的重鏈序列，其中所述重鏈序列選自SEQ ID NOs. :4、5和8。
40.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述親本抗體是抗Her2并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列和相同的重鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQID NOs. :1、2、3、6和7，并且所述重鏈序列選自SEQ ID NOs. :4、5和8。
41.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述抗Herl選自D1-5和C3-101。
42.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述親本抗體是抗Herl并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs. :18,19,21和22。
43.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述親本抗體是抗Herl并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的重鏈序列，其中所述重鏈序列選自SEQ ID NOs. :17和20。
44.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述親本抗體是抗Herl并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列和相同的重鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQID NOs. :18、19、21和22，并且所述重鏈序列選自SEQ ID NOs. : 17和20。
45.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述抗Fey RIIb是5A6。
46.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述親本抗體是抗Fey RIIb并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs. 11和12。
47.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述親本抗體是抗FeY RIIb并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的重鏈序列，其中所述重鏈序列選自SEQ ID NOs. :9和10。
48.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述親本抗體是抗FeYRIIb并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列和相同的重鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs. 11和12，并且所述重鏈序列選自SEQ ID NOs. :9和10。
49.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述抗Fee RI a是22E7。
50.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述親本抗體是抗FeeRI a并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs. 15和16。
51.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述親本抗體是抗FeeRI a并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的重鏈序列，其中所述重鏈序列選自SEQ ID NOs. 13和14。
52.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述親本抗體是抗Fee RI a并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列和相同的重鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs. :15和16，并且所述重鏈序列選自SEQ ID NOs. :13和14。
53.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑選自雙馬來(lái)酰亞氨基鹵、雙烷基鹵、吡啶基二硫化物、雙汞鹽、5-硫基-2-硝基苯甲酸介導(dǎo)的交聯(lián)和雙硫代磺酸酯。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑是雙馬來(lái)酰亞胺。
55.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述親本抗體是半胱氨酸工程化抗體。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述半胱氨酸工程化抗體包含在所述輕鏈的位置110或在位置205處的置換，其中所述的殘基編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)，并且其中所述置換是半胱氨酸。
57.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述半胱氨酸工程化抗體包含在所述重鏈的位置118或在位置121處的置換，其中所述的殘基編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)，并且其中所述置換是半胱氨酸。
58.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述親本抗體是天然抗體，其中所述天然抗體用胃蛋白酶消化以產(chǎn)生F(ab' )2片段，其中所述F(ab' )2片段經(jīng)純化并且用還原劑并隨后用氧化劑在其中Fab重鏈和輕鏈之間的二硫鍵重新形成及鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基仍是未氧化的條件下處理。
59.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述抗體類(lèi)似物具有在結(jié)構(gòu)上與親本抗體的抗原結(jié)合區(qū)不同的抗原結(jié)合區(qū)。
60.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求35所述的方法，其中所述交聯(lián)劑是包含受保護(hù)的SH基團(tuán)的改性交聯(lián)劑。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述的改性交聯(lián)劑是雙馬來(lái)酰亞氨基-乙酰乙酸酯 OMata)。
62.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中包含所述改性交聯(lián)劑的抗體進(jìn)一步與包含官能團(tuán)的試劑反應(yīng)。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述試劑選自聚乙二醇(PEG)、白蛋白結(jié)合肽(ABP)、熒光標(biāo)簽、放射成像劑、細(xì)胞毒性劑和siRNA。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述試劑是PEG并且所述PEG選自2000mw(2K)PEG、12，OOOmw(12K)PEG 和 20，OOOmw(20K)PEG。
65.合成一組多特異性抗體的方法，其中從具有第一單特異性和游離硫氫基的第一親本抗體獲得的第一抗體片段與巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑反應(yīng)以產(chǎn)生抗體片段-交聯(lián)劑部分，并且其中所述抗體片段-交聯(lián)劑部分與從與所述第一抗體片段具有不同單特異性的一個(gè)或多個(gè)親本抗體獲得的兩個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中每一者配對(duì)反應(yīng)，所述每個(gè)額外抗體片段具有游離硫氫基，以產(chǎn)生所述的多特異性抗體組。
66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法,其中所述第一親本抗體選自抗Herl、抗Her2、抗Fe e RI a 和抗 Fe yRIIb。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述第一抗體片段從抗Her2獲得并且所述兩個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者從抗Herl獲得，或所述第一抗體片段從抗Herl獲得并且所述兩個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者從抗Her2獲得，或者所述第一抗體片段從抗Fe e RI a獲得并且所述兩個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者從抗Fe y RIIb獲得，或所述第一抗體片段從抗FcYRIIb獲得并且所述兩個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者從抗Fe e RIa獲得。
68.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述抗Her2選自曲妥珠單抗和帕妥珠單抗。
69.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述抗Herl選自D1-5和C3-101。
70.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中所述抗Her2選自曲妥珠單抗和帕妥珠單抗并且所述抗Herl選自D1-5和C3-101。
71.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述抗FeY RIIb是5A6。
72.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述抗Fee RI a是22E7。
73.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中所述抗FeY RIIb是5A6并且所述抗Fe e RI a是 22E7。
74.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中所述巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑選自雙馬來(lái)酰亞氨基鹵、雙烷基鹵、吡啶基二硫化物、雙汞鹽、5-硫基-2-硝基苯甲酸介導(dǎo)的交聯(lián)和雙硫代磺酸酯。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，其中所述巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑是雙馬來(lái)酰亞胺。
76.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中所述第一抗體片段和/或所述兩個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段中的每一者從半胱氨酸工程化抗體獲得。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中所述半胱氨酸工程化抗體包含在所述輕鏈的位置110或在位置205處的置換，其中所述的殘基編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)，并且其中所述置換是半胱氨酸。
78.根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中所述半胱氨酸工程化抗體包含在所述重鏈的位置118或在位置121處的置換，其中所述的殘基編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)，并且其中所述置換是半胱氨酸。
79.合成一組抗體類(lèi)似物的方法，其中具有游離硫氫基的第一抗體片段與巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑反應(yīng)以產(chǎn)生抗體片段-交聯(lián)劑部分，并且其中所述抗體片段-交聯(lián)劑部分與兩個(gè)或更多個(gè)額外抗體片段的每一者配對(duì)反應(yīng)，所述每個(gè)額外抗體片段具有游離硫氫基，以產(chǎn)生所述的抗體類(lèi)似物組，其中所述抗體片段的每一者從單一親本抗體獲得。
80.根據(jù)權(quán)利要求79所述的方法，其中所述親本抗體選自抗Herl、抗Her2、抗Fe e RI a 和抗 Fe yRIIb。
81.根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中所述抗Her2選自曲妥珠單抗和帕妥珠單抗。
82.根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中所述抗Herl選自D1-5和C3-101。
83.根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中所述抗Fey RIIb是5A6。
84.根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中所述抗Fee RI a是22E7。
85.根據(jù)權(quán)利要求79所述的方法，其中所述巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑選自雙馬來(lái)酰亞氨基鹵、雙烷基鹵、吡啶基二硫化物、雙汞鹽、5-硫基-2-硝基苯甲酸介導(dǎo)的交聯(lián)和雙硫代磺酸酯。
86.根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中所述巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑是雙馬來(lái)酰亞胺。
87.根據(jù)權(quán)利要求79所述的方法，其中所述親本抗體是半胱氨酸工程化抗體。
88.根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中所述半胱氨酸工程化抗體包含在所述輕鏈的位置110或在位置205處的置換，其中所述的殘基編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)，并且其中所述置換是半胱氨酸。
89.根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中所述半胱氨酸工程化抗體包含在所述重鏈的位置118或在位置121處的置換，其中所述的殘基編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)，并且其中所述置換是半胱氨酸。
90.一種多特異性抗體，由包括以下的方法合成 a)從具有第一單特異性和游離硫氫基的第一親本抗體獲得的第一抗體片段與巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑反應(yīng)以產(chǎn)生抗體片段-交聯(lián)劑部分，和 (ii)所述抗體片段-交聯(lián)劑部分與從具有第二單特異性和游離硫氫基的第二親本抗體獲得的第二抗體片段反應(yīng)以產(chǎn)生所述多特異性抗體， 并且其中所述第一單特異性與所述第二單特異性不同。
91.根據(jù)權(quán)利要求90所述的多特異性抗體,其中所述第一親本抗體選自抗Herl和抗Her2。
92.根據(jù)權(quán)利要求91所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗Her2并且所述第二親本抗體是抗Herl，或者所述第一親本抗體是抗Herl并且所述第二親本抗體是抗Her2。
93.根據(jù)權(quán)利要求91所述的多特異性抗體，其中所述抗Her2選自曲妥珠單抗和帕妥珠單抗。
94.根據(jù)權(quán)利要求91所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗Her2并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :1、2、3、6和7的輕鏈序列。
95.根據(jù)權(quán)利要求91所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗Her2并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :4、5和8的重鏈序列。
96.根據(jù)權(quán)利要求91所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗Her2并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :1、2、3、6和7的輕鏈序列和選自SEQ ID NOs.4、5和8的重鏈序列。
97.根據(jù)權(quán)利要求91所述的多特異性抗體，其中所述抗Herl選自D1-5和C3-101。
98.根據(jù)權(quán)利要求91所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗Herl并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. : 18、19、21和22的輕鏈序列。
99.根據(jù)權(quán)利要求91所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗Herl并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :17和20的重鏈序列。
100.根據(jù)權(quán)利要求91所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗Herl并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :18、19、21和22的輕鏈序列和選自SEQ IDNOs. 17和20的重鏈序列。
101.根據(jù)權(quán)利要求92所述的多特異性抗體，其中所述抗Her2選自曲妥珠單抗和帕妥珠單抗并且所述抗Herl選自D1-5和C3-101。
102.根據(jù)權(quán)利要求92所述的多特異性抗體，其中從抗Her2獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :1、2、3、6和7的輕鏈序列，并且從抗Herl獲得的抗體片段包含選自SEQ IDNOs. :18、19、21和22的輕鏈序列。
103.根據(jù)權(quán)利要求92所述的多特異性抗體，其中從抗Her2獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :4、5和8的重鏈序列，并且從抗Herl獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs.17和20的重鏈序列。
104.根據(jù)權(quán)利要求92所述的多特異性抗體，其中從抗Her2獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :1、2、3、6和7的輕鏈序列和選自SEQ ID NOs. :4、5和8的重鏈序列；并且從抗Herl獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. : 18、19、21和22的輕鏈序列和選自SEQ IDNOs. 17和20的重鏈序列。
105.根據(jù)權(quán)利要求90所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體選自抗Fey RIIb和抗 Fe e RI a。
106.根據(jù)權(quán)利要求105所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗FeY RIIb并且所述第二親本抗體是抗Fe e RI a，或者所述第一親本抗體是抗Fe e RI a并且所述第二親本抗體是抗Fe Y RIIb。
107.根據(jù)權(quán)利要求105所述的多特異性抗體，其中所述抗Fey RIIb是5A6。
108.根據(jù)權(quán)利要求105所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗FeY RIIb并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. : 11和12的輕鏈序列。
109.根據(jù)權(quán)利要求105所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗FeY RIIb并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :9和10的重鏈序列。
110.根據(jù)權(quán)利要求105所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗FeYRIIb并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. : 11和12的輕鏈序列和選自SEQ ID NOs.9和10的重鏈序列。
111.根據(jù)權(quán)利要求105所述的多特異性抗體，其中所述抗Fee RI a是22E7。
112.根據(jù)權(quán)利要求105所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗Fee RI a并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :15和16的輕鏈序列。
113.根據(jù)權(quán)利要求105所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗Fee RI a并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :13和14的重鏈序列。
114.根據(jù)權(quán)利要求105所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗Fee RI a并且其中所述第一抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :15和16的輕鏈序列和選自SEQ ID NOs.13和14的重鏈序列。
115.根據(jù)權(quán)利要求106所述的多特異性抗體，其中從抗FeY RIIb獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. 11和12的輕鏈序列，并且從抗Fe e RI a獲得的抗體片段包含選自SEQID NOs. 15和16的輕鏈序列。
116.根據(jù)權(quán)利要求106所述的多特異性抗體，其中從抗FeY RIIb獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. 9和10的重鏈序列，并且從抗Fe e RI a獲得的抗體片段包含選自SEQID NOs. :13和14的重鏈序列。
117.根據(jù)權(quán)利要求106所述的多特異性抗體，其中從抗FeY RIIb獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. 11和12的輕鏈序列和選自SEQ ID NOs. 9和10的重鏈序列；并且從抗Fe e RI a獲得的抗體片段包含選自SEQ ID NOs. :15和16的輕鏈序列和選自SEQ IDNOs. 13和14的重鏈序列。
118.根據(jù)權(quán)利要求90所述的多特異性抗體，其中所述巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑選自雙馬來(lái)酰亞氨基鹵、雙烷基鹵、吡啶基二硫化物、雙汞鹽、5-硫基-2-硝基苯甲酸介導(dǎo)的交聯(lián)和雙硫代磺酸酯。
119.根據(jù)權(quán)利要求118所述的多特異性抗體，其中所述巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑是雙馬來(lái)酰亞胺。
120.根據(jù)權(quán)利要求90所述的多特異性抗體，其中所述第一抗體片段和/或第二抗體片段是從半胱氨酸工程化抗體獲得的。
121.根據(jù)權(quán)利要求120所述的多特異性抗體，其中所述半胱氨酸工程化抗體包含在所述輕鏈的位置110或在位置205處的置換，其中所述的殘基編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)，并且其中所述置換是半胱氨酸。
122.根據(jù)權(quán)利要求120所述的多特異性抗體，其中所述半胱氨酸工程化抗體包含在所述重鏈的位置118或在位置121處的置換，其中所述的殘基編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)，并且其中所述置換是半胱氨酸。
123.根據(jù)權(quán)利要求90所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體特異性結(jié)合T細(xì)胞上的靶，并且所述第二親本抗體特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞上的靶。
124.根據(jù)權(quán)利要求123所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗CD3，并且所述第二親本抗體選自抗BLRl、抗BR3、抗CD 19、抗CD20、抗CD22、抗CD72、抗CD79A、抗CD79B、抗 CD180、抗 CR2、抗 FCER2、抗 FcRHl、抗 FcRH2、抗 FcRH5、抗 FCRL4、抗 Her2、抗 HLA-D0B 和抗 NAG14。
125.根據(jù)權(quán)利要求124所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗CD3并且所述第二親本抗體是抗⑶19。
126.根據(jù)權(quán)利要求124所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗CD3并且所述第二親本抗體是抗⑶20。
127.根據(jù)權(quán)利要求124所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗CD3并且所述第二親本抗體是抗⑶22。
128.根據(jù)權(quán)利要求124所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗CD3并且所述第二親本抗體是抗FcRH5。
129.根據(jù)權(quán)利要求124所述的多特異性抗體，其中所述第一親本抗體是抗CD3并且所述第二親本抗體是抗Her2。
130.根據(jù)權(quán)利要求90所述的多特異性抗體，其中所述多特異性抗體展示與所述親本抗體的每一者不可區(qū)分的一種或多種生物學(xué)活性。
131.根據(jù)權(quán)利要求90所述的多特異性抗體，其中所述多特異性抗體展示與所述親本抗體的至少之一者可區(qū)分的一種或多種生物學(xué)活性。
132.—種治療癌癥的方法，包括施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求90-104或118-131中任一項(xiàng)所述的多特異性抗體至需要治療的受試者。
133.一種抗體類(lèi)似物，由包括以下的方法合成 (i)具有游離硫氫基的第一抗體片段與巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑反應(yīng)以產(chǎn)生抗體片段-交聯(lián)劑部分，和 (ii)所述抗體片段-交聯(lián)劑部分與具有游離硫氫基的第二抗體片段反應(yīng)以產(chǎn)生所述抗體類(lèi)似物， 并且其中所述第一抗體片段和所述第二抗體片段從單一親本抗體獲得。
134.根據(jù)權(quán)利要求133所述的抗體類(lèi)似物,其中所述親本抗體選自抗HerI、抗Her2、抗Fe e RI a 和抗 Fe yRIIb。
135.根據(jù)權(quán)利要求134所述的抗體類(lèi)似物，其中所述抗Her2選自曲妥珠單抗和帕妥珠單抗。
136.根據(jù)權(quán)利要求134所述的抗體類(lèi)似物，其中所述親本抗體是抗Her2并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs.1、2、3、6 和 7。
137.根據(jù)權(quán)利要求134所述的抗體類(lèi)似物，其中所述親本抗體是抗Her2并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的重鏈序列，其中所述重鏈序列選自SEQ ID NOs.4、5 和 8。
138.根據(jù)權(quán)利要求134所述的抗體類(lèi)似物，其中所述親本抗體是抗Her2并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列和相同的重鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs. :1、2、3、6和7，并且所述重鏈序列選自SEQ ID NOs. :4、5和8。
139.根據(jù)權(quán)利要求134所述的抗體類(lèi)似物，其中所述抗Herl選自D1-5和C3-101。
140.根據(jù)權(quán)利要求134所述的抗體類(lèi)似物，其中所述親本抗體是抗Herl并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs.18、19、21 和 22。
141.根據(jù)權(quán)利要求134所述的抗體類(lèi)似物，其中所述親本抗體是抗Herl并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的重鏈序列，其中所述重鏈序列選自SEQ ID NOs.17 和 20。
142.根據(jù)權(quán)利要求134所述的抗體類(lèi)似物，其中所述親本抗體是抗Herl并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列和相同的重鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs. :18、19、21和22，并且所述重鏈序列選自SEQ ID NOs. : 17和20。
143.根據(jù)權(quán)利要求134所述的抗體類(lèi)似物，其中所述抗Fey RIIb是5A6。
144.根據(jù)權(quán)利要求134所述的抗體類(lèi)似物，其中所述親本抗體是抗FeYRIIb并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ IDNOs. 11 和 12。
145.根據(jù)權(quán)利要求134所述的抗體類(lèi)似物，其中所述親本抗體是抗Fey RIIb并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的重鏈序列，其中所述重鏈序列選自SEQ IDNOs. 9 和 10。
146.根據(jù)權(quán)利要求134所述的抗體類(lèi)似物，其中所述親本抗體是抗FeY RIIb并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列和相同的重鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs. :11和12，并且所述重鏈序列選自SEQ ID NOs. :9和10。
147.根據(jù)權(quán)利要求134所述的抗體類(lèi)似物，其中所述抗Fee RI a是22E7。
148.根據(jù)權(quán)利要求134所述的抗體類(lèi)似物，其中所述親本抗體是抗Fee RI a并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ IDNOs. 15 和 16。
149.根據(jù)權(quán)利要求134所述的抗體類(lèi)似物，其中所述親本抗體是抗Fee RI a并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的重鏈序列，其中所述重鏈序列選自SEQ IDNOs. 13 和 14。
150.根據(jù)權(quán)利要求134所述的抗體類(lèi)似物，其中所述親本抗體是抗Fee RI a并且其中所述第一抗體片段和第二抗體片段包含相同的輕鏈序列和相同的重鏈序列，其中所述輕鏈序列選自SEQ ID NOs. :15和16，并且所述重鏈序列選自SEQ ID NOs. :13和14。
151.根據(jù)權(quán)利要求133所述的抗體類(lèi)似物，其中所述巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑選自雙馬來(lái)酰亞氨基鹵、雙烷基鹵、吡啶基二硫化物、雙汞鹽、5-硫基-2-硝基苯甲酸介導(dǎo)的交聯(lián)和雙硫代磺酸酯。
152.根據(jù)權(quán)利要求151所述的抗體類(lèi)似物，其中所述巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑是雙馬來(lái)酰亞胺。
153.根據(jù)權(quán)利要求133所述的抗體類(lèi)似物，其中所述親本抗體是半胱氨酸工程化抗體。
154.根據(jù)權(quán)利要求153所述的抗體類(lèi)似物，其中所述半胱氨酸工程化抗體包含在所述輕鏈的位置110或在位置205處的置換，其中所述的殘基編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)，并且其中所述置換是半胱氨酸。
155.根據(jù)權(quán)利要求153所述的抗體類(lèi)似物，其中所述半胱氨酸工程化抗體包含在所述重鏈的位置118或在位置121處的置換，其中所述的殘基編號(hào)根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)，并且其中所述置換是半胱氨酸。
156.根據(jù)權(quán)利要求133所述的抗體類(lèi)似物，其中所述親本抗體是天然抗體，其中所述天然抗體用胃蛋白酶消化以產(chǎn)生F(ab' )2片段，其中所述F(ab' )2片段經(jīng)純化并且用還原劑并隨后用氧化劑在其中Fab重鏈和輕鏈之間的二硫鍵重新形成及鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基仍是未氧化的條件下處理。
157.根據(jù)權(quán)利要求133所述的抗體類(lèi)似物，其中所述抗體類(lèi)似物具有在結(jié)構(gòu)上與親本抗體的抗原結(jié)合區(qū)不同的抗原結(jié)合區(qū)。
158.根據(jù)權(quán)利要求90或權(quán)利要求133所述的抗體，其中所述交聯(lián)劑是包含受保護(hù)的SH基團(tuán)的改性交聯(lián)劑。
159.根據(jù)權(quán)利要求158所述的抗體，其中所述的改性交聯(lián)劑是雙馬來(lái)酰亞氨基-乙酰乙酸酯OMata)。
160.根據(jù)權(quán)利要求158所述的抗體，其中包含所述改性交聯(lián)劑的抗體進(jìn)一步與包含官能團(tuán)的試劑反應(yīng)。
161.根據(jù)權(quán)利要求160所述的抗體，其中所述試劑選自聚乙二醇(PEG)、白蛋白結(jié)合肽(ABP)、熒光標(biāo)簽、放射成像劑、細(xì)胞毒性劑和siRNA。
162.根據(jù)權(quán)利要求161所述的方法，其中所述試劑是PEG并且所述PEG選自2000mw(2K)PEG、12，OOOmw(12K)PEG 和 20，OOOmw(20K)PEG。
163.根據(jù)權(quán)利要求133所述的抗體類(lèi)似物，其中所述抗體類(lèi)似物展示與所述親本抗體不可區(qū)分的一種或多種生物學(xué)活性。
164.根據(jù)權(quán)利要求163所述的抗體類(lèi)似物，其中所述生物學(xué)活性是細(xì)胞增殖作用。
165.根據(jù)權(quán)利要求164所述的抗體類(lèi)似物，其中所述抗體類(lèi)似物是表達(dá)Her2的細(xì)胞的拮抗劑，并且所述親本抗體是曲妥珠單抗。
166.根據(jù)權(quán)利要求165所述的抗體類(lèi)似物，其中所述抗體類(lèi)似物選自雙Fab1324、雙Fab 1328 和雙 Fab 1329。
167.根據(jù)權(quán)利要求133所述的抗體類(lèi)似物，其中所述抗體類(lèi)似物展示與所述親本抗體可區(qū)分的一種或多種生物學(xué)活性。
168.根據(jù)權(quán)利要求167所述的抗體類(lèi)似物，其中所述抗體類(lèi)似物的生物學(xué)活性是拮抗的，并且所述親本抗體的生物學(xué)活性是激動(dòng)的。
169.根據(jù)權(quán)利要求167所述的抗體類(lèi)似物，其中所述抗體類(lèi)似物的生物學(xué)活性是激動(dòng)的，并且所述親本抗體的生物學(xué)活性是拮抗的。
170.根據(jù)權(quán)利要求169所述的抗體類(lèi)似物，其中所述生物學(xué)活性是細(xì)胞增殖作用。
171.根據(jù)權(quán)利要求170所述的抗體類(lèi)似物，其中所述抗體類(lèi)似物是表達(dá)Her2的細(xì)胞增殖的激動(dòng)劑，并且所述親本抗體是曲妥珠單抗。
172.根據(jù)權(quán)利要求171所述的抗體類(lèi)似物、其中所述抗體類(lèi)似物選自雙Fab1188、雙Fab 1321、雙 Fab 1322、雙 Fab 1323 和雙 Fab 1325。
173.一種組合物，其包含一種或多種選自雙Fab 1187、雙Fab 1189、雙Fab 1190、雙Fab 1191、雙 Fab 1192、雙 Fab 1193、雙 Fab 1299、雙 Fab 1300、雙 Fab 1301、雙 Fab 1302、雙Fabl303、雙Fab 1304、雙Fabl305、雙Fab 1306和雙Fab 1307的多特異性抗體。
174.一種組合物，其包含一種或多種選自雙Fab 1188、雙Fab 1204、雙Fab 1321、雙Fab 1322、雙 Fab 1323、雙 Fab 1324、雙 Fab 1325、雙 Fab 1326、雙 Fab 1327、雙 Fab 1328、雙Fab 1329、雙Fab 1400和雙Fabl401的抗體類(lèi)似物。
全文摘要
本發(fā)明提供了特異性結(jié)合至少兩個(gè)不同表位的多特異性抗體。還提供了天然抗體的結(jié)構(gòu)性變體(抗體類(lèi)似物)。另外，提供了具有一系列生物學(xué)活性的多特異性抗體和抗體類(lèi)似物。提供了激動(dòng)劑及拮抗劑多特異性抗體和激動(dòng)劑及拮抗劑抗體類(lèi)似物。還提供了與治療劑和/或診斷劑綴合的多特異性抗體和抗體類(lèi)似物，還提供了與下述試劑綴合的多特異性抗體和抗體類(lèi)似物，與缺少這類(lèi)試劑的多特異性抗體和抗體類(lèi)似物相比，所述試劑用來(lái)增加體內(nèi)半壽期。此外，提供了制造多特異性抗體及抗體類(lèi)似物和包含多特異性抗體及抗體類(lèi)似物的組合物的方法。也提供了多特異性抗體和抗體類(lèi)似物的治療用途、研究用途和診斷用途。
文檔編號(hào)C07K16/46GK102770456SQ201080055004
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月4日
發(fā)明者J·舍爾, R·L·范德倫 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司