專利名稱：具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物和用于制備該植物的方法
具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物和用于制備該植物的方法本發(fā)明總體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域并涉及用于通過(guò)調(diào)節(jié)植物中編碼D0F-C2(具 有一個(gè)指狀物的結(jié)合DNA的，亞組C2)結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽或MYB結(jié)構(gòu)域蛋白(MYB7)的核 酸的表達(dá)而增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀或改善多種植物生長(zhǎng)特征的方法。本發(fā)明還涉及具有編碼 D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽或MYB7的核酸的受調(diào)節(jié)表達(dá)的植物，所述植物相對(duì)于對(duì)應(yīng)的 野生型植物或其他對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀。本發(fā)明也提供了在本發(fā)明方法中有用的構(gòu)建體。
持續(xù)增長(zhǎng)的世界人口和農(nóng)業(yè)用可耕地供應(yīng)萎縮刺激了有關(guān)提高農(nóng)業(yè)效率的研究。 常規(guī)的作物及園藝學(xué)改良手段利用選擇育種技術(shù)以鑒定具有受歡迎特征的植物。然而，此 類選擇育種技術(shù)具有幾個(gè)缺陷，即這些技術(shù)一般耗費(fèi)很多勞動(dòng)并且產(chǎn)生這樣的植物，其經(jīng) 常含有可能并不總導(dǎo)致受歡迎性狀從親代植物傳遞下去的異源遺傳組分。分子生物學(xué)進(jìn)展 已經(jīng)允許人類改良動(dòng)物及植物的種質(zhì)。植物的遺傳工程使得可以分離和操作遺傳物質(zhì)(一 般處于DNA或RNA形式)并且隨后導(dǎo)入該遺傳物質(zhì)至植物中。此類技術(shù)具有產(chǎn)生具備多種 經(jīng)濟(jì)學(xué)、農(nóng)學(xué)或園藝學(xué)改良性狀的作物或植物的能力。具有特殊經(jīng)濟(jì)意義的性狀是提高的產(chǎn)量。產(chǎn)量通常定義為來(lái)自作物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值的 可測(cè)量結(jié)果。該結(jié)果可以就數(shù)量和/或品質(zhì)方面進(jìn)行定義。產(chǎn)量直接取決于幾個(gè)因素，例 如器官的數(shù)目和大小、植物構(gòu)造(例如枝的數(shù)目)、種子產(chǎn)生、葉衰老等。根發(fā)育、養(yǎng)分?jǐn)z入、 脅迫耐受性和早期生長(zhǎng)勢(shì)(earlyvigor)也可以是決定產(chǎn)量的重要因素。優(yōu)化前述因素因 而可以有助于提高作物產(chǎn)量。種子產(chǎn)量是特別重要的性狀，因?yàn)樵S多植物的種子對(duì)人和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)是重要的。作 物如谷物、稻、小麥、卡諾拉油菜和大豆占超過(guò)一半的人類總熱量攝入，無(wú)論通過(guò)直接消費(fèi) 種子本身或通過(guò)消費(fèi)基于加工的種子而產(chǎn)生的肉產(chǎn)品。作物也是糖、油及工業(yè)加工中所用 許多類型代謝物的來(lái)源。種子含有胚(新苗和新根的來(lái)源)和胚乳(萌發(fā)期間和籽苗早期 生長(zhǎng)期間用于胚生長(zhǎng)的養(yǎng)分來(lái)源)。種子發(fā)育涉及多種基因并且需要代謝物從根、葉和莖轉(zhuǎn) 移至正在生長(zhǎng)的種子中。胚乳尤其同化糖類、油和蛋白質(zhì)的代謝前體并且將它們合成為貯 藏大分子以灌滿籽粒。對(duì)于許多作物的另一個(gè)重要性狀是早期生長(zhǎng)勢(shì)。改進(jìn)早期生長(zhǎng)勢(shì)是現(xiàn)代稻育種計(jì) 劃在溫帶和熱帶稻品種方面的重要目標(biāo)。長(zhǎng)根對(duì)于水栽稻中正確土壤固定是重要的。在稻 直接播種至被淹沒(méi)田地的情況下，以及在植物必須從水中迅速出苗的情況下，較長(zhǎng)的苗與 生長(zhǎng)勢(shì)相關(guān)。在實(shí)施條播的情況下，較長(zhǎng)的中胚軸和胚芽鞘對(duì)良好出苗是重要的。將早期 生長(zhǎng)勢(shì)人工改造到植物內(nèi)的能力在農(nóng)業(yè)中將是極重要的。例如，不良的早期生長(zhǎng)勢(shì)已經(jīng)限 制了基于玉米帶種質(zhì)(Corn Belt germplasm)在歐洲大西洋地區(qū)引種玉米(Zea mayes L.) 雜種。又一個(gè)重要性狀是改進(jìn)的非生物性脅迫耐受性。非生物性脅迫是世界范圍作 物損失的主要原因，對(duì)于大多數(shù)主要作物植物而言平均產(chǎn)量降低超過(guò)50% (Wang等人， Planta(2003) 218 :1_14)。非生物性脅迫可以由干旱、鹽度、極端溫度、化學(xué)毒性和氧化脅迫 引起。改善植物的非生物性脅迫耐受性能力將在世界范圍對(duì)農(nóng)民是巨大的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)并且將允許在不利條件期間及在本來(lái)不可能栽培作物的陸地上栽培作物。因而可以通過(guò)優(yōu)化前述因素之一提高作物產(chǎn)量。取決于最終用途，對(duì)某些產(chǎn)量性狀的改良可能優(yōu)先于其它產(chǎn)量性狀。例如對(duì)于應(yīng)用如飼料或木材生產(chǎn)或生物燃料資源而言，增加植物營(yíng)養(yǎng)體部分可能是希望的，而對(duì)于應(yīng) 用如面粉、淀粉或油生產(chǎn)而言，種子參數(shù)提高可能是特別希望的。即便在種子參數(shù)當(dāng)中，某 些參數(shù)可以更優(yōu)先于其它參數(shù)，這取決于用途。多種機(jī)制可以有助于提高種子產(chǎn)量，無(wú)論其 形式為提高的種子尺寸或提高的種子數(shù)目。提高植物中產(chǎn)量(種子產(chǎn)量和/或生物量)的一種方法可以是通過(guò)調(diào)節(jié)植物的內(nèi) 在生長(zhǎng)機(jī)制如細(xì)胞周期或參與植物生長(zhǎng)或參與防御機(jī)制的多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以在植物中通過(guò)調(diào)節(jié)植物中編碼植物中D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子 多肽或MYB7的核酸的表達(dá)改善產(chǎn)量相關(guān)性狀或各種生長(zhǎng)特征。Dof結(jié)構(gòu)域蛋白(包含Dof結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì))是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，其具有帶 單個(gè)C2-C2鋅指的高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在過(guò)去十年期間，已經(jīng)在包括玉米、大麥、 小麥、稻、煙草、擬南芥屬植物、南瓜、馬鈴薯及豌豆的單子葉植物和雙子葉植物中鑒定到許 多Dof結(jié)構(gòu)域蛋白。已經(jīng)顯示Dof結(jié)構(gòu)域蛋白作為轉(zhuǎn)錄激活物或阻遏物在多樣的植物特異 性生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用。系統(tǒng)發(fā)育研究表明Dof結(jié)構(gòu)域蛋白在被子植物的多樣化之前趨 異，因而在長(zhǎng)時(shí)間增殖后，明顯不同的Dof結(jié)構(gòu)域蛋白可能已經(jīng)進(jìn)化以在植物生理學(xué)中發(fā) 揮不同的作用。然而，Dof結(jié)構(gòu)域的高度保守序列可以賦予Dof結(jié)構(gòu)域蛋白相似的功能。另 一方面，Dof結(jié)構(gòu)域蛋白的序列在Dof結(jié)構(gòu)域之外是高度趨異的。已經(jīng)提出Dof結(jié)構(gòu)域之外 的多樣化區(qū)域可能與明顯不同的Dof結(jié)構(gòu)域蛋白的不同功能有關(guān)(Yanagiswa，PlantCell Physiol. 45(4) :386_391(2004)。Dof結(jié)構(gòu)域蛋白展示序列特異性DNA結(jié)合活性。序列特異性僅由Dof結(jié)構(gòu)域 7k ^ (Yanagisawa, S. (1995)Nucleic Acids Res. 23 3403-3410 ；Kisu, Y. ， Ono, Τ.， Shimofurutani, N.，Suzuki, Μ.和 Esaka, Μ. (1998)Plant CellPhysiol. 39 1054-1064.)。 已經(jīng)對(duì)許多Dof蛋白(Dof結(jié)構(gòu)域蛋白)描述了所靶向DNA中的結(jié)合位點(diǎn)(De Paolis, Α. , Sabatini, S. , de Pascalis, L. , Contantino, P.禾口 Capone, I. (1996)Plant J. 10 215-223 ；Yanagisawa, S.和 Izui, K. (1993)J. Biol. Chem. 268 :16028_16036 ；Mena, M.， Vicente-Carbajosa, J. , Schmidt, R. J.禾口 Carbonero, P. (1998)Plant J. 16 :53_62)。大 部分Dof結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)合互補(bǔ)鏈中的序列AAAG或CTTT。在與AGTA序列結(jié)合的南瓜AOBP Dof 結(jié)構(gòu)域蛋白中存在例外(Kisu 等人.1998. Plant cell physiol 39，1054-1064)。序列 (A/T)AAAG代表Dof結(jié)構(gòu)域的已識(shí)別的DNA結(jié)合核心基序。Dof結(jié)構(gòu)域由包含共有序列CX2CX21CX2C的約50_60個(gè)氨基酸組成，其中認(rèn)為所 述的共有序列形成與Cys2/Cys2鋅指結(jié)構(gòu)域相似的鋅指結(jié)構(gòu)，其中4個(gè)保守的半胱氨酸殘 基將與鋅離子配位(Uemura等人.2004Plant J 37，741-749)。Dof結(jié)構(gòu)域富含堿性氨基 酸。盡管Dof結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和半胱氨酸殘基的排列不同于其他鋅指，然而全部Dof 結(jié)構(gòu)域均具有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基(Yanagisawa, S. (1995)Nucleic Acids Res. 23 3403-3410. Yanagisawa, S. (1996)Trends Plant Sci.1 :213-214. Yanagisawa, S. (2002) Trends Plant Sci. 7 :555_560)。擬南芥和稻的Dof結(jié)構(gòu)域蛋白已經(jīng)被劃分成4個(gè)主要直向同源聚類，稱作Aa、Bb、Cc 和 Dd(Lijavetzky 等人.2003. BMC Evolutionary Biology3)?；谙到y(tǒng)發(fā)育關(guān)系，已經(jīng)在主要聚類中某些聚類內(nèi)部識(shí)別出子聚類。在Dof結(jié)構(gòu)域外部，不同聚類中的成員之間存 在很小的序列保守性。這種大的序列多樣性提示植物中Dof結(jié)構(gòu)域蛋白的差異性生物學(xué)作 用。然而，相同聚類或子聚類內(nèi)部的成員共有大量保守的序列基序，這提示屬于相同聚類或 子聚類的Dof蛋白的生物學(xué)功能保守性。WO 2007/064724公開(kāi)了在提高植物產(chǎn)量中有用的屬于聚類Dd和Bb的Dof結(jié)構(gòu)域蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，現(xiàn)在已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)編碼屬于聚類Ce、子聚類C2的 Dof結(jié)構(gòu)域蛋白(D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽)的核酸的表達(dá)產(chǎn)生了相對(duì)于合適的對(duì)照植物具有 提高(或增強(qiáng))的產(chǎn)量的植物。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，提供了用于相對(duì)于對(duì)照植物改善植物的產(chǎn)量相關(guān)性狀的方 法，包括調(diào)節(jié)植物中編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸的表達(dá)。MYB結(jié)構(gòu)域蛋白是具有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。最初在禽成髓 細(xì)胞瘤病毒的致癌基因(v-myb)中描述了 MYB結(jié)構(gòu)域(Klempnauer等人，(1982)Cell 33， 453-63)。許多脊椎動(dòng)物含有與v-Myb、c_Myb、A-Myb和B-Myb相關(guān)的3種基因并且已經(jīng)在 昆蟲、植物、真菌和粘菌中鑒定到其他的相似基因。所編碼的蛋白質(zhì)對(duì)于許多細(xì)胞類型中 增殖和分化的控制是重要的。MYB蛋白含有50-53個(gè)氨基酸的保守序列的1至4個(gè)不完 全同向重復(fù)序列，所述保守序列編碼參與DNA結(jié)合的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)(Rosinski和 Atchley (1998) J Mol Evol 46，74-83)。3個(gè)規(guī)律間隔的色氨酸殘基(它們?cè)谌S螺旋-轉(zhuǎn) 角-螺旋結(jié)構(gòu)中形成色氨酸簇)是MYB重復(fù)序列的特征。將c-Myb中的這三個(gè)重復(fù)序列稱 作Rl、R2和R3 ；并且將來(lái)自其他MYB蛋白的重復(fù)序列根據(jù)它們與Rl、R2或R3的相似性分 類。由于在MYB結(jié)構(gòu)域之外存在少量序列保守性，因而已經(jīng)將MYB蛋白基于MYB編碼區(qū)之 外所鑒定到的保守基序聚類成亞組(Jiang等人，(2004)Genome Biology 5，R46)。AtMYB7 屬于 R2R3-MYB 基因家族(Li 和 Parish, Plant J. 8，963-972，1995)，該基 因家族是一個(gè)大的基因家族(具有擬南芥(Arabidopsis thaliana)中已報(bào)道的126種基 因)(Zimmerman等人，Plant J. 40，22-34，2004))。該組成員參與多種過(guò)程，包括次級(jí)代謝、 細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、分生組織形成的調(diào)節(jié)、花與種子發(fā)育、細(xì)胞周期、防御和脅迫應(yīng)答、光和激素 信號(hào)傳導(dǎo)(Chen等人，Cell Res. 16，797-798，2006)。盡管報(bào)道AtMYB7在脅迫下具有增加的 表達(dá)(Ma和Bohnert，Genome Biology 8 :R49，2007)，然而它在植物中的確切功能仍未知。 進(jìn)一步推測(cè)AtMYB7表達(dá)在生物脅迫耐受性中發(fā)揮作用(W0 02/16655和WO 03/000898)。 WO 2007099096公開(kāi)了用于提高植物中種子產(chǎn)量的稻MYB蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)編碼MYB7多肽的核酸的表達(dá)產(chǎn) 生相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀、尤其提高的營(yíng)養(yǎng)生物量和提高的出苗生長(zhǎng)勢(shì) 的植物。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，提供了用于相對(duì)于對(duì)照植物改善植物的產(chǎn)量相關(guān)性狀的方 法，包括調(diào)節(jié)植物中編碼MYB7多肽的核酸的表達(dá)。這種改善的產(chǎn)量相關(guān)性狀包含提高的生 物量和提高的出苗生長(zhǎng)勢(shì)。定義多肽/蛋白質(zhì)
術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可相互交換地使用并且指由肽鍵連接起來(lái)的任 意長(zhǎng)度聚合物形式的氨基酸。多核苷酸/核酸/核算序列/核苷酸序列
術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可相 互交換地使用并且指任意長(zhǎng)度的聚合非分支形式的核苷酸，即核糖核苷酸或脫氧核糖核苷 酸或這二者的組合。對(duì)照棺物選擇合適的對(duì)照植物是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的例行部分并且可以包括相應(yīng)的野生型植物或 無(wú)目的基因的相應(yīng)植物。對(duì)照植物一般是相同的植物物種或甚至是與待評(píng)估植物相同的品 種。對(duì)照植物也可以是待評(píng)估植物的失效合子。失效合子是因分離而丟失轉(zhuǎn)基因的個(gè)體。 如本文中所用的“對(duì)照植物”不僅指完整植物，也指植物部分，包括種子和種子部分。同源物蛋白質(zhì)的“同源物”包括這樣的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，它們相對(duì)于非修飾的 所討論蛋白質(zhì)具有氨基酸替換、缺失和/或插入并且與衍生它們的非修飾蛋白質(zhì)具有相似 的生物學(xué)活性和功能活性。缺失指從蛋白質(zhì)中移除一個(gè)或多個(gè)氨基酸。插入指一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被導(dǎo)入蛋白質(zhì)中的預(yù)定位點(diǎn)。插入可以包含氨基端 融合和/或羧基端融合以及序列內(nèi)插入單個(gè)或多個(gè)氨基酸。通常，在氨基酸序列內(nèi)部的插 入物比氨基端融合物或羧基端融合物小約1至10個(gè)殘基級(jí)別。氨基端或羧基端融合蛋白 或融合肽的例子包括如酵母雙雜交系統(tǒng)中所用的轉(zhuǎn)錄激活物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、 噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)-6-標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-標(biāo)簽、蛋白A、麥芽糖結(jié)合蛋白、 二氫葉酸還原酶、Tag · 100表位、c-myc表位、FLAG -表位、IacZ、CMP (鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、 HA表位、蛋白C表位和VSV表位。替換指以具有相似特性(如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞α -螺旋 結(jié)構(gòu)或折疊結(jié)構(gòu)的傾向性)的其他氨基酸替代蛋白質(zhì)的氨基酸。氨基酸替換一般是單 個(gè)殘基的，但是根據(jù)給予多肽的功能性約束條件，可以是簇集的；插入通常是約1至10個(gè) 氨基酸殘基級(jí)別。氨基酸替換優(yōu)選地是保守性氨基酸替換。保守性替換表是本領(lǐng)域熟知的 (見(jiàn)例如 Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (編著)禾口下表 1)。表1 保守性氨基酸替換的例子
氨基酸替換、缺失和/或插入可以使用本領(lǐng)域熟知的肽合成技術(shù)如固相肽合成法 等或通過(guò)重組DNA操作輕易地進(jìn)行。用于操作DNA序列以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的替換、插入或缺 失變體的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，用于在DNA的預(yù)定位點(diǎn)處產(chǎn)生替換突變的技術(shù)是 本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且包括M13誘變法、T7-Gen體外誘變法(USB，Cleveland, OH)、 QuickChange位點(diǎn)定向誘變法(Stratagene，San Diego, CA)、PCR介導(dǎo)的位點(diǎn)定向誘變或其 他位點(diǎn)定向誘變法。衍牛物“衍生物”包括這樣的肽、寡肽、多肽，其中與天然存在形式蛋白質(zhì)(如目的蛋白) 的氨基酸序列相比較，它們包含非天然存在的氨基酸殘基對(duì)氨基酸的替換或非天然存在的 氨基酸殘基的添加。蛋白質(zhì)的“衍生物”也包括這樣的肽、寡肽、多肽，其中與所述多肽的天 然存在形式的氨基酸序列相比，它們包含天然存在的改變(糖基化、酰化、異戊二烯化、磷 酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)的氨基酸殘基或非天然存在的改變的氨基酸殘基。與衍生出 衍生物的氨基酸序列相比較，該衍生物可以也包含與所述氨基酸序列共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的 一個(gè)或多個(gè)非氨基酸取代基或添加物(例如報(bào)道分子或其他配體)，如所結(jié)合旨在促進(jìn)檢 測(cè)該衍生物的報(bào)道分子，和相對(duì)于天然存在蛋白質(zhì)的氨基酸序列而言，包含非天然存在的 氨基酸殘基。此外，“衍生物”也包括天然存在形式的蛋白質(zhì)與標(biāo)簽肽如FLAG、HIS6或硫氧 還蛋白(對(duì)標(biāo)簽肽的綜述，見(jiàn) Terpe，Appl. Microbiol. Biotechnol. 60，523-533，2003)的融 合物。盲向同源物/旁系同源物直向同源物和旁系同源物包括用來(lái)描述基因祖先關(guān)系的進(jìn)化概念。旁系同源物是 相同物種內(nèi)因祖先基因復(fù)制而起源的基因；直向同源物是來(lái)自不同生物的因物種形成而起 源的基因，并且也衍生于共同的祖先基因。結(jié)構(gòu)域術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域”指在進(jìn)化相關(guān)性蛋白質(zhì)的序列比對(duì)結(jié)果上的特定位置處保守的一 組氨基酸。盡管在其他位置處的氨基酸可以在同源物之間不同，然而在特定位置處高度保 守的氨基酸指示在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或功能方面很可能是必需的氨基酸。結(jié)構(gòu)域因其在 蛋白質(zhì)同源物家族的比對(duì)序列中高程度保守而鑒定，故它們可以用作鑒定物來(lái)確定所討論的任意多肽是否屬于先前已鑒定的多肽家族。基序/共有序列/標(biāo)簽術(shù)語(yǔ)“基序”或“共有序列，，或“標(biāo)簽”指在進(jìn)化相關(guān)蛋白質(zhì)的序列中的短保守區(qū) 域。基序往往是結(jié)構(gòu)域的高度保守部分，但是也可以僅包括該結(jié)構(gòu)域的部分，或可以位于保 守結(jié)構(gòu)域之外(若該基序的全部氨基酸位于定義的結(jié)構(gòu)域之外)。^^如本文中所定義的術(shù)語(yǔ)“雜交”是其中基本上同源的互補(bǔ)核苷酸序列相互復(fù)性的 過(guò)程。雜交過(guò)程可以完全在溶液中進(jìn)行，即兩種互補(bǔ)性核酸均處在溶液中。雜交過(guò)程也可 以用固定至基質(zhì)如磁珠、瓊脂糖凝膠(S印harose)珠或任何其他樹(shù)脂的互補(bǔ)性核酸之一進(jìn) 行。雜交過(guò)程也可以用固定至固體支持物如硝酸纖維素膜或尼龍膜上或通過(guò)例如照相平版 印刷術(shù)固定至例如硅玻璃支持物(后者稱作核酸陣列或微陣列或稱作核酸芯片)的互補(bǔ)性 核酸之一進(jìn)行。為使雜交發(fā)生，核酸分子通常被熱變性或化學(xué)變性，以將雙鏈解鏈成兩條單 鏈和/或去除來(lái)自單鏈核酸的發(fā)夾或其他二級(jí)結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格性”指雜交發(fā)生的條件。雜交的嚴(yán)格性受諸條件如溫度、鹽濃度、離子 強(qiáng)度和雜交緩沖液組成的影響。通常，將低嚴(yán)格條件選擇成在定義的離子強(qiáng)度和PH處，低 于特定序列的熱解鏈溫度(TJ約30°C。中等嚴(yán)格條件是當(dāng)所述溫度在Tm以下20°C時(shí)，并 且高嚴(yán)格條件是當(dāng)所述溫度在Tm以下10°C時(shí)。高嚴(yán)格雜交條件一般用于分離與靶核酸序 列具有高序列相似性的雜交序列。然而，核酸可以在序列上偏離且依舊編碼基本上相同的 多肽，原因是遺傳密碼的簡(jiǎn)并性。因而，有時(shí)候可能需要中等嚴(yán)格雜交條件以鑒定此類核酸 分子。1 是在定義的離子強(qiáng)度和pH處的下述溫度，其中50%的靶序列在所述溫度與完 全匹配的探針雜交。取決于溶液條件和探針的堿基組成及長(zhǎng)度。例如，較長(zhǎng)的序列在更 高溫度上特異性雜交。最大雜交速率從低于Tm約16°C直至32°C獲得。雜交溶液中一價(jià)陽(yáng) 離子的存在降低了兩條核酸鏈之間的靜電排斥作用，因而促進(jìn)雜交體形成；這種作用對(duì)于 直到0. 4M的鈉濃度是顯而易見(jiàn)的(對(duì)于更高濃度而言，可以忽略這種作用)。甲酰胺降低 DNA-DNA和DNA-RNA雙鏈體的解鏈溫度，每百分?jǐn)?shù)的甲酰胺降低0. 6至0. 7°C，且添加50% 甲酰胺允許在30至45°C雜交，盡管雜交速率會(huì)降低。堿基對(duì)錯(cuò)配降低雜交速率和雙鏈體的 熱穩(wěn)定性。平均且對(duì)于大的探針而言，Tm下降約rc/每^堿基錯(cuò)配。根據(jù)雜交體的類型， 1可以使用以下等式計(jì)算1)DNA-DNA 雜交體(Meinkoth 和 ffahl, Anal. Biochem.，138 :267_284，1984)Tm = 81. 5°C +16. 6Xlog10[Na+]a+0. 41X % [G/Cb]-500 X LT1-。. 61X % 甲酰胺
2) DNA-RNA 雜交體或 RNA-RNA 雜交體Tm = 79. 8+18. 5 (log10 [Na+]a) +0. 58(% G/Cb)+ll. 8(% G/Cb) 2_820/Lc3)寡DNA雜交體或寡RNAd雜交體對(duì)少于20個(gè)核苷酸而言Tm = 2 (ln)對(duì)20-35 個(gè)核苷酸而言Tm = 22+1. 46 (ln)a或者用于其他一價(jià)陽(yáng)離子，但是僅在0. 01-0. 4M范圍內(nèi)是精確的。MX對(duì)于在30% -75%范圍內(nèi)的％ GC是精確的。CL =雙鏈體的堿基對(duì)長(zhǎng)度。
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d01igo，寡核苷酸;ln，=引物的有效長(zhǎng)度=2X (G/C數(shù))+ (A/T數(shù))。可以使用許多已知技術(shù)中任意一種技術(shù)控制非特異性結(jié)合，例如將膜以含有蛋白 質(zhì)的溶液封閉、添加異源RNA、異源DNA和SDS至雜交緩沖液，并且用RNA酶處理。對(duì)于非 同源性探針，可以通過(guò)變換以下條件之一 (i)漸進(jìn)地降低復(fù)性溫度(例如從68°C至42°C) 或(ii)漸進(jìn)地降低甲酰胺濃度(例如從50%至0%)進(jìn)行一系列雜交。技術(shù)人員了解可 以在雜交期間變更并且會(huì)維持或改變所述嚴(yán)格條件的多個(gè)參數(shù)。除了雜交條件之外，雜交特異性一般還取決于雜交后洗液的功能。為除去因非特 異性雜交引起的背景，用稀釋的鹽溶液洗滌樣品。此類洗液的關(guān)鍵因素包括最終洗滌溶液 的離子強(qiáng)度和溫度鹽濃度越低且洗滌溫度越高，則洗滌的嚴(yán)格性越高。洗滌條件一般在 雜交嚴(yán)格性上或低于所述雜交嚴(yán)格性進(jìn)行。陽(yáng)性雜交產(chǎn)生至少兩倍于背景信號(hào)的信號(hào)。通 常，用于核酸雜交測(cè)定法或基因擴(kuò)增檢測(cè)方法的適宜嚴(yán)格條件如上所述。也可以選擇嚴(yán)格 性更高或更低的條件。技術(shù)人員了解可以在洗滌期間變更并且會(huì)維持或改變所述嚴(yán)格條件 的多個(gè)參數(shù)。例如，用于長(zhǎng)度大于50個(gè)核苷酸的DNA雜交體的典型高嚴(yán)格雜交條件包括在65°C 于1XSSC中或在42°C于1XSSC和50%甲酰胺中雜交，隨后在65°C于0. 3XSSC中洗滌。 用于長(zhǎng)度大于50個(gè)核苷酸的DNA雜交體的中等嚴(yán)格雜交條件的例子包括在50°C于4X SSC 或在40°C于6XSSC和50%甲酰胺中雜交，隨后在50°C于2XSSC中洗滌。雜交體的長(zhǎng)度 是雜交核酸的預(yù)期長(zhǎng)度。當(dāng)序列已知的核酸雜交時(shí)，可以通過(guò)比對(duì)序列并鑒定本文中所述 的保守區(qū)而確定雜交體長(zhǎng)度。1\33(是0. 15M NaCl和15mM檸檬酸鈉；雜交溶液和洗滌溶 液可以額外地包括5XDenhardt試劑、0. 5-1.0% SDSUOOu g/ml變性的片段化鮭精DNA、 0.5%焦磷酸鈉。出于定義嚴(yán)格性水平的目的，可以參考Sambrook等(2001)MolecularCloning :a laboratory manual,第三版 Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, CSH, New York 或參考 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，N. Y. (1989 和年度更新 版)。剪接變體如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“剪接變體”包括其中已經(jīng)切除、替換、置換或添加所選內(nèi)含 子和/或外顯子或其中已經(jīng)縮短或加長(zhǎng)內(nèi)含子的核酸序列的變體。此類變體將是基本上保 留蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的一類變體；這可以通過(guò)選擇性保留蛋白質(zhì)的功能片段實(shí)現(xiàn)。此類 剪接變體可以在自然界中找到或可以人工制備。用于預(yù)測(cè)和分離此類剪接變體的方法是本 領(lǐng)域熟知的(見(jiàn)例如 Foissac 和 Schiex(2005)BMC Bioinformatics. 6 25)。等位變體等位基因或等位變體是給定基因位于相同染色體位置處的備選形式。等位變體包 含單核苷酸多態(tài)性(SNP)和小的插入/缺失多態(tài)性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。 SNP和INDEL形成大部分生物的天然存在多態(tài)性株系中的序列變體的最大集合?；蚋慕M/定向進(jìn)化基因改組或定向進(jìn)化由反復(fù)DNA改組，隨后適當(dāng)篩選和/或選擇以產(chǎn)生編碼具 有改良生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)的核酸或其部分的變體而組成(Castle等人，(2004)Science 304(5674) 1151-4 ；美國(guó)專利 5，811，238 和 6，395，547)。
調(diào)節(jié)元件/調(diào)控序列/啟動(dòng)子術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)元件”、“調(diào)控序列”和“啟動(dòng)子”均在本文中可相互交換地使用并且在廣 泛含義上意指能夠?qū)崿F(xiàn)與它們相連接的序列表達(dá)的調(diào)節(jié)性核酸序列。術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”一般指 位于基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游并參與識(shí)別和結(jié)合RNA聚合酶和其他蛋白質(zhì)，因而指導(dǎo)有效連接的 核酸轉(zhuǎn)錄的核酸調(diào)控序列。前述術(shù)語(yǔ)包括從經(jīng)典真核基因組基因(包括對(duì)于精確轉(zhuǎn)錄啟動(dòng) 所需的TATA框，具有或沒(méi)有CCA T框序列)衍生的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和應(yīng)答發(fā)育性刺激和/或 外部刺激或以組織特異性方式而改變基因表達(dá)的其它調(diào)節(jié)元件(即上游激活序列、增強(qiáng)子 和沉默子)。本術(shù)語(yǔ)還包括經(jīng)典原核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，在此情況下它可以包括一個(gè)-35 框序列和/或一個(gè)-10框轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)元件”也包含賦予、激活或增強(qiáng)核酸分 子在細(xì)胞、組織或器官中表達(dá)的人工融合分子或衍生物?！爸参飭?dòng)子”包含介導(dǎo)植物細(xì)胞中編碼序列節(jié)段表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。因此，植物啟 動(dòng)子不必須是植物來(lái)源的，但可以源自病毒或微生物，例如來(lái)自侵襲植物細(xì)胞的病毒?！爸?物啟動(dòng)子”也可以源自植物細(xì)胞，例如來(lái)自用本發(fā)明方法中待表達(dá)的并在本文中描述的核 酸序列轉(zhuǎn)化的植物。這也適用于其他“植物”調(diào)節(jié)信號(hào)，如“植物”終止子。用于本發(fā)明方 法中的核苷酸序列上游的啟動(dòng)子可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷酸替換、插入和/或缺失進(jìn)行修 飾，但不影響啟動(dòng)子、可讀框(0RF)或3’調(diào)節(jié)區(qū)如終止子或遠(yuǎn)離0RF存在的其他3’調(diào)節(jié)區(qū) 的功能性或活性。還有可能所述啟動(dòng)子的活性因修飾其序列或它們被更活躍的啟動(dòng)子、甚 至來(lái)自異源生物的啟動(dòng)子徹底替換而提高。為了在植物中表達(dá)，如上所述，核酸分子必須有 效地連接至或包含在正確的時(shí)間點(diǎn)并以所需空間表達(dá)模式表達(dá)基因的合適啟動(dòng)子。為鑒定功能性等同啟動(dòng)子，候選啟動(dòng)子的啟動(dòng)子強(qiáng)度和/或表達(dá)模式可以例如通 過(guò)將此啟動(dòng)子有效連接至報(bào)道基因并分析該報(bào)道基因在植物的多種組織中的表達(dá)水平和 模式進(jìn)行分析。合適的熟知報(bào)道基因包括例如葡糖醛酸酶或半乳糖苷酶。啟動(dòng)子活 性通過(guò)測(cè)量葡糖醛酸酶或半乳糖苷酶的酶活性進(jìn)行分析。啟動(dòng)子強(qiáng)度和/或表達(dá) 模式可以隨后與參考啟動(dòng)子(如在本發(fā)明方法中使用的一種啟動(dòng)子)的啟動(dòng)子強(qiáng)度和/或 表達(dá)模式比較。備選地，啟動(dòng)子強(qiáng)度可以使用本領(lǐng)域已知方法如RNA印跡法及放射自顯影 圖的密度計(jì)分析法、定量實(shí)時(shí)PCR或RT-PCR(Heid等，1996Genome Methods 6 :986_994)，通 過(guò)量化mRNA水平或通過(guò)將本發(fā)明方法中所用核酸的mRNA水平與持家基因(如18S rRNA) 的mRNA水平比較進(jìn)行分析。通?！叭鯁?dòng)子”意指驅(qū)動(dòng)編碼序列在低水平表達(dá)的啟動(dòng)子。 “低水平”意指在每個(gè)細(xì)胞約1/10，000轉(zhuǎn)錄物至約1/100，000轉(zhuǎn)錄物、至約1/500，0000轉(zhuǎn) 錄物的水平上。相反，“強(qiáng)啟動(dòng)子”驅(qū)動(dòng)編碼序列在高水平、或以每個(gè)細(xì)胞約1/10轉(zhuǎn)錄物至 約1/100轉(zhuǎn)錄物、至約1/1000轉(zhuǎn)錄物表達(dá)。有效地連接如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“有效地連接”指啟動(dòng)子序列與目的基因之間的功能連接，從 而該啟動(dòng)子序列能夠啟動(dòng)該目的基因轉(zhuǎn)錄。組成型啟動(dòng)子“組成型啟動(dòng)子”指在生長(zhǎng)和發(fā)育的大部分期間但不是必需在全部期間，以及在大 多數(shù)環(huán)境條件下，在至少一種細(xì)胞、組織或器官中有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。下表2C給出組成 型啟動(dòng)子的例子。遍在啟動(dòng)子
遍在啟動(dòng)子是在生物的全部組織或細(xì)胞中基本上有活性的。發(fā)育調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子發(fā)育調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子在某些發(fā)育階段期間或在經(jīng)歷發(fā)育變化的植物的部分中有活 性。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在應(yīng)答化學(xué)刺激(綜述見(jiàn)Gatz 1997，Annu. Rev. PlantPhysiol. Plant Mol.Biol. ,48 :89_108)、環(huán)境刺激或物理刺激時(shí)具有誘導(dǎo)的或提高的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)作 用，或可以是“脅迫誘導(dǎo)的”，即當(dāng)植物暴露于多種脅迫條件時(shí)其激活，或是“病原體誘導(dǎo) 的”，即當(dāng)植物暴露于多種病原體時(shí)其激活。器官特異件/組織特異件啟動(dòng)子器官特異性或組織特異性啟動(dòng)子是能夠偏好地啟動(dòng)某些器官或組織如葉、根、種 子組織等中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。例如，“根特異性啟動(dòng)子”是這樣的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子優(yōu)勢(shì)地在植 物根中具有轉(zhuǎn)錄活性，在植物的任何其他部分中基本上無(wú)活性，盡管在該植物的這些其他 部分中仍允許任意泄露表達(dá)。能夠僅在某些細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子在本文中稱作“細(xì)胞 特異性的”。根特異性啟動(dòng)子的例子列于下表2A中。表2A 根特異性啟動(dòng)子的例子 種子特異性啟動(dòng)子是能夠在種子組織中優(yōu)勢(shì)地具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子，但無(wú)需排 他性地在種子組織中有轉(zhuǎn)錄活性(在泄露表達(dá)的情況下)。種子特異性啟動(dòng)子可以在種子 發(fā)育期間和/或萌發(fā)期間有活性。種子特異性啟動(dòng)子的例子示于下表2B中。種子特異性 啟動(dòng)子的其他實(shí)例在 Qing Qu和 Takaiwa(Plant Biotechnol. J. 2，113—125，2004)中給出， 所述文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容如完整所述那樣通過(guò)引用方式并入本文。表2B 種子特異性啟動(dòng)子的例子如本文中所定義的綠色組織特異性啟動(dòng)子是優(yōu)勢(shì)地在綠色組織中具有轉(zhuǎn)錄活性 的啟動(dòng)子，在植物的任何其它部分內(nèi)基本上無(wú)活性，盡管在該植物的這些其他部分中仍允 許任意泄露表達(dá)。表2c 組成型啟動(dòng)子的例子 組織特異性啟動(dòng)子的另一個(gè)例子是分生組織特異性啟動(dòng)子，其優(yōu)勢(shì)地在分生組織 中具有轉(zhuǎn)錄活性，在植物的任何其它部分內(nèi)基本上無(wú)活性，盡管在該植物的這些其他部分 中仍允許任意泄露表達(dá)。終止子術(shù)語(yǔ)“終止子”包括作為轉(zhuǎn)錄單元末端處DNA序列的調(diào)控序列，所述的DNA序列產(chǎn) 生初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的3’加工和多腺苷酸化及轉(zhuǎn)錄終止的信號(hào)。終止子可以從天然基因、從多種 其他植物基因或從T-DNA衍生。待添加的終止子可以從例如胭脂堿合酶基因或章魚堿合酶 基因或備選地從另一種植物基因或較次優(yōu)選地從任何其他真核基因衍生。調(diào)節(jié)就表達(dá)或基因表達(dá)而言，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”意指這樣的過(guò)程，在所述過(guò)程中與對(duì)照植物 相比較，表達(dá)水平因所述基因的表達(dá)而改變，優(yōu)選地，表達(dá)水平可以提高或降低。原始、未 調(diào)節(jié)的表達(dá)可以是結(jié)構(gòu)性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何類型的表達(dá)，隨后是翻譯。術(shù)語(yǔ) “調(diào)節(jié)活性”應(yīng)當(dāng)意指本發(fā)明核酸序列或所編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)的任何改變，這引起植物產(chǎn)量 提高和/或生長(zhǎng)增加。表達(dá)術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”或“基因表達(dá)”意指某個(gè)特定基因或多個(gè)特定基因或特定基因構(gòu)建體 的轉(zhuǎn)錄。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”或“基因表達(dá)”尤其意指某個(gè)基因或某些基因或基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄成結(jié) 構(gòu)性RNA (rRNA.tRNA)或mRNA，所述RNA隨后翻譯成或不翻譯成蛋白質(zhì)。該過(guò)程包括DNA的轉(zhuǎn)錄和所得mRNA產(chǎn)物的加工。增加的表汰/過(guò)量表汰如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“增加的表達(dá)”或“過(guò)量表達(dá)”意指相對(duì)于原有野生型表達(dá)水 平為額外的任何形式的表達(dá)。用于提高基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的方法在本領(lǐng)域內(nèi)被充分報(bào)道并且包括例如由適 宜啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的過(guò)量表達(dá)、使用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子?？梢詫?dǎo)入在非異源形式的多核 苷酸的適宜位置(一般在上游)中導(dǎo)入充當(dāng)啟動(dòng)子或增強(qiáng)子元件的分離的核酸，從而上調(diào) 編碼目的多肽的核酸表達(dá)。例如，可以在體內(nèi)通過(guò)突變、缺失和/或替換而改變內(nèi)源性啟動(dòng) 子(見(jiàn)Kmiec，US5, 565，350 ；Zarling等，W09322443)，或可以將分離的啟動(dòng)子以相對(duì)于本 發(fā)明基因的恰當(dāng)方向及距離導(dǎo)入植物細(xì)胞，從而控制該基因的表達(dá)。若需要多肽表達(dá)，通常希望的是在多核苷酸編碼區(qū)的3’末端包括多腺苷酸化區(qū)。 該多腺苷酸化區(qū)可以從天然基因、從多種其他植物基因或從T-DNA衍生。待添加的3’末端 序列可以從例如胭脂堿合酶基因或章魚堿合酶基因或備選地從另一種植物基因或較不優(yōu) 選地從任何其他真核基因衍生。內(nèi)含子序列也可以添加至5’非翻譯區(qū)(UTR)或部分編碼序列的編碼序列以提 高細(xì)胞質(zhì)中聚集的成熟信使的量。已經(jīng)顯示在植物和動(dòng)物表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄單位中包 含可剪接內(nèi)含子提高了 mRNA水平及蛋白質(zhì)水平上的基因表達(dá)高達(dá)1000倍(Buchman和 Berg(1988)Mol. Cell biol. 8 :4395_4405 ;Callis等(1987)Gens Dev 1 :1183_1200)。此類 內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)的作用一般在所述內(nèi)含子置于轉(zhuǎn)錄單位的5’末端附近時(shí)最強(qiáng)烈。玉米 內(nèi)含子Adhl-S內(nèi)含子1、2和6、Bronze-1內(nèi)含子的用途是本領(lǐng)域已知的。對(duì)于總體信息， 見(jiàn)《玉米手冊(cè)》，第 116 章，編者 Freeling 和 Walbot，Springer, N. Y. (1994)。內(nèi)源基因本文中對(duì)“內(nèi)源性”基因的稱謂不僅指如植物中以其天然形式(即沒(méi)有人類任何 干預(yù))存在的所討論基因，還指處于分離形式的隨后(再)被導(dǎo)入植物(轉(zhuǎn)基因)的相同 基因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有這種轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物可以遭遇轉(zhuǎn)基因 表達(dá)的相當(dāng)大程度地度降低和/或內(nèi)源基因表達(dá)的實(shí)質(zhì)降低。分離的基因可以從生物分離 或可以是人造的，例如通過(guò)化學(xué)合成法。降低的表達(dá)本文中提及的“降低的表達(dá)”或“降低或基本消除表達(dá)”意指內(nèi)源基因表達(dá)和/或 多肽水平和/或多肽活性相對(duì)于對(duì)照植物的下降。與對(duì)照植物相比較，所述降低或基本上 消除以增加的優(yōu)選順序是至少10%、20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、85%、90% 或 95%、96%、97%、98%、99% 或更多降低。為了降低或基本消除植物中內(nèi)源基因的表達(dá)，需要核酸序列的基本上連續(xù)的核苷 酸的足夠長(zhǎng)度。為進(jìn)行基因沉默，該長(zhǎng)度可以短至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10個(gè) 或更少核苷酸，或者該長(zhǎng)度可以長(zhǎng)至整個(gè)基因(包括部分或完整的5’和/或3’UTR)。基本 上連續(xù)的核苷酸片段可以從編碼目的蛋白的核酸(靶基因)或從能夠編碼目的蛋白的直向 同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸衍生。優(yōu)選地，基本上連續(xù)的核苷酸的片段能夠與 靶基因(有義鏈或反義鏈)形成氫鍵，更優(yōu)選地，基本上連續(xù)的核苷酸片段以增加的優(yōu)選順 序與靶基因(有義鏈或反義鏈)具有50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的序列同一性。編碼(功能性)多肽的核酸序列不是本文中所討論用于 降低或基本消除內(nèi)源基因表達(dá)的多種方法的前提。可以使用常規(guī)工具和技術(shù)完成表達(dá)的這種降低或基本消除。用于降低或基本消除 內(nèi)源基因表達(dá)的優(yōu)選方法是在植物中導(dǎo)入并表達(dá)基因構(gòu)建體，其中將核酸(在此情況下， 從目的基因或從能夠編碼任何一種目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核 酸中衍生的一段基本上連續(xù)的核苷酸)克隆至所述基因構(gòu)建體，(部分或完全地)作為被 間隔序列(非編碼性DNA)隔開(kāi)的反向重復(fù)序列。在這種優(yōu)選的方法中，使用核酸或其部分(在此情況下，所述部分是從目的基因 或從能夠編碼目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸中衍生的一段基本 上連續(xù)的核苷酸)的反向重復(fù)序列(其優(yōu)選能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu))，通過(guò)RNA介導(dǎo)的沉默作用 降低或基本上消除內(nèi)源基因的表達(dá)。在包含調(diào)控序列的表達(dá)載體中克隆該反向重復(fù)序列。 非編碼性DNA核酸序列(間隔序列，例如基質(zhì)附著區(qū)片段(MAR)、內(nèi)含子、多接頭等)位于 形成所述反向重復(fù)序列的兩個(gè)反向核酸之間。在反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄后，形成具有(部分或 完全)自我互補(bǔ)性結(jié)構(gòu)的嵌合RNA。這種雙鏈RNA結(jié)構(gòu)稱作發(fā)夾RNA(hpRNA)。hp RNA由植 物加工成siRNA，該siRNA被摻入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)。該RISC進(jìn)一步切開(kāi)所述 mRNA轉(zhuǎn)錄物，從而相當(dāng)大程度地降低待翻譯成多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目。對(duì)于其他一般細(xì) 節(jié)，見(jiàn)例如 Grierson 等人(1998)W0 98/53083 ；ffaterhouse 等人(1999)W0 99/53050。本發(fā)明方法的實(shí)施不取決于在植物中導(dǎo)入并表達(dá)將所述核酸作為反向重復(fù)序列 克隆到其中的基因構(gòu)建體，不過(guò)可以使用幾種熟知“基因沉默”方法中任何一種或多種方法 來(lái)實(shí)現(xiàn)相同效果。用于降低內(nèi)源基因表達(dá)的一種這樣的方法是RNA介導(dǎo)的基因表達(dá)沉默(下調(diào))。 在這種情況下，沉默作用由植物中與內(nèi)源性靶基因?qū)嵸|(zhì)相似的雙鏈RNA序列(dsRNA)觸發(fā)。 這種dsRNA進(jìn)一步被植物加工成約20個(gè)至約26個(gè)核苷酸的所謂短干擾RNA (siRNA)。所 述siRNA被摻入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)，其中所述RISC切割內(nèi)源靶基因的mRNA轉(zhuǎn) 錄物，從而相當(dāng)大程度地將降低待翻譯成多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目。優(yōu)選地，所述雙鏈RNA 序列與靶基因?qū)?yīng)。RNA沉默方法的另一個(gè)例子涉及將核酸序列或其部分(在此情況下是從目的基因 或從能夠編碼目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸中衍生的一段基本 上連續(xù)的核苷酸)以有義方向?qū)胫参??！坝辛x方向”是指與自身mRNA轉(zhuǎn)錄物同源的DNA 序列。因而將所述核酸序列的至少一個(gè)拷貝導(dǎo)入植物。這個(gè)額外核酸序列會(huì)降低內(nèi)源基因 表達(dá)，從而產(chǎn)生已知為共抑制作用的現(xiàn)象。將一個(gè)核酸序列的幾個(gè)額外拷貝導(dǎo)入植物時(shí)，基 因表達(dá)的降低將更明顯，因?yàn)楦咿D(zhuǎn)錄物水平與觸發(fā)共抑制作用之間存在正相關(guān)。RNA沉默方法的另一個(gè)例子涉及使用反義核酸序列?！胺戳x”核酸序列包含與編碼 蛋白質(zhì)的“有義”核酸序列互補(bǔ)，即與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補(bǔ)，或與mRNA轉(zhuǎn)錄物序列 互補(bǔ)的核苷酸序列。反義核酸序列優(yōu)選地互補(bǔ)于待沉默的內(nèi)源基因。這種互補(bǔ)性可以存在 于基因的“編碼區(qū)”中和/或其“非編碼區(qū)”中。術(shù)語(yǔ)“編碼區(qū)”指包含被翻譯成氨基酸殘基 的密碼子的核苷酸序列的區(qū)域。術(shù)語(yǔ)“非編碼區(qū)”指分布在編碼區(qū)側(cè)翼的被轉(zhuǎn)錄但不翻譯 成氨基酸的5’和3’序列(也稱作5’和3’非翻譯區(qū))。反義核酸序列可以根據(jù)Watson和Crick堿基配對(duì)規(guī)則設(shè)計(jì)。反義核酸序列可以互補(bǔ)于整個(gè)核酸序列(在此情況下是從目的基因或從能夠編碼目的蛋白的直向同源物、旁 系同源物或同源物的任何核酸中衍生的一段基本上連續(xù)的核苷酸)，不過(guò)也可以是僅對(duì)所 述核酸序列的一部分(包括mRNA 5’和3’UTR)反義的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸序列 可以互補(bǔ)于編碼多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯起點(diǎn)周圍的區(qū)域。合適反義寡核苷酸序列的長(zhǎng) 度是本領(lǐng)域已知的并且可以從約50、45、40、35、30、25、20、15或10個(gè)核苷酸或更小的核苷 酸長(zhǎng)度開(kāi)始。本發(fā)明的反義核酸序列可以使用化學(xué)合成反應(yīng)和酶連接反應(yīng)，利用本領(lǐng)域已 知的方法構(gòu)建。例如，反義核酸序列(例如反義寡核苷酸序列)可以使用天然存在核苷酸 或以多種方式修飾的核苷酸化學(xué)地合成，其中所述的修飾核苷酸設(shè)計(jì)旨在增加分子的生物 學(xué)穩(wěn)定性或增加反義與有義核酸序列之間所形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性，例如，可以使用 硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸?？梢杂脕?lái)產(chǎn)生反義核酸序列的修飾核苷酸的例子 是本領(lǐng)域熟知的。已知的核苷酸修飾包括甲基化、環(huán)化和‘加帽’及用類似物(如肌苷)替 換一個(gè)或多個(gè)天然存在核苷酸。對(duì)核苷酸的其他修飾作用是本領(lǐng)域熟知的。反義核酸序列可以使用表達(dá)載體以生物學(xué)方式產(chǎn)生，其中一種核酸序列已經(jīng)以反 義方向亞克隆(即從插入的核酸轉(zhuǎn)錄出的RNA會(huì)對(duì)目的靶核酸為反義方向)到所述表達(dá)載 體中。優(yōu)選地，植物中反義核酸序列的產(chǎn)生借助穩(wěn)定整合的核酸構(gòu)建體進(jìn)行，其中所述的核 酸構(gòu)建體包含啟動(dòng)子、有效連接的反義寡核苷酸和終止子。用于本發(fā)明方法中沉默作用的核酸分子(無(wú)論被導(dǎo)入植物中或原位(insitu)地 產(chǎn)生)與mRNA轉(zhuǎn)錄物和/或編碼多肽的基因組DNA雜交或結(jié)合以因而抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)， 例如通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯做到這一點(diǎn)。雜交可以因形成穩(wěn)定雙鏈體的常規(guī)核苷酸互 補(bǔ)性引起，或例如，在與DNA雙鏈體結(jié)合的反義核酸序列的情況下，因雙螺旋大溝內(nèi)的特異 性相互作用引起。反義核酸序列可以通過(guò)在特定組織部位轉(zhuǎn)化或直接注射導(dǎo)入植物。備選 地，反義核酸序列可以被修飾以靶向所選的細(xì)胞并且隨后全身性施用。例如，對(duì)于全身性施 用，可以修飾反義核酸序列，從而它們與表達(dá)在所選細(xì)胞表面上的受體或抗原特異性地結(jié) 合，例如通過(guò)將所述反義核酸序列連接至與細(xì)胞表面受體或抗原結(jié)合的肽或抗體連接而做 到這一點(diǎn)。反義核酸序列也可以使用本文中所述的載體遞送至細(xì)胞。根據(jù)又一個(gè)方面，反義核酸序列是a-端基異構(gòu)核酸序列。a端基異構(gòu)核酸序 列與互補(bǔ)RNA形成特定的雙鏈雜交體，在所述雙鏈雜交體中與常見(jiàn)的b-單元相反，所述 鏈彼此平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Resl5 :6625_6641)。反義核酸序列也可以包含 2，-0-甲基核糖核苷酸(Inoue 等(1987) Nucl Ac Res 15,6131-6148)或嵌合 RNA-DNA 類 似物(Inoue 等(1987) FEBS Lett. 215，327-330)。內(nèi)源基因表達(dá)的降低或基本上消除也可以使用核酶進(jìn)行。核酶是具有核糖核酸 酶活性的催化性RNA分子，能夠切割與之具有互補(bǔ)區(qū)域的單鏈核酸序列，如mRNA。因此， 核酶(例如錘頭狀核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334，585-591中描述) 可以用來(lái)催化地切割編碼多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物，因而相當(dāng)大程度地降低待翻譯成多肽的 mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目?？梢栽O(shè)計(jì)對(duì)核酸序列具有專一性的核酶(見(jiàn)例如Cech等美國(guó)專利 號(hào)4，987，071 ；和Cech等美國(guó)專利號(hào)5，116，742)。備選地，與核酸序列相對(duì)應(yīng)的mRNA轉(zhuǎn) 錄物可以用來(lái)從RNA分子的匯集物中選出具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel 和Szostak (1993) Science 261，1411-1418)。核酶在植物中用于基因沉默的用途是本領(lǐng)域 已知的(例如 Atkins 等(1994) W0 94/00012 ；Lenne 等(1995) W0 95/03404 ；Lutziger 等(2000)W0 00/00619 ；Prinsen 等(1997)WO 97/13865 和 Scott 等(1997)W097/38116)?；虺聊部梢酝ㄟ^(guò)插入誘變(例如T-DNA插入或轉(zhuǎn)座子插入)或通過(guò)如 Angell 和 Baulcombe((1999)Plant J. 20(3) :357_62)、(Amp1 icon VIGSWO 98/36083)或 Baulcombe(W0 99/15682)及其他人描述的策略實(shí)現(xiàn)。如果內(nèi)源基因中存在突變和/或在隨后導(dǎo)入植物的分離基因/核酸中存在突變， 基因沉默也可能發(fā)生。所述降低或基本上消除可以由無(wú)功能的多肽引起。例如，該多肽可 以與多種相互作用的蛋白質(zhì)結(jié)合；一種或多種突變和/或截短作用因而可以產(chǎn)生仍能夠結(jié) 合相互作用的蛋白質(zhì)(如受體蛋白)但不能展示正常功能的多肽(如信號(hào)傳導(dǎo)配體)。基因沉默的又一種方法是瞄準(zhǔn)互補(bǔ)于基因調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子) 的核酸序列以形成阻止靶細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的三重螺旋結(jié)構(gòu)。見(jiàn)Helene，C.，Anticancer Drug Res. 6，569-84，1991 ；Helene 等，Ann. N. Y. Acad. Sci. 660，27-361992 ；和 Maher, L. J. Bioassays 14，807-15，1992。技術(shù)人員會(huì)熟知其他方法，如使用針對(duì)內(nèi)源多肽的抗體以抑制該多肽在植物中 (in planta)的功能，或干擾涉及某多肽的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。特別地，可以考慮人造分子可能 用于抑制靶多肽的生物學(xué)功能，或用于干擾涉及所述靶多肽的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。備選地，可以建立篩選程序以鑒定植物群體中基因的天然變體，其中所述的變體 編碼具有降低的活性的多肽。也可以使用此類天然變體，例如來(lái)進(jìn)行同源重組。人工和/或天然的微RNA(miRNA)可以用來(lái)敲除基因表達(dá)和/或mRNA翻譯。內(nèi)源 miRNA是通常19-24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的單鏈小RNA。它們主要發(fā)揮調(diào)節(jié)基因表達(dá)和/或mRNA翻 譯的功能。大多數(shù)的植物微RNA (miRNA)與其靶序列具有完全或接近完全的互補(bǔ)性。然而， 存在具有多達(dá)5個(gè)錯(cuò)配的天然靶。它們從具有特征性折返結(jié)構(gòu)的較長(zhǎng)非編碼性RNA由Dicer 家族的雙鏈特異性RNA酶加工得來(lái)。加工后，它們通過(guò)與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)的 主要組分-Argonaute蛋白結(jié)合被摻入該復(fù)合體。miRNA充當(dāng)RISC的特異性組分，因?yàn)樗鼈?與胞漿中的靶核酸(大多是mRNA)發(fā)生堿基配對(duì)。后續(xù)調(diào)節(jié)事件包括靶mRNA切割和摧毀 和/或翻譯抑制。miRNA過(guò)量表達(dá)的影響因此往往反映為靶基因的mRNA水平降低?？梢詫ｉT地遺傳工程化一般21個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的人工微RNA(amiRNA)以負(fù)向地調(diào) 節(jié)單個(gè)或多個(gè)目的基因的基因表達(dá)。選擇植物的微RNA靶的決定因素是本領(lǐng)域熟知的。 用于靶識(shí)別的經(jīng)驗(yàn)參數(shù)已經(jīng)被定義并可以用來(lái)輔助具體amiRNA的設(shè)計(jì)(Schwab等，Dev. Cell 8，517-527，2005)。用于設(shè)計(jì)并產(chǎn)生amiRNA及其前體的便利工具也是公眾可獲得的 (Schwab 等，2006 Plant Cell. 2006 18(5) :1121_33)。為了最佳性能，用于降低植物中內(nèi)源基因表達(dá)的基因沉默技術(shù)需要使用來(lái)自單子 葉植物的核酸序列轉(zhuǎn)化單子葉植物，并使用來(lái)自雙子葉植物的核酸序列轉(zhuǎn)化雙子葉植物。 優(yōu)選地，將來(lái)自任意的給定植物物種的核酸序列導(dǎo)入相同的物種。例如，將來(lái)自稻的核酸序 列轉(zhuǎn)化到稻植物中。然而，不絕對(duì)要求待導(dǎo)入的核酸序列來(lái)自與待導(dǎo)入該核酸序列的植物 相同的植物物種。只要內(nèi)源靶基因與待導(dǎo)入的核酸之間存在實(shí)質(zhì)同源性即可。上文描述了用于降低或基本上消除植物中內(nèi)源基因表達(dá)的多種方法的例子。例 如，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠輕易調(diào)整用于沉默的前述方法，從而通過(guò)利用合適的啟動(dòng)子在 完整植物中或其部分中實(shí)現(xiàn)內(nèi)源基因表達(dá)的降低。選擇標(biāo)記(基因)/報(bào)道基因
“選擇標(biāo)記”、“選擇標(biāo)記基因”或“報(bào)道基因”包括對(duì)細(xì)胞賦予表型的任何基因，其 中在所述細(xì)胞中表達(dá)該“選擇標(biāo)記”、“選擇標(biāo)記基因”或“報(bào)道基因”以促進(jìn)鑒定和/或選擇 用本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。這些標(biāo)記基因能夠借助一系列不同原理而鑒定核 酸分子的成功轉(zhuǎn)移。合適的標(biāo)記可以選自賦予抗生素抗性或除草劑抗性、導(dǎo)入新代謝性狀 或允許目視選擇的標(biāo)記。選擇標(biāo)記基因的例子包括賦予抗生素抗性的基因(如使新霉素和 卡那霉素磷酸化的nptll或使潮霉素磷酸化的hpt或賦予針對(duì)例如博來(lái)霉素、鏈霉素、四環(huán) 素、氯霉素、氨芐青霉素、慶大霉素、遺傳霉素(Geneticin) (G418)、壯觀霉素或殺稻瘟菌素 的抗性的基因)、賦予除草劑抗性的基因(例如提供Basta 抗性的bar ；提供草甘膦抗性的 aroA或gox或賦予針對(duì)例如咪唑啉酮、膦絲菌素或磺脲類的抗性的基因)或提供代謝性狀 的基因(如允許植物使用甘露糖作為唯一碳源的manA，或利用木糖的木糖異構(gòu)酶，或抗?fàn)I 養(yǎng)性標(biāo)記如2-脫氧葡萄糖抗性)。目視標(biāo)記基因的表達(dá)導(dǎo)致顏色(例如0 -葡糖醛酸酶、 GUS或0 -半乳糖苷酶與其有色底物例如X-Gal)、發(fā)光(如螢光素/螢光素酶系統(tǒng))或熒 光(綠色熒光蛋白GFP和其衍生物)的形成。這個(gè)名單僅代表少數(shù)的可能標(biāo)記。技術(shù)人員 熟悉此類標(biāo)記。取決于生物和選擇方法，優(yōu)選不同的標(biāo)記。已知當(dāng)核酸穩(wěn)定或瞬時(shí)地整合至植物細(xì)胞時(shí)，僅少數(shù)細(xì)胞攝取外來(lái)DNA，并且根據(jù) 需要，將其整合至細(xì)胞的基因組中，這取決于所用的表達(dá)載體和所用的轉(zhuǎn)染技術(shù)。為鑒定并 選擇這些整合體，通常將編碼選擇標(biāo)記的基因(如上文所述的基因)連同目的基因一起導(dǎo) 入宿主細(xì)胞。這些標(biāo)記可以在這些基因例如通過(guò)常規(guī)方法缺失而無(wú)功能的突變體中使用。 此外，編碼選擇標(biāo)記的核酸分子可以在包含編碼本發(fā)明多肽或在本發(fā)明方法中使用的序列 的相同載體上，或在獨(dú)立的載體上導(dǎo)入宿主細(xì)胞。已經(jīng)用所導(dǎo)入核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以 通過(guò)選擇加以鑒定(例如具有整合的選擇標(biāo)記的細(xì)胞存活而其他細(xì)胞死亡)。因?yàn)橐坏┮呀?jīng)成功地導(dǎo)入所述標(biāo)記基因、尤其抗生素抗性基因和除草劑抗性基 因，則這些核酸不再是轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中需要的或是不想要的，故而，用于導(dǎo)入核酸的本發(fā) 明方法有利地使用能夠移除或切除這些標(biāo)記基因的技術(shù)。一種這樣的方法是所謂共轉(zhuǎn)化 法。共轉(zhuǎn)化法同時(shí)使用兩種載體以轉(zhuǎn)化，一種載體攜帶本發(fā)明的核酸而第二種載體攜帶標(biāo) 記基因。大比例的轉(zhuǎn)化體接受或在植物情況下包含(多達(dá)40%或更多的轉(zhuǎn)化體)這兩種載 體。在用農(nóng)桿菌(Agrobacterium)轉(zhuǎn)化的情況下，轉(zhuǎn)化體通常僅接受載體的一部分，即側(cè)翼 存在T-DNA的序列，該序列通常代表表達(dá)盒。標(biāo)記基因隨后可以通過(guò)實(shí)施雜交從轉(zhuǎn)化植物 中移除。在另一種方法中，整合至轉(zhuǎn)座子的標(biāo)記基因用于隨目的核酸一起轉(zhuǎn)化(稱作Ac/Ds 技術(shù))。轉(zhuǎn)化體可以與轉(zhuǎn)座酶來(lái)源物雜交，或轉(zhuǎn)化體用引起轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的核酸構(gòu)建體瞬時(shí)或 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。在一些情況下(大約10% )，一旦轉(zhuǎn)化已經(jīng)成功發(fā)生，則轉(zhuǎn)座子從宿主細(xì)胞的基 因組跳出并丟失。在其他許多情況下，轉(zhuǎn)座子跳到一個(gè)不同位置。在這些情況下，標(biāo)記基因 必須通過(guò)實(shí)施雜交來(lái)消除。在微生物學(xué)中，開(kāi)發(fā)了有可能或促進(jìn)檢測(cè)這類事件的技術(shù)。又 一種有利方法依賴于所謂重組系統(tǒng)；所述方法的優(yōu)勢(shì)在于雜交消除作用可以用該重組系統(tǒng) 實(shí)行。最知名的該類型系統(tǒng)稱作Cre/lox系統(tǒng)。Crel是移除位于loxP序列之間序列的重 組酶。如果標(biāo)記基因整合于loxP序列之間，一旦轉(zhuǎn)化已經(jīng)成功發(fā)生，則它因重組酶的表達(dá) 被移除。其他重組系統(tǒng)是 HIN/HIX、FLP/FRT 和 REP/STB 系統(tǒng)(Tribble 等，J. Biol. Chem.， 275，2000 22255-22267 ；Velmurugan 等，J. Cell Biol.，149，2000 :553_566)。位點(diǎn)特異性 地整合本發(fā)明核酸序列至植物基因組是可能的。自然，這些方法也可以應(yīng)用于微生物如酵母、真菌或細(xì)菌。轉(zhuǎn)基因的/轉(zhuǎn)基因/重組為本發(fā)明的目的，“轉(zhuǎn)基因的”、“轉(zhuǎn)基因”或“重組”例如就核酸序列而言，意指包含 所述核酸序列的表達(dá)盒、基因構(gòu)建體或載體，或用本發(fā)明核酸序列、表達(dá)盒或載體轉(zhuǎn)化的生 物，這些構(gòu)建體均通過(guò)重組方法產(chǎn)生，其中(a)編碼在本發(fā)明方法中有用的蛋白質(zhì)的核酸序列，或(b)與本發(fā)明核酸序列有效連接的基因調(diào)控序列，例如啟動(dòng)子，或(c)a)和b)并不位于它們的天然遺傳環(huán)境中或已經(jīng)通過(guò)重組方法被修飾，所述的 修飾有可能采取例如替換、添加、倒位或插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基的形式。天然遺傳環(huán)境 理解為意指原初植物中的天然基因組位點(diǎn)或染色體位點(diǎn)或存在于基因組文庫(kù)中。在基因組 文庫(kù)的情況下，優(yōu)選地保留，至少部分地保留該核酸序列的天然遺傳環(huán)境。該環(huán)境分布在該 核酸序列的至少一側(cè)并且具有至少50bp、優(yōu)選至少500bp、特別優(yōu)選至少lOOObp、最優(yōu)選至 少5000bp序列長(zhǎng)度。當(dāng)通過(guò)非天然、合成性(“人工”)方法(例如誘變處理)修飾天然存 在表達(dá)盒時(shí)，該表達(dá)盒_例如所述核酸序列的天然啟動(dòng)子與編碼如上文所定義在本發(fā)明方 法中有用的多肽的相應(yīng)核酸序列的天然存在組合_變成轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。合適的方法例如在 US 5，565，350 或 W0 00/15815 中描述。為了本發(fā)明的目的，如上所述，將轉(zhuǎn)基因植物因而理解為意指在本發(fā)明方法中使 用的核酸不處于它們?cè)谒鲋参锘蚪M中的天然基因座處，所述核酸有可能同源或異源地 表達(dá)。然而，如所提及，轉(zhuǎn)基因還意指盡管本發(fā)明的或在本發(fā)明方法中使用的核酸處在植物 基因組中它們的天然位置處，然而相對(duì)于天然序列而言，其序列已經(jīng)被修飾，和/或所述天 然序列的調(diào)節(jié)序列已經(jīng)被修飾。轉(zhuǎn)基因優(yōu)選地理解為意指本發(fā)明核酸在基因組中非天然基 因座處表達(dá)，即所述核酸的同源表達(dá)或優(yōu)選異源表達(dá)發(fā)生。在本文中提及優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植 物。MiL如本文中提及的術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)入”或“轉(zhuǎn)化”包括轉(zhuǎn)移外源多核苷酸至宿主細(xì)胞中，無(wú)論 轉(zhuǎn)化所用的方法是什么。能夠后續(xù)克隆性增殖(無(wú)論通過(guò)器官發(fā)生或胚發(fā)生)的植物組織 可以用本發(fā)明的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化并且可完整植物以從中再生。所選的具體組織根據(jù)可用于 并且最好適于正在進(jìn)行轉(zhuǎn)化的具體物種的克隆性增殖系統(tǒng)變化。示例性靶組織包括葉盤、 花粉、胚、子葉、下胚軸、大配子體、愈傷組織、現(xiàn)存的分生組織(例如頂端分生組織、腋芽和 根分生組織)和誘導(dǎo)的分生組織(例如子葉分生組織和下胚軸分生組織)。多核苷酸可以 瞬時(shí)或穩(wěn)定地導(dǎo)入宿主細(xì)胞并且可以非整合地維持，例如作為質(zhì)粒。備選地，它可以整合至 宿主基因組中。所得的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞隨后可以用來(lái)以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式再生出轉(zhuǎn) 化植物。外來(lái)基因轉(zhuǎn)移至植物基因組的過(guò)程稱作轉(zhuǎn)化。植物物種的轉(zhuǎn)化現(xiàn)在是相當(dāng)常規(guī)的 技術(shù)。有利地，可以使用幾種轉(zhuǎn)化方法中的任意方法將目的基因?qū)牒线m的祖先細(xì)胞。描 述用于轉(zhuǎn)化并從植物組織或植物細(xì)胞再生出植物的方法可以用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn) 化方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔法、增加游離DNA攝入的化學(xué)品、DNA直接注射至植物、粒子 槍轟擊法、使用病毒或花粉的轉(zhuǎn)化法和微量投射法(microprojection)。轉(zhuǎn)化方法可以選 自用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇法(Krens，F(xiàn).A.等人，(1982)Nature296，72-74 ；NegrutiuI 等人(1987)Plant Mol Biol 8:363-373)；原生質(zhì)體的電穿孔法(Shillito R. D.等人 (1985) Bio/Techno 1 3，1099-1102)；對(duì)植物材料的微量注射法(Crossway A 等人，(1986) Mol. Gen Genet 202 179-185) ；DNA 或 RNA 包被粒子轟擊法(Klein TM 等人，(1987) Nature 327:70)、用(非整合性)病毒感染等。包括轉(zhuǎn)基因作物植物在內(nèi)的轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選通過(guò) 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法產(chǎn)生。有利的轉(zhuǎn)化方法是植物原位(in planta)轉(zhuǎn)化法。為此目的， 例如有可能使農(nóng)桿菌作用于植物種子或有可能用農(nóng)桿菌接種植物分生組織。根據(jù)本發(fā)明， 已經(jīng)證明將轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌懸液作用于完整植物或至少作用于花原基是特別有利的。隨后 培育該植物直至獲得已處理植物的種子(Clough和Bent, Plant J. (1998) 16，735-743)。 用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)稻轉(zhuǎn)化的方法包括用于稻轉(zhuǎn)化的熟知方法，如在以下任意文獻(xiàn)中描述的那 些方法歐洲專利申請(qǐng) EP 1198985A1，Aldemita 和 Hodges (Planta 199:612-617,1996)； Chan 等(Plant Mol Biol 22(3) :491_506，1993)，Hiei 等(Plant J 6(2) :271_282，1994)， 其公開(kāi)內(nèi)容如充分所述那樣通過(guò)引用的方式并入本文。在谷物轉(zhuǎn)化的情況下，優(yōu)選的方 法如 Ishida 等人(Nat. Biotechnol 14(6) :745_50，1996)或 Frame 等人(Plant Physiol 129(1) =13-22,2002)描述，其公開(kāi)內(nèi)容如充分所述那樣通過(guò)引用的方式并入本文。所 述方法例如還由 B. Jenes 等，Techniques for Gene,在Transgenic Plants,第 1 卷， Engineering and Utilization,編者 S. D. Kung 和 R. ffu, AcademicPress (1993) 128-143 及 在 Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225)中描述。待 表達(dá)的核酸或構(gòu)建體優(yōu)選地克隆至適于轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的 載體，例如pBinl9(Bevan等，Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711)。通過(guò)這種載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿 菌隨后可以按照已知方式用于轉(zhuǎn)化植物，例如作為模型使用的植物如擬南芥屬植物(擬南 芥在本發(fā)明范圍不視為作物植物)，或作物植物，例如煙草植物，所述方式例如是通過(guò)在農(nóng) 桿菌溶液中浸泡擦傷的葉或切碎的葉并隨后在合適培養(yǎng)基中培育它們。借助根癌農(nóng)桿菌 轉(zhuǎn)化植物例如由Hfifgen和Willmitzer在Nucl. Acid Res. (1988) 16,9877中描述或尤其
從F.F.White，用于高等植物中基因轉(zhuǎn)移的載體(Vectors for Gene Transfer in Higher Plants)；在Transgenic Plants,第 1 卷，Engineering and Utilization, S. D. Kung禾口 R. Wu 編著，Academic Press，1993，第 15-38 頁(yè)中獲知。 除了轉(zhuǎn)化隨后必需再生成完整植物的體細(xì)胞之外，也可以轉(zhuǎn)化植物分生組織的 細(xì)胞，并且尤其那些發(fā)育成配子的細(xì)胞。在這種情況下，轉(zhuǎn)化的配子遵循天然的植物發(fā)育 過(guò)程，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。因此，例如用農(nóng)桿菌處理擬南芥屬植物的種子并且從正在發(fā) 育的植物中獲得種子，其中一定比例的所述植物被轉(zhuǎn)化并且因此是轉(zhuǎn)基因的[Feldman， KA 禾口 MarksMD(1987)Mol Gen Genet 208 274-289 ；Feldmann K (1992)，在編者 CKoncz， N-H Chua 禾口 J Shell, Methods in Arabidopsis Research. WordScientific, Singapore, 第274-289頁(yè)]。備選方法基于反復(fù)移除花序并將蓮座叢中心內(nèi)的切除部位與轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿 菌孵育，因而同樣可以在較晚的時(shí)間點(diǎn)獲得轉(zhuǎn)化的種子(Chang(1994)Plant J. 5 :551_558 ； Katavic(1994)MolGen Genet, 245 =363-370) 然而，特別有效的方法是改良真空滲入法， 如“浸花”法。在擬南芥屬植物真空浸潤(rùn)法的情況下，用農(nóng)桿菌懸液在減低的壓力下處 理完整植物[Bechthold，N(1993). C R Acad Sci Paris Life Sci，316 :1194_1199]，而 在“浸花”法的情況下，將正在發(fā)育的花組織與表面活性劑處理過(guò)的農(nóng)桿菌懸液短暫孵育 [Clough，SJ 和 Bent，AF (1998) The Plant J. 16，735-743]。在這兩種情況下均收獲某個(gè)比例的轉(zhuǎn)基因種子，并且這些種子可以通過(guò)生長(zhǎng)在如上所述的選擇條件下與非轉(zhuǎn)基因種子區(qū) 分開(kāi)。此外，質(zhì)體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化是有利的，因?yàn)橘|(zhì)體在大部分作物中以母系方式遺傳，這降低 或消除了借助花粉的轉(zhuǎn)基因流動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)。葉綠體基因組的轉(zhuǎn)化一般通過(guò)已經(jīng)在Klaus等人， 2004 [Nature Biotechnology 22 (2)，225-229]中示意性展示的方法實(shí)現(xiàn)。簡(jiǎn)而言之，將待 轉(zhuǎn)化的序列連同選擇標(biāo)記基因一起克隆至同源于葉綠體基因組的側(cè)翼序列之間。這些同源 側(cè)翼序列指導(dǎo)向原質(zhì)體系的位點(diǎn)特異性整合。已經(jīng)對(duì)許多不同的植物物種描述質(zhì)體轉(zhuǎn)化 法并且在Bock (2001)基礎(chǔ)研究和植物生物技術(shù)中的轉(zhuǎn)基因質(zhì)體(Transgenic plastidsin basic research and plant biotechnology). J Mol Biol. 2001 年月 21 日；312 (3) :425_38 或 Maliga, P(2003)質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)商業(yè)化進(jìn)展(Progresstowards commercialization of plastid transformation technology), TrendsBiotechnol. 21, 20-28 中給出綜述。其他 的生物技術(shù)進(jìn)展最近已經(jīng)以無(wú)標(biāo)記質(zhì)體轉(zhuǎn)化體的形式報(bào)道，其中可以通過(guò)瞬時(shí)共整合的 標(biāo)記基因產(chǎn)生所述無(wú)標(biāo)記質(zhì)體轉(zhuǎn)化體(Klaus等人，2004，Nature Biotechnology 22(2)， 225-229)。T-DNA 活化標(biāo)簽技術(shù)(T-DNA activation tagging)T-DNA活化標(biāo)簽技術(shù)(Hayashi等Science (1992) 1350-1353)涉及以如此方式在目 的基因的基因組區(qū)域內(nèi)或基因的編碼區(qū)上游或下游10kb處插入通常含有啟動(dòng)子(也可以 是翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子)的T-DNA，從而該啟動(dòng)子指導(dǎo)所靶向基因的表達(dá)。一般，目標(biāo)基因 的天然啟動(dòng)子對(duì)該基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用被破壞，并且該基因受新導(dǎo)入的啟動(dòng)子控制。該啟 動(dòng)子一般嵌入T-DNA中。這種T-DNA隨機(jī)地插入植物基因組，例如借助農(nóng)桿菌感染，并且引 起在所插入T-DNA附近的基因表達(dá)受到調(diào)節(jié)。所得的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)顯性表型，原因在于 所導(dǎo)入啟動(dòng)子附近的基因受修飾的表達(dá)。TILLING術(shù)語(yǔ)“TILLING”是“基因組中定向誘導(dǎo)的局部損傷法”的縮寫并且指用于產(chǎn)生和/ 或鑒定核酸的誘變技術(shù)，其中所述核酸編碼表達(dá)和/或活性改良的蛋白質(zhì)。TILLING還允許 選擇攜帶此類突變變體的植物。這些突變變體可以展示在強(qiáng)度或在位置或在時(shí)間方面改良 的表達(dá)(例如，如果所述突變影響啟動(dòng)子)。這些突變變體可以展示比其天然形式基因所表 現(xiàn)活性更高的活性。TILLING聯(lián)合了高密度誘變法與高通量篩選法。TILLING中一般所遵循 的步驟是(&作]\^誘變(1^(161 GP和Koncz C (1992)在Methods inArabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, Singapore編輯,World Scientific Publishing Co,第 16-82 頁(yè)；Feldmann等，(1994)在Meyerowitz EM, Somerville CR編輯,Arabidopsis. Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,第 137-172 頁(yè)；Lightner 禾口 Caspar T(1998) ^ J Martinez-Zapater, J SalinasMethods onMolecular Biology H 82 卷 Humana Press, Totowa, NJ,第 91-104 頁(yè))；(b)DNA 制備和匯集個(gè)體 DNA ； (c)PCR 擴(kuò)增 目的區(qū)域；(d)變性和復(fù)性以允許異雙鏈體形成；(e)DHPLC，其中匯集物中異雙鏈體的存在 被檢測(cè)為色譜圖中的一個(gè)額外峰；(f)鑒定突變個(gè)體；和(g)將突變PCR產(chǎn)物測(cè)序。用于 TILLING 的方法是本領(lǐng)域熟知的(McCallum 等，(2000)Nat Biotechnol 18 :455_457 ；綜述 ML Stemple(2004)Nat Rev Genet 5(2) 145-50)。同源重組同源重組允許在基因組中限定選擇的位置處導(dǎo)入所選擇的核酸。同源重組是在生物科學(xué)中例行用于低等生物如酵母或展葉劍葉蘚屬(Physcomitrella)苔蘚的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。 已經(jīng)對(duì)模式植物(Offringa等(1990) EMBO J 9(10) :3077_84)和作物植物例如稻(Terada 等(2002)NatBiotech 20(10) 1030-4 ;Iida 和 Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2) 132-8)描述了用于植物中進(jìn)行同源重組的方法，并且存在與靶生物無(wú)關(guān)而通常適用的方法 (Miller 等，Nature Biotechnol. 25，778-785，2007)。術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)量”通常意指經(jīng)濟(jì)價(jià)值的可測(cè)量結(jié)果，一般與指定作物、與面積并且與時(shí) 間間隔有關(guān)。單個(gè)植物部分基于它們的數(shù)目、大小和/或重量而直接有助于對(duì)產(chǎn)量，或?qū)嶋H 產(chǎn)量是某種作物和一年的每平方米產(chǎn)量，這通過(guò)總產(chǎn)量(包括收獲的和評(píng)估的產(chǎn)量)除以 種植的平方米數(shù)而確定。術(shù)語(yǔ)植物的“產(chǎn)量”可以涉及該植物的營(yíng)養(yǎng)生物量(根和/或苗 生物量)、涉及繁殖器官和/或涉及繁殖體(如種子)。早期牛長(zhǎng)勢(shì)“早期生長(zhǎng)勢(shì)”指活躍、健康、充分平衡的生長(zhǎng)，尤其是植物生長(zhǎng)早期期間，并且可 以因提高的植物適應(yīng)性所致，其中所述提高的植物適的原因是例如該植物更好地適應(yīng)環(huán)境 (即優(yōu)化能量資源的用途和在苗與根之間的分配)。具有早期生長(zhǎng)勢(shì)的植物也顯示提高的 籽苗存活和更佳的作物建立，這往往產(chǎn)生高度均一的田塊(作物以均一方式生長(zhǎng)，即大多 數(shù)植物在基本上相同的時(shí)間達(dá)到各個(gè)發(fā)育期)和往往更好及更高的產(chǎn)量。因而，早期生長(zhǎng) 勢(shì)可以通過(guò)測(cè)量多種因素如千粒核重(Thousand Kernel Weight)、萌發(fā)百分?jǐn)?shù)、出苗百分 數(shù)、籽苗生長(zhǎng)、籽苗高度、根長(zhǎng)度、根和苗生物量和許多其他因素等確定。提高/改善/增強(qiáng)術(shù)語(yǔ)“提高”、“改善”或“增強(qiáng)”是相互可交換的并且在應(yīng)用含義上應(yīng)當(dāng)意指與如本 文中定義的對(duì)照植物相比較，至少3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%、優(yōu)選至少15% 或20%、更優(yōu)選地25%、30%、35%或40%更多的產(chǎn)量和/或生長(zhǎng)。種子產(chǎn)量提高的種子產(chǎn)量自身可以表現(xiàn)為以下一個(gè)或多個(gè)指標(biāo)a)種子生物量(種子總重 量)增加，這可以基于單粒種子基礎(chǔ)和/或每株植物和/或每平方米；b)提高的每株植物 花數(shù)目；c)提高的(充實(shí))種子數(shù)；d)提高的種子充實(shí)率(其表述為充實(shí)種子數(shù)與種子總 數(shù)之間的比率)；e)提高的收獲指數(shù)，其表述為可收獲部分(如種子)產(chǎn)量與總生物量的比 率；和f)提高的千粒核重(TKW)，這從計(jì)數(shù)的充實(shí)種子數(shù)及其總重量中外推出來(lái)。提高的 TKW可以因增加的種子尺寸和/或種子重量弓|起，并且也可以因胚尺寸和/或胚乳尺寸增加 引起。種子產(chǎn)量的提高也可以表現(xiàn)為種子尺寸和/或種子體積的增加。此外，種子產(chǎn)量 的提高自身也可以表現(xiàn)為種子面積和/或種子長(zhǎng)度和/或種子寬度和/或種子周長(zhǎng)的提 高。提高的產(chǎn)量也可以產(chǎn)生改良的構(gòu)造，或可以因改良的構(gòu)造而出現(xiàn)。綠度指數(shù)從植物的數(shù)字圖像計(jì)算如本文中所用的“綠度指數(shù)”。對(duì)屬于圖像上植物目標(biāo)的每 個(gè)像素計(jì)算綠色值與紅色值的比率(在編碼顏色的RGB模式中)。綠度指數(shù)表述為綠色/ 紅色比超過(guò)給定閾值的像素百分?jǐn)?shù)。在正常生長(zhǎng)條件下，在鹽脅迫生長(zhǎng)條件下和在養(yǎng)分可 利用性降低的生長(zhǎng)條件下，植物的綠度指數(shù)在開(kāi)花前的最后成像中測(cè)量。相反，在干旱脅迫生長(zhǎng)條件下，植物的綠度指數(shù)在干旱后的首次成像中測(cè)量。腦本文中所用的術(shù)語(yǔ)“植物”包括完整植物、植物的祖先及子代和包括種子、苗、莖、 葉、根(包括塊莖)、花和組織、器官在內(nèi)的植物部分，其中每種前述對(duì)象包含目的基因/核 酸。術(shù)語(yǔ)“植物”也包括植物細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生組織區(qū)、配子體、孢子體、 花粉和小孢子，同樣其中每種前述對(duì)象包含目的基因/核酸。在本發(fā)明方法中特別有用的植物包括屬于植物界(Viridiplantae)超家族、尤 其單子葉和雙子葉植物的全部植物，包括飼用或飼料豆科植物、觀賞植物、糧食作物、樹(shù)或 灌木，其中所述植物選自包含以下物種的名單槭樹(shù)屬物種(Acer spp.)、獼猴桃屬物種 (Actinidia spp. )、fCM 禾中(Abelmoschus spp. )(Agave sisalana) ^^JC^M^J 種(Agropyron spp.)、匍匐剪股穎(Agrostis stolonifera)、蔥屬物種(Allium spp.)、莧 屬物禾中(Amaranthus spp.)、歐洲海濱草(Ammophila arenaria)、鳳梨(Ananascomosus)、 番荔枝屬物種(Annona spp.)、旱芹(Apium graveolens)、蜘蛛蘭屬物種(Arachis spp.)、 木波羅屬物種(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagusofficinalis)、燕麥屬物種(Avena spp.)(例如燕麥(Avena sativa)、里予燕麥(Avenafatua)、比贊燕麥(Avena byzantina) > Sf^^J^^ft (Avena fatua var. sativa) (Avena hybrida)、P曰杉匕(Averrhoa carambola) > M tt M (Bambusasp. ) > # /R (Benincasa hispida) > E M ^ (Bertholletia excelsea)、甜菜(Betavulgaris)、蕓苔屬物種(Brassica spp.)(例如歐洲油菜(Brassica napus)、#青物禾中(Brassica rapa ssp.)[卡 i若拉油菜、油禾子油菜(oilseed rape) > M 胄(turniprape) ]) > Cadaba farinosa> ^ (Camellia sinensis) > _ 入■ (Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒屬物禾中(Capsicum spp. ) > Carex elata、番木瓜 (Carica papaya) > (Carissa macrocarpa) > |JL| M ft (Caryaspp. ) > tE 花(Carthamus tinctorius)、栗屬物禾中(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceibapentandra)、 苦苣(Cichorium endivia)、樟屬物禾中(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、 柑桔屬物種(Citrus spp.)、椰子屬物種(Cocos spp.)、咖啡屬物種(Coffea spp.)、芋 頭(Colocasia esculenta)、非洲梧桐屬物種(Colaspp.)、黃麻屬(Corchorus sp.)、芫荽 (Cor i an drum sativum)、棒屬物禾中(Corylusspp.)、山才查屬物禾中(Crataegus spp.)、番紅 ^ (Crocus sativus) ^/RM^ft (Cucurbita spp. )、#j!M 禾中(Cucumis spp.) 屬物種(Cynara spp.)、胡蘿卜(Daucus carota)、山馬幢屬物種(Desmodium spp.)、龍眼 (Dimocarpuslongan) (Dioscorea spp.)、t市豐對(duì)屬物禾中(Diospyros spp.)、禾卑 屬物種(Echinochloa spp.)、油棕屬(Elaeis)(例如油棕(Elaeis guineensis)、美洲油 棕(Elaeis oleifera))、糝子(Eleusine coracana)、蔗茅屬物種(Erianthus sp.)、枇杷 (Eriobotrya japonica)、㈱屬_禾中(Eucalyptus sp. )、tl [子果(Eugeniauniflora)、#■屬 物種(Fagopyrum spp. )、7jC 青岡屬物種(Fagus spp.)、葦狀羊茅(Festuca arundinacea)、 無(wú)花果(Ficus carica)、金桔屬物種(Fortunellaspp.)、草莓屬物種(Fragaria spp.)、 銀杏(Ginkgo biloba)、大豆屬(Glycinespp.)(例如大豆(Glycine max)、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陸地棉(Gossypium hirstum)、向日葵屬(Helianthus spp.)(例如向曰奏(Helianthusannuus))、長(zhǎng)管營(yíng)草(Hemerocallis fulva)、木樓屬 物種(Hibiscus spp.)、大麥屬(Hordeum spp.)(例如大麥(Hordeum vulgare))、甘M (Ipomoea batatas)、核杉匕屬物禾中(Juglans spp.)、萬(wàn) H (Lactuca sativa)、山 H 豆 屬物禾中(Lathyrusspp.)> 兵豆(Lens culinaris)> M 麻(Linum usitatissimum)> M 枝(Litchichinensis)、百脈根屬物種(Lotus spp.)、棱角絲瓜(Luffa acutangula)、 習(xí)習(xí)扇豆屬物禾中(Lupinus spp. ) > Luzula sylvatica、番 屬物禾中(Lycopersiconspp.) (例如番爺(Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆屬物種(Macrotyloma spp.)、蘋果屬物種(Malus spp.)、凹緣金虎 尾(Malpighia emarginata)、牛油果(Mammeaamericana)、芒果(Mangifera indica)、木 WM^ft (Manihot spp.(Manilkara zapota)^^!! (Medicago sativa)
禾中(Melilotus spp.)、_^M 禾中(Mentha spp. (Miscanthus sinensis) 瓜屬物種(Momordicaspp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉屬物種(Musa spp.)、煙草屬物種 (Nicotianaspp.)、木犀欖屬物種(Olea spp.)、仙人掌屬物種(Opuntia spp.)、鳥足豆屬 物種(Ornithopus spp.)、稻屬(Oryza spp.)(例如稻、闊葉稻(Oryza latifolia))、稷 (Panicum mi 1 iaceum) >(Panicum virgatum) > X^S^ (Passifloraedulis) >
M (Pastinaca sativa) ^^M^M^ft (Pennisetum sp.)、魚f 禾中(Persea spp.)、 Jf (Petroselinum crispum)、(Phalarisarundinacea) > ^ ii M ft (Phaseolus spp.)、貓尾草(Phleum pratense)、朿 lj 奏屬物禾中(Phoenix spp.)、南方聲華(Phragmites australis)、酸菜屬物種(Physalis spp.)、松屬物種(Pinus spp.)、阿月渾子(Pistacia vera)、豌豆屬物種(Pi sum spp.)、早熟禾屬物種(Poa spp.)、楊屬物種(Populus spp.)、 牧豆草屬物種(Prosopis spp.)、李屬物種(Prunus spp.)、番石榴屬物種(Psidiumspp.)、 石 (Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、f樂(lè)屬物禾中(Quercusspp.)、蘿卜 (Raphanus sativus)、波葉大黃(Rheum rhabarbarum)、茶薦子屬物禾中(Ribes spp.)、蓖麻 (Ricinus communis)、懸鉤子屬物種(Rubus spp.)、甘蔴屬物種(Saccharum spp.)、柳屬 物種(Salix sp.)、接骨木屬物種(Sambucusspp.)、黑麥(Secale cereale)、胡麻屬物種 (Sesamum spp.)、白芥屬物種(Sinapissp.)、爺屬(Solanum spp.)(例如馬鈴薯(Solanum tuberosum)、紅爺(Solanumintegrifolium)或番爺)、兩色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜 屬物種(Spinaciaspp.)、蒲桃屬物種(Syzygium spp.)、萬(wàn)壽菊屬物種(Tagetes spp.)、酸 ii (Tamarindus indica) > bJ bJW (Theobroma cacao)、$$由胃屬 禾中(Trifoliumspp.) > Triticosecale rimpaui、小麥屬(Triticum spp.)(例如普通小麥(Triticumaestivum)、硬 粒小麥(Triticum durum)、圓柱小麥(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、馬卡小麥 (Triticum macha)、普f(shuō)fl/j、麥(Triticumsativum)或普通zj、麥(Triticum vulgare))、/j、金 蓮花(Tropaeolum minus)、金蓮花(Tropaeolum majus)、越桔屬物禾中(Vaccinium spp.)、野 碗豆屬物種(Viciaspp.)、豇豆屬物種(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄屬物種 (Vitis spp.)、玉米(Zea mays)、Zizania palustris、麥屬物禾中(Ziziphus spp.)及其他。發(fā)明詳述令人驚訝地，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)植物中編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽 的核酸的表達(dá)產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物。根據(jù)第一實(shí)施方案， 本發(fā)明提供了用于相對(duì)于對(duì)照植物而言增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，包括調(diào)節(jié)植物中 編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸的表達(dá)。表述“增強(qiáng)/增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀”和“改善/改進(jìn)的產(chǎn)量相關(guān)性狀”具有相等的含義并且在本文中可互換地使用。表述“改善/改進(jìn)的產(chǎn)量相關(guān)性狀”和“改善/改進(jìn)的植物生長(zhǎng)特征”具有相等的 含義并且在本文中可互換地使用。用于調(diào)節(jié)(優(yōu)選增加)編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸表達(dá)的優(yōu) 選方法是在植物中導(dǎo)入并表達(dá)分別編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸。下文任何對(duì)“在本發(fā)明方法中有用的蛋白質(zhì)”的談及意指如本文中定義的D0F-C2 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽或MYB7多肽。下文任何對(duì)“在本發(fā)明方法中有用的核酸”的談及意指 能夠編碼這種D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽或這種MYB7多肽的核酸。待導(dǎo)入植物(并且因 而在實(shí)施本發(fā)明方法中有用)的核酸是編碼現(xiàn)在將描述的蛋白質(zhì)類型的任意核酸，下文也 稱作“D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子核酸”或“D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子基因”或“MYB7核酸”或“MYB7基因”。如本文中所定義的術(shù)語(yǔ)“D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽”指包含如下特征⑴和特征(ii) 的任意多肽(i)DOF結(jié)構(gòu)域，其以增加的優(yōu)選順序與由SEQ ID NO 35或SEQ IDN0 36代表的 D0F 結(jié)構(gòu)域序列具有至少 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性；和(ii)具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有5、4、3、2 或1個(gè)非保守性氨基酸替換的基序I :ERKARPQKDQ(SEQ IDN0 37)；和/或具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有3、2或1個(gè)非 保守性氨基酸替換的基序II :YWSGMI (SEQ ID NO 38)。如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽”、“D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子蛋白”、“D0F-C2 轉(zhuǎn)錄因子”、“D0F-C2多肽”和“D0F-C2蛋白”具有相同含義并且是彼此可互換的。額外地，D0F-C2多肽可以包含1、2、3、4種或全部的以下基序-具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有5、4、3、2或 1個(gè)非保守性氨基酸替換的基序III :RLLFPFEDLKPLVS(SEQID NO 39)；和/或-具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有4、3、2或1 個(gè)非保守性氨基酸替換的基序IV JNVKPMEEI (SEQ ID NO 40)；和/或;-具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有9、8、7、6、5、 4、3、2或1個(gè)非保守性氨基酸替換的基序V :KNPKLLHEGAQDLNLAFPHH(SEQ ID NO 41)；和/ 或-具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有5、4、3、2或 1個(gè)非保守性氨基酸替換的基序VI :MELLRSTGCYM(SEQ IDN0 42)；和/或-具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有9、8、7、6、5、 4、3、2 或 1 個(gè)非保守性氨基酸替換的基序 VII :MMDSNSVLYSSLGFPTMPDYK (SEQ ID NO 43)。在本發(fā)明方法中有用的優(yōu)選多肽包含如特征⑴中所述的Dof結(jié)構(gòu)域并包含基序 I和II。更優(yōu)選地，包含基序I、基序II和基序III。進(jìn)一步優(yōu)選地，該多肽也包含基序III。 進(jìn)一步優(yōu)選地，該多肽也包含基序IV。最優(yōu)選地，該多肽包含如特征(i)中所述的Dof 結(jié)構(gòu) 域和基序I、基序II、基序III、IV和V。(由SEQID N0:1編碼的)SEQ ID NO :2是D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽的例子，其中所述 D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽包含如本文以上所定義的特征(i)和(ii)，即與由SEQ ID NO :35或SEQ ID NO 36代表的Dof結(jié)構(gòu)域具有至少60%序列同一性，并且具有基序I和在這種情況 下額外包含基序II。在表A1中給出了包含如本文以上所定義特征(i)和(ii)的D0F-C2 轉(zhuǎn)錄因子多肽的其他例子。在本說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ)“表A”將用來(lái)說(shuō)明表A1和/或A2的內(nèi)容。在本說(shuō)明書 中使用的術(shù)語(yǔ)“表A1”將用來(lái)說(shuō)明表A1的內(nèi)容。在本說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ)“表A2”將用來(lái) 說(shuō)明表A2的內(nèi)容。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“表A”意指表A1。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 方案中，術(shù)語(yǔ)“表A”意指表A2。在本說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ)“表B”將用來(lái)說(shuō)明表B1和/或B2的內(nèi)容。在本說(shuō)明書 中使用的術(shù)語(yǔ)“表B1”將用來(lái)說(shuō)明表B1的內(nèi)容。在本說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ)“表B2”將用來(lái) 說(shuō)明表B2的內(nèi)容。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“表B”意指表B1。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 方案中，術(shù)語(yǔ)“表B”意指表B2。在本說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ)“表C”將用來(lái)說(shuō)明表C1和/或C2的內(nèi)容。在本說(shuō)明書 中使用的術(shù)語(yǔ)“表C1”將用來(lái)說(shuō)明表C1的內(nèi)容。在本說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ)“表C2”將用來(lái) 說(shuō)明表C2的內(nèi)容。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“表C”意指表C1。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 方案中，術(shù)語(yǔ)“表C”意指表C2。在本說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ)“表D1”將用來(lái)說(shuō)明表D1和/或D2的內(nèi)容。在本說(shuō)明 書中使用的術(shù)語(yǔ)“表D1”將用來(lái)說(shuō)明表D1的內(nèi)容。在本說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ)“表D2”將用 來(lái)說(shuō)明表D2的內(nèi)容。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“表D”意指表D1。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，術(shù)語(yǔ)“表D”意指表D2。在本說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ)“表2”將用來(lái)說(shuō)明表2A和/或表2B和/或表2C的內(nèi) 容。在本說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ)“表2A”將用來(lái)說(shuō)明表2A的內(nèi)容。在本說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ) “表2B”將用來(lái)說(shuō)明表2B的內(nèi)容。在本說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ)“表2C”將用來(lái)說(shuō)明表2C的內(nèi) 容。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“表2”意指表2A。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“表 2”意指表2B。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“表2”意指表2C。在表A1中給出的多肽是來(lái)自多種植物源的由SEQ ID NO :2代表的D0F-C2轉(zhuǎn)錄因 子多肽的“旁系同源物和直向同源物”例子，其屬于如Lijavetzky等人.2004的圖2和圖 3中定義的主要直向同源組Cc，亞組C2及C2. 1和C2. 2。用于實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選多肽屬于 如Lijavetzky等人.2004所定義的直向同源組C2(其包含擬南芥的C2以及稻的C2. 1和 C2. 2)。本發(fā)明的優(yōu)選D0F-C2多肽是表A1中給出的任意多肽的旁系同源物或直向統(tǒng)原物。備選地，D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽的同源物以增加的優(yōu)選順序與SEQ IDN0 2所代表 的氨基酸具有至少 25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、 37%,38%,39%A0%A1%A2%A3%A4:%A5%A6%A7%A8%A9%,50%,51%, 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%, 67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%, 97%、98%或99%的總體序列同一性，并且包含如下特征⑴和特征(ii)(i)DOF結(jié)構(gòu)域，其以增加的優(yōu)選順序與SEQ ID NO 35或SEQ IDN0 :36所代表 的 D0F 結(jié)構(gòu)域具有至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性；和
(ii)具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有5、4、3、2 或ι個(gè)非保守性氨基酸替換的基序I :ERKARPQKDQ(SEQ IDNO 37)；和/或 具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有3、2或1個(gè)非 保守性氨基酸替換的基序II =YffSGMI (SEQ ID NO 38)。如本文中定義的“MYB7多肽”指包含2個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域(SMART登錄號(hào)SM00717)、 Myb_DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Pfam登錄號(hào)PF00249)、同源異型域樣(Superfamily登錄號(hào) SSF46689))的任意R2R3 MYB多肽，條件是該R2R3 MYB多肽不是由SEQ ID NO: 141編碼的 或具有SEQ ID NO :142序列的0sMYB4。另外，“MYB7多肽”還包含基序1至7中的4種或更多種基序，優(yōu)選地還包含基序 1至7中的5種或更多種基序，更優(yōu)選地還包含基序1至7中的6種或更多種基序，最優(yōu)選 地還包含基序1至7的全部。基序1 (SEQ ID NO 55) (T/S)X(E/Q/D)EDXXLXX(Y/H) IXXXG ；其中在位置 2 中的 X 可以是任意氨基酸，但優(yōu)選地是K、Q、A、P、T、I、S之一，更優(yōu)選地是K或Q ；其中在位置6中 的X可以是任意氨基酸，但優(yōu)選地是Q、E、D、A、S之一，更優(yōu)選地是Q、E或D ；其中在位置7 中的X可以是任意氨基酸，但優(yōu)選地是R、L、K、M、I之一，更優(yōu)選地是R、L或K ；其中在位置 9中的X可以是任意氨基酸，但優(yōu)選地是I、V、T、G、L、A之一，更優(yōu)選地是I、V或T ；其中在 位置10中的X可以是任意氨基酸，但優(yōu)選地是N、D、A、S、K、G之一，更優(yōu)選地是N、D、A或 S ；其中在位置13中的X可以是任意氨基酸，但優(yōu)選地是R、K、Q、Ε、T、N之一，更優(yōu)選地是 R、K、Q或E ；其中在位置14中的X可以是任意氨基酸，但優(yōu)選地是V、K、A、S、Τ、E、N之一， 更優(yōu)選地是V、K、A或S ；和其中在位置15中的X可以是任意氨基酸，但優(yōu)選地是Y、H、N、D 之一，更優(yōu)選地是H或Y?；? (SEQ ID NO 56)(E/Y/P/H/L)(G/S)(C/N/S/R/G)W(R/N)(S/T/A/L/N)(L/I)P(K/R/T/A/S)(A/S/K/ N/L/R)。優(yōu)選地，基序 2 是 EG (C/N) WR (S/T/A) LP (K/R) (A/S)?；? (SEQ ID NO :57) :RCGKSCRLRWXNYLRP，其中X可以是任意氨基酸，優(yōu)選地是 I、M、L 或 T 之一?；?(SEQID NO 58) RTDNE(I/V)KN(Y/H/F)WN。優(yōu)選地，基序4是RTDNEIKNYWN?；? (SEQ ID NO 59) (T/S) (H/N/R) (I/V/L) (K/R/S) (R/K) (K/R) (L/I)XXXG(I/ L/T) (D/T) (P/L)，其中在位置8中的X可以是任意氨基酸，優(yōu)選地是I、L、V、T、A、R之一，更 優(yōu)選地是I、L、V或T ；其中在位置9中的X可以是任意氨基酸，優(yōu)選地是S、N、R、G、A、V、K、 Q之一，優(yōu)選地是S、N、R、G或A之一；其中在位置10中的X可以是任意氨基酸，優(yōu)選地是 R、K、Q、M、T 之一。優(yōu)選地，基序 5 是 TH(I/V/L) (K/R) (R/K) (K/R) (L/I)XXXG(I/L)DP?；? (SEQ ID NO 60)X(P/L/Q/ff)(D/E/V)(L/1)NL(E/D)LX(I/L/V)(S/D/N/G) (L/P/1) (P/S/A/V/T)，其 中在位置1中的X可以是任意氨基酸，優(yōu)選地是F、G、C、L、D或Y之一，并且其中在位置9 中的X可以是任意氨基酸，優(yōu)選地是R、K、G、T、C、D、S之一。基序7 (SEQ ID NO 61) (F/Y/C/D) (R/S/T) (S/T/G/R) (L/I) (Ε/Ρ) (M/T)K。備選地，MYB7蛋白的同源物以增加的優(yōu)選順序與SEQ ID NO :50所代表的氨基 酸具有至少 25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%,39%A0%A1%A2%A3%A4:%A5%A6%A7%A8%A9%,50%,51%,52%, 53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%, 68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98%或99%的總體序列同一性，條件是該同源蛋白包含如上概述的保守基序并且條件是該 同源物不是如SEQ ID NO 142中給出的0sMYB4。
使用總體比對(duì)算法如程序GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys)中的 Needleman Wunsch算法，優(yōu)選地采用默認(rèn)參數(shù)，確定總體序列同一性。與總體序列同一性相 比較，僅考慮保守的結(jié)構(gòu)域或基序時(shí)，該序列同一性通常會(huì)更高。局部比對(duì)算法如BLAST可 以用來(lái)確定多肽的保守區(qū)域(如D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽中的DOF結(jié)構(gòu)域)中的序列相似性。優(yōu)選地，多肽序列在構(gòu)建進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)(如圖X中所繪制的一個(gè)進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù))中使 用時(shí)，與包含SEQ ID NO 2所代表的氨基酸序列的組C2聚類，而不與任何其他組聚類。術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域”和“基序”在本文的“定義”部分中定義。存在用于鑒定結(jié)構(gòu) 域的專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)，例如，SMART (Schultz 等人，(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95， 5857-5864 ；Letunic ^ 人，(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro (Mulder 等，(2003)Nucl. Acids. Res. 31,315-318)、Prosite(Bucher 和 Bairoch(1994)，用于 生物分子序列基序的概括特征結(jié)構(gòu)及其在自動(dòng)化序列解讀中的功能(A generalized profile syntax forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation).(在)ISMB-94 ；第二屆分子生物學(xué)智能系統(tǒng)國(guó)際會(huì)議文 集.Altman R. ,Brutlag D. ,Karp P. , Lathrop R. ,Searls D.編輯,第 53-61 頁(yè),AAAIPress, Menlo Park ；HuIo 等，Nucl. Acids. Res. 32 :D134_D137，(2004))或 Pfam(Bateman 等， Nucleic Acids Research 30(1) =276-280(2002)) 一組用于計(jì)算機(jī)方式分析蛋白質(zhì)序 列的工具可在ExPASY蛋白質(zhì)組服務(wù)器(瑞士生物信息研究所(Gasteiger等人，ExPASy 用于深入認(rèn)識(shí)和分析蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組服務(wù)器(The proteomics server for in-depth protein knowledgeand analysis),Nucleic Acids Res. 31 :3784_3788 (2003))上獲得。也 可以使用常規(guī)技術(shù)如通過(guò)序列比對(duì)鑒定結(jié)構(gòu)域或基序。用于比對(duì)序列以做比較的方法是本領(lǐng)域熟知的，此類方法包括GAP、BESTFIT、 BLAST、FASTA 禾口 TFASTA。GAP 使用 Needleman 和 Wunsch 算法((1970) J Mol Biol 48 443-453)以找到使匹配數(shù)最大化并使空位數(shù)最小化的兩個(gè)序列的總體(即覆蓋完整序列 的)比對(duì)結(jié)果。BLAST 算法(Altschul 等人，(1990) J Mol Biol 215 :403_10)計(jì)算序列 同一性百分?jǐn)?shù)并開(kāi)展兩個(gè)序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)分析。用于開(kāi)展BLAST分析的軟件是通 過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)可公開(kāi)獲得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序 列比對(duì)算法(1. 83版本)，以默認(rèn)配對(duì)比對(duì)參數(shù)和百分?jǐn)?shù)評(píng)分方法輕易地鑒定。相似性和 同一性的總體百分?jǐn)?shù)也可以使用MatGAT軟件包中可用的方法之一確定(Campanella等， BMC Bioinformatics. 2003年7月10日；4:29. MatGAT 使用蛋白質(zhì)序列或DNA序列產(chǎn)生相
生 / 同一'性失巨陣的一禾中應(yīng)用(an application that generates similarity/identity matrices using proteinor DNA sequences))。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)顯而易見(jiàn),可以進(jìn)行 少許手工編輯以優(yōu)化保守基序之間的比對(duì)。此外，作為使用全長(zhǎng)序列鑒定同源物的替代，也 可以使用特定的結(jié)構(gòu)域。使用上文提及的程序，使用默認(rèn)參數(shù)，可以確定完整核酸或氨基酸序列范圍或保守基序范圍內(nèi)的序列同一性值。對(duì)于局部比對(duì)，所述Smith-Waterman算法是特別有用的(Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1) ； 195-7)。備選地，可以通過(guò)與已知D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽進(jìn)行序列比較并建立序列 相似性而鑒定在本發(fā)明方法中有用的D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知 的任意方法如Blast算法(用于局部比對(duì))或BestFit算法(用于總體比對(duì))比對(duì)所述序 列。取得與給定序列出現(xiàn)比對(duì)結(jié)果的概率作為用于鑒定相似多肽的基礎(chǔ)。一般用來(lái)代表這 種概率的參數(shù)稱作e-值。所述e-值是S評(píng)分可靠性的一個(gè)量度。S評(píng)分是查詢項(xiàng)與所示 序列的相似性的一個(gè)度量。e-值描述給定S評(píng)分預(yù)期以多大頻率隨機(jī)發(fā)生。臨界e_值可 以高至1. 0。顯示與查詢序列的顯著序列同一性并由BLAST搜索產(chǎn)生的受信任(真實(shí))命 中的常見(jiàn)閾值低于1. e-5(e提高至第5可能性)，在某種情況下采用甚至更低的閾值，例如 1. e-10(e提高至第10可能性)或甚至更低。優(yōu)選地，在本發(fā)明方法中有用的D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽以增加的優(yōu)選順序 在與表Al任意多肽的比對(duì)中具有低于1. e-10、l. e-15、l. e_20、l· e_25、l. e_50、l· e_75、 1. e-100、1. e-150、1. e_200、1. e_300、1. e-400 和 1. e-500 的 e_ 值。應(yīng)當(dāng)理解編碼本發(fā)明D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸不限于天然來(lái)源的序 列。該核酸可以編碼“從頭”設(shè)計(jì)的D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽。另外，D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽一般具有DNA結(jié)合活性并具有核定位信號(hào)和激活結(jié)構(gòu) 域。激活結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合活性的存在可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)和方法輕易地 確定。已經(jīng)描述了測(cè)量Dof結(jié)構(gòu)域多肽的DNA結(jié)合活性的實(shí)驗(yàn)方法(Umemura等人.2004 ； Yanagisawa, S.禾口 Sheen，J. (1998)Plant Cell 10 :75_89 ；Plesch, G.，Ehrhardt, Τ.禾口 MuelIer-Roeber, B. (2001)Plant J. 28 :455_464)。在本發(fā)明方法中有用的優(yōu)選D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽能夠與包含序列(Α/Τ) AAAG(SEQ ID NO 44)的DNA片段和/或基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，其中所述序列代表Dof結(jié)構(gòu)域 的已識(shí)別的DNA結(jié)合核心基序。另外，D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽在稻中根據(jù)實(shí)施例5和6中概述的本發(fā)明方法表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生這樣的植物，其具有提高(或增強(qiáng))的產(chǎn)量相關(guān)性狀，尤其種子總重量、每株植 物種子總數(shù)、充實(shí)種子數(shù)、每花序的花數(shù)和收獲指數(shù)。本發(fā)明通過(guò)用SEQ ID NO 1所代表的核酸序列轉(zhuǎn)化植物進(jìn)行說(shuō)明，其中所述核酸 序列編碼SEQ ID NO :2的多肽序列。然而，本發(fā)明的實(shí)施不限于這些序列；本發(fā)明的方法可 以有利地使用如本文中定義的編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子的任意核酸或D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn) 錄因子多肽實(shí)施。另外，ΜΥΒ7多肽(至少它們的天然形式)一般具有DNA結(jié)合活性和激活結(jié)構(gòu)域。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用常規(guī)技術(shù)和方法輕易地確定激活結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合活性的存在。 可以使用對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如雙雜交相互作用法輕易地鑒定與ΜΥΒ7多 肽(例如在轉(zhuǎn)錄復(fù)合物)相互作用的蛋白質(zhì)。推測(cè)ΜΥΒ7蛋白與BHLH轉(zhuǎn)錄因子相互作用 (Zimmerman 等人，Plant Journal 40，22—34，2004)。另外，MYB7多肽在稻中根據(jù)實(shí)施例8和9中概述的本發(fā)明方法表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生這樣 的植物，其具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀，尤其提高的生物量和/或提高的出苗生長(zhǎng)勢(shì)。本發(fā)明通過(guò)用SEQ ID NO :49所代表的核酸序列轉(zhuǎn)化植物進(jìn)行說(shuō)明，其中所述核酸序列編碼SEQ ID N0:50的多肽序列。然而，本發(fā)明的實(shí)施不限于這些序列；本發(fā)明的方法 可以有利地使用如本文中定義的編碼MYB7的任意核酸或MYB7多肽實(shí)施。編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸的例子在本文實(shí)施例1的表Al中 給出。此類核酸在實(shí)施本發(fā)明的方法中有用。在實(shí)施例1的表Al中給出的氨基酸序列是 由SEQ ID NO :2所代表的D 0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽的或由SEQ ID NO :50所代表的MYB7 多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，術(shù)語(yǔ)“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中 定義。其他直向同源物和旁系同源物可以通過(guò)開(kāi)展所謂交互性blast搜索輕易地鑒定。通 常，這包括第一 BLAST，其中所述的第一 BLAST包括將查詢序列(例如使用實(shí)施例1的表A 中列出的任意序列)針對(duì)任意序列數(shù)據(jù)庫(kù)，如可公開(kāi)獲得的NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST。當(dāng)從 核苷酸序列開(kāi)始時(shí)，一般使用BLASTN或TBLASTX (使用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值)，并且當(dāng)從蛋白質(zhì)序列 開(kāi)始時(shí)，使用BLASTP或TBLASTN (使用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值)?？梢匀芜x地篩選BLAST結(jié)果。篩選結(jié) 果或非篩選結(jié)果的全長(zhǎng)序列隨后針對(duì)來(lái)自生物的序列進(jìn)行反向BLAST搜索(第二 BLAST)， 其中查詢序列從所述的生物中衍生(在一個(gè)實(shí)施方案中查詢序列是SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2和在另一個(gè)實(shí)施方案中是SEQ ID NO 49或SEQ ID NO 50的情況下，第二 BLAST 因而將針對(duì)擬南芥序列進(jìn)行)。隨后比較第一 BLAST和第二 BLAST的結(jié)果。如果來(lái)自第一 blast的高階位命中是源自與衍生查詢序列的物種相同的物種，則鑒定到旁系同源物，隨后 一個(gè)反向BLAST理想地在最高命中當(dāng)中產(chǎn)生該查詢序列；若在第一 BLAST中的高階位命中 不是源自與衍生查詢序列的物種相同的物種，則鑒定到直向同源物，并且在反向BLAST時(shí)， 優(yōu)選地產(chǎn)生屬于最高命中的該查詢序列。高階位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，評(píng)分越顯著(或換句話說(shuō)，偶 然發(fā)現(xiàn)該命中的幾率越低)。E-值的計(jì)算是本領(lǐng)域熟知的。除了 E-值外，比較結(jié)果也由同 一性百分?jǐn)?shù)評(píng)價(jià)。同一性百分?jǐn)?shù)指兩個(gè)所比較的核酸(或多肽)序列之間的特定長(zhǎng)度范圍 內(nèi)相同核苷酸(或氨基酸)的數(shù)目。在大型家族的情況下，可以使用ClustalW，隨后使用鄰 接樹(shù)法，以幫助觀察相關(guān)基因的聚類并鑒定直向同源物和旁系同源物。核酸變體也可以用于實(shí)施本發(fā)明的方法中。此類變體的例子包括編碼在實(shí)施例1 的表A中所給出任一氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，術(shù)語(yǔ)“同源物”和“衍生物”如 本文中定義。還在本發(fā)明方法中有用的是這樣的核酸，其編碼在實(shí)施例1的表A中所給出 任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。在本發(fā)明方法中有用的同 源物和衍生物與衍生它們的未修飾蛋白質(zhì)具有基本上相同的生物學(xué)活性和功能活性。在實(shí)施本發(fā)明方法中有用的其他核酸變體包括編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或 MYB7多肽的核酸的部分、與編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸雜交的核酸、編 碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸的剪接變體、編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或 MYB7多肽的核酸的等位變體和通過(guò)基因改組獲得的編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多 肽的核酸的變體。術(shù)語(yǔ)“雜交序列”、“剪接變體”、“等位變體”和“基因改組作用”如本文中 所述。如本文中所定義的術(shù)語(yǔ)“部分”指編碼包含如下特征(i)和特征(ii)的多肽的一 段 DNA (i)DOF結(jié)構(gòu)域，其以增加的優(yōu)選順序與SEQ ID NO 35或SEQ IDNO :36所代表 的 DOF 結(jié)構(gòu)域具有至少 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性；和(ii)具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有5、4、3、2 或ι個(gè)非保守性氨基酸替換的基序I :ERKARPQKDQ(SEQ IDNO 37)；和/或具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有3、2或1個(gè)非 保守性氨基酸 替換的基序II =YffSGMI (SEQ ID NO 38)。另外，在上文“部分”中的多肽可以包含任意的1、2、3、4種或全部的以下基序-具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有5、4、3、2或 1個(gè)非保守性氨基酸替換的基序III :RLLFPFEDLKPLVS(SEQID NO 39)；和/或-具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有4、3、2或1 個(gè)非保守性氨基酸替換的基序IV JNVKPMEEI (SEQ ID NO 40)；和/或;-具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有9、8、7、6、5、 4、3、2或1個(gè)非保守性氨基酸替換的基序V :KNPKLLHEGAQDLNLAFPHH(SEQ ID NO 41)；和/ 或-具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有5、4、3、2或 1個(gè)非保守性氨基酸替換的基序VI :MELLRSTGCYM(SEQ IDNO 42)；和/或-具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有9、8、7、6、5、 4、3、2 或 1 個(gè)非保守性氨基酸替換的基序 VII :MMDSNSVLYSSLGFPTMPDYK (SEQ ID NO 43)。編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸不必須是全長(zhǎng)核酸，因?yàn)楸景l(fā)明 方法的實(shí)施不取決于全長(zhǎng)核酸序列的使用。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān) 性狀的方法，包括在植物中導(dǎo)入并表達(dá)實(shí)施例1的表A中給出的任一核酸序列的一部分或 編碼實(shí)施例1表A中所給出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的 一部分。核酸的一部分可以例如通過(guò)對(duì)所述核酸產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)缺失而制備。所述部分可 以以分離的形式使用或它們可以與其他編碼(或非編碼)序列融合，例如旨在產(chǎn)生聯(lián)合有 幾種活性的蛋白質(zhì)。當(dāng)融合至其他編碼序列時(shí)，翻譯后產(chǎn)生的所得多肽可以比對(duì)該蛋白質(zhì) 部分所預(yù)測(cè)的多肽更大。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明方法中有用的部分編碼如本文中定義的D0F-C2結(jié) 構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽，并且基本上具有如實(shí)施例1的表Al中所給出氨基酸序列相同的生物學(xué) 活性。優(yōu)選地，此部分是在實(shí)施例1的表Al中給出的任一核酸的一部分，或是編碼在實(shí)施例 1的表Al中所給出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。優(yōu)選地， 該部分的長(zhǎng)度是至少 150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、1000 個(gè)或更 多個(gè)連續(xù)核苷酸，所述連續(xù)核苷酸屬于實(shí)施例1的表Al中給出的任一核酸序列或?qū)儆诰幋a 在實(shí)施例1的表Al中所給出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最優(yōu)選 地，該部分是SEQ IDNO 1的核酸的一部分。優(yōu)選地，該部分編碼下述氨基酸序列的片段，其 中所述氨基酸序列在構(gòu)建進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)(如圖3中所繪制的一個(gè)進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù))中使用時(shí)，與 包含SEQ ID NO :2所代表的氨基酸序列的C2組聚類，而不與任何其他組聚類。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明方法中有用的部分編碼如本文中定義的MYB7多 肽，并且基本上具有如實(shí)施例1的表A2中所給出氨基酸序列相同的生物學(xué)活性。優(yōu)選地， 此部分是在實(shí)施例1的表A2中給出的任一核酸的一部分，或是編碼在實(shí)施例1的表A2中所給出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。優(yōu)選地，該部分的長(zhǎng) 度是至少400、450、500、550、600、650、700、750、800個(gè)連續(xù)核苷酸，所述連續(xù)核苷酸屬于實(shí) 施例1的表A2中給出的任一核酸序列或?qū)儆诰幋a在實(shí)施例1的表A2中所給出任一氨基酸 序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最優(yōu)選地，該部分是SEQ ID N0:49的核酸的一部 分。在本發(fā)明方法中有用的另一種核酸變體是能夠在降低的嚴(yán)格條件下、優(yōu)選在嚴(yán)格 條件下與編碼 如本文中定義的D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸或與如本文中定 義的部分雜交的核酸。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，包括在植物中導(dǎo)入并 表達(dá)能夠與實(shí)施例1的表A中給出的任一核酸雜交的核酸，或包括在植物中導(dǎo)入并表達(dá)這 樣的核酸，其中所述核酸能夠與編碼在實(shí)施例1的表A中給出的任意核酸序列的直向同源 物、旁系同源物或同源物的核酸雜交。在本發(fā)明方法中有用的雜交序列編碼如本文中定義的D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或 MYB7多肽，其基本上具有如實(shí)施例1的表A中所給出氨基酸序列相同的生物學(xué)活性。優(yōu)選 地，該雜交序列能夠與實(shí)施例1的表A中給出的任一核酸或與這些序列中任意序列的一部 分雜交，所述的一部分如上文定義，或所述雜交序列能夠與編碼在實(shí)施例1的表A中給出的 任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸雜交。最優(yōu)選地，該雜交序列能夠與如 SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 49所代表的核酸或與其一部分雜交。優(yōu)選地，該雜交序列部分編碼具有下述氨基酸序列的多肽，其中當(dāng)所述氨基酸序 列是全長(zhǎng)的并且在構(gòu)建進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)(如圖3中所繪制的一個(gè)進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù))中使用時(shí)，該氨 基酸序列與包含SEQ ID NO :2所代表的氨基酸序列的C2組聚類，而不與任何其他組聚類。在本發(fā)明方法中有用的另一種核酸變體是編碼如上文所定義的D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn) 錄因子或MYB7多肽的剪接變體，剪接變體如本文中定義。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，包括在植物中導(dǎo)入并 表達(dá)實(shí)施例1的表A中給出的任一核酸序列的剪接變體或編碼實(shí)施例1表A中所給出任意 氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的剪接變體是由SEQ ID NO :1所代表的核酸的剪接變體， 或是編碼SEQ ID NO :2的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接變體。優(yōu)選地，由所述剪 接變體編碼的氨基酸序列在構(gòu)建進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)(如圖3中所繪制的一個(gè)進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù))中使用 時(shí)，與包含SEQ ID NO 2所代表的氨基酸序列的C2組聚類，而不與任何其他組聚類。在另一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的剪接變體是由SEQ ID NO :49所代表的核酸的剪接變 體，或是編碼SEQ ID NO :50的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接變體。在實(shí)施本發(fā)明方法中有用的另一種核酸變體是編碼如上文所定義的D0F-C2結(jié)構(gòu) 域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸的等位變體，等位變體如本文中定義。根據(jù)本發(fā)明，提供用于增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，包括在植物中導(dǎo)入并表 達(dá)實(shí)施例1的表A中給出的任一核酸的等位變體，或包括在植物中導(dǎo)入并表達(dá)編碼在實(shí)施 例1的表A中所給出任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的等位變 體。在本發(fā)明方法中有用的等位變體基本上具有與SEQ ID NO 2的D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽和實(shí)施例1的表Al中所述的任意氨基酸序列相同的生物學(xué)活性。等位變體存 在于自然界中，并且在本發(fā)明的方法中包括使用這些天然等位基因。優(yōu)選地，所述等位變體 是SEQ ID NO :1的等位變體或編碼SEQ ID NO :2的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位 變體。優(yōu)選地，由所述等位變體編碼的氨基酸序列在構(gòu)建進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)(如圖3中所繪制的 一個(gè)進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù))中使用時(shí)，與包含SEQ ID NO :2所代表的氨基酸序列的C2組聚類，而不 與任何其他組聚類。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明方法中有用的等位變體基本上具有與SEQ ID NO 50的MYB7多肽和實(shí)施例1的表A2中所述的任意氨基酸序列相同的生物學(xué)活性。等位變體 存在于自然界中，并且在本發(fā)明的方法中包括使用這些天然等位基因。優(yōu)選地，所述等位變 體是SEQ ID NO :49的等位變體或編碼SEQ ID NO :50的直向同源物或旁系同源物的核酸的 等位變體。基因改組或定向進(jìn)化也可以用來(lái)產(chǎn)生編碼如上文定義的D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子 或MYB7多肽的核酸的變體；術(shù)語(yǔ)“基因改組”如本文中定義。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，包括在植物中導(dǎo)入并 表達(dá)在實(shí)施例1的表A中給出的任一核酸序列的變體，或包括在植物中導(dǎo)入并表達(dá)核酸的 變體，所述的核酸編碼在實(shí)施例1的表A中給出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源 物或同源物，其中所述的變體核酸通過(guò)基因改組獲得。優(yōu)選地，由通過(guò)基因改組所獲得的變體核酸編碼的氨基酸序列在構(gòu)建進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù) (如圖3中 所繪制的一個(gè)進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù))中使用時(shí)，與包含由SEQID NO 2代表的氨基酸序列 的C2組聚類，而不與任何其他組聚類。另外，核酸變體也可以通過(guò)位點(diǎn)定向誘變獲得。幾種方法可用于實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)定向誘 變，最常見(jiàn)的是基于PCR 的方法(Current Protocols inMolecular Biology. Wiley 編輯)。編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸可以衍生自任何天然或人工來(lái)源。該核 酸可以通過(guò)人類有意操作，在組成和/或基因組環(huán)境方面從其天然形式中修飾而來(lái)。優(yōu)選 地，編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸來(lái)自植物，還優(yōu)選來(lái)自雙子葉植物，更優(yōu)選來(lái) 自十字花科，該核酸最優(yōu)選地來(lái)自擬南芥。本發(fā)明方法的實(shí)施產(chǎn)生了具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物。特別地，本發(fā)明方法 的實(shí)施產(chǎn)生這樣的植物，其相對(duì)于對(duì)照植物具有出苗生長(zhǎng)勢(shì)和/或提高的產(chǎn)量、尤其提高 的種子產(chǎn)量和/或生物量。術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)量”和“種子產(chǎn)量”和“出苗生長(zhǎng)勢(shì)”在本文的“定義” 部分中更詳細(xì)地描述。本文中對(duì)增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的談及意指植物的一個(gè)或多個(gè)部分的生物量(重 量)增加，所述的部分可以包括地上(可收獲)部分和/或地下(可收獲)部分。特別地，在一個(gè)實(shí)施方案中，此類可收獲部分是種子，并且本發(fā)明方法的實(shí)施產(chǎn)生 了相對(duì)于對(duì)照植物的種子產(chǎn)量而言，具有提高的種子產(chǎn)量的植物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此類可收獲部分是營(yíng)養(yǎng)生物量和/或種子，并且本發(fā)明方 法的實(shí)施產(chǎn)生了相對(duì)于對(duì)照植物而言，具有提高的生物量和/或種子產(chǎn)量的植物。優(yōu)選地， 營(yíng)養(yǎng)生物量是地上部分生物量。以谷物為例，產(chǎn)量提高可以表現(xiàn)為以下一個(gè)或多個(gè)指標(biāo)每平方米已建立的植物 數(shù)目增加、每株植物花序數(shù)的提高、行數(shù)、每行核粒數(shù)、核粒重、千粒核重、花序長(zhǎng)度/直徑的提高、種子充實(shí)率(即充實(shí)種子數(shù)除以種子總數(shù)并乘以100)提高，及其他。以稻為例， 產(chǎn)量提高可以自身表現(xiàn)為下列一種或多種指標(biāo)的提高每平方米植物數(shù)、每株植物的花序 數(shù)、每個(gè)花序的小穗數(shù)、每個(gè)花序的花(小花)數(shù)目(其表述為充實(shí)種子數(shù)對(duì)原發(fā)花序數(shù)的 比)、種子充實(shí)率(即充實(shí)種子數(shù)除以種子總數(shù)并乘以100)提高、千粒核重提高及其他。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于相對(duì)于對(duì)照植物而言提高植物的產(chǎn)量、尤 其種子產(chǎn)量的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)植物中編碼如本文中定義的D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因 子多肽的核酸表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于相對(duì)于對(duì)照植物提高植物的產(chǎn)量、尤其 生物量的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)植物中編碼如本文中定義的MYB7多肽的核酸表達(dá)。由于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有提高的產(chǎn)量，故這些植物有可能在其生活周期的相 應(yīng)階段(在其生活周期的至少部分期間)相對(duì)于對(duì)照植物的生長(zhǎng)速率表現(xiàn)出提高的生長(zhǎng)速率。提高的生長(zhǎng)速率可以是植物的一個(gè)或多個(gè)部分(包括種子)特有的，或可以基本 上遍及整株植物。具有提高的生長(zhǎng)速率的植物可以具備較短的生活周期。植物的生活周期 可以意指從干燥成熟種子生長(zhǎng)直至植物已經(jīng)產(chǎn)生與起始材料相似的干燥成熟種子的階段 所需要的時(shí)間。這個(gè)生活周期可以受諸因素如早期生長(zhǎng)勢(shì)、生長(zhǎng)速率、綠度指數(shù)、開(kāi)花時(shí)間 和種子成熟速度影響。生長(zhǎng)速率的提高可以在植物生活周期的一個(gè)或多個(gè)階段上或基本上 在植物整個(gè)生活周期期間發(fā)生。在植物生活周期中早期期間提高的生長(zhǎng)速率可以反映增強(qiáng) 的生長(zhǎng)勢(shì)。生長(zhǎng)速率的提高可以改變植物的收獲周期，從而允許植物更晚地播種和/或更 早地收獲，而這本來(lái)是不可能的(可以隨更早的開(kāi)花時(shí)間獲得相似效果)。如果大幅提高 生長(zhǎng)速率，則可以允許進(jìn)一步播種相同植物物種的種子(例如播種并收獲稻植物，隨后播 種并收獲其他稻植物，全部稻植物均處于一個(gè)常規(guī)生長(zhǎng)時(shí)期中)。類似地，如果大幅提高生 長(zhǎng)速率，則可以允許進(jìn)一步播種不同植物物種的種子(例如播種并收獲谷物植物，隨后例 如播種并任選收獲大豆、馬鈴薯或任何其他合適的植物)。在一些作物植物的例子中，來(lái)自 相同根狀莖的額外收獲次數(shù)也可以是可能的。改變植物的收獲周期可以導(dǎo)致每平方米一年 生物量生產(chǎn)提高(原因在于可以培育并收獲任何具體植物的次數(shù)(即在一年中)提高)。 生長(zhǎng)速率的提高也可以允許將轉(zhuǎn)基因植物在比其野生型對(duì)應(yīng)物更廣泛的地理區(qū)域內(nèi)培育， 因?yàn)榕嘤魑锏牡赜蛳拗仆稍苑N時(shí)期(早季)或在收獲時(shí)期(晚季)的不利環(huán)境條件 決定。如果縮短收獲周期，則可以避開(kāi)這類不利條件。生長(zhǎng)速率可以通過(guò)從生長(zhǎng)曲線衍生 多個(gè)參數(shù)而確定，此類參數(shù)可以是T-Mid(植物達(dá)到50%最大植物大小所花費(fèi)的時(shí)間)和 Τ_90(植物達(dá)到90%最大植物大小所花費(fèi)的時(shí)間)，以及其他。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選特征，本發(fā)明方法的實(shí)施產(chǎn)生了相對(duì)于對(duì)照植物具有提高 的生長(zhǎng)速率的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了用于提高植物生長(zhǎng)速率的方法，所述方法包 括在植物中調(diào)節(jié)編碼如本文中定義的D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或ΜΥΒ7多肽的核酸表達(dá)。與對(duì)照植物相比較，無(wú)論所述植物處于非脅迫條件下或無(wú)論所述植物暴露于多種 脅迫，產(chǎn)量和/或生長(zhǎng)速率的提高均出現(xiàn)。植物一般通過(guò)生長(zhǎng)得更慢而應(yīng)答于脅迫暴露。 在嚴(yán)重脅迫條件下，植物甚至可能完全停止生長(zhǎng)。另一方面，輕度脅迫在本文中定義為植物 所暴露的任何下述脅迫，其中所述的脅迫不導(dǎo)致植物完全停止生長(zhǎng)，但同時(shí)不能恢復(fù)生長(zhǎng)。 與非脅迫條件下的對(duì)照植物相比較，輕度脅迫在本發(fā)明的意義下導(dǎo)致受脅迫植物的生長(zhǎng)降低小于40%、35%或30%、優(yōu)選地小于25%、20%或15%、更優(yōu)選地小于14%、13%、12%、 11%或10%或更低。由于農(nóng)業(yè)實(shí)踐(灌溉、施肥、殺蟲劑處理)的進(jìn)步，栽培作物植物中并 不經(jīng)常遭遇嚴(yán)重脅迫。因此，由輕度脅迫誘導(dǎo)的受損生長(zhǎng)對(duì)于農(nóng)業(yè)往往是不受歡迎的特征。 輕度脅迫是植物所暴露的常見(jiàn)生物脅迫和/或非生物(環(huán)境)脅迫。非生物脅迫可以因干 旱或過(guò)量的水、缺氧脅迫、鹽脅迫、化學(xué)毒性、氧化脅迫和熱、寒冷或冰凍溫度所致。非生物 脅迫可以是因水脅迫(尤其因?yàn)楦珊?、鹽脅迫、氧化脅迫或離子脅迫引起的滲透脅迫。生 物脅迫一般是由病原體如細(xì)菌、病毒、真菌和昆蟲引起的那些脅迫。特別地，本發(fā)明的方法可以在非脅迫條件下或在輕度干旱條件開(kāi)展以產(chǎn)生相對(duì)于 對(duì)照植物具有提高的產(chǎn)量的植物。如Wang等人(Planta(2003)218 :1-14)中報(bào)道，非生物 性脅迫導(dǎo)致一系列不利地影響植物生長(zhǎng)及生產(chǎn)力的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)和分子變化。 干旱、鹽度、極端溫度和氧化脅迫已知相互聯(lián)系并可以通過(guò)相似的機(jī)制誘導(dǎo)生長(zhǎng)損害及細(xì) 胞損害。Rabbani等人(Plant Physiol (2003) 133 1755-1767)描述了干旱脅迫與高鹽度 脅迫之間極高程度的“交互作用”。例如，干旱和/或鹽化作用主要表現(xiàn)為滲透脅迫，從而導(dǎo) 致細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和離子分布的破壞。經(jīng)常伴隨高溫或低溫、鹽度或干旱脅迫的氧化脅迫可以 引起功能蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白變性。因此，這些多樣的環(huán)境脅迫常常激活相似的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo) 途徑和細(xì)胞應(yīng)答，如產(chǎn)生脅迫蛋白、上調(diào)抗氧化物質(zhì)、積累兼容性溶質(zhì)和生長(zhǎng)停滯。如本文 中所用的術(shù)語(yǔ)“非脅迫”條件是允許植物最佳生長(zhǎng)的那些環(huán)境條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚 對(duì)于給定地點(diǎn)的正常土壤條件和氣候條件。相對(duì)于可比較條件下培育的對(duì)照植物，本發(fā)明方法的實(shí)施賦予在非脅迫條件下或 在輕度干旱條件下培育的植物提高的產(chǎn)量相關(guān)性狀。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了用于在非脅 迫條件下或在輕度干旱條件下培育的植物中提高產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，所述方法包括增加 植物中編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸表達(dá)。 相對(duì)于可比較條件下培育的對(duì)照植物，本發(fā)明方法的實(shí)施賦予在養(yǎng)分缺乏條件 下、尤其在缺氮條件下培育的植物提高的產(chǎn)量。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了用于在養(yǎng)分缺乏 條件下培育的植物中提高產(chǎn)量的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)植物中編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄 因子或MYB7多肽的核酸表達(dá)。養(yǎng)分缺乏可以因養(yǎng)分如氮、磷酸鹽和其他含磷化合物、鉀、 鈣、鎘、鎂、錳、鐵和硼及其他元素缺少所致。本發(fā)明包括通過(guò)本發(fā)明方法可獲得的植物或其部分(包括種子)。所述植物或其 部分包含編碼如上文定義的D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明也提供了基因構(gòu)建體和載體以促進(jìn)在植物中導(dǎo)入和/或表達(dá)編碼D0F-C2 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸。所述基因構(gòu)建體可以插入適于轉(zhuǎn)化至植物并適于在 轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)目的基因的載體，所述載體可以是市售的。本發(fā)明也提供了如本文中定義 的基因構(gòu)建體在本發(fā)明方法中的用途。更具體地，本發(fā)明提供了構(gòu)建體，其包含(a)編碼如上文定義的D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸；(b)能夠驅(qū)動(dòng)(a)的核酸序列表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列；和任選地(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選地，編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸如上文定義。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控 序列”和“終止序列”如本文中定義。
植物用包含上述任意核酸的載體轉(zhuǎn)化。技術(shù)人員非常了解必須存在于所述載體上 以便成功轉(zhuǎn)化、選擇和增殖含有目的序列的宿主細(xì)胞的遺傳元件。此目的序列有效地與一 個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列(至少與啟動(dòng)子)連接。有利地，任意類型的啟動(dòng)子，無(wú)論是天然的或合成的，可以用來(lái)驅(qū)動(dòng)所述核酸序列 的表達(dá)。種子特異性或組成型啟動(dòng)子是在所述方法中特別有用的。優(yōu)選地，種子特異性啟 動(dòng)子是編碼晚期胚發(fā)生蛋白的基因的啟動(dòng)子，更優(yōu)選地是稻W(wǎng)SI18基因的啟動(dòng)子。優(yōu)選地， 所述組成型啟動(dòng)子也是遍在啟動(dòng)子。對(duì)于多種啟動(dòng)子類型的定義，見(jiàn)本文中的“定義”部分。應(yīng)當(dāng)明白本發(fā)明的應(yīng)用不限于由SEQ ID NO :1或SEQ ID N0:49代表的編碼 D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸，本發(fā)明的應(yīng)用也不限于編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn) 錄因子或MYB7多肽的核酸在受種子特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)時(shí)，或受根特異性啟動(dòng)子和/或組成 型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)時(shí)的表達(dá)。
種子特異性啟動(dòng)子優(yōu)選地是ABA誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，優(yōu)選地是來(lái)自稻的WSI18啟動(dòng)子。 進(jìn)一步優(yōu)選地，該WSI18啟動(dòng)子由基本上與SEQ ID NO 47相似的核酸序列代表。組成型啟動(dòng)子優(yōu)選地是G0S2啟動(dòng)子，優(yōu)選地是來(lái)自稻的G0S2啟動(dòng)子。進(jìn)一步優(yōu) 選地，該組成型啟動(dòng)子由基本上與SEQ ID NO :53相似的核酸序列代表，最優(yōu)選地該組成型 啟動(dòng)子如SEQ ID NO 53所代表。對(duì)于種子特異性或組成型啟動(dòng)子的其他例子，見(jiàn)本文“定義”部分中的表2。任選地，可以在被導(dǎo)入植物的構(gòu)建體中使用一個(gè)或多個(gè)終止子序列。優(yōu)選地，該構(gòu) 建體包含與SEQ ID NO 48基本上相似或相同的表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含WSI18啟動(dòng)子、編 碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸和T-玉米醇溶蛋白+T-核酮糖二磷酸羧化酶-加氧 酶轉(zhuǎn)錄終止子序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該構(gòu)建體與SEQ ID NO 54基本上相似或相同的表達(dá)盒，所 述表達(dá)盒包含稻G0S2啟動(dòng)子和編碼MYB7多肽的核酸。額外的調(diào)節(jié)元件可以包括轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子以及翻譯增強(qiáng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道可 能適用于實(shí)施本發(fā)明的終止子和增強(qiáng)子序列。如定義部分中描述，內(nèi)含子序列也可以添加 至5’非翻譯區(qū)(UTR)或編碼序列中，以提高細(xì)胞質(zhì)中積累的成熟信使的量。(除啟動(dòng)子、增 強(qiáng)子、沉默子、內(nèi)含子序列、3’ UTR和/或5’ UTR區(qū)域之外的)其他調(diào)控序列可以是蛋白質(zhì) /或RNA穩(wěn)定化元件。此類序列將是已知的或可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易地獲得。本發(fā)明的基因構(gòu)建體可以還包括對(duì)于特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制所需要的 復(fù)制起點(diǎn)序列。一個(gè)例子是當(dāng)需要將基因構(gòu)建體在細(xì)菌細(xì)胞中作為游離型遺傳元件(例如 質(zhì)?；蛘沉７肿?維持時(shí)的復(fù)制起點(diǎn)。優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括但不限于fl-ori和colEl。為檢測(cè)如用于本發(fā)明方法中的核酸序列的成功轉(zhuǎn)移和/或選擇包含這些核酸的 轉(zhuǎn)基因植物，使用標(biāo)記基因(或報(bào)道基因)是有利的。因此，所述基因構(gòu)建體可以任選地包 含選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記在本文的“定義”部分中更詳細(xì)地描述。一旦不再需要所述標(biāo) 記基因時(shí)，可以從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中移除或切除它們。用于標(biāo)記移除的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，有 用的技術(shù)在上文定義部分中描述。本發(fā)明也提供了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物相對(duì)于對(duì)照植物 具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀，其中所述方法包括在植物中導(dǎo)入并表達(dá)編碼如上文所定義的 D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的任意核酸。
更具體地，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物具有增加 的增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀、尤其提高的(種子)產(chǎn)量和提高的早期生長(zhǎng)勢(shì)，其中所述方法包括(i)在植物或植物細(xì)胞中導(dǎo)入并表達(dá)編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸；和(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育植物細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植 物具有增加的增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀、尤其提高的營(yíng)養(yǎng)生物量和/或提高的出苗生長(zhǎng)勢(shì)，其中 所述方法包括(i)在植物或植物細(xì)胞中導(dǎo)入并表達(dá)編碼MYB7多肽的核酸；和(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育植物細(xì)胞。(i)的核酸可以能夠編碼如本文中所定義的D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽 的任意核酸。該核酸可以直接地導(dǎo)入植物細(xì)胞或?qū)胫参镒陨?包括導(dǎo)入組織、器官或植物的 任何其他部分)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，該核酸優(yōu)選地通過(guò)轉(zhuǎn)化作用導(dǎo)入植物。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn) 化”在本文的“定義”部分中更詳細(xì)地描述。可以借助技術(shù)人員熟悉的全部方法再生出基因修飾的植物細(xì)胞。合適的方法可以 在上文提及的S. D. Kung和R. ffu, Potrykus或H6fgen和Willmitzer的出版物中找到。通常在轉(zhuǎn)化后，對(duì)植物細(xì)胞或細(xì)胞群體選擇一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的存在性，其中所述 標(biāo)記由隨同目的基因一起共轉(zhuǎn)移的植物可表達(dá)基因編碼，隨后將轉(zhuǎn)化材料再生成完整植 物。為了選擇轉(zhuǎn)化的植物，轉(zhuǎn)化中獲得的植物材料一般經(jīng)歷選擇條件，從而轉(zhuǎn)化植物可以與 非轉(zhuǎn)化植物區(qū)分開(kāi)。例如，以上文所述方式獲得的種子可以播種，并且在初始培育時(shí)間后， 通過(guò)噴灑經(jīng)受合適的選擇。另一種可能性在于種子根據(jù)需要消毒后，在使用合適選擇劑的 瓊脂板上培育，從而僅轉(zhuǎn)化的種子可以長(zhǎng)成植物。備選地，篩選所述轉(zhuǎn)化植物的選擇標(biāo)記 (如上文所述的選擇標(biāo)記)的存在性。在DNA轉(zhuǎn)移和再生后，推定轉(zhuǎn)化的植物也可以例如使用DNA印跡分析就目的基因 的存在、拷貝數(shù)和/或基因組構(gòu)造進(jìn)行評(píng)價(jià)。備選地或額外地，可以使用RNA印跡分析和/ 或蛋白質(zhì)印跡分析監(jiān)測(cè)新導(dǎo)入的DNA的表達(dá)水平，這兩項(xiàng)技術(shù)均是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟 知的。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可以通過(guò)多種方法繁殖，如通過(guò)克隆繁殖法或經(jīng)典育種技術(shù)。例 如，第一世代(或T1)轉(zhuǎn)化植物可以進(jìn)行自交并且選擇純合的第二世代(或T2)轉(zhuǎn)化體，并 且1~2植物隨后可以通過(guò)經(jīng)典育種技術(shù)進(jìn)一步繁殖。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物可以采取多種形式。例 如，它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；克隆性轉(zhuǎn)化體(例如，被轉(zhuǎn)化以含有表達(dá) 盒的全部細(xì)胞)；轉(zhuǎn)化組織和非轉(zhuǎn)化組織的移植體(例如在植物中，與未轉(zhuǎn)化接穗嫁接的轉(zhuǎn) 化根狀莖)。本發(fā)明明確地?cái)U(kuò)展至由本文中所述任意方法產(chǎn)生的任意植物細(xì)胞或植物，并擴(kuò)展至全部植物部分及其繁殖體。本發(fā)明進(jìn)一步擴(kuò)展以包括已經(jīng)由前述任意方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn) 化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞、組織、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代展示出與如本發(fā)明方法中的 親本相同的基因型和/或表型特征。本發(fā)明也包括含有編碼如本文以上所定義D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的 分離核酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)選宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。對(duì)于本發(fā)明方法中所用的核酸或載體、表達(dá)盒或構(gòu)建體或載體而言，宿主植物原則上有利地是能夠合成在本發(fā)明方法中 所用多肽的全部植物。本發(fā)明的方法有利地適用于任意植物。在本發(fā)明方法中特別有用的植物包括屬 于植物界超家族、尤其單子葉和雙子葉植物的全部植物，包括飼用或飼料豆科植物、觀賞植 物、糧食作物、樹(shù)或灌木。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，植物是作物植物。作物植物的 例子包括大豆、向日葵、卡諾拉油菜、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、馬鈴薯和煙草。更優(yōu)選地，該 植物是單子葉植物。單子葉植物的例子包括甘蔗。 更優(yōu)選地，該植物是禾谷植物。禾谷植 物的例子包括稻、玉米、小麥、大麥、谷子、黑麥、小黑麥屬、高粱和燕麥。優(yōu)選的稻品種是秈 稻或粳稻或這兩個(gè)品種的任意雜種，優(yōu)選的粳稻栽培品種是日本晴。本發(fā)明也擴(kuò)展至植物的可收獲部分如，但不限于種子、葉、果實(shí)、花、莖、根、根狀 莖、塊莖和球莖。本發(fā)明進(jìn)一步涉及衍生自、優(yōu)選直接衍生自此種植物的可收獲部分的產(chǎn) 品，如干燥顆?；蚍勰?、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，受調(diào)節(jié)的表達(dá)是增加的表達(dá)。在本領(lǐng)域中充分報(bào)道了用 于增加核酸或基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的方法并且在定義部分中提供了例子。如上文提及，用于調(diào)節(jié)編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸表達(dá)的優(yōu) 選方法是通過(guò)在植物中導(dǎo)入并表達(dá)編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸；然而， 實(shí)施本方法的效果，即增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀，也可以使用包括但不限于T-DNA活化標(biāo)簽法、 TILLING、同源重組在內(nèi)的其他熟知技術(shù)實(shí)現(xiàn)。在定義部分中提供了對(duì)這些技術(shù)的描述。本發(fā)明也包括編碼如本文中所述D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸的用 途，和這些D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的用途，用于增強(qiáng)植物中任意的前述產(chǎn)量相 關(guān)性狀。編碼本文中所述D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸或D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn) 錄因子或MYB7多肽自身可以用于其中鑒定到DNA標(biāo)記的育種程序中，其中所述的DNA標(biāo)記 可以遺傳地與編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的基因連鎖。所述核酸/基因或 D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽自身可以用來(lái)定義分子標(biāo)記。這種DNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記 隨后可以在育種程序中用來(lái)在本發(fā)明的方法中選擇具有增強(qiáng)的如上文所定義產(chǎn)量相關(guān)性 狀的植物。編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸/基因的等位變體也可以用于標(biāo) 記輔助的育種程序中。此類育種程序有時(shí)需要使用例如EMS誘變法通過(guò)對(duì)植物進(jìn)行誘變處 理而導(dǎo)入等位變異；備選地，所述程序可以從收集并非故意造成的所謂“天然”來(lái)源的等位 變體開(kāi)始。隨后進(jìn)行等位變體的鑒定，例如通過(guò)PCR法。此后是步驟選擇所討論和導(dǎo)致產(chǎn) 量提高的序列的優(yōu)異等位變體。一般通過(guò)監(jiān)測(cè)含有所討論序列的不同等位變體的植物的生 長(zhǎng)性能實(shí)施選擇?？梢栽跍厥抑谢蛟谔镩g監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)性能。其他任選步驟包括將其中鑒定到 優(yōu)異等位變體的植物與另一種植物雜交。這可能用來(lái)例如產(chǎn)生感興趣的表型特征的組合。編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸也可以作為探針用于遺傳地或物 理地繪制所述探針構(gòu)成其一部分的基因并且用作與這些基因連鎖的性狀的標(biāo)記。此類信息 可以用于植物育種中，以開(kāi)發(fā)具有所希望表型的品系。編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7 多肽的核酸序列的這種用途僅需要具有至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核酸序列。編碼D0F-C2結(jié) 構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸可以用作限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記。限制性消化的植物基因組DNA的DNA印跡物(Sambrook J，F(xiàn)ritschEF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning, A Laboratory Manual)可以用編碼POI的核酸探測(cè)。所得的結(jié)合模式隨后可以 使用計(jì)算機(jī)程序如MapMaker (Lander等人(1987)Genomics 1 174-181)開(kāi)展遺傳分析以構(gòu) 建遺傳圖譜。此外，該核酸可以用來(lái)探測(cè)含有一組個(gè)體的限制性核酸內(nèi)切酶處理的基因組 DNA的DNA印跡物，其中所述的一組個(gè)體代表具有所定義遺傳雜交的親本和子代。標(biāo)明了 DNA多態(tài)性的分離并用來(lái)計(jì)算編碼D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子或MYB7多肽的核酸在先前使用 這個(gè)群體獲得的遺傳圖中的位置(Botstein等人(1980)Am. J. Hum. Genet. 32 :314_331)。在Bernatzky 禾口 Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Importer 4 :37_41 中描述了植 物基因來(lái)源的探針的產(chǎn)生及其在遺傳作圖中的用途。許多出版物描述了使用上文概述的方 法學(xué)或其變例對(duì)特定cDNA克隆的遺傳作圖。例如，F(xiàn)2互交群、回交群、隨機(jī)交配群、鄰近純 合系和其他個(gè)體群體可以用于作圖。此類方法學(xué)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。所述核酸探針也可以用于物理作圖(即序列在物理圖上的排列；見(jiàn)Hoheisel等 在Non-mamma1ian Genomic Analyasis :A Practical Guide，Academic press 1996，第 319-346頁(yè)及其中引用的參考文獻(xiàn))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸探針可以在直接熒光原位雜交(FISH)作圖法 (Trask(1991)Trends Genet. 7 149-154)中使用。盡管當(dāng)前的FISH作圖法支持使用大的 克隆(幾個(gè)kb至幾百個(gè)kb ；見(jiàn)Laan等人(1995) GenomeRes. 5 13-20)，然而靈敏度的改善 可以允許使用更短探針進(jìn)行FISH作圖。 用于遺傳作圖及物理作圖的多種基于核酸擴(kuò)增的方法可以使用所述核酸而實(shí)施。 方法例子包括等位基因特異性擴(kuò)增法(Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11 :95_96)、PCR 擴(kuò)增片段的多態(tài)性(CAPS ；Sheffield等人(1993)Genomics 16 :325_332)、等位基因特異性 連接(Landegren 等人(1988) Science 241 :1077_1080)、核苷酸延伸反應(yīng)(Sokolov (1990) NucleicAcid Res. 18 3671)、放射雜交作圖(Walter 等人(1997)Nat. Genet. 7 22~28)和 Happy 作圖法(Dear 和 Cook(1989)Nucleic Acid Res. 17 :6795_6807)。對(duì)于這些方法，使 用一種核酸的序列來(lái)設(shè)計(jì)并產(chǎn)生在擴(kuò)增反應(yīng)或在引物延伸反應(yīng)中使用的引物對(duì)。此類引物 的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在使用基于PCR遺傳作圖的方法中，可能需要在對(duì)應(yīng)于 當(dāng)前核酸序列的區(qū)域中鑒定作圖交叉的親本之間的DNA序列差異。然而，這對(duì)作圖法而言 通常不是必需的。如前文所述，本發(fā)明方法產(chǎn)生了具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物。這些性狀也可 以與經(jīng)濟(jì)上有利的其他性狀組合，如其他的產(chǎn)量增強(qiáng)性狀、針對(duì)其他非生物性脅迫和生物 脅迫的耐受性、調(diào)節(jié)多種構(gòu)造性特征和/或生物化學(xué)特征和/或生理學(xué)特征的性狀。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如下概括的主題項(xiàng)1.用于相對(duì)于對(duì)照植物增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，包括調(diào)節(jié)植物中編 碼包含如下特征⑴和特征(ii)的D0F-C2(具有一個(gè)指狀物的結(jié)合DNA的，亞組C2)結(jié)構(gòu) 域轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸的表達(dá)(i)DOF結(jié)構(gòu)域，其以增加的優(yōu)選順序與SEQ ID N0:83或SEQ IDNO :84代表的DOF 結(jié)構(gòu)域具有至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91 %、92%、93%、94%、96%、 97%、98%、99%或更多的序列同一性；和(ii)具有O、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有5、4、3、2或ι個(gè)非保守性氨基酸替換的基序I :ERKARPQKDQ(SEQ IDNO 85)；和/或 具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有3、2或1個(gè)非 保守性氨基酸替換的基序II =YffSGMI (SEQ ID NO 86)。項(xiàng)2.根據(jù)項(xiàng)1的方法，其中所述的D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽還包含1、2、3、4種或全 部的以下基序具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有5、4、3、2或1 個(gè)非保守性氨基酸替換的基序III :RLLFPFEDLKPLVS(SEQID NO 87)；和/或具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有4、3、2或1個(gè) 非保守性氨基酸替換的基序IV JNVKPMEEI (SEQ ID NO 88)；和/或;具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有9、8、7、6、5、4、 3、2或1個(gè)非保守性氨基酸替換的基序V:KNPKLLHEGAQDLNLAFPHH(SEQ ID NO 89)；和/或具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有5、4、3、2或1 個(gè)非保守性氨基酸替換的基序VI :MELLRSTGCYM(SEQ IDNO 90)；和/或具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有9、8、7、6、5、4、 3、2或1個(gè)非保守性氨基酸替換的基序VII :MMDSNSVLYSSLGFPTMPDYK(SEQ ID NO 91)。項(xiàng)3.根據(jù)項(xiàng)1或2的方法，其中所述受調(diào)節(jié)的表達(dá)通過(guò)在植物中導(dǎo)入和表達(dá)編碼 D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸實(shí)施。項(xiàng)4.根據(jù)任一前述項(xiàng)的方法，其中所述編碼D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸編碼表 Al中所列的任一種蛋白質(zhì)或是這種核酸的一部分或是能夠與這種核酸雜交的核酸。項(xiàng)5.根據(jù)任一前述項(xiàng)的方法，其中所述的核酸序列編碼表Al中給出的任意蛋白 質(zhì)的直向同源物或旁系同源物。項(xiàng)6.根據(jù)任一前述項(xiàng)的方法，其中所述的增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀包括相對(duì)于對(duì)照 植物而言提高的產(chǎn)量、優(yōu)選提高的早期生長(zhǎng)勢(shì)和/或提高的種子產(chǎn)量。項(xiàng)7.根據(jù)項(xiàng)3至6任一項(xiàng)的方法，其中所述的核酸有效連接至種子特異性啟動(dòng) 子，優(yōu)選地有效連接至編碼晚期胚發(fā)生蛋白的基因的啟動(dòng)子，最優(yōu)選地有效連接至來(lái)自稻 的WSI18啟動(dòng)子。項(xiàng)8.根據(jù)任一前述項(xiàng)的方法，其中所述編碼D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸是植物 來(lái)源的，優(yōu)選地來(lái)自雙子葉植物，進(jìn)一步優(yōu)選地來(lái)自十字花科(Brassicaceae)，更優(yōu)選地來(lái) 自擬南芥屬(Arabidopsis)，最優(yōu)選地來(lái)自擬南芥。項(xiàng)9.根據(jù)任一前述項(xiàng)的方法可獲得的植物或其部分，包括種子，其中所述的植物 或其部分包含編碼D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽的重組核酸。項(xiàng)10.構(gòu)建體，其包含(i)編碼如項(xiàng)1或2中定義的D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸；(ii)能夠驅(qū)動(dòng)(a)的核酸序列表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列；和任選地(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。項(xiàng)11.根據(jù)項(xiàng)10的構(gòu)建體，其中所述調(diào)控序列之一是種子特異性啟動(dòng)子，優(yōu)選地 是編碼晚期胚發(fā)生蛋白的基因的啟動(dòng)子，最優(yōu)選地是稻W(wǎng)SI18基因的啟動(dòng)子。項(xiàng)12.根據(jù)項(xiàng)10或11的構(gòu)建體在用于制備植物的方法中的用途，所述植物相對(duì) 于對(duì)照植物具有提高的產(chǎn)量，特別具有提高的早期生長(zhǎng)勢(shì)和/或提高的種子產(chǎn)量。
項(xiàng)13.用根據(jù)項(xiàng)10或11的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞。項(xiàng)14.用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述的轉(zhuǎn)基因植物相對(duì)于對(duì)照植物具有提高 的產(chǎn)量、尤其提高的早期生長(zhǎng)勢(shì)和/或提高的種子產(chǎn)量，該方法包括(i)在植物中導(dǎo)入并表達(dá)編碼如項(xiàng)1或2中定義的D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸;(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育植物細(xì)胞。項(xiàng)15.轉(zhuǎn)基因植物，其相對(duì)于對(duì)照植物具有由編碼如項(xiàng)1或2中所定義D0F-C2轉(zhuǎn) 錄因子多肽的核酸的受調(diào)節(jié)表達(dá)引起的提高產(chǎn)量、尤其提高的早期生長(zhǎng)勢(shì)和/或提高的種 子產(chǎn)量，或從所述轉(zhuǎn)基因植物衍生的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。項(xiàng)16.根據(jù)項(xiàng)9、13或15的轉(zhuǎn)基因植物，或從其中衍生的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中 所述的植物是作物植物或單子葉植物或禾谷植物，如稻、玉米、小麥、大麥、谷子、黑麥、小黑 麥、高粱和燕麥。項(xiàng)17.根據(jù)項(xiàng)16的植物的可收獲部分，其中所述的可收獲部分優(yōu)選地是苗生物量 和/或種子。項(xiàng)18.產(chǎn)物，從根據(jù)項(xiàng)16的植物和/或從根據(jù)項(xiàng)17的植物的可收獲部分衍生。項(xiàng)19.編碼D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸在相對(duì)于對(duì)照植物提高植物中植物產(chǎn)量、 尤其在提高種子產(chǎn)量和/或早期生長(zhǎng)勢(shì)中的用途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如下概括的主題項(xiàng)20.用于相對(duì)于對(duì)照植物增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，包括調(diào)節(jié)植物中編 碼MYB7多肽的核酸的表達(dá)，其中所述的MYB7多肽包含2個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域。項(xiàng)21.根據(jù)項(xiàng)20的方法，其中所述的MYB7多肽包含基序1至7 (SEQID NO :55至 SEQ ID NO 61)中的4種或更多種基序。項(xiàng)22.根據(jù)項(xiàng)20或21的方法，其中所述受調(diào)節(jié)的表達(dá)通過(guò)在植物中導(dǎo)入并表達(dá) 編碼MYB7多肽的核酸實(shí)施。項(xiàng)23.根據(jù)項(xiàng)20至22的方法，其中所述編碼MYB7多肽的核酸編碼表A2中所列 的任一種蛋白質(zhì)或是這種核酸的一部分或是能夠與這種核酸雜交的核酸。項(xiàng)24.根據(jù)項(xiàng)20至23的方法，其中所述的核酸序列編碼表A2中給出的任意蛋白 質(zhì)的直向同源物或旁系同源物。項(xiàng)25.根據(jù)項(xiàng)20至24的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀包含相對(duì)于對(duì)照植 物而言提高的生物量和/或提高的出苗生長(zhǎng)勢(shì)。項(xiàng)26.根據(jù)項(xiàng)20至25任一項(xiàng)的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀在非脅迫條 件下獲得。項(xiàng)27.根據(jù)項(xiàng)22至26任一項(xiàng)的方法，其中所述的核酸有效連接至組成型啟動(dòng)子， 優(yōu)選地有效連接至G0S2啟動(dòng)子，最優(yōu)選地有效連接至來(lái)自稻的G0S2啟動(dòng)子。項(xiàng)28.根據(jù)項(xiàng)20至27的方法，其中所述編碼MYB7多肽的核酸是植物來(lái)源的，優(yōu) 選地來(lái)自雙子葉植物，進(jìn)一步優(yōu)選地來(lái)自十字花科，更優(yōu)選地來(lái)自擬南芥屬，最優(yōu)選地來(lái)自 擬南芥。項(xiàng)29.根據(jù)項(xiàng)20至28的方法可獲得的植物或其部分，包括種子，其中所述的植物 或其部分包含編碼MYB7多肽的重組核酸。
項(xiàng)30.構(gòu)建體，其包含(i)編碼如項(xiàng)20至21中定義的一類MYB7多肽的核酸；(ii)能夠驅(qū)動(dòng)(a)的核酸序列表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列；和任選地(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。項(xiàng)31.根據(jù)項(xiàng)30的構(gòu)建體，其中所述的控制序列之一是組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選地是 G0S2啟動(dòng)子，最優(yōu)選地是來(lái)自稻的G0S2啟動(dòng)子。項(xiàng)32.根據(jù)項(xiàng)30或31的構(gòu)建體在用于制備植物的方法中的用途，所述植物相對(duì) 于對(duì)照植物具有提高的產(chǎn)量，特別具有提高的生物量和/或提高的出苗生長(zhǎng)勢(shì)。項(xiàng)33.用根據(jù)項(xiàng)30或31的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞。
項(xiàng)34.用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述的轉(zhuǎn)基因植物相對(duì)于對(duì)照植物具有提高 的產(chǎn)量、尤其提高的生物量和/或提高的出苗生長(zhǎng)勢(shì)，該方法包括(i)在植物中導(dǎo)入并表達(dá)編碼如項(xiàng)20至21中定義的MYB7多肽的核酸；和(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育植物細(xì)胞。項(xiàng)35.轉(zhuǎn)基因植物，其相對(duì)于對(duì)照植物具有由編碼項(xiàng)20或21中定義的MYB7多肽 的核酸的受調(diào)節(jié)表達(dá)引起的提高產(chǎn)量、尤其提高的生物量和/或提高的種子產(chǎn)量，或從所 述轉(zhuǎn)基因植物衍生的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。項(xiàng)36.根據(jù)項(xiàng)29、33或35的轉(zhuǎn)基因植物，或從其中衍生的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中 所述的植物是作物植物或單子葉植物或禾谷植物，如稻、玉米、小麥、大麥、谷子、黑麥、小黑 麥、高粱和燕麥。項(xiàng)37.根據(jù)項(xiàng)36的植物的可收獲部分，其中所述的可收獲部分優(yōu)選地是營(yíng)養(yǎng)生物量。項(xiàng)38.產(chǎn)物，從根據(jù)項(xiàng)36的植物和/或從根據(jù)項(xiàng)37的植物的可收獲部分衍生。項(xiàng)39.編碼MYB7多肽的核酸在相對(duì)于對(duì)照植物增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀、尤其在 提高生物量和/或出苗生長(zhǎng)勢(shì)中的用途。附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明現(xiàn)在將參考以下圖進(jìn)行描述，其中

圖1代表SEQ ID NO 2的序列和結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。Dof結(jié)構(gòu)域的序列以粗體字符顯示。 指出了基序I至基序V。圖2A代表表Al中給出的D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽的多重比對(duì)。圖2B代表表Al中給出的D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽中存在的Dof結(jié)構(gòu)域的多重氨基 酸序列比對(duì)結(jié)果。圖3顯示擬南芥和稻的D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽的進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)。指出了包含亞組C2 的聚類。圖4描述了用于稻中在稻W(wǎng)SI18啟動(dòng)子的控制下增加SEQ ID NO :1表達(dá)的雙元載 體(pffSI18)。圖5詳述在實(shí)施本發(fā)明方法中有用的諸序列的例子。圖6代表具有以粗體顯示的兩個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域和下劃線標(biāo)出的保守基序1至7的 SEQ ID NO :50。圖7代表多種MYB 7蛋白的多重比對(duì)結(jié)果。
圖8代表了用于稻中在稻G0S2啟動(dòng)子(pG0S2)控制下增加編碼MYB7的核酸表達(dá) 的雙元載體。圖9詳述在實(shí)施本發(fā)明方法中有用的諸序列的例子。 實(shí)施例本發(fā)明現(xiàn)在參考如下實(shí)施例進(jìn)行描述，所述實(shí)施例僅是示意性的。以下實(shí)施例不 意圖完全限定或限制本發(fā)明的范圍。
DNA操作除非另外說(shuō)明，重組DNA技術(shù)根據(jù)(Sambrook(2001)Molecular Cloning :a laboratory manual,第 3 版 ColdSpring Harbor Laboratory Press, CSH, New York)或 Ausubel 等人(1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols第1卷和第2卷中描述的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。用于植物分子研究工作的標(biāo)準(zhǔn)材料 和方法在BIOS科學(xué)出版有限責(zé)任公司(BIOS Scientific Publications Ltd(英國(guó)))和 Blackwell 科學(xué)出版社(Blackwell Scientific Publications (英國(guó)))出版的 R. D. D. Croy 的 Plant Molecular Biology Labfax (1993)中描述。實(shí)施例1 鑒定與本發(fā)明方法中所用核酸序列相關(guān)的序列用數(shù)據(jù)庫(kù)搜索工具如基本局部比對(duì)工具(BLAST) (Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215 :403-410 ；和 Altschul 等人(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402)，在國(guó)家 生物技術(shù)信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中維護(hù)的那些序列中鑒定到與本發(fā)明方 法中所用核酸序列相關(guān)的(全長(zhǎng)cDNA、EST或基因組)序列。使用該程序通過(guò)將核酸序列 或多肽序列與序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較并且計(jì)算匹配的統(tǒng)計(jì)顯著性來(lái)找到序列之間的局部相似性 區(qū)域。由與本發(fā)明方法中所用核酸編碼的多肽用于TBLASTN算法，采用默認(rèn)設(shè)置和過(guò)濾程 序以略去低復(fù)雜性序列啟動(dòng)。該分析的輸出結(jié)果通過(guò)逐對(duì)比較進(jìn)行檢驗(yàn)，并根據(jù)概率評(píng)分 (E-值)進(jìn)行評(píng)級(jí)，其中所述的評(píng)分反映特定比對(duì)結(jié)果偶然發(fā)生的概率(E-值越低，命中的 顯著性越高)。除E-值外，比較也可以通過(guò)同一性百分?jǐn)?shù)評(píng)分。同一性百分?jǐn)?shù)指兩個(gè)所比 較的核酸(或多肽)序列之間特定長(zhǎng)度范圍內(nèi)相同核苷酸(或氨基酸)的數(shù)目。在一些情 況下，可以調(diào)整默認(rèn)參數(shù)以調(diào)節(jié)搜索的嚴(yán)格性。例如，可以提高E-值以顯示嚴(yán)格性更低的 匹配。以這種方式，可以鑒定到短的近乎完全的匹配。表Al和表A2提供了與本發(fā)明方法中所用核酸序列相關(guān)的核酸序列名單。表Al :D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子核酸和多肽的例子 表A2 :MYB7多肽的例子在一些情況下，相關(guān)序列已經(jīng)由研究機(jī)構(gòu)如基因組研究機(jī)構(gòu)(TIGR)初步地匯編 并且公開(kāi)披露?？梢允褂谜婧松锘蛑毕蛲次?EGO)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)鑒定此類相關(guān)序列，這 可通過(guò)關(guān)鍵詞搜索或通過(guò)使用BLAST算法以目的核酸或多肽序列進(jìn)行。SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 11代表在擬南芥基因組的基因座AT4G24060處的兩 種剪接變體。實(shí)施例2 :D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽序列和MYB7多肽序列的比對(duì)使用來(lái)自Vector NTI (Invitrogen)的Alignment X程序進(jìn)行多肽序列的比 對(duì)，其中所述Alignment X程序基于流行的累進(jìn)比對(duì)Clustal W算法(Thompson等人 (1997) Nucleic Acids Res 25 4876-4882 ；Chenna 等人(2003)，Nucleic Acids Res 31 3497-3500)。空位開(kāi)口罰分的默認(rèn)值是10，空位延伸罰分是0. 1并且所選的權(quán)重矩陣是 Blosum 62(如果比對(duì)多肽的話)。就D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽而言，可以進(jìn)行少許手工編輯以進(jìn)一步優(yōu)化比對(duì)。 D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽之間的序列保守性基本上在所述多肽的Dof結(jié)構(gòu)域內(nèi)并在如 共有SEQ ID NO 37至43所代表的保守基序I至VII的位置處(見(jiàn)圖2A)。D0F-C2結(jié)構(gòu)域 轉(zhuǎn)錄因子多肽在圖2A中比對(duì)。圖2B代表如在表Al的多肽中存在的DOF結(jié)構(gòu)域的多重比 對(duì)結(jié)果。顯示了共有序列。在共有序列中顯示Dof結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽之間的高度保守氨 基酸殘基。在圖3中顯示來(lái)自擬南芥(At)和稻(Os)的DOF家族的轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)。 含有亞組Cc的DOF多肽的分化體由框顯示。使用如Vector NTI (Invitrogen)的AlignX 程序中所提供的鄰接法聚類算法構(gòu)建圖3。就MYB7多肽而言，可以進(jìn)行少許手工編輯以進(jìn)一步優(yōu)化比對(duì)。諸MYB7多肽之間 的序列保守性基本上在所述多肽氨基半端部分的SANT結(jié)構(gòu)域內(nèi)，羧基半端部分通常在序列長(zhǎng)度和組成方面更為多變。諸MYB7多肽在圖7中比對(duì)。實(shí)施例3 計(jì)算在實(shí)施本發(fā)明方法中有用的多肽序列之間的總體同一性百分?jǐn)?shù)使用現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域可獲得的方法之一，即MatGAT(矩陣總體比對(duì)工具)軟件(BMC Bioi nformatics. 2003 4 29. MatGAT 使用蛋白質(zhì)序列或DNA序列產(chǎn)生相似性/同一性矩 P車的一 Ρ 用(an application thatgenerates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences), Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J 亥軟件由 Ledion Bitincka維護(hù))確定在實(shí)施本發(fā)明方法中有用的全長(zhǎng)多肽序列之間的總體相似性和同一 性百分?jǐn)?shù)。MatGAT軟件對(duì)DNA序列或蛋白質(zhì)序列產(chǎn)生相似性/同一性矩陣，無(wú)需預(yù)先比對(duì) 數(shù)據(jù)。該程序使用Myers和Miller總體比對(duì)算法(空位開(kāi)口罰分12和空位延伸罰分2) 執(zhí)行一系列配對(duì)比對(duì)，使用例如Blosum 62(對(duì)于多肽而言)計(jì)算相似性和同一性并且隨后 將結(jié)果置于距離矩陣中。在分割線下半部分顯示序列相似性，并且在對(duì)角分割線的上半部 分顯示序列同一性。比較中使用的參數(shù)是評(píng)分矩陣Blosum62第一空位12延伸空位2就D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽而言表Bl中顯示在多肽序列的全長(zhǎng)范圍內(nèi)總體 相似性和同一性的軟件分析結(jié)果。在對(duì)角線上方給出同一性百分?jǐn)?shù)而在對(duì)角線下方給出相 似性百分?jǐn)?shù)(正常字體)。表Bl 在所述多肽序列的全長(zhǎng)范圍內(nèi)總體相似性和同一性的MatGAT結(jié)果 與SEQ ID NO :2相比較，在實(shí)施本發(fā)明方法中有用的D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽 序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)可以低至(在表Bl中以粗體顯示的)27. 5%氨基酸同一性。親緣 最近的旁系同源多肽與SEQ ID NO :2的同一性百分?jǐn)?shù)是45. 7%。SEQ ID NO :2與剪接變體 Aratb_D0F_C2_6的同一性是90%。與表Bl中作為雙子葉植物來(lái)源形式的直系同源D0F_C2 多肽之間的同一性在25-45%范圍內(nèi)。SEQ ID NO :2與表Bl中所示的作為單子葉植物來(lái)源 形式的直系同源D0F_C2多肽之間的同一性在23. 9-35. 4%范圍內(nèi)。就MYB7多肽而言，表B2中顯示在多肽序列的全長(zhǎng)范圍內(nèi)總體相似性和同一性的 軟件分析結(jié)果。在對(duì)角線下方以粗體給出同一性百分?jǐn)?shù)而在對(duì)角線上方(正常字體)給出 相似性百分?jǐn)?shù)。
與SEQ ID NO :50相比較，在實(shí)施本發(fā)明方法中有用的MYB7多肽序列之間的百分?jǐn)?shù)同一性可以低至28. 7%序列同一性。

于序列的搜索法的常用特征標(biāo)識(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)的集成界面。InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)合并了這些數(shù)據(jù)庫(kù)， 所述數(shù)據(jù)庫(kù)使用不同的方法學(xué)及不同程度的有關(guān)充分表征的蛋白質(zhì)的生物學(xué)信息以獲得 蛋白質(zhì)特征標(biāo)識(shí)(proteinsignatures)。合作數(shù)據(jù)庫(kù)包括 SWISS-PROT、PROS ITE, TrEMBL, PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆蓋眾多常見(jiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和家族的 多重序列比對(duì)結(jié)果和隱匿馬爾科夫模型(HMM)的龐大集合。Pfam在英國(guó)Sanger研究所服 務(wù)器上維護(hù)。Interpro由英國(guó)歐洲生物信息學(xué)研究所維護(hù)。在表Cl中呈現(xiàn)如SEQ ID NO 2所代表的多肽序列的InterPro掃描結(jié)果。表Cl 如SEQ ID NO 2所代表的多肽序列的InterPro掃描結(jié)果(主要登錄號(hào)) 在表C2中呈現(xiàn)如SEQ ID NO 50所代表的多肽序列的InterPro掃描結(jié)果。表C2 如SEQ ID NO :50所代表的多肽序列的InterPro掃描結(jié)果(主要登錄號(hào))。 標(biāo)出了氨基酸坐標(biāo)(起始?xì)埢徒K止殘基)。
實(shí)施例5 在本發(fā)明方法中所用的核酸序列的克隆使用定制的擬南芥幼苗cDNA 文庫(kù)(在 pCMV Sport 6. O 中；Invitrogen，Paisley， UK)作為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增本在本發(fā)明方法中使用的核酸序列。使用Hifi Taq DNA聚合 酶，在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用50 μ 1 PCR混合物中的200ng模板進(jìn)行PCR。使用的引物是有義引物 (如SEQ ID N0:44所代表，有義)5' -ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggatacggctcagtgg-3'禾P反義引物(SEQ ID NO 45 ；反義，互補(bǔ))5' -ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaccgagaaattaattagcacc-3'，其中所述引物包括用于Gateway重組的AttB位點(diǎn)。也使用標(biāo)準(zhǔn)方法純化擴(kuò)增 的PCR片段。隨后進(jìn)行Gateway方法的第一步驟，即BP反應(yīng)，在此期間所述PCR片段與 PD0NR201質(zhì)粒在體內(nèi)重組以產(chǎn)生根據(jù)Gateway術(shù)語(yǔ)學(xué)的“進(jìn)入克隆”pSEQIDNO :1。質(zhì)粒 PD0NR201作為Gateway 技術(shù)的部分從Invitrogen購(gòu)買。包含SEQ ID NO=I的進(jìn)入克隆隨后在LR反應(yīng)中與用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體一起使 用。這種載體含有在T-DNA邊界內(nèi)部的植物選擇標(biāo)記、篩選標(biāo)記表達(dá)盒和意圖與已經(jīng)克隆 在該進(jìn)入克隆中的目的核酸序列發(fā)生LR體內(nèi)重組的Gateway盒作為功能性元件。用于種 子特異性表達(dá)的稻W(wǎng)SI18啟動(dòng)子(SEQ ID NO 47)位于該Gateway盒上游。在LR重組步驟后，將所得表達(dá)載體pWSI 18: SEQIDN0 :1 (圖4)根據(jù)本領(lǐng)域熟知的 方法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株LBA4044中。實(shí)施例6 在實(shí)施本發(fā)明方法中有用的多肽序列的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)TargetP 1. 1預(yù)測(cè)真核蛋白的亞細(xì)胞定位?；谌魏伟被饲靶蛄腥~綠體轉(zhuǎn)運(yùn) 肽(cTP)、線粒體靶向肽(mTP)或分泌途徑信號(hào)肽(SP)的預(yù)測(cè)存在性進(jìn)行定位指派。作為最 終預(yù)測(cè)基礎(chǔ)的評(píng)分并不真正是概率，并且它們不是必需地加合成一體。然而，根據(jù)TargetP， 具有最高評(píng)分的定位是最可能的，并且評(píng)分之間的關(guān)系(可靠性級(jí)別)可以指示該預(yù)測(cè)具 有多大確定性。可靠性級(jí)別(RC)范圍從1至5，其中1表示最可靠的預(yù)測(cè)。TargetP在丹 麥技術(shù)大學(xué)(Technical University of Denmark)的服務(wù)器上維護(hù)。對(duì)于預(yù)測(cè)含有氨基端前序列的序列而言，也可以預(yù)測(cè)潛在的切割位點(diǎn)?？梢赃x擇許多參數(shù)，如生物組別(非植物或植物)、臨界值集合(無(wú)、預(yù)定義的臨界 值集合或用戶指定的臨界值集合)和切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)的計(jì)算(是或否)。在表Dl中呈現(xiàn)如SEQ ID NO 50所代表的多肽序列的TargetP 1. 1分析的結(jié)果。 選擇“植物”生物組別，未定義臨界值，并且對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的預(yù)測(cè)長(zhǎng)度提出要求。如SEQ ID NO 50所代表的多肽序列的亞細(xì)胞定位可以是細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，沒(méi)有預(yù)測(cè)到轉(zhuǎn)運(yùn)肽。表Dl 如SEQ ID NO 50所代表的多肽序列的TargetP 1. 1分析結(jié)果
預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽長(zhǎng)度 許多其他算法可以用來(lái)進(jìn)行此類分析，包括·在丹麥技術(shù)大學(xué)服務(wù)器上維護(hù)的ChloroP 1. 1 ；·在澳大利亞布里斯班昆士蘭大學(xué)生物科學(xué)研究所的服務(wù)器上維護(hù)的Protein Prowler亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)者1. 2版；·在加拿大阿伯特省埃德蒙頓市阿爾伯塔大學(xué)的服務(wù)器上維護(hù)的PENCE蛋白組分 析專家 PA-GOSUB 2. 5 ；·在丹麥技術(shù)大學(xué)服務(wù)器上維護(hù)的TMHMM。實(shí)施例7 :MYB7樣多肽的功能測(cè)定法MYB7蛋白質(zhì)活性可以如Li和Parish (1995)所述驗(yàn)定。簡(jiǎn)而言之，將MYB7編碼 序列以符合T7基因10前導(dǎo)序列可讀框的形式克隆并在大腸桿菌中表達(dá)。將蛋白質(zhì)純化并 使用32P標(biāo)記的c-myb結(jié)合位點(diǎn)(MBS)和玉米P基因產(chǎn)物結(jié)位點(diǎn)(PBS)，在遷移率滯留測(cè)定 法中分析所述蛋白質(zhì)。以這種方式，顯示了來(lái)自擬南芥的MYB7不以高親和力與MBS位點(diǎn)結(jié) 合，但對(duì)PBS位點(diǎn)具有結(jié)合偏好性。實(shí)施例8 在本發(fā)明方法中所用的核酸序列的克隆本發(fā)明方法中所用的核酸序列通過(guò)PCR，使用定制的擬南芥幼苗cDNA文庫(kù)(在 pCMV Sport 6. O 內(nèi)；Invitrogen，Paisley，UK)作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。使用 Hifi Taq DNA 聚合酶，在標(biāo)準(zhǔn)條件下利用在50 μ 1 PCR混合物中的200ng模板進(jìn)行PCR。使用的引物是 prm05966 (SEQ ID NO 51 ；有義，起始密碼子為粗體字)5' -ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaaca ggaagatctccttgctg-3 ‘和prm05967 (SEQ ID NO 52 ；反義，互補(bǔ))5' -ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcatttatttcatttccaagcttc-3',其中所述引物包括用于Gateway重組的AttB位點(diǎn)。也使用標(biāo)準(zhǔn)方法純化擴(kuò)增 的PCR片段。隨后進(jìn)行Gateway方法的第一步驟，即BP反應(yīng)，在此期間所述PCR片段與 PD0NR201質(zhì)粒在體內(nèi)重組以產(chǎn)生根據(jù)Gateway術(shù)語(yǔ)學(xué)的“進(jìn)入克隆”pMYB7。質(zhì)粒pD0NR201 作為Gateway 技術(shù)的部分從Invitrogen購(gòu)買。
包含SEQ ID NO 49的進(jìn)入克隆隨后在LR反應(yīng)中與用于稻(粳稻栽培品種日本 晴)轉(zhuǎn)化的目的載體P00640 —起使用。這種載體含有在T-DNA邊界內(nèi)部的植物選擇標(biāo) 記、篩選標(biāo)記表達(dá)盒和意圖與已經(jīng)克隆在該進(jìn)入克隆中的目的核酸序列發(fā)生LR體內(nèi)重組 的Gateway盒作為功能性元件。用于組成型表達(dá)的稻G0S2啟動(dòng)子(SEQ ID NO 53)位于該 Gateway盒上游。在所述LR重組步驟后，所得表達(dá)載體PG0S2 MYB7 (圖8)根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法 轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株LBA4044內(nèi)。實(shí)施例9 植物轉(zhuǎn)化
稻轉(zhuǎn)化使用含有所述表達(dá)載體的農(nóng)桿菌來(lái)轉(zhuǎn)化稻植物。將粳稻栽培品種日本晴 (Nipponbare)的成熟干燥種子脫殼。通過(guò)如下方式實(shí)施消毒在70%乙醇中孵育1分鐘， 隨后在0. 2% HgCl2中孵育30分鐘，隨后用無(wú)菌蒸餾水洗滌6次15分鐘。無(wú)菌的種子隨后 在含有2，4-D的培養(yǎng)基(愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上萌發(fā)。在黑暗中孵育4周后，將胚發(fā)生 的盾片衍生的愈傷組織切下并在相同的培養(yǎng)基上增殖。2周后，將所述愈傷組織通過(guò)在同一 種培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)另外2周進(jìn)行繁殖或增殖。胚發(fā)生的愈傷組織片在新鮮培養(yǎng)基上傳代 培養(yǎng)3日，隨后共培育(以助長(zhǎng)細(xì)胞分裂活性)。將含有所述表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株LBA4404用于共培育。農(nóng)桿菌接種在含有適宜 抗生素的AB培養(yǎng)基上并在28°C培養(yǎng)3日。隨后收集細(xì)菌并在液體共培育培養(yǎng)基中懸浮至 密度(0D_)約1。該混懸液隨后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿內(nèi)并將所述愈傷組織浸入此混懸液中15分 鐘。將所述愈傷組織隨后在濾紙上蘸干并轉(zhuǎn)移至固化的共培育培養(yǎng)基，并在25°C于黑暗中 孵育3日。共培育的愈傷組織在含2，4-D的培養(yǎng)基上在28°C于黑暗中在選擇劑存在下培 育4周。在此期間，迅速生長(zhǎng)的抗性愈傷組織團(tuán)發(fā)育。在轉(zhuǎn)移這種材料至再生培養(yǎng)基并在 光照下孵育后，釋放了胚發(fā)生潛能并且苗在隨后4至5周內(nèi)發(fā)育。將苗從愈傷組織切下并 且在含有植物生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上孵育2至3周，將苗從所述培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至土壤。硬化的苗 在溫室中于高濕度和短日照下培育。對(duì)于一個(gè)構(gòu)建體，產(chǎn)生大約35個(gè)獨(dú)立的TO稻轉(zhuǎn)化體。將原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng) 箱轉(zhuǎn)移至溫室。在定量PCR分析驗(yàn)證T-DNA插入物的拷貝數(shù)后，僅保留顯示所述選擇劑抗 性的單拷貝轉(zhuǎn)基因植物用于收獲Tl種子。種子隨后在移栽后3至5個(gè)月收獲。該方法以 超過(guò)50%的比例產(chǎn)生單基因座轉(zhuǎn)化體(Aldemita和Hodges 1996，Chan等1993，Hiei等 1994)。玉米轉(zhuǎn)化玉米的轉(zhuǎn)化用Ishida等人(1996). Nature Biotech 14(6) :745_50所述方法的改 良形式進(jìn)行。在谷物中，轉(zhuǎn)化是基因型依賴的并且僅特定基因型適合于轉(zhuǎn)化和再生。近交 系A(chǔ)188(明尼蘇達(dá)大學(xué))或以A188作為親本的雜交體是用于轉(zhuǎn)化的供體材料的良好來(lái)源， 不過(guò)也可以成功地使用其他基因型。谷穗從授粉后大約11日(DAP)的谷物植物收獲，此時(shí) 不成熟的胚的長(zhǎng)度是大約1至1. 2mm。不成熟的胚與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌共培育，并 且轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)器官發(fā)生過(guò)程回收。將切下的胚在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上、隨后在玉米 再生培養(yǎng)基上培育，其中所述的培養(yǎng)基含有選擇劑(例如咪唑啉酮，不過(guò)可以使用不同的 選擇標(biāo)記)。培養(yǎng)板在25°C于光照下孵育2-3周，或直至苗發(fā)育。將來(lái)自每個(gè)胚的綠色苗轉(zhuǎn)移至玉米生根培養(yǎng)基并在25°C孵育2-3周，直至根發(fā)育。將生根的苗移植至溫室中的土 壤內(nèi)。Tl種子從顯示選擇劑耐受性并且含有單拷貝T-DNA插入物的植物產(chǎn)生。小麥轉(zhuǎn)化用Ishida 等人(1996)Nature Biotech 14(6) :745_50 描述的方法進(jìn)行小麥的轉(zhuǎn) 化。栽培品種Bobwhite (可從墨西哥CIMMYT獲得)通常用于轉(zhuǎn)化。將不成熟的胚與含有 表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌共培育，并且通過(guò)器官發(fā)生過(guò)程回收轉(zhuǎn)基因植物。與農(nóng)桿菌孵育后， 將所述胚在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上、隨后于再生培養(yǎng)基上體外培育，其中所述的培養(yǎng)基含 有選擇劑(例如咪唑啉酮，但是可以使用多種選擇標(biāo)記)。培養(yǎng)板在25°C于光照下孵育2-3 周，或直至苗發(fā)育。將來(lái)自每個(gè)胚的綠色苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基并在25°C孵育2-3周，直至根 發(fā)育。將生根的苗移植至溫室中的土壤內(nèi)。Tl種子從顯示選擇劑耐受性并且含有單拷貝 T-DNA插入物的植物產(chǎn)生。大豆轉(zhuǎn)化根據(jù)Texas A&M美國(guó)專利5，164，310中描述的改良方法轉(zhuǎn)化大豆。幾個(gè)商業(yè)大豆 品種適合通過(guò)這種方法轉(zhuǎn)化。栽培品種Jack(從Illinois種子基金會(huì)可獲得)通常用于 轉(zhuǎn)化。將大豆種子消毒用于體外播種。從7日齡的年幼籽苗切除下胚軸、胚根和一片子葉。 進(jìn)一步培育上胚軸和剩余的子葉以發(fā)育腋生結(jié)節(jié)。切下這些腋生結(jié)節(jié)并與含有表達(dá)載體的 根癌農(nóng)桿菌孵育。在共培育處理之后，洗滌外植體并轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基。切下再生的苗并 置于苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上。將長(zhǎng)度不超過(guò)Icm的苗置于生根培養(yǎng)基上直至根發(fā)育。將生根的苗 移植至溫室中的土壤內(nèi)。Tl種子從顯示選擇劑耐受性并且含有單拷貝T-DNA插入物的植物 產(chǎn)生。油菜籽/卡諾拉油菜轉(zhuǎn)化使用5-6日齡的年幼籽苗的子葉柄和下胚軸作為組織培養(yǎng)用外植體并且根據(jù) Babic等人(1998，Plant Cell Rep 17 :183_188)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。商業(yè)品種Westar(Agriculture Canada)是用于轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)品種，不過(guò)也可以使用其他品種。將卡諾拉油菜種子表面消毒用 于體外播種。從所述體外籽苗切下帶有子葉的子葉柄外植體，并且通過(guò)將該葉柄外植體的 切口末端浸入細(xì)菌懸液用(含有表達(dá)載體的)農(nóng)桿菌接種。所述外植體隨后在23°C，16小 時(shí)光照下于含有3mg/l BAP、3%蔗糖、0. 7%植物瓊脂的MSBAP-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)2日。與農(nóng) 桿菌共培育2日后，將所述葉柄外植體轉(zhuǎn)移至含有3mg/lBAP、頭孢噻肟、羧芐青霉素或特美 汀(300mg/l)的MSBAP-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)7日，并且隨后在含有頭孢噻肟、羧芐青霉素或特美 汀和選擇劑的MSBAP-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至苗再生。當(dāng)苗的長(zhǎng)度是5-10mm時(shí)，切下這些苗 并且轉(zhuǎn)移至苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)基(MSBAP-0. 5，含有0. 5mg/l BAP)。將長(zhǎng)度大約2cm的苗轉(zhuǎn)移至用 于根誘導(dǎo)的生根培養(yǎng)基(MSO)。將生根的苗移植至溫室中的土壤內(nèi)。Tl種子從顯示選擇劑 耐受性并且含有單拷貝T-DNA插入物的植物產(chǎn)生。苜蓿轉(zhuǎn)化使用(McKersie等，1999Plant Physiol 119:839-847)的方法轉(zhuǎn)化苜蓿的再生性 克隆。苜蓿的再生和轉(zhuǎn)化是基因型依賴性的并且因而需要再生性植物。已經(jīng)描述了獲得 再生性植物的方法。例如，這些再生性植物可以選自栽培品種Range lander (Agriculture Canada)或如Brown DCW禾口AAtanassov(1985. Plant Cell Tissue Culture 4:111—112)所 述的任何其他商業(yè)苜蓿品種。備選地，已經(jīng)選擇RA3品種(威斯康星大學(xué))用于組織培養(yǎng)(Walker等，1978 Am J Bot 65 :654_659)。葉柄外植體與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌C58C1 pMP90 (McKersie 等，1999 Plant Physiol 119 :839_847)或LBA4404 的過(guò)夜培養(yǎng)物共培育。 所述外植體在黑暗中于含有288mg/LPro、53mg/L硫代脯氨酸、4. 35g/L K2SOjP 100 μ m乙酰 丁香酮的SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上共培育3日。所述外植體在半濃度的Murashige-Skoog培養(yǎng)基 (Murashige和Skoog，1962)中洗滌并鋪種在不含乙酰丁香酮而含有抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的合 適選擇劑和合適抗生素的相同SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。幾周后，將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移至不含生長(zhǎng)調(diào)節(jié) 齊IJ、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的B0i2Y發(fā)育培養(yǎng)基。隨后在半濃度的Murashige-Skoog 培養(yǎng)基上萌發(fā)體細(xì)胞胚。將生根的籽苗移植至花缽內(nèi)并且在溫室中培育。Tl種子從顯示選 擇劑耐受性并且含有單拷貝T-DNA插入物的植物產(chǎn)生。棉花轉(zhuǎn)化 使用根癌農(nóng)桿菌，根據(jù)US 5159135中所述的方法轉(zhuǎn)化棉花。棉花種子在3%次氯 酸鈉溶液中作20分鐘表面消毒并在含500 μ g/ml頭孢噻肟的蒸餾水中洗滌。隨后將種子 轉(zhuǎn)移至含有50 μ g/m苯菌靈的SH培養(yǎng)基用于萌發(fā)。取下4至6日齡籽苗的下胚軸，切成 0.5cm小片并置于0.8%瓊脂上。農(nóng)桿菌混懸液(每毫升大約IO8個(gè)細(xì)胞，從含有用目的基 因和合適選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化的過(guò)夜培養(yǎng)物稀釋)用于接種下胚軸外植體。在室溫和光照下3日 后，將組織轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基(1. 6g/l脫乙酰吉蘭糖膠)，所述固體培養(yǎng)基含有具維生素B5 的 Murashige 和 Skoog 鹽(Gamborg 等人，Exp. Cell Res. 50 151-158 (1968)) ,0. lmg/1 2， 4-D、0. lmg/1 6-呋喃甲基氨基嘌呤和750 μ g/ml MgCL2以及殺死殘留細(xì)菌的50至100 μ g/ ml頭孢噻肟和400-500 μ g/ml羧芐青霉素。單個(gè)細(xì)胞系在2至3個(gè)月(每隔4至6周傳 代培養(yǎng))后分離并且在用于組織增殖的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)一步培育(30°C，16小時(shí)光周期)。 轉(zhuǎn)化的組織隨后在非選擇培養(yǎng)基上進(jìn)一步培育持續(xù)2至3個(gè)月以產(chǎn)生體細(xì)胞胚。將至少 4mm長(zhǎng)度的外觀健康胚轉(zhuǎn)移至含有精細(xì)蛭石中具SH培養(yǎng)基的管內(nèi)，所述SH培養(yǎng)基補(bǔ)充有 0. lmg/1吲哚乙酸、6-呋喃甲基氨基嘌呤和赤霉酸。在30°C以16小時(shí)光周期培育胚，并且 將處于2至3葉期的小植物轉(zhuǎn)移至具有蛭石和養(yǎng)分的花缽。植物硬化并隨后移至溫室以進(jìn) 一步培育。實(shí)施例10 表型評(píng)價(jià)方法10. 1評(píng)價(jià)建立產(chǎn)生大約35個(gè)獨(dú)立的TO稻轉(zhuǎn)化體。將原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移至溫室以培 育并收獲Tl種子。留下6個(gè)事件，其中Tl子代以3 1比例對(duì)所述轉(zhuǎn)基因的存在/不存 在分離。對(duì)于這些事件中的每個(gè)事件，通過(guò)監(jiān)測(cè)目視標(biāo)記表達(dá)選出大約10株含有該轉(zhuǎn)基因 的Tl籽苗(雜合子和純合子)和大約10株缺少該轉(zhuǎn)基因的Tl籽苗(失效合子)。以隨機(jī) 位置并排生長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)的失效合子。溫室條件是短日照(12小時(shí)光照)，在光照 下28°C和在黑暗中22°C，和70%相對(duì)濕度。在非脅迫條件下培育的植物以規(guī)律的間隔期澆 水，以確保水和養(yǎng)分不是限制性的并確保滿足植物完全生長(zhǎng)和發(fā)育的需要。4個(gè)Tl事件在T2世代中按照如對(duì)Tl世代相同的評(píng)價(jià)方法進(jìn)一步評(píng)估，但是每個(gè) 事件采用更多個(gè)體。植物從播種期至成熟期數(shù)次通過(guò)數(shù)字成像室。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，從至 少6個(gè)不同角度拍攝每株植物的數(shù)字圖像(2048X 1536像素，1600萬(wàn)顏色)。如下進(jìn)行與D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽關(guān)聯(lián)的干旱篩選在盆栽土壤中在正常條件下培育用pWSI 18 SEQIDN0 1轉(zhuǎn)化并從T2種子生長(zhǎng)出的稻植物的子代直至它們接近齊穗期。隨后將它們轉(zhuǎn)移至灌溉減少的“干燥”區(qū)。將濕度 探測(cè)器插入隨機(jī)選擇的花缽內(nèi)，以監(jiān)測(cè)土壤水含量(SWC)。當(dāng)SWC下降低于某個(gè)閾值時(shí)，自 動(dòng)地對(duì)所述植物連續(xù)再灌溉直至再次達(dá)到正常水平。隨后將植物再次轉(zhuǎn)移至正常條件。栽 培的剩余部分(植物成熟、種子收獲)與不在非生物脅迫條件下培育的植物相同。如對(duì)正 常條件下詳述那樣記錄生長(zhǎng)和產(chǎn)量參數(shù)。如下進(jìn)行與D0F-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽關(guān)聯(lián)的氮利用效率篩選 在盆栽土壤中在除營(yíng)養(yǎng)液之外的正常條件下培育用pWSI 18 SEQIDN0 1轉(zhuǎn)化并 從T2種子生長(zhǎng)出的稻植物的子代。從移植至成熟期間用含有降低的、通常7至8倍之間更 少的氮(N)含量的特定營(yíng)養(yǎng)液澆灌所述花缽。栽培的剩余部分(植物成熟、種子收獲)與 不在非生物脅迫下培育的植物相同。如對(duì)正常條件下詳述那樣記錄生長(zhǎng)和產(chǎn)量參數(shù)。如下進(jìn)行與MYB7多肽關(guān)聯(lián)的干旱篩選在盆栽土壤中在正常條件下培育用pG0S2: :MYB7轉(zhuǎn)化并從T2種子生長(zhǎng)出的稻植 物的子代直至它們接近齊穗期。隨后將它們轉(zhuǎn)移至灌溉減少的“干燥”區(qū)。將濕度探測(cè)器 插入隨機(jī)選擇的花缽內(nèi)，以監(jiān)測(cè)土壤水含量(SWC)。當(dāng)SWC下降低于某個(gè)閾值時(shí)，自動(dòng)地對(duì) 所述植物連續(xù)地再灌溉直至再次達(dá)到正常水平。隨后將植物再次轉(zhuǎn)移至正常條件。栽培的 剩余部分(植物成熟、種子收獲)與不在非生物脅迫條件下培育的植物相同。如對(duì)正常條 件下詳述那樣記錄生長(zhǎng)和產(chǎn)量參數(shù)。如下進(jìn)行與MYB7多肽關(guān)聯(lián)的氮利用效率篩選在盆栽土壤中在除營(yíng)養(yǎng)液之外的正常條件下培育用pG0S2: :MYB7轉(zhuǎn)化并從T2種 子生長(zhǎng)出的稻植物的子代。從移植至成熟期間用含有降低的、通常7至8倍之間更少的氮 (N)含量的特定營(yíng)養(yǎng)溶液澆灌所述花缽。培育的其余部分(植物成熟、種子收獲)與不在非 生物脅迫下培育的植物相同。如對(duì)正常條件下詳述那樣記錄生長(zhǎng)和產(chǎn)量參數(shù)。7. 2統(tǒng)計(jì)分析F-檢驗(yàn)使用兩因素ANOVA(變量分析)作為總體評(píng)價(jià)植物表型特征的統(tǒng)計(jì)模型。對(duì)用本 發(fā)明基因轉(zhuǎn)化的全部事件的全部植物的全部所測(cè)量參數(shù)實(shí)施F檢驗(yàn)。實(shí)施F檢驗(yàn)以檢查該 基因?qū)θ哭D(zhuǎn)化事件的影響并驗(yàn)證該基因的整體作用(又稱作基因總體作用)。對(duì)于該F 檢驗(yàn)而言，真實(shí)基因總體作用顯著性的閾值對(duì)于所述F檢驗(yàn)設(shè)置在5%概率水平上。顯著性 F檢驗(yàn)值指出了基因作用，這意味不僅僅是基因的存在或位置才造成表型上的差異。因?yàn)閷?shí)施了具有重疊事件的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，故進(jìn)行聯(lián)合分析。這用于檢驗(yàn)對(duì)這兩個(gè)實(shí) 驗(yàn)影響的一致性，并且如果一致，則用于積累來(lái)自兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的證據(jù)以提高結(jié)論的可信度。所 用的方法是考慮數(shù)據(jù)的多重水平結(jié)構(gòu)的混合模型法(即實(shí)驗(yàn)_事件_分離子)。通過(guò)比較 似然比檢驗(yàn)與卡方分布(chi squaredistribution)獲得P-值。10. 3測(cè)量的參數(shù)生物量相關(guān)的參數(shù)測(cè)量植物從播種期至成熟期數(shù)次通過(guò)數(shù)字成像室。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，從至少6個(gè)不同 角度拍攝每株植物的數(shù)字圖像(2048X 1536像素，1600萬(wàn)顏色)。植物地上部分面積(或葉生物量)通過(guò)計(jì)數(shù)來(lái)自植物地上部分的數(shù)字圖像上與背 景區(qū)別的像素總數(shù)而確定。這個(gè)值對(duì)相同時(shí)間點(diǎn)上從不同角度拍攝的畫面進(jìn)行平均化并且 通過(guò)校正轉(zhuǎn)化成以平方mm表述的物理表面值(physical surface value) 0實(shí)驗(yàn)顯示以這種方式測(cè)量的地上部分植物面積與地上植物部分的生物量相關(guān)。地上部分面積是在植物已 經(jīng)達(dá)到其最大葉生物量的時(shí)間點(diǎn)處所測(cè)量的面積。早期生長(zhǎng)勢(shì)是萌發(fā)后3周的植物(籽 苗)地上部分面積。根生物量的增加表述為總根生物量的增加(測(cè)量為植物壽命期間所觀 察到的根最大生物量)；或表述為根/冠比增加(測(cè)量為根和苗的活躍生長(zhǎng)期間根質(zhì)量與 苗質(zhì)量之間的比例)。早期生長(zhǎng)勢(shì)通過(guò)計(jì)數(shù)來(lái)自植物地上部分的與背景區(qū)別的像素總數(shù)確定。這個(gè)值對(duì) 相同時(shí)間點(diǎn)上從不同角度拍攝的畫面進(jìn)行平均化并且通過(guò)校正轉(zhuǎn)化成以平方mm表述的物 理表面值。下述結(jié)果是針對(duì)萌發(fā)后3周的植物。
種子相關(guān)的參數(shù)測(cè)量值將成熟的原發(fā)花序收獲、計(jì)數(shù)、裝袋、加條形碼標(biāo)記并且隨后在干燥箱內(nèi)于37°干 燥3日。隨后將所述花序脫粒，并且收集和計(jì)數(shù)全部種子。使用吹氣裝置將充實(shí)粒與空粒 分開(kāi)。棄去空粒并且再次計(jì)數(shù)剩余部分。充實(shí)粒在分析天平上稱重。通過(guò)計(jì)數(shù)分離步驟后 仍留下的充實(shí)粒的數(shù)目確定充實(shí)種子數(shù)。種子總產(chǎn)量通過(guò)稱量從一株植物收獲的全部充實(shí) 粒測(cè)量。每株植物的種子總數(shù)通過(guò)計(jì)數(shù)從一株植物收獲的殼數(shù)測(cè)量。千粒核重(TKW)從計(jì) 數(shù)的充實(shí)種子數(shù)及它們的總重量外推出來(lái)。本發(fā)明中的收獲指數(shù)(HI)定義為種子總產(chǎn)量 與地上部分面積(mm2)之間的比率乘以系數(shù)106。如本發(fā)明中定義的每花序總花數(shù)是種子總 數(shù)與成熟原發(fā)花序數(shù)之間的比率。如本發(fā)明中定義的種子充實(shí)率是充實(shí)種子數(shù)對(duì)種子(或 小花)總數(shù)的比例(表述為％)。實(shí)施例11 轉(zhuǎn)基因植物的表型評(píng)價(jià)結(jié)果評(píng)價(jià)在WSI 18啟動(dòng)子(SEQ ID NO 47)或在如表2A中所述RCc3啟動(dòng)子的控制下 表達(dá)D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子核酸的轉(zhuǎn)基因稻植物的結(jié)果。在以下參數(shù)至少之一中觀察到至少5% 的提高出苗生長(zhǎng)勢(shì)(早期生長(zhǎng)勢(shì))、種子總產(chǎn)量、種子總數(shù)、充實(shí)種子數(shù)、每穗花數(shù)和收獲 指數(shù)。在下表D2中呈現(xiàn)用載體pWSI 18 SEQIDN0 1轉(zhuǎn)化并在非脅迫條件下生長(zhǎng)的植物 的性能。表D2.用實(shí)施例5中所述的包含SEQ ID NO 1的植物轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物 的表型評(píng)價(jià)結(jié)果 實(shí)施例12 轉(zhuǎn)基因植物的表型評(píng)價(jià)結(jié)果在非脅迫條件下表達(dá)MYB7核酸的轉(zhuǎn)基因稻植物(用pG0S2: :MYB7轉(zhuǎn)化并從T2種 子長(zhǎng)出來(lái)的植物的子代)的評(píng)價(jià)揭示地上部分生物量(AreaMax)總體提高超過(guò)5%，P-值 為0. 0012，并且出苗生長(zhǎng)勢(shì)(早期生長(zhǎng)勢(shì))總體提高超過(guò)5%，P-值小于0. 00001。
權(quán)利要求
用于通過(guò)調(diào)節(jié)植物中編碼DOF-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽或MYB-結(jié)構(gòu)域蛋白的核酸表達(dá)而增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用于相對(duì)于對(duì)照植物而言增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，包括 調(diào)節(jié)以下核酸的表達(dá) a)植物中編碼包含如下特征(i)和特征(ii)的D0F-C2(具有一個(gè)指狀物的結(jié)合DNA 的，亞組C2)結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸(i)DOF結(jié)構(gòu)域，其以增加的優(yōu)選順序與SEQ ID N0:35或SEQ IDNO 36所代表的DOF結(jié) 構(gòu)域具有至少 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,96%,97%, 98%、99%或更多的序列同一性；和( )具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有5、4、3、2或1 個(gè)非保守性氨基酸替換的基序I :ERKARPQKDQ(SEQ IDNO 37)；和/或具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有3、2或1個(gè)非保守 性氨基酸替換的基序II =YWSGMI (SEQ ID NO :38)，或b)植物中編碼MYB7多肽的核酸，其中所述MYB7多肽包含兩個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中a)所述的D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽還包含1、2、3、4種或全部的以下基序具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有5、4、3、2或1個(gè)非 保守性氨基酸替換的基序III :RLLFPFEDLKPLVS(SEQID NO 39)；和/或具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有4、3、2或1個(gè)非保 守性氨基酸替換的基序IV JNVKPMEEI (SEQ ID NO 40)；和/或;具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有9、8、7、6、5、4、3、2 或1個(gè)非保守性氨基酸替換的基序V :KNPKLLHEGAQDLNLAFPHH(SEQ ID NO 41)；和/或具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有5、4、3、2或1個(gè)非 保守性氨基酸替換的基序VI :MELLRSTGCYM(SEQ IDNO 42)；和/或具有0、1個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換和/或以增加的優(yōu)選順序具有9、8、7、6、5、4、3、2 或1個(gè)非保守性氨基酸替換的基序VII :MMDSNSVLYSSLGFPTMPDYK(SEQ ID NO 43)；或者b)所述的MYB7多肽包含基序1至7(SEQ ID NO 55至SEQ ID NO 61)中的4種或更 多種基序。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法，其中所述受調(diào)節(jié)的表達(dá)通過(guò)在植物中導(dǎo)入并表達(dá)編碼 D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸或編碼MYB7多肽的核酸實(shí)現(xiàn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4的方法，其中a)所述編碼D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸編碼表Al中所列的任一種蛋白質(zhì)或是這種核 酸的一部分或是能夠與這種核酸雜交的核酸；或b)所述編碼MYB7多肽的核酸編碼表A2中所列的任一種蛋白質(zhì)或是這種核酸的一部分 或是能夠與這種核酸雜交的核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5的方法，其中所述的核酸序列編碼表Al或表A2中給出的任意蛋 白質(zhì)的直向同源物或旁系同源物。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀包括a)相對(duì)于對(duì)照植物而 言提高的產(chǎn)量、優(yōu)選地提高的早期生長(zhǎng)勢(shì)和/或提高的種子產(chǎn)量或b)相對(duì)于對(duì)照植物而言提高的生物量和/或提高的出苗生長(zhǎng)勢(shì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀是在非脅迫條件下獲得的。
9.根據(jù)權(quán)利要求2-8的方法，其中所述核酸有效連接至a)種子特異性啟動(dòng)子，優(yōu)選地有效連接至編碼晚期胚發(fā)生蛋白的基因的啟動(dòng)子，最優(yōu) 選地有效連接至來(lái)自稻的WSI18啟動(dòng)子，或b)組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選地有效連接至G0S2啟動(dòng)子，最優(yōu)選地有效連接至來(lái)自稻的G0S2 啟動(dòng)子。
10.根據(jù)權(quán)利要求2-9的方法，其中所述編碼DOF-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽或MYB7多肽的核酸 是植物來(lái)源的，優(yōu)選地來(lái)自雙子葉植物，進(jìn)一步優(yōu)選地來(lái)自十字花科(Brassicaceae)，更優(yōu) 選地來(lái)自擬南芥屬(Arabidopsis)，最優(yōu)選地來(lái)自擬南芥(Arabidopsis thaliana)。
11.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求2-10的方法可獲得的植物或其部分，包括種子，其中所述的植 物或其部分包含編碼D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽或MYB7多肽的重組核酸。
12.構(gòu)建體，其包含(i)編碼權(quán)利要求3或4中所定義的D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽或一類MYB7多肽的核酸；( )能夠驅(qū)動(dòng)(a)的核酸序列表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列；和任選地(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的構(gòu)建體，其中a)所述調(diào)控序列之一是種子特異性啟動(dòng)子，優(yōu)選地是編碼晚期胚發(fā)生蛋白的基因的啟 動(dòng)子，最優(yōu)選地是稻W(wǎng)SI18基因的啟動(dòng)子，或b)所述調(diào)控序列之一是組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選地是G0S2啟動(dòng)子，最優(yōu)選地是來(lái)自稻的 G0S2啟動(dòng)子。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的構(gòu)建體在用于制備植物的方法中的用途，所述植物具有提 高的產(chǎn)量和a)相對(duì)于對(duì)照植物而言特別地具有提高的早期生長(zhǎng)勢(shì)和/或提高的種子產(chǎn)量 或b)相對(duì)于對(duì)照植物而言特別地具有提高的生物量和/或提高的出苗生長(zhǎng)勢(shì)。
15.用根據(jù)權(quán)利要求12或13的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞。
16.用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述的轉(zhuǎn)基因植物相對(duì)于對(duì)照植物具有提高的產(chǎn)量、 特別地具有提高的生物量和/或提高的生長(zhǎng)勢(shì)和/或提高的種子產(chǎn)量，該方法包括(i)導(dǎo)入并在植物中表達(dá)權(quán)利要求2或3中所定義的編碼D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸 或編碼MYB7多肽的核酸；和( )在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育植物細(xì)胞。
17.轉(zhuǎn)基因植物，其相對(duì)于對(duì)照植物而言具有由編碼權(quán)利要求2或3中所定義的 D0F-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽或MYB7多肽的核酸受調(diào)節(jié)地表達(dá)而引起的提高的產(chǎn)量、特別地提高 的生物量和/或提高的生長(zhǎng)勢(shì)和/或提高的種子產(chǎn)量，或從所述轉(zhuǎn)基因植物衍生的轉(zhuǎn)基因 植物細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求11、15或17的轉(zhuǎn)基因植物或從其衍生的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述 的植物是作物植物或單子葉植物或谷物植物，如稻、玉米、小麥、大麥、谷子、黑麥、小黑麥、 高粱和燕麥。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的植物的可收獲部分，其中所述的可收獲部分優(yōu)選地是苗生物量和/或種子或營(yíng)養(yǎng)生物量。
20.產(chǎn)物，其從根據(jù)權(quán)利要求18的植物和/或從根據(jù)權(quán)利要求19的植物的可收獲部分衍生。
21.編碼DOF-C2轉(zhuǎn)錄因子多肽或MYB7多肽的核酸的用途，用于在植物中相對(duì)于對(duì)照植 物而言提高植物產(chǎn)量、特別地提高種子產(chǎn)量和/或提高生物量和/或生長(zhǎng)勢(shì)。
全文摘要
本發(fā)明總體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域并涉及用于增強(qiáng)植物中多種經(jīng)濟(jì)重要的產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。更具體地，本發(fā)明涉及用于通過(guò)調(diào)節(jié)植物中編碼DOF-C2(具有一個(gè)指狀物的結(jié)合DNA的，亞組C2)結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽或MYB 7多肽的核酸的表達(dá)而增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。本發(fā)明也涉及具有編碼DOF-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽或MYB7多肽的核酸受調(diào)節(jié)地表達(dá)的植物，所述植物相對(duì)于對(duì)照植物而言具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀。本發(fā)明也提供了在實(shí)施本發(fā)明方法中有用的包含DOF-C2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子多肽或MYB7多肽的構(gòu)建體。
文檔編號(hào)C07K14/415GK101842489SQ200880113918
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2008年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月29日
發(fā)明者A·I·桑茲莫林納羅, C·勒佐 申請(qǐng)人:巴斯夫植物科學(xué)有限公司